CN103266089A - 抗人和肽素单克隆抗体mcco1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，公开了抗人和肽素单克隆抗体mcco1及其应用。一株分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1，于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2012189。所述的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1，该单克隆抗体效价高、特异性强，敏感性高，优于多克隆抗体，可应用于人和肽素蛋白检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及抗人和肽素单克隆抗体mcco1及其应用。
背景技术
和肽素(Copeptin)是精氨酸加压素原C末端的39个氨基酸残基，相对分子质量为5000。和肽素和信号肽、精氨酸加压素(AVP)、神经垂体激素运载蛋白II共同组成前精氨酸加压素原，合成于下丘脑，再转运至垂体后叶贮存，和肽素与AVP等摩尔释放。和肽素在精氨酸加压素的成熟、转运以及对精氨酸加压素原的细胞内加工等方面起作用，参与机体的应激反应。应激反应可刺激AVP及和肽素的合成和释放，使血液水平明显升高。体内AVP水平的上升与心脑血管事件预后呈显著相关，中风后激活下丘脑－脑垂体－肾上腺压力轴线，释放AVP。但由于AVP血浆半衰期短，不足30分钟，难以在体外检测并应用于临床诊断，而和肽素稳定性好，室温下可至少保存7天，易于检测，故和肽素成为国内外研究者的热点，现已作为一种应激状态、心脑血管病的新的重要生物标志物（Swiss Med Wkly，2010年第140卷w13101页；国际心血管病杂志，2010年第37卷第210页；心血管病学进展，2011年第32卷第175页）。
发明内容
本发明的目的是提供分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的另一目的是提供抗人和肽素单克隆抗体。
本发明的又一目的是提供抗人和肽素单克隆抗体的应用。
一株分泌和肽素的杂交瘤细胞株MCCO1，于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2012189。
所述的保藏号为CCTCC NO：C2012189的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
所述的保藏号为CCTCC NO：C2012189的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1在制备人和肽素的检测试剂中的应用。
所述的人和肽素检测试剂优选检测人和肽素的Western Blot试剂、免疫细胞化学或免疫组织化学试剂。
一种人和肽素检测试剂，包含本发明所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
本发明的有益效果：
本发明利用合成人和肽素片段与KLH偶联作为免疫原，经过皮下免疫及脾内免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，获得了一株能够稳定分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1（CCTCC NO：C2012189）。经ELISA、免疫印迹等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体mcco1能够特异性识别和肽素(Sigma公司)，效价高、特异性强，免疫细胞化学结果证明其敏感性优于多克隆抗体（Santa Cruz公司）。
本发明抗人和肽素单克隆抗体mcco1的应用如下：
（1）应用该单克隆抗体可Western Blot检测和肽素抗原。
（2）应用该单克隆抗体进行免疫细胞化学检测培养细胞和肽素蛋白表达。
（3）应用该单克隆抗体进行免疫组化检测组织中和肽素蛋白表达。
本发明确认了所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1在体外用于检测细胞或组织中和肽素的表达；进一步将可用于检测各种体液如血液、血浆、血清及尿液的和肽素的水平，并应用于疾病诊断，如急性心肌梗死，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志物。本发明获得的抗人和肽素单克隆抗体mcco1，为和肽素的基础和临床研究提供了有利的工具。
附图说明：
图1为杂交瘤细胞株MCCO1染色体检测。
图2为Western Blot检测mcco1单克隆抗体与Sigma公司和肽素、合成人和肽素及合成和肽素片段多肽的特异性反应，
其中泳道1为Sigma和肽素5μg蛋白＋mcco1单克隆抗体20μg/mL，
泳道2为合成和肽素全长5μg蛋白＋mcco1单克隆抗体20μg/mL，
泳道3为合成和肽素N端多肽5μg＋mcco1单克隆抗体20μg/mL，
泳道4为合成和肽素C端多肽5μg＋mcco1单克隆抗体20μg/mL。
图3为免疫细胞化学利用mcco1单克隆抗体检测培养细胞和肽素蛋白的表达，
其中A为人胃腺癌细胞株BGC823检测结果（左为未加一抗阴性对照，中一抗为Santa Cruz公司抗人和肽素多克隆抗体SC-7811、右一抗为抗人和肽素单克隆抗体mcco1。一抗浓度均为4μg/mL,DAB染色，黄褐色为阳性，mcco1优于SC-7811）。
B为人肺腺癌细胞株SPCA-1检测结果（左为未加一抗阴性对照，中一抗为Santa Cruz公司抗人和肽素多克隆抗体SC-7811、右一抗为抗人和肽素单克隆抗体mcco1。一抗浓度均为4μg/mL,DAB染色，黄褐色为阳性，mcco1优于SC-7811）。
图4为免疫组织化学利用mcco1单克隆抗体检测人乳腺癌及肺癌组织和肽素蛋白的表达结果，
其中A为mcco1单克隆抗体检测的人乳腺癌组织和肽素蛋白表达×400（DAB＋Ni深褐色为阳性，苏木精复染核）
B为mcco1单克隆抗体检测的人肺癌组织和肽素蛋白表达×400（DAB＋Ni深褐色为阳性，苏木精复染核）。
生物材料保藏信息
杂交瘤细胞株MCCO1，于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2012189。
具体实施方式
实施例1.人和肽素肽段合成
按人和肽素蛋白序列（NCBI序列号NP-000481.2）合成和肽素全长P1：ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY（SEQ ID NO.1）39肽；合成和肽素N端多肽P2：CATQLDGPAGALLLRLV（SEQ ID NO.2）肽段与KLH偶联作为免疫抗原（Curr ProtocNeurosci，2001年第5章第5.6节；天津医药，2009年第10期862页）；合成和肽素N端多肽P3：ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQ（SEQ ID NO.3）23肽作为检测筛选抗原；合成和肽素C端多肽P4：LAGAPEPFEPAQPDAY（SEQ ID NO.4）16肽。
实施例2.杂交瘤细胞系的建立
步骤1、免疫动物
选8-12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），用实施例1合成的120μL KLH偶联P2(含蛋白质100μg)与120μL福氏完全佐剂（Sigma公司）充分混匀，小鼠腹腔内注射免疫，3-4周以40-50μg KLH偶联P2，小鼠脾内注射加强免疫1次。3-7天后采用间接酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测免疫小鼠血清中和肽素多克隆抗体的效价，效价高则进行细胞融合。
步骤2、细胞融合
无菌制备上述步骤1中KLH偶联P2免疫的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0（来源于中科院上海细胞库）以6:1的比例在PEG1450（Sigma公司）作用下融合，融合按常规法（Nature.1975;256:495-497）进行,用1mL PEG，1分钟内缓慢加完，反应时间为90秒，无血清的DMEM（Gibco BRL公司）培养基终止反应，1000rpm离心10min，HAT（H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷，Gibco BRL公司)完全DMEM培养基调整细胞浓度至1х106/mL，加入已预先铺有饲养细胞（Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞）的96孔培养板，100μl/mL，37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔3天观察并换液，10天后以HT DMEM（Gibco BRL公司）培养基换液，1周后换为完全DMEM培养基培养。
步骤3、间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞
用实施例1合成的肽段P3（1μg/mL）包被96孔酶标板，37℃反应2小时或4℃过夜；3%牛血清白蛋白（BSA）封闭，4℃过夜，加入上述步骤2制得的杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，SP2/0培养上清为阴性对照；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Sigma公司）37℃孵育1小时；TMB底物液显色10min，2mol/L H2SO4终止反应。每步完成均用含0.05%Tween20的PBS充分洗涤，Ultra Microplate Reader（EL808Ultra Microplate Reader BIO-TEKInstruments,Inc.,Winooski,VT）测OD450值。挑选所测的OD450比阴性对照高10倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存。
步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法
将上述步骤3筛选得到的细胞用HT DMEM培养基稀释至每孔1个细胞，铺于U型96孔细胞培养板，4小时内光镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单克隆抗体分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化并鉴定，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1。杂交瘤细胞株MCCO1于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.C2012189。
实施例3.体外培养法制备单克隆抗体
将实施例2获得的阳性杂交瘤细胞株MCCO1（CCTCC NO.C2012189）扩大培养，待细胞浓度达105/mL时停止换液，持续培养直至细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，-20℃保存备用。
实施例4.体内诱生腹水法制备单克隆抗体
挑选经产Balb/c小鼠，腹腔内注射0.5mL液体石蜡（Sigma公司），7天后每只小鼠腹腔内注射0.5mL含2×105的MCCO1（CCTCC NO.C2012189）杂交瘤细胞，7-10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水，4℃离心，2500rpm离心20min，收集上清，得到含单克隆抗体mcco1的小鼠腹水，将腹水分装-70℃保存备用。
实施例5.单克隆抗体的特性鉴定
步骤1、滴度测定
取实施例4制备的小鼠腹水做等比稀释，用实施例1合成的P3为检测抗原，间接ELISA法（同实施例2步骤3）测定实施例4制备的小鼠腹水中单克隆抗体mcco1的滴度，并以SP2/0诱生的小鼠腹水为阴性对照，ELISA检测的结果显示腹水中单克隆抗体mcco1的滴度达到1:106。
步骤2、单克隆抗体IgG亚类鉴定
取实施例3获得的MCCO1杂交瘤细胞培养上清，用小鼠单克隆抗体分型试剂（Sigma公司）进行测定：
（1）用实施例1合成的P3（1μg/mL）包被96孔酶标板，加入MCCO1杂交瘤细胞培养上清，室温孵育2小时。
（2）用含0.05%Tween20的PBS洗板三次。分别加入羊抗鼠的IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3（Sigma公司）（用PBST1:2000稀释）各100μL/孔，每个样品双复孔。室温孵育30分钟。
（3）用含0.05%Tween20的PBS洗板三次。加入HRP偶联的兔抗羊IgG（Sigma公司）（用PBST做1:20000稀释），100μL/孔，室温孵育30分钟。
（4）用含0.05%Tween20的PBS洗板三次，TMB底物显色10min。
（5）2mol/L H2SO4终止反应。
（6）ELISA Reader测OD450值，判断单克隆抗体IgG亚类。
结果表明，MCCO1杂交瘤分泌的mcco1单克隆抗体是IgG1亚类免疫球蛋白。
步骤3、单克隆抗体的纯化
将实施例4制备的抗人和肽素单克隆抗体mcco1小鼠腹水用0.01mol/L的PBS（pH7.4）对倍稀释，采用Protein A（Amersham Pharmacia Biotech公司）亲和层析法（按说明书操作）纯化单克隆抗体mcco1。纯化的单克隆抗体mcco1-70℃保存。
步骤4、单克隆抗体稳定性的测定
复苏实施例2获得的阳性杂交瘤细胞株MCCO1（CCTCC NO.C2012189），收集传代3、4、5次数的细胞及上清，检测杂交瘤细胞染色体及用ELISA方法检测其效价。结果显示，杂交瘤细胞株MCCO1染色体数均>100（附图1）；上清抗体效价稳定，表明杂交瘤细胞株MCCO1不同传代次数的细胞均能够稳定的产生单克隆抗体。
步骤5、单克隆抗体反应特异性
（1）间接ELISA方法（同实施例2步骤3）检测上述步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1与实施例1合成的P1肽段以及购买的Sigma和肽素的抗原特异性反应。实验结果见表1。结果表明，抗人和肽素单克隆抗体mcco1与实施例1合成的P1肽段和Sigma公司和肽素均有特异性反应。
表1ELISA检测单克隆抗体mcco1与合成P1肽段和Sigma和肽素的特异性反应
（2）Western Blot免疫印迹实验检测上述步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1与Sigma公司购买的和肽素抗原、合成P1肽段、合成P3肽段及合成P4肽段的结合反应：
按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore公司），用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入上述步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1，室温反应1h，洗涤三次。随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Sigma公司）室温反应1h，洗涤三次，ECL两种底物1:1等体积混合后均匀覆盖在膜表面，保鲜膜覆膜，Bio-rad凝胶成像曝光、拍照。结果显示：单克隆抗体mcco1与Sigma公司购买的和肽素抗原、合成P1肽段、合成P3肽段（和肽素N端多肽）有较强的特异性反应，而与合成P4肽段（和肽素C端多肽）无反应（附图2）。表明本发明获得的、由MCCO1细胞株产生的抗人和肽素单克隆抗体mcco1可特异性与和肽素抗原发生强烈的结合反应，抗原表位位于人和肽素N端，可应用于和肽素的检测。
步骤6、单克隆抗体滴度测定
以Sigma和肽素为检测抗原，间接ELISA法（同实施例2步骤3）测定实施例5步骤3纯化的单克隆抗体mcco1的滴度，并以稀释液作为阴性对照，和肽素多克隆抗体（Santa Cruz公司）为阳性对照。实验结果表明：间接ELISA检测的单克隆抗体滴度是1:106以上，且MCCO1制备的单克隆抗体mcco1OD值高于Santa Cruz公司的和肽素多克隆抗体SC-7811（见表2）。
表2间接ELISA检测mcco1单克隆抗体滴度
实施例6、免疫细胞化学检测培养细胞中和肽素蛋白表达
步骤1、检测抗体准备：
取实施例5步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1做检测抗体，以PBS＋1％BSA稀释为4μg/mL；另购买Santa Cruz公司抗人和肽素多克隆抗体SC-7811作为阳性对照抗体，均以PBS＋1％BSA稀释为4μg/mL。
步骤2、培养细胞准备：
复苏人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823，于24孔培养板培养，细胞融合达80％左右时以PBS清洗培养液3遍，4％PFA常温固定细胞10分钟。PBS清洗3遍。
步骤3、免疫细胞化学：
固定后的培养细胞用0.5％Triton-X100(PBS配)孵育20分钟后，PBS清洗3遍。3％H2O2孵育15分钟去除内源性过氧化物酶后，PBS清洗3遍。封闭血清孵育30分钟（Santa CruzSC-7811孔用1％BSA＋PBS封闭，其余孔用正常马血清封闭（Vector公司，R.T.U Vectastainuniversal elite ABC KIT PK-7200）。小心吸去封闭液，加入相应一抗，4℃孵育过夜（同时设立不加一抗的阴性对照）。PBS清洗3遍后生物素标记二抗常温孵育30分钟（Santa CruzSC-7811孔加生物素标记抗-山羊IgG抗体（Vector公司V0609），其余孔加生物素标记的马抗体（Vector公司，R.T.U Vectastain universal elite ABC KIT PK-7200，可识别兔及小鼠IgG）。PBS清洗后加入Vectastain elite ABC试剂（PK-7200）常温孵育30分钟。PBS清洗后DAB试剂盒染色10分钟。中止染色流水冲洗后苏木精复染核3分钟。流水冲洗后吸干水份，加入培养板封片剂（自配，含明胶及甘油），光镜下观察并拍照。实验结果见附图3，可见人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823胞浆胞核均可见黄褐色着色，结果说明单克隆抗体mcco1能检测培养细胞和肽素蛋白表达,mcco1的敏感性优于多克隆抗体SC-7811。
实施例7、免疫组织化学检测肺癌组织中和肽素蛋白表达
步骤1、检测抗体准备：
取实施例5步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1做检测抗体，以TBS＋1％BSA稀释为12μg/mL；
步骤2、癌组织标本准备：
取江苏省人民医院组织标本库中-80℃保存乳腺癌组织标本50mg左右（女，39岁，浸润性导管癌II级，住院号673412）、肺癌组织标本100mg左右（男，52岁，左上肺小细胞肺癌，住院号72609），4℃解冻后以PBS清洗，4％PFA固定组织块24小时。PBS清洗3遍。
步骤3、组织包埋及切片
固定后的组织经逐级酒精脱水（30％、50％、70％、95％2次、100％3次），二甲苯透明2次，浸蜡3次后，包埋，4μm连续切片后，经二甲苯2次脱蜡，逐级酒精复水（100％3次、95％2次、70％、50％、30％、水）。
步骤4、免疫组织化学
复水后的切片行微波抗原修复（修复液选用Vector公司低pH抗原修复液H-3300）,沸腾3×5分钟，TBST清洗3遍。1％H2O2孵育30分钟去除内源性过氧化物酶后，TBST清洗3遍。正常马血清封闭孵育30分钟（Vector公司，R.T.U Vectastain universal elite ABC KITPK-7200）。小心吸去封闭液，加入相应mcco1一抗，4℃孵育过夜。TBS清洗3遍后生物素标记二抗常温孵育30分钟（Vector公司，R.T.U Vectastain universal elite ABC KITPK-7200，可识别兔及小鼠IgG）。TBS清洗后加入Vectastain elite ABC试剂（PK-7200）常温孵育30分钟。TBS清洗后DAB+Ni试剂盒（Vector公司，SK-4100）染色10分钟。中止染色流水冲洗后苏木精复染核3分钟。流水冲洗后逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。实验结果见附图4，可见人乳腺癌、肺癌组织内深褐色着色，结果说明单克隆抗体mcco1能检测癌组织中和肽素蛋白表达。
Claims (5)
1.一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1，于2012年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2012189。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
3.权利要求2所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1在制备人和肽素检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的人和肽素检测试剂为检测人和肽素的Western Blot试剂、免疫细胞化学或免疫组织化学试剂。
5.一种人和肽素检测试剂，其特征在于包含权利要求2所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130828 |