CN103266089A - 抗人和肽素单克隆抗体mcco1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域,公开了抗人和肽素单克隆抗体mcco1及其应用。一株分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1,于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:C2012189。所述的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1,该单克隆抗体效价高、特异性强,敏感性高,优于多克隆抗体,可应用于人和肽素蛋白检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及抗人和肽素单克隆抗体mcco1及其应用。
背景技术
和肽素(Copeptin)是精氨酸加压素原C末端的39个氨基酸残基,相对分子质量为5000。和肽素和信号肽、精氨酸加压素(AVP)、神经垂体激素运载蛋白II共同组成前精氨酸加压素原,合成于下丘脑,再转运至垂体后叶贮存,和肽素与AVP等摩尔释放。和肽素在精氨酸加压素的成熟、转运以及对精氨酸加压素原的细胞内加工等方面起作用,参与机体的应激反应。应激反应可刺激AVP及和肽素的合成和释放,使血液水平明显升高。体内AVP水平的上升与心脑血管事件预后呈显著相关,中风后激活下丘脑-脑垂体-肾上腺压力轴线,释放AVP。但由于AVP血浆半衰期短,不足30分钟,难以在体外检测并应用于临床诊断,而和肽素稳定性好,室温下可至少保存7天,易于检测,故和肽素成为国内外研究者的热点,现已作为一种应激状态、心脑血管病的新的重要生物标志物(Swiss Med Wkly,2010年第140卷w13101页;国际心血管病杂志,2010年第37卷第210页;心血管病学进展,2011年第32卷第175页)。
发明内容
本发明的目的是提供分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的另一目的是提供抗人和肽素单克隆抗体。
本发明的又一目的是提供抗人和肽素单克隆抗体的应用。
一株分泌和肽素的杂交瘤细胞株MCCO1,于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:C2012189。
所述的保藏号为CCTCC NO:C2012189的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
所述的保藏号为CCTCC NO:C2012189的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1在制备人和肽素的检测试剂中的应用。
所述的人和肽素检测试剂优选检测人和肽素的Western Blot试剂、免疫细胞化学或免疫组织化学试剂。
一种人和肽素检测试剂,包含本发明所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
本发明的有益效果:
本发明利用合成人和肽素片段与KLH偶联作为免疫原,经过皮下免疫及脾内免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化,获得了一株能够稳定分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1(CCTCC NO:C2012189)。经ELISA、免疫印迹等方法鉴定,该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体mcco1能够特异性识别和肽素(Sigma公司),效价高、特异性强,免疫细胞化学结果证明其敏感性优于多克隆抗体(Santa Cruz公司)。
本发明抗人和肽素单克隆抗体mcco1的应用如下:
(1)应用该单克隆抗体可Western Blot检测和肽素抗原。
(2)应用该单克隆抗体进行免疫细胞化学检测培养细胞和肽素蛋白表达。
(3)应用该单克隆抗体进行免疫组化检测组织中和肽素蛋白表达。
本发明确认了所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1在体外用于检测细胞或组织中和肽素的表达;进一步将可用于检测各种体液如血液、血浆、血清及尿液的和肽素的水平,并应用于疾病诊断,如急性心肌梗死,作为临床诊断或辅助诊断的一个标志物。本发明获得的抗人和肽素单克隆抗体mcco1,为和肽素的基础和临床研究提供了有利的工具。
附图说明:
图1为杂交瘤细胞株MCCO1染色体检测。
图2为Western Blot检测mcco1单克隆抗体与Sigma公司和肽素、合成人和肽素及合成和肽素片段多肽的特异性反应,
其中泳道1为Sigma和肽素5μg蛋白+mcco1单克隆抗体20μg/mL,
泳道2为合成和肽素全长5μg蛋白+mcco1单克隆抗体20μg/mL,
泳道3为合成和肽素N端多肽5μg+mcco1单克隆抗体20μg/mL,
泳道4为合成和肽素C端多肽5μg+mcco1单克隆抗体20μg/mL。
图3为免疫细胞化学利用mcco1单克隆抗体检测培养细胞和肽素蛋白的表达,
其中A为人胃腺癌细胞株BGC823检测结果(左为未加一抗阴性对照,中一抗为Santa Cruz公司抗人和肽素多克隆抗体SC-7811、右一抗为抗人和肽素单克隆抗体mcco1。一抗浓度均为4μg/mL,DAB染色,黄褐色为阳性,mcco1优于SC-7811)。
B为人肺腺癌细胞株SPCA-1检测结果(左为未加一抗阴性对照,中一抗为Santa Cruz公司抗人和肽素多克隆抗体SC-7811、右一抗为抗人和肽素单克隆抗体mcco1。一抗浓度均为4μg/mL,DAB染色,黄褐色为阳性,mcco1优于SC-7811)。
图4为免疫组织化学利用mcco1单克隆抗体检测人乳腺癌及肺癌组织和肽素蛋白的表达结果,
其中A为mcco1单克隆抗体检测的人乳腺癌组织和肽素蛋白表达×400(DAB+Ni深褐色为阳性,苏木精复染核)
B为mcco1单克隆抗体检测的人肺癌组织和肽素蛋白表达×400(DAB+Ni深褐色为阳性,苏木精复染核)。
生物材料保藏信息
杂交瘤细胞株MCCO1,于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏号为CCTCC NO:C2012189。
具体实施方式
实施例1.人和肽素肽段合成
按人和肽素蛋白序列(NCBI序列号NP-000481.2)合成和肽素全长P1:ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY(SEQ ID NO.1)39肽;合成和肽素N端多肽P2:CATQLDGPAGALLLRLV(SEQ ID NO.2)肽段与KLH偶联作为免疫抗原(Curr ProtocNeurosci,2001年第5章第5.6节;天津医药,2009年第10期862页);合成和肽素N端多肽P3:ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQ(SEQ ID NO.3)23肽作为检测筛选抗原;合成和肽素C端多肽P4:LAGAPEPFEPAQPDAY(SEQ ID NO.4)16肽。
实施例2.杂交瘤细胞系的建立
步骤1、免疫动物
选8-12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司),用实施例1合成的120μL KLH偶联P2(含蛋白质100μg)与120μL福氏完全佐剂(Sigma公司)充分混匀,小鼠腹腔内注射免疫,3-4周以40-50μg KLH偶联P2,小鼠脾内注射加强免疫1次。3-7天后采用间接酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测免疫小鼠血清中和肽素多克隆抗体的效价,效价高则进行细胞融合。
步骤2、细胞融合
无菌制备上述步骤1中KLH偶联P2免疫的小鼠脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(来源于中科院上海细胞库)以6:1的比例在PEG1450(Sigma公司)作用下融合,融合按常规法(Nature.1975;256:495-497)进行,用1mL PEG,1分钟内缓慢加完,反应时间为90秒,无血清的DMEM(Gibco BRL公司)培养基终止反应,1000rpm离心10min,HAT(H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷,Gibco BRL公司)完全DMEM培养基调整细胞浓度至1х106/mL,加入已预先铺有饲养细胞(Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞)的96孔培养板,100μl/mL,37℃,5%CO2培养箱中培养,每隔3天观察并换液,10天后以HT DMEM(Gibco BRL公司)培养基换液,1周后换为完全DMEM培养基培养。
步骤3、间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞
用实施例1合成的肽段P3(1μg/mL)包被96孔酶标板,37℃反应2小时或4℃过夜;3%牛血清白蛋白(BSA)封闭,4℃过夜,加入上述步骤2制得的杂交瘤细胞培养上清,37℃孵育1小时,SP2/0培养上清为阴性对照;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Sigma公司)37℃孵育1小时;TMB底物液显色10min,2mol/L H2SO4终止反应。每步完成均用含0.05%Tween20的PBS充分洗涤,Ultra Microplate Reader(EL808Ultra Microplate Reader BIO-TEKInstruments,Inc.,Winooski,VT)测OD450值。挑选所测的OD450比阴性对照高10倍的克隆,进行亚克隆化,并进行扩增冻存。
步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法
将上述步骤3筛选得到的细胞用HT DMEM培养基稀释至每孔1个细胞,铺于U型96孔细胞培养板,4小时内光镜下观察每孔实际细胞数,记录单个细胞孔,待其长成克隆且ELISA鉴定抗体分泌呈阳性,即获得单克隆抗体分泌株,大量扩增并冻存,长期传代培养后,以相同的方法再次克隆化并鉴定,从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1。杂交瘤细胞株MCCO1于2012年12月12日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCNO.C2012189。
实施例3.体外培养法制备单克隆抗体
将实施例2获得的阳性杂交瘤细胞株MCCO1(CCTCC NO.C2012189)扩大培养,待细胞浓度达105/mL时停止换液,持续培养直至细胞全部死亡。收集培养上清,1500rpm,离心10分钟,上清含有高水平的单克隆抗体,-20℃保存备用。
实施例4.体内诱生腹水法制备单克隆抗体
挑选经产Balb/c小鼠,腹腔内注射0.5mL液体石蜡(Sigma公司),7天后每只小鼠腹腔内注射0.5mL含2×105的MCCO1(CCTCC NO.C2012189)杂交瘤细胞,7-10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水,4℃离心,2500rpm离心20min,收集上清,得到含单克隆抗体mcco1的小鼠腹水,将腹水分装-70℃保存备用。
实施例5.单克隆抗体的特性鉴定
步骤1、滴度测定
取实施例4制备的小鼠腹水做等比稀释,用实施例1合成的P3为检测抗原,间接ELISA法(同实施例2步骤3)测定实施例4制备的小鼠腹水中单克隆抗体mcco1的滴度,并以SP2/0诱生的小鼠腹水为阴性对照,ELISA检测的结果显示腹水中单克隆抗体mcco1的滴度达到1:106。
步骤2、单克隆抗体IgG亚类鉴定
取实施例3获得的MCCO1杂交瘤细胞培养上清,用小鼠单克隆抗体分型试剂(Sigma公司)进行测定:
(1)用实施例1合成的P3(1μg/mL)包被96孔酶标板,加入MCCO1杂交瘤细胞培养上清,室温孵育2小时。
(2)用含0.05%Tween20的PBS洗板三次。分别加入羊抗鼠的IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3(Sigma公司)(用PBST1:2000稀释)各100μL/孔,每个样品双复孔。室温孵育30分钟。
(3)用含0.05%Tween20的PBS洗板三次。加入HRP偶联的兔抗羊IgG(Sigma公司)(用PBST做1:20000稀释),100μL/孔,室温孵育30分钟。
(4)用含0.05%Tween20的PBS洗板三次,TMB底物显色10min。
(5)2mol/L H2SO4终止反应。
(6)ELISA Reader测OD450值,判断单克隆抗体IgG亚类。
结果表明,MCCO1杂交瘤分泌的mcco1单克隆抗体是IgG1亚类免疫球蛋白。
步骤3、单克隆抗体的纯化
将实施例4制备的抗人和肽素单克隆抗体mcco1小鼠腹水用0.01mol/L的PBS(pH7.4)对倍稀释,采用Protein A(Amersham Pharmacia Biotech公司)亲和层析法(按说明书操作)纯化单克隆抗体mcco1。纯化的单克隆抗体mcco1-70℃保存。
步骤4、单克隆抗体稳定性的测定
复苏实施例2获得的阳性杂交瘤细胞株MCCO1(CCTCC NO.C2012189),收集传代3、4、5次数的细胞及上清,检测杂交瘤细胞染色体及用ELISA方法检测其效价。结果显示,杂交瘤细胞株MCCO1染色体数均>100(附图1);上清抗体效价稳定,表明杂交瘤细胞株MCCO1不同传代次数的细胞均能够稳定的产生单克隆抗体。
步骤5、单克隆抗体反应特异性
(1)间接ELISA方法(同实施例2步骤3)检测上述步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1与实施例1合成的P1肽段以及购买的Sigma和肽素的抗原特异性反应。实验结果见表1。结果表明,抗人和肽素单克隆抗体mcco1与实施例1合成的P1肽段和Sigma公司和肽素均有特异性反应。
表1ELISA检测单克隆抗体mcco1与合成P1肽段和Sigma和肽素的特异性反应
(2)Western Blot免疫印迹实验检测上述步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1与Sigma公司购买的和肽素抗原、合成P1肽段、合成P3肽段及合成P4肽段的结合反应:
按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司),用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜,加入上述步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1,室温反应1h,洗涤三次。随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Sigma公司)室温反应1h,洗涤三次,ECL两种底物1:1等体积混合后均匀覆盖在膜表面,保鲜膜覆膜,Bio-rad凝胶成像曝光、拍照。结果显示:单克隆抗体mcco1与Sigma公司购买的和肽素抗原、合成P1肽段、合成P3肽段(和肽素N端多肽)有较强的特异性反应,而与合成P4肽段(和肽素C端多肽)无反应(附图2)。表明本发明获得的、由MCCO1细胞株产生的抗人和肽素单克隆抗体mcco1可特异性与和肽素抗原发生强烈的结合反应,抗原表位位于人和肽素N端,可应用于和肽素的检测。
步骤6、单克隆抗体滴度测定
以Sigma和肽素为检测抗原,间接ELISA法(同实施例2步骤3)测定实施例5步骤3纯化的单克隆抗体mcco1的滴度,并以稀释液作为阴性对照,和肽素多克隆抗体(Santa Cruz公司)为阳性对照。实验结果表明:间接ELISA检测的单克隆抗体滴度是1:106以上,且MCCO1制备的单克隆抗体mcco1OD值高于Santa Cruz公司的和肽素多克隆抗体SC-7811(见表2)。
表2间接ELISA检测mcco1单克隆抗体滴度
实施例6、免疫细胞化学检测培养细胞中和肽素蛋白表达
步骤1、检测抗体准备:
取实施例5步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1做检测抗体,以PBS+1%BSA稀释为4μg/mL;另购买Santa Cruz公司抗人和肽素多克隆抗体SC-7811作为阳性对照抗体,均以PBS+1%BSA稀释为4μg/mL。
步骤2、培养细胞准备:
复苏人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823,于24孔培养板培养,细胞融合达80%左右时以PBS清洗培养液3遍,4%PFA常温固定细胞10分钟。PBS清洗3遍。
步骤3、免疫细胞化学:
固定后的培养细胞用0.5%Triton-X100(PBS配)孵育20分钟后,PBS清洗3遍。3%H2O2孵育15分钟去除内源性过氧化物酶后,PBS清洗3遍。封闭血清孵育30分钟(Santa CruzSC-7811孔用1%BSA+PBS封闭,其余孔用正常马血清封闭(Vector公司,R.T.U Vectastainuniversal elite ABC KIT PK-7200)。小心吸去封闭液,加入相应一抗,4℃孵育过夜(同时设立不加一抗的阴性对照)。PBS清洗3遍后生物素标记二抗常温孵育30分钟(Santa CruzSC-7811孔加生物素标记抗-山羊IgG抗体(Vector公司V0609),其余孔加生物素标记的马抗体(Vector公司,R.T.U Vectastain universal elite ABC KIT PK-7200,可识别兔及小鼠IgG)。PBS清洗后加入Vectastain elite ABC试剂(PK-7200)常温孵育30分钟。PBS清洗后DAB试剂盒染色10分钟。中止染色流水冲洗后苏木精复染核3分钟。流水冲洗后吸干水份,加入培养板封片剂(自配,含明胶及甘油),光镜下观察并拍照。实验结果见附图3,可见人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823胞浆胞核均可见黄褐色着色,结果说明单克隆抗体mcco1能检测培养细胞和肽素蛋白表达,mcco1的敏感性优于多克隆抗体SC-7811。
实施例7、免疫组织化学检测肺癌组织中和肽素蛋白表达
步骤1、检测抗体准备:
取实施例5步骤3纯化的抗人和肽素单克隆抗体mcco1做检测抗体,以TBS+1%BSA稀释为12μg/mL;
步骤2、癌组织标本准备:
取江苏省人民医院组织标本库中-80℃保存乳腺癌组织标本50mg左右(女,39岁,浸润性导管癌II级,住院号673412)、肺癌组织标本100mg左右(男,52岁,左上肺小细胞肺癌,住院号72609),4℃解冻后以PBS清洗,4%PFA固定组织块24小时。PBS清洗3遍。
步骤3、组织包埋及切片
固定后的组织经逐级酒精脱水(30%、50%、70%、95%2次、100%3次),二甲苯透明2次,浸蜡3次后,包埋,4μm连续切片后,经二甲苯2次脱蜡,逐级酒精复水(100%3次、95%2次、70%、50%、30%、水)。
步骤4、免疫组织化学
复水后的切片行微波抗原修复(修复液选用Vector公司低pH抗原修复液H-3300),沸腾3×5分钟,TBST清洗3遍。1%H2O2孵育30分钟去除内源性过氧化物酶后,TBST清洗3遍。正常马血清封闭孵育30分钟(Vector公司,R.T.U Vectastain universal elite ABC KITPK-7200)。小心吸去封闭液,加入相应mcco1一抗,4℃孵育过夜。TBS清洗3遍后生物素标记二抗常温孵育30分钟(Vector公司,R.T.U Vectastain universal elite ABC KITPK-7200,可识别兔及小鼠IgG)。TBS清洗后加入Vectastain elite ABC试剂(PK-7200)常温孵育30分钟。TBS清洗后DAB+Ni试剂盒(Vector公司,SK-4100)染色10分钟。中止染色流水冲洗后苏木精复染核3分钟。流水冲洗后逐级酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察并拍照。实验结果见附图4,可见人乳腺癌、肺癌组织内深褐色着色,结果说明单克隆抗体mcco1能检测癌组织中和肽素蛋白表达。
Claims (5)
1.一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCCO1,于2012年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:C2012189。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株MCCO1分泌的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
3.权利要求2所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1在制备人和肽素检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述的人和肽素检测试剂为检测人和肽素的Western Blot试剂、免疫细胞化学或免疫组织化学试剂。
5.一种人和肽素检测试剂,其特征在于包含权利要求2所述的抗人和肽素单克隆抗体mcco1。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130828 |