CN108761092A - 建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了建立侧向免疫层析法（LateralFlowImmunoassay，LFIA），时间分辨荧光法（Time‑resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)检测和肽素（Copeptin,CPP）试剂盒过程。本发明试剂盒有试纸卡：底板上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，加外壳后形成试纸卡；其中结合垫上吸附稀土元素荧光微球标记抗CPP抗体；硝酸纤维素膜上喷涂有CPP抗体（检测线）和抗IgG抗体（质控线）。所述稀土元素荧光微球的直径为100‑500nm，在波长420nm激发光作用下，发射出波长615nm荧光，用相配套TRFIA分析仪测定荧光强度。本发明试剂盒具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点,用于检测血液或液体样品中CPP浓度，用于早期判定脑血管栓塞发生。

Description

建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

随着人口老年化社会到来，脑血管疾病发病率日趋增多，死亡率及致残率很高，脑血管梗塞是导致全球人类死亡的第二位病因，脑血管梗塞发病后1年内的病死率为21％～27％，而15％～30％的存活者遗留长期残疾。减少脑血管梗塞发病主要方法是早期预防，早期诊断，早期治疗，目前，没有一个血液学指标能用于早期诊断脑血管梗塞发生。研究发现，脑血管梗塞发生前期，血液中和肽素(Copeptin,CPP)水平明显增高，需要大力开发检测血液中CPP试剂盒，用于早期诊断脑血管梗塞发生。

发明内容

本发明的目的是采用稀土元素荧光微球时间分辨免疫层析技术，用稀土元素荧光纳米微球作为标记示踪的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒。

本发明包括试纸卡由底板上依次相互交错排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫构成试纸条；结合垫上涂有兔抗CPP抗体-稀土元素荧光微粒；硝酸纤维素膜上喷涂CPP抗体形成检测线，抗兔IgG抗体形成质控线，其中，检测线固定CCP抗体和结合垫上CPP抗体识别不同CPP抗原表位；试纸条装在塑料外壳中，形成试纸卡，试纸卡上设置有加实验液窗口，加样窗口，和观察窗口；试剂盒提供实验液为10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5),150mMNaCl,0.02％Tween-20。

本发明用抗体净化和浓缩离心柱(InnovaBiosciences)，净化和浓缩CPP抗体；稀土元素荧光标记羧基修饰微球,直径为100-500nmn，用5-40mmol碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理稀土元素羧基修饰微球后，把1.0-2.0mg/mlCPP抗体偶联到稀土元素荧光微球上，CPP抗体与稀土元素荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪以5ul-15ul/cm速度将微球喷涂于结合垫上，在30-37℃，烘干2-6小时，加入干燥剂封存备用。

本发明用抗体净化和浓缩离心柱(InnovaBiosciences)，把CPP单克隆抗体和抗IgG抗体净化后，用包被液把两抗体浓度调到0.2-2.0mg/ml；用定量喷膜仪以0.5-1.5ul/cm速度，将两抗体以4-6mm间隔喷涂层析膜上，形成检测线和质控线，30-37℃，烘干2-6小时，加入干燥剂封存备用。

本发明底板上中间铺放硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜质控线一侧铺放吸水纸，吸水纸位于硝酸纤维素膜上方，吸水纸与硝酸纤维素膜相重叠长度为1.8mm-2.2mm；硝酸纤维素膜检测线一端铺放结合垫结，合垫位于硝酸纤维素膜上方，结合垫与硝酸纤维素膜相重叠长度为1.8mm-2.2mm；结合垫另一端铺设样品垫，样品垫位于结合垫上方，样品垫与结合垫相重叠长度为3.8mm-4.2mm，最后切割成宽度为3-5mm试纸条，将试纸条装入塑料外壳里，组装成检测CPP时间分辨免疫层析试纸卡。

本发明稀土元素微粒上荧光染料可为铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)等，激发波长420nm,检测波长615nm，其中，发射荧光后，延时100-400us,再测量荧光强度，建立时间分辨荧光法(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)测定试纸条上荧光强度。

本发明试剂盒用合成和肽素(CPP)肽作为校准品，纯度达98％以上，合成CPP肽氨基酸序列是：(126)ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY(164)。

本发明合成CPP多肽作为校准品，用TRFIA检测仪测定不同浓度CPP校准品试纸条检测线上呈现荧光强度，制备CPP浓度标准曲线，建立CPP浓度标准卡，输入到时间分辨荧光法(TRFIA)分析仪，建立自动显示待测样品中CPP浓度的运行系统。

本发明采用稀土元素荧光微球时间分辨免疫层析技术，用稀土元素荧光纳米微球作为标记示踪，结合了稀土元素荧光寿命长和纳米微球信号放大效应，荧光强度高，而且稀土元素荧光的发射光谱峰范围窄，检测特异性强；420nm激发光与615nm发射光之间stokes位移大，激发光不干扰发射光接收，大幅度提高了检测的灵敏度和稳定性；稀土元素荧光寿命长，可达600us，通过延时测定，即时间分辨免疫荧光法(TRFIA)，短寿命背景荧光衰变后，再测定稀土元素荧光，排除了背景荧光干扰。

本发明建立定量时间分辨荧光免疫层析法检测CPP试剂盒，灵敏度高，特异性强，快速检测血液中CPP浓度，用于早期诊断脑血管栓塞发生。

附图说明

图1是侧向免疫层析法试纸条侧面图；其中1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸水垫；

图2是包装外壳后侧向免疫层析法试纸卡示意图；其中5是检测线，6是质控线，8是试验液窗口，9是样品窗口，10是检测窗口；

图3是侧向免疫层析法试纸条长度示意图；

图4是CPP浓度标准曲线图；

图5是CPP浓度敏感度曲线图；

图6是精氨酸加压素原(Pre-provasopressin)多肽结构。

具体实施方式

本发明具体步骤是：

一.制备时间分辨荧光免疫层析法检测CPP试纸卡

采取技术方案为—种侧向免疫免疫层析法试纸条，看图1，包括，底板(1)以及顺次粘覆于底板上的吸水纸(7)、硝酸纤维素膜(4)、结合垫(3)和样品垫(2)；硝酸纤维素膜粘覆底板中间部位，其上有相间隔的由CPP单克隆抗体涂层形成检测线(Testline)和由羊抗兔IgG抗体涂层形成质控线(Control line)，检测线在结合垫方向，质控线吸水纸方向；结合垫涂有兔抗CPP抗体-稀土元素荧光微球；吸水垫、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫之间，依次与相邻部位部分重叠。

吸水纸(7)位于硝酸纤维素膜(4)靠近质控线(6)一端，且吸水纸一端与硝酸纤维素膜(4)有部分重叠，其重叠部分长度为1.8-2.2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方(图1)。

结合垫(3)位于硝酸纤维素膜(4)靠近检测线(5)一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为1.8-2.2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方(图1)。

样品垫(2)位于结合垫(3)的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为3.8-4.2mm；样品垫重叠在结合垫上方。

硝酸纤维素膜上检测线(5)与质控线(6)平行设置，看图2，检测线与质控线之间的距离为4-6mm。

本发明选用GE Healthcare公司MF1或Fusion5玻璃纤维样品垫,能测定全血，血清，及血浆样本。本发明选用EDM Millipore公司GFDX或GFCP玻璃纤维结合垫，能快速释放结合垫上抗体-荧光微球；HF120或HF135硝酸纤维素膜，呈中等层析速度，有底衬支持；C068或C083纤维素吸水垫，有高吸水性。

本发明把抗CPP抗体化学偶联到直径100-500nm稀土元素荧光标记羧基修饰微粒上，过程如下：(1)将CPP抗体加到抗体净化和浓缩离心柱中(Innova Biosciences),按说明书步骤，净化和浓缩CPP抗体，用磷酸盐缓冲液调节CPP抗体浓度到1.0-2.0mg/ml；(2)用20-50mmol MES缓冲液(pH6.0-7.0)洗涤稀土元素荧光标记羧基修饰微粒，加入10-40mmol碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，22-26℃,反应15-40分钟，用上述MES缓冲液洗涤微球，用20-100mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-8.0)复溶微球后，加入净化后CPP抗体，使CPP抗体与微球的质量比为1:50-1:5，22-26℃，反应2-3小时，用100-500mMTris(pH7.0-8.0)终止反应，0.1-0.5％BSA，0.01-0.05％Tween-20，10-100mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-8.0)液洗涤微球，用抗体稀释液复溶微球至0.1-0.5mg/m1，用喷膜仪以5ul-15ul/cm速度，将微球喷涂在结合垫上，在35-37℃，烘干1-6小时，加入干燥剂封存备用。

用抗体净化和浓缩离心柱(InnovaBiosciences)净化和浓缩CPP抗体和抗IgG抗体。CPP抗体和抗IgG抗体浓度调到0.2-2.0mg/ml；用喷膜仪以0.5-1.5ul/cm速度将两抗体以4-6mm间隔喷涂硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，其中，检测线距离结合垫边缘为6-10mm，35-37℃，烘干1-6小时，加入干燥剂封存备用。

组装试纸条，底板中间先铺放硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜质控线相临近一侧铺放吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠(1.8-2.2mm)，吸水纸在硝酸纤维素膜上方；然后在硝酸纤维素膜检测线相临近一端铺放结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫一端部分重叠(1.8-2.2mm)，结合垫在硝酸纤维素膜上方；随后，结合垫另一端铺设样品垫，使结合垫与样品垫一端部分重叠(3.8-4.2mm)，样品垫在结合垫上方；最后切割成宽度为3-5mm试纸条。

将上述宽度4mm试纸条装入塑料外壳内，形成试纸卡。塑料外壳包括底座和卡盖。看图2，卡盖上设置有实验液窗口(8)，加样窗口(9)和观察窗口(10)，露出试纸条局部区域；实验液窗口，加样窗口开口在述样品垫上部，露出部分样品垫区域；检测窗口开口在硝酸纤维素膜上部，露出全部检测线和质控线，用于检测线和质控线发出荧光信号检测。

本发明选用铕螯合物(Europiumchelate)为荧光物，铕螯合物峰值激发波长为420nm，峰值发射波长为615nm,Stocks位移较大，可有效排除激发光和非特异性荧光对测定荧光的干扰。铕螯合物的萤光寿命较长,可达600微秒(uS),而普通荧光团的荧光衰变时间只有1～100μS，样品中的一些蛋白质荧光衰变时间也很短，仅为1～10μS，因此可适当延迟测量时间(100-400uS)，待背景荧光完全衰减后测定，可消除蛋白质及背景荧光的干扰。

本发明用时间分辨荧光法(TRFIA)分析仪,选激发波长350-430nm，测定波长600-650nm，测定本发明试纸条检测线及质控线上荧光强度。

二.建立时间分辨免疫层析试纸条定量检测CPP自动程序

样品液稀释合成CPP多肽到不同浓度(0,2,5,10,20，50,100pmol/L)，作为CPP校准品,加50ul CPP校准品到试纸卡的样品窗口部位，加120ul实验液到实验液窗口，进行膜层析反应，15-20分钟后，用TRFIA分析仪，TRFIA法测定试纸条上检测线荧光强度。以CPP校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位为横坐标，制备CPP校准品浓度标准曲线，通过此标准曲线建立CPP浓度标准卡，将此卡数值输入TRFIA分析仪，建立荧光强度与CPP浓度自动转换程序，并固定设置TRFIA测定法，TRFIA分析仪自动显示出待测样品中的CPP浓度，用建立TRFIA分析仪自动显示系统，测定出人血清样品中的CPP浓度。

具体实施方案所描述是优选实施例，仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步实验过程：研究发现，在急性脑血管梗塞发生前期，机体处于应激状态，激活下丘脑–垂体–肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-AdrenalAxis,HPA)“压力轴线”系统，其中下丘脑室旁核是HPA轴活动的直接控制部位，在受到应激刺激时，丘脑室旁核的小细胞神经元合成和分泌促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasing hormone，CRH)和精氨酸加压素(ArginineVasopressin，AVP)。CRH和AVP经垂体门脉血流到达垂体，并刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)；ACTH经血液循环到达肾上腺，刺激肾上腺皮质合成和分泌皮质醇，参与机体应激反应。

HPA激活在急性脑血管梗塞病理生理学机制中起重要作用，其过度激活可加重患者病情，AVP是反映HPA轴激活水平的敏感指标，AVP水平升高与脑血管梗塞严重程度和转归相关,AVP可用于早期判断脑血管梗塞发生和预后判定。

精氨酸加压素(AVP)是精氨酸加压素原(Pre-provasopressin)加工剪切后,而形成的含有9个氨基酸的短肽，又称为抗利尿激素或血管加压素，研究发现，AVP能与V1a,V2,V1b受体作用，发挥其生物效应：V1a受体有很强的收缩小动脉的作用；兴奋V2受体可产生抗利尿效应，促进肾脏的保水作用，维持体内渗透压和心血管稳态平衡；V1b受体存在于腺垂体及胰岛细胞，具有内分泌调解活性。AVP是能调节渗透压、血液动力学、血液凝集、并影响内分泌、神经效应的肽类激素。AVP分泌受高渗透压、血容量不足、下丘脑渗透压感受器、神经调节等因素影响。由此看出，AVP参与调节神经系统，心血管系统，内分泌系统，泌尿系统功能。研究进一步发现，脑血管栓塞、急性心肌梗死、高血压、慢性阻塞性肺病等患者血液中AVP水平明显升高，因此，测定血液中AVP可用于判定多种疾病发生。

在血液循环中，AVP半衰期短，少于30分钟；血清中AVP体外稳定性差，保存要求高，很难对AVP进行准确测量。目前，常用放射免疫法测定血清AVP，由于AVP90％以上与血小板结合，且以快速被清除,直接导致检测AVP结果偏低。放射免疫法测定血清中AVP不包括与血小板结合AVP，故放射免疫法精确度低，差异大；另外，AVP是9个氨基酸组成短肽，不适用敏感性很高酶联免疫方法进行测定，所以需要寻找血液中AVP的替代物，用于判断脑血管栓塞，急性心肌梗死发生。

精氨酸加压素原剪切出AVP外，还同时加工形成NeuropathysinⅡ与和CPP。CPP是精氨酸加压素原C末端的一部分(126-164氨基酸序列)，由39个氨基酸组成，一种富含亮氨酸的糖肽。CPP在下丘脑室旁核产生，呈脉冲式释放入血液中。研究表明，CPP在AVP前体加工、AVP的成熟、转运及稳定AVP等方面发挥重要作用。CPP在血液中长期保持稳定，无酶切位点和受体，体内几乎不降解，主要在肾脏排泄。常用免疫学方法就可快速、准确地测定血液中CPP水平。

CPP与AVP都是从精氨酸加压素原剪切下来的多肽片断，它们摩尔浓度是相同，并且CPP与AVP呈等摩尔释放入血液中。CPP变化趋势与AVP是一致的，是反映AVP释放水平的理想替代物。CPP比AVP更稳定，更易用免疫学方法测量，因此测定血液中CPP可替代AVP，作为早期诊断脑栓塞发生标记物。

研究者测定362名脑栓塞患者血液中AVP与CPP水平，结果发现患者血液中AVP水平与CPP水平呈高度正相关，脑血管栓塞患者血浆中CPP水平随应激反应程度加重而逐渐增高。脑血管栓塞引发神经缺损症状越重，机体所受应激反应越强，CPP水平也就越高，而转归则越差。

脑血管栓塞严重程度评估大多采用NIHSS(The National Institutes of HealthStroke Scale)评分标准指标，并被广泛用来评价脑栓塞后3个月转归。早期和及时的危险评估对脑栓塞患者治疗决策十分重要。研究表明，目前，CPP是唯一可提高NIHSS评分对功能转归和死亡风险预测精度高指标，CPP直接反映脑栓塞引发脑内应激反应过程并透过血脑屏障直接释放于体循环中，CPP在体循环中较为稳定，方便免疫法快捷检测的特点，使其在预测脑栓塞发生和程度方面，临床上得到广泛应用。

正常人群血清中CPP水平波动在1～12pmol/L之间，平均小于5pmol/L，男性较女性稍高，与年龄无明显关系；发性急性脑血管栓塞病人血清中CPP水平高于14pmol/L。脑血管栓塞是急症，需要快速诊断，及时治疗，本发明选用测向免疫层析法检测血液中CPP水平，20分钟内出结果，满足快速诊断要求；同时，CPP为短肽，在血液中浓度较低，需要敏感度高的检测方法，用时间分辨免疫荧光法(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)能满足测定CPP浓度要求。

本发明采用稀土元素荧光微球时间分辨免疫层析技术，用稀土元素荧光纳米微球作为标记示踪，结合了稀土元素荧光寿命长和纳米微球信号放大效应，荧光强度高，而且稀土元素荧光的发射光谱峰范围窄，检测特异性强；420nm激发光与615nm发射光之间stokes位移大，激发光不干扰发射光接收，大幅度提高了检测的灵敏度和稳定性；稀土元素荧光寿命长，可达600us，通过延时测定，即时间分辨免疫荧光法(TRFIA)，短寿命背景荧光衰变后，再测定稀土元素荧光，排除了背景荧光干扰。

一.制备测定CPP时间分辨免疫层析试纸卡

(一)测定CPP时间分辨免疫层析试纸条组成

测定CPP侧向免疫层析试纸条(图3)包括底板以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于底板上的吸水垫(30mm)、硝酸纤维素膜(20mm)、结合垫(10mm)和样品垫(28mm)；其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔的由CPP单克隆抗体涂层形成的检测线和由羊抗兔IgG抗体涂层形成的质控线，检测线位于结合垫一侧，质控线靠近吸水纸一侧；结合垫喷涂有CPP抗体-铕螯合物微球涂层；吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫之间，依次与相邻部位接触且部分重叠。

本发明实施例中，检测线与质控线平行设置，检测线与质控线之间的距离为5mm。吸水垫位于硝酸纤维素膜靠近质控线一端，且吸水纸一端与硝酸纤维素膜有部分重叠，其重叠部分长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方(图3)。

结合垫位于硝酸纤维素膜靠近检测线一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方(图3)。

样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为4mm；样品垫重叠在结合垫上方。本发明实施例中，所有测定CPP时间分辨免疫层析试纸条宽度为4mm。

将上述结构试纸条装入塑料外壳里，形成试纸卡，看图2，卡盖上设置有实验液窗口(8)，加样窗口(9)，检测窗口(10)，露出试纸条局部区域；实验液窗口和加样窗口开口于样品垫(2)上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开口于硝酸纤维素膜(4)上部，以露出全部检测线(5)和质控线(6)。

本发明选用玻璃纤维Fusion5样品垫(GE Healthcare)，侵泡在样品垫处理液(0.2％BSA，0.02％Tween-20，0.01％NaN3,20mmol磷酸盐缓冲液pH7.5)，室温下，1小时，再37℃烘干5小时，干燥封闭保持。

本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫(EMD Millipore)，侵泡在结合垫处理液(0.1％BSA,10％Sucrose,0.2％PVP，0.2％PEG，0.02％Tween-20，0.01％NaN3,10mmol磷酸盐缓冲液pH8.0)，室温下，1小时，再37℃烘干6小时，干燥封闭保持。

(二)CPP抗体化学偶联到铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒上本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒(Carboxylated Fluorescent Microspheres)，购于Ocean NanoTech,可选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒直径为100-500nm。

本发明实施例中，选用兔抗CPP抗体(Invitrogen),用InnovaBiosciences公司抗体浓缩和净化离心柱(AbSelectTMAntibody Concentration and Clean-Up Kit)预处理CPP抗体,步骤如下：

1、加500ul CPP抗体到抗体浓缩和净化离心柱中，

2、离心，15000g 1-4分钟,减少CPP抗体到100ul

3、去除收集管中液体,加400ul20mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)到抗体浓缩和净化离心柱中

4、离心，15000g 1-4分钟,减少离心柱中液体积到100ul

5、重复3-4步骤，6次以上

6、吸出抗体浓缩和净化离心柱中约100ulCPP抗体

7、测定CPP抗体浓度，50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)稀释CPP抗体到需要浓度。

本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS化学试剂把CPP抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒(直径300nm)上,步骤如下：

1、取0.4mlCarboxylated Fluorescent Microspheres(10mg/ml),直径300nmm，加入1.5ml离心管中，离心，10000rpm，6分钟，去除上清液

2、再加入1.0ml 50mmolMES缓冲液(pH6.0)到离心管中，悬浮微粒

3、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液

4、重复2-3步骤2次

5、再加0.5ml50mmol MES缓冲液(pH6.0)含20mmol碳二亚胺(EDC)和40mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)到离心管中,混均

6、25℃，反应15分钟

7、离心，10000rpm，6分钟，去除反应液

8、加入1.0ml 50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中

9、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，重复8-9步骤1次

10、加入0.4ml预处理过CPP抗体(0.4mg/ml)加入到上述离心管中，25℃，反应2.5小时

11、加入100ul of 0.1M Tris(pH7.5)到离心管中，25℃，反应30分钟

12、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，

13、加入1.0ml 0.2％BSA，0.01％Tween-20 50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中

14、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，重复13-14步骤2次

15、用1.0ml抗体稀释液(5mmol磷酸盐缓冲液pH7.5，0.2％BSA，10％Sucrose,0.05％Tween-20,0.02％NaN3)到离心管中,悬浮CPP抗体-铕螯合物微粒，4℃储存，备用。

(三).喷涂CPP抗体到结合垫和硝酸纤维素膜上

1.将上述制备CPP抗体-铕螯合物微粒液体(0.15mg/ml)，用定量喷膜仪以10ul/cm量,喷涂在结合垫上，37℃，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

2.用抗体浓缩和净化离心柱预处理CPP单克隆抗体(R&DSystems)及羊抗兔IgG抗体(StemCell Technologies)后，用包被液(5mmol磷酸盐缓冲液pH8.0,0.1％PEG,0.1％PVP，10％Surcose，0.01％NaN3)稀释两抗体浓度到2.0mg/ml and 0.5mg/ml,使用定量喷膜仪,0.8ul/cm速度将两抗体以5mm间隔喷于硝酸纤维素膜上，37℃，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

(四).组装时间分辨免疫层析法检测CPP试纸卡

组装操作在湿度小于30％，稳定25-30℃的房间进行，底板中间先铺放硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜质控线相临近一侧铺放吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠(2mm)，吸水纸在硝酸纤维素膜上方；然后在硝酸纤维素膜检测线相临近一端铺放结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫一端部分重叠(2mm)，结合垫在硝酸纤维素膜上方；随后，结合垫另一端铺设样品垫，使结合垫与样品垫一端部分重叠(4mm)，样品垫在结合垫上方；最后切割成宽度为4mm试纸条。

将上述宽度4mm试纸条装入塑料外壳内，形成试纸卡。其中塑料外壳包括底座和卡盖。看图2，卡盖上设置有实验液窗口(8)，加样窗口(9)和检测窗口(10)，露出试纸条局部区域；实验液窗口和加样窗口开在样品垫上部，露出部分样品垫区域；检测窗口开口在硝酸纤维素膜上部，露出全部检测线和质控线，用于测定检测线和质控线发出荧光信号。

(五).测定CPP时间分辨免疫层析试纸条操作过程

使用测定CPP时间分辨免疫层析试纸条进行定量检测时，在样品垫窗口上加入样品液，在毛细现象作用下，样品液向吸水纸方向泳动，当样品液中含有CPP移动到结合垫时，CPP多肽与CPP抗体-铕螯合物荧光微粒结合，形成CPP多肽-CPP抗体-荧光微粒复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达硝酸纤维素膜检测线处，此处CPP抗体进一步结合，形成CPP抗体-CPP多肽-CPP抗体-荧光微粒夹心复合物，聚集在检测线上；而未结合CPP的CPP抗体-荧光微粒继续前移，到达质控线时，此处羊抗兔IgG抗体与CPP抗体-荧光微粒结合，在质控线处出现羊抗兔IgG抗体-CPP抗体-荧光微粒复合物聚集。检测线和质控线都会产生相应的荧光信号，使用时间分辨荧光分析仪,选定激发波长420nm,检测波长615nm，其中发射荧光在延时200us后,测量荧光强度。TRFIA定量测定试纸条的检测线及质控线上铕螯合物荧光微球发出荧光强度，并计算出样品中CPP含量。整个反应在20分钟内完成。

(六).建立时间分辨免疫层析试纸条定量检测CPP程序建立CPP浓度标准曲线

用样品液(PBS，pH7.5,0.2％BSA,0.02％Tween-20)稀释合成CPP多肽，制成不同浓度CPP校准品(0,2，5，10，20，50，100pmol/L),加50ulCPP校准品到CPP免疫层析试纸卡样品窗口部位，再加120ul实验液(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.5,150mM NaCl,0.05％Tween-20)到实验液窗口，进行膜层析反应，15分钟后，用时间分辨荧光分析仪,选定激发波长420nm,检测波长615nm，延迟测定时间为200us，TRFIA法测定试纸条上检测线及质控线荧光强度。以CPP校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度为横坐标，制备CPP校准品浓度标准曲线(图4)，y＝1.8577x-11.906,R²＝0.8676,通过此标准曲线建立CPP浓度标准卡，作为对样品中所含CPP浓度进行定量分析的基础

输入上述标准卡到TRFIA分析仪，建立自动运行系统，TRFIA分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中的CPP浓度。

测定0-2pmol/L CPP校准品荧光强度,0.1-2pmol/L之间有线关系，TRFIA分析仪测定0.5pmol/L CPP校准品荧光强度(2.01)与0pmol/L CPP校准品荧光强度(0.98)相差约3倍，确定此试剂盒TRFIA测定CPP敏感度为0.5pmol/L

2.用CPP时间分辨荧光免疫层析试纸盒检测血清中CPP浓度

加50ul血清样品到测定CPP时间分辨免疫层析试纸卡加样窗口部位，再加120ul实验液到实验液窗口进行膜层析反应，15分钟后，用时间分辨荧光分析仪,选定CPP时间分辨免疫层析试剂盒自动检测系统，测定血清样品中CPP浓度，结果如下：

Claims (7)

1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：包括试纸卡由底板上依次相互交错排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫构成试纸条；结合垫上涂有兔抗CPP抗体-稀土元素荧光微粒；硝酸纤维素膜上喷涂CPP抗体形成检测线，抗兔IgG抗体形成质控线，其中，检测线固定CCP抗体和结合垫上CPP抗体识别不同CPP抗原表位；试纸条装在塑料外壳中，形成试纸卡，试纸卡上设置有加实验液窗口，加样窗口，和观察窗口；试剂盒提供实验液为10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5),150mM NaCl,0.02% Tween-20。

2.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：用抗体净化和浓缩离心柱（InnovaBiosciences），净化和浓缩CPP抗体；稀土元素荧光标记羧基修饰微球,直径为100-500nmn，用5-40mmol碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理稀土元素羧基修饰微球后，把1.0-2.0mg/mlCPP抗体偶联到稀土元素荧光微球上，CPP抗体与稀土元素荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪以5ul-15ul/cm 速度将微球喷涂于结合垫上，在30-37°C，烘干2-6小时，加入干燥剂封存备用。

3.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：用抗体净化和浓缩离心柱（InnovaBiosciences），把CPP单克隆抗体和抗IgG抗体净化后，用包被液把两抗体浓度调到0.2-2.0mg/ml；用定量喷膜仪以0.5-1.5ul/cm速度，将两抗体以4-6mm间隔喷涂层析膜上，形成检测线和质控线，30-37°C，烘干2-6小时，加入干燥剂封存备用。

4.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：底板上中间铺放硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜质控线一侧铺放吸水纸，吸水纸位于硝酸纤维素膜上方，吸水纸与硝酸纤维素膜相重叠长度为1.8mm-2.2mm；硝酸纤维素膜检测线一端铺放结合垫结，合垫位于硝酸纤维素膜上方，结合垫与硝酸纤维素膜相重叠长度为1.8mm-2.2mm；结合垫另一端铺设样品垫，样品垫位于结合垫上方，样品垫与结合垫相重叠长度为3.8mm-4.2mm，最后切割成宽度为3-5mm试纸条，将试纸条装入塑料外壳里，组装成检测CPP时间分辨免疫层析试纸卡。

5.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：稀土元素微粒上荧光染料可为铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)等，激发波长420nm,检测波长615nm，其中，发射荧光后，延时100-400us,再测量荧光强度，建立时间分辨荧光法（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）测定试纸条上荧光强度。

6.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：此发明试剂盒用合成和肽素（CPP）肽作为校准品，纯度达98%以上，合成CPP肽氨基酸序列是：( 126) ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY(164)。

7.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测和肽素试剂盒，其特征在于：合成CPP多肽作为校准品，用TRFIA 检测仪测定不同浓度CPP校准品试纸条检测线上呈现荧光强度，制备CPP浓度标准曲线，建立CPP浓度标准卡，输入到时间分辨荧光法（TRFIA）分析仪，建立自动显示待测样品中CPP浓度的运行系统。