CN113514642A - 制备检测igfbp4/shbg双指标免疫层析试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种同时检测胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGF‑binding protein 4，IGFBP4)和性激素结合球蛋白(Sex hormone‑binding globulin，SHBG)免疫层析试剂盒，主要成分为免疫层析试纸条，由PVC底板上依次粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。其中结合垫吸附有IGFBP4抗体‑微球和SHBG抗体‑微球，硝酸纤维素膜固定IGFBP4抗体形成检测线1(T1线)，固定SHBG抗体形成检测线2(T2线)，固定抗IgG抗体形成质控线(C线)。本发明同时公开了IGFBP4抗体和SHBG抗体偶联微球过程。本发明用IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒，检测血液或其他体液中IGFBP4和SHBG浓度，用于预测先兆子痫(PE)，妊娠糖尿病(GDM)，宫内生长受限(IUGR)及胎儿早产(PTB)发生的风险。

Description

制备检测IGFBP4/SHBG双指标免疫层析试剂盒
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及制备出IGFBP4抗体-荧光微球和SHBG抗体-荧光微球，建立检测 IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒过程。
背景技术
异常胎盘发育与妊娠相关疾病的发生密切相关，包括先兆子痫(Preeclampsia，PE)，妊娠糖尿病 (Gestational diabetes mellitus，GDM)，宫内生长受限(Intrauterinegrowth restriction，IUGR) 及胎儿早产(Preterm birth，PTB)等。研究发现，绒毛外滋养细胞病理性侵入到母体蜕膜及子宫螺旋动脉构建缺陷，导致胎盘功能不全。胎盘组织表达胰岛素类生长因子(Insulin-like growth factors，IGFs)， IGFs对胎盘的正常发育起着重要作用，IGFs可增进表浅绒毛外滋养细胞侵润，运送营养成分，促进胎儿生长发育。IGFs生物活性学受到胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-binding proteins，IGFBPs)的调控，胎盘中主要表达IGFBP1和IGFBP4。胎盘中妊娠相关蛋白A(Pregnancy associated plasmaprotein A， PAPP-A)是IGFBP4的蛋白水解酶，降解IGFBP4而释放出生物活性IGFs。IGFBP4是6种IGFBP1-6之一， IGFBPs具有高度保守结构，包括N-端富含半胱氨酸区域、高度变异链接区和C-端GCGCCXXC。IGFBP4高亲和力结合IGFs，延长IGFs半衰期，改变IGFs与细胞表面受体的相互作用，并影响IGFs功能。孕早期血循环中IGFBP4水平升高的孕妇，其后PF，IUGR及PTB的发病率明显增高，血液中IGFBP4水平升高与妊娠相关疾病发生密切相关。
妊娠糖尿病(GDM)是一种常见的妊娠并发症，与增加产后妇女糖尿病发病率有关。对GDM患者进行早期诊断和治疗，改善GDM预后十分重要。对GDM诊断是用口服葡萄糖耐受试验。这种测试需要禁食至少8小时，需要3-4血液抽样，并要求2-3小时完成，需要开发一个简单，快速血液检测方法，预测GDM发生。研究发现，正常孕妇组血液中IGFBP4水平为22.78ng/ml，而GDM组血液中IGFBP4水平下降至14.79ng/ml，两组间有显著差异，p＜0.001，血液中IGFBP4水平下降与GDM发生有明显的相关性。
SHBG是由肝脏产生的糖蛋白，结合循环中的性激素，如雌二醇，二氢睾酮和睾丸激素，调节睾丸激素和雌二醇的生物利用度，影响葡萄糖代谢。循环中SHBG水平受雄激素/雌激素平衡状况、甲状腺激素、胰岛素和饮食因素的调节。
胰岛素和胰岛素样生长因子导致抑制SHBG分泌、在胰岛素抵抗状态下，检测到低水平SHBG，SHBG已被认为是胰岛素抵抗的标志物。流行病学研究发现男性血清睾丸激素降低与随后中央性肥胖、胰岛素浓度升高、代谢综合征和糖尿病之间存在关联，而女性血液中睾丸激素升高与葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗密切相关，向糖尿病方向发展。研究表明，在肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征和T2MD病人群中，SHBG水平降低，循环中SHBG浓度成为是T2DM发展的潜在预测因子。
研究发现，胰岛素抵抗是GDM发生的危险信号，GDM和胰岛素治疗妇女SHBG水平较低，此外，妊娠前三个月SHBG浓度降低孕妇，在妊娠后期，患GDM风险明现增加。一项前瞻性研究表明，评估15周269例孕妇几个生物标志物，表明低水平SHBG与GDM风险增加有关，而独立于其他危险因素，如BMI，吸烟和血压。使用211.5mM/L截止值，检测SHBG预测GDM发生灵敏度为85％，特异性为37％。检测血液中SHBG水平可帮助预测GDM发生。
同时检测IGFBP4和SHBG双指标，可同时预测PE，GDM，IUGR及PTB的发生的危险性，需要开发简单，快速，定量检测血液中IGFBP4/SHBG的试剂盒。
本发明建立检测IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒，测定血液中IGFBP4和SHBG水平，用于PE，GDM，IUGR及 PTB发生风险的评估。
发明内容
本发明公开了一种检测血液中IGFBP4和SHBG免疫层析试剂盒，主要成分试纸条，由PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，看图1。结合垫上吸附IGFBP4抗体-微球和SHBG 抗体-微球；硝酸纤维素膜设有固定IGFBP4抗体检测线1(T1线)，固定SHBG抗体检测线2(T2线) 和固定抗IgG抗体(C线)。
层析液：20-200mM Tris，pH7.0-8.0，0.1-1.0％BSA，100-400mM NaCl，0.1-1.0％Tween-20。
所述的微球可以是荧光微球，彩色微球，金标微球，磁性微球及上转换发光微球的一种，本发明选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光微球，激发光波长360-420nm，发射光波长600-650nm。
所述荧光微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，优选为羧基修饰过荧光微球。选用荧光微球直径范围是100-300nm，优选为直径100nm和200nm荧光微球。
本发明公开了IGFBP4抗体和SHBG抗体偶联荧光微球制备过程，步骤如下：
(1)5-20mM碳二亚胺(EDC)和10-40mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-MHS)活化羧基修饰荧光微球；(2) 加入IGFBP4抗体或SHBG抗体进行偶联反应；(3)加入100-400mM Tris缓冲液终止偶联反应；(4)洗涤后，将用Tris缓冲液复溶IGFBP4抗体-荧光微球或SHBG抗体-荧光微球，2-8℃，保存备用。
本发明公开了一种结合垫吸附有IGFBP4抗体-荧光微球和SHBG抗体-荧光微球的制备过程：
用Tris缓冲液稀释IGFBP4抗体-荧光微球浓度到0.05-0.5mg/ml，SHBG抗体-荧光微球浓度到 0.1-0.5mg/ml，用4-10ul/cm速度，将上述荧光微球喷涂到结合垫上，25-37℃，烘干4-12小时，干燥密封，备用。
本发明公开了一种硝酸纤维素膜上T线和C线的制备过程：
用磷酸盐缓冲液稀释IGFBP4抗体浓度到0.5-2.5mg/ml，SHBG抗体浓度到0.5-2.5mg/ml和抗IgG抗体浓度到0.5-2.5mg/ml，用0.4-1.0ul/cm速度，将上述抗体液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T1线，T2 线和C线，间隔为4-6mm，25-37℃，烘干4-12小时，干燥密封，备用。
本发明公开了一种试纸条组装过程：
在PVC底板中间粘贴硝酸纤维素膜，一端粘贴吸水纸，位于硝酸纤维素膜上方，重叠2-3mm；另一端粘贴结合垫，位于硝酸纤维素膜上方，重叠2-3mm；在结合垫另一端粘贴样品垫，位于样品垫上方，重叠2-5mm，形成试纸板，切割成宽3-5mm试纸条。
本发明公开了一种试纸卡组装过程：
本发明含有外壳，由壳面和壳底座两部分构成。将上述试纸条置于壳底座上，合上壳面，形成试纸卡。所述壳面上对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗口，壳面上对应于样品垫位置设有样品孔，看图2。
本发明用双抗体夹心免疫层析原理：样品中IGFBP4和SHBG通过层析作用向前移动，与结合垫吸附IGFBP4 抗体-荧光微球或SHBG抗体-荧光微球结合，形成IGFBP4-IGFBP4抗体-荧光微球复合物或SHBG-SHBG抗体-荧光微球复合物；在毛细动力作用下，SHBG-SHBG抗体-荧光微球复合物，其荧光微球直径为100nm，先进入硝酸纤维素膜，通过T1线，与硝酸纤维素膜T2线固定SHBG抗体结合，而形成荧光微球-SHBG抗体 -SHBG-SHBG抗体复合物，聚集在T2线；IGFBP4-IGFBP4抗体-荧光微球复合物，其荧光微球直径为200nm，后进入硝酸纤维素膜，与硝酸纤维素膜T1线固定IGFBP4抗体结合，而形成荧光微球-IGFBP4抗体-IGFBP4-IGFBP4抗体复合物，聚集在T1线；游离IGFBP4抗体-荧光微球或SHBG抗体-荧光微在T1线或T2线处不结合，继续向前移动，并与C线固定抗IgG抗体结合，未结合成分继续移动到吸水纸位置。T1线捕获的荧光微球量与样品中IGFBP4浓度成正相关，T2线捕获的荧光微球量与样品中SHBG浓度成正相关，而C线捕获的荧光微球，表明完成免疫层析过程。通过免疫荧光分析仪对T1线、T2线和C线信号进行扫描，根据T1线信号强度与样品中IGFBP4浓度成正相关，获得样品中IGFBP4浓度；根据T2线信号强度与样品中 SHBG浓度成正相关，获得样品中SHBG浓度。
免疫荧光分析仪，其特征在于：激发光波长为350-430nm，接收波长为600-650nm。用此分析仪对试纸卡结果进行判读，可实现自动化，提供简单、快速、可靠的检测结果。
将IGFBP4和SHBG校准品加到IGFBP4/SHBG试纸卡样品孔中，反应5-20分钟，用免疫荧光分析仪，测定试纸卡上T1线，T2线和C线荧光强度，制备IGFBP4和SHBG浓度标准曲线，获得IGFBP4和SHBG浓度与荧光强度单位相关参数后，设立免疫荧光分析仪自动检测IGFBP4和SHBG浓度系统，进一步检测样品中 IGFBP4和SHBG浓度。
本发明建立检测IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒，操作简单，快速，特异性高，定量测定出血液中IGFBP4 和SHBG浓度，能满足临床检验要求。
附图说明
图1免疫层析试纸条示意图
图2免疫层析试纸卡正面
图3 IGFBP4浓度与RFU相关曲线
图4 SHBG浓度与RFU相关曲线
具体实施方式
结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步骤实验过程。
一.制备检测IGFBP4/SHBG免疫层析试纸条
(一)IGFBP4抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒(Europium Chelate PS-COOH)，购于Bangs Laboratories Inc.可选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-300nm。
本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把IGFBP4单克隆抗体，购于Hytest，偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，步骤如下：
1.取0.1ml Europium Chelate PS-COOH，浓度为10mg/ml，直径200nm，加入1.5ml离心管中，离心， 15000rpm，15分钟，去除上清液。
2.再加1.2ml 20mM MES缓冲液，pH6.0，到离心管中，悬浮微球。
3.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液。
4.加0.2ml上述MES缓冲液含5mM EDC和10mM Sulfo-MHS到离心管中，混均，25℃，反应30分钟。
5.再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中。
6.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液。
7.加0.2ml pH7.0 PBS含50ug IGFBP4单克隆抗体到上述离心管中，25℃，反应2小时。
8.加20ul 200mM Tris，pH7.4到离心管中，25℃，反应30分钟。
9.加1.2ml Tris缓冲液，20mM Tris，pH7.0 0.2％BSA，0.01％Tween-20到离心管中。
10.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液。
11.用上述Tris缓冲液悬浮IGFBP4抗体-荧光微球，4℃储存，备用。
(二)SHBG抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
本发明实施例中，SHBG单克隆抗体，购于Medix Biochemical，偶联到EuropiumChelate PS-COOH上，步骤如下：
1.取0.1ml Europium Chelate PS-COOH，浓度为10mg/ml，直径100nm，加入1.5ml离心管中，离心， 20000rpm，20分钟，去除上清液。
2.加1.2ml 20mM pH6.0 MES缓冲液到离心管中，悬浮荧光微球。
3.离心，20000rpm，20分钟，去除上清液。
4.加0.2ml上述MES缓冲液含4mM EDC和10mM Sulfo-NHS到离心管中，混均，25℃，反应30分钟
5.再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中。
6.离心，20000rpm，20分钟，去除上清液。
7.加0.2ml pH7.0 PBS含50ug SHBG单克隆抗体到上述离心管中，25℃，反应2小时。
8.加20ul 200mM Tris，pH7.4到离心管中，25℃，反应30分钟。
9.加1.2ml Tris缓冲液，20mM Tris，Ph7.0，0.2％BSA，0.01％Tween-20到离心管中。
10.离心，20000rpm，20分钟，去除上清液。
11.用上述Tris缓冲液悬浮SHBG抗体-荧光微球，4℃储存，备用。
(三)处理样品垫和结合垫
本发明选用玻璃纤维MF1样品垫，购于GE Healthcare，浸泡在样品垫处理液，20mMTris，pH7.4，0.5％ BSA，0.2％Tween-20，0.01NaN3，室温下，1小时，再30℃，烘干8小时，干燥封闭，备用。
本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫，购于EMD Millipore，浸泡在结合垫处理液，20mM Tris，pH7.0，0.5％ BSA，0.1％PVP，5％Sucrose，0.2％Tween-20，0.01％NaN3，室温下，1小时，再30℃，烘干6小时，干燥封闭，备用。
(四)喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
1.用Tris缓冲液，20mM Tris，pH 7.0，10mM NaCl，1.0％BSA，10％Sucrose，0.5％PVP，0.5％Tween20，稀释IGFBP4抗体-铕螯合物荧光微球到0.1mg/ml，稀释SHBG抗体-铕螯合物荧光微球到0.15mg/ml，用XYZ 三维划膜喷金仪(HM3035)，购于上海金标科技生物有限公司，微定量喷头方式，8ul/cm速度，将IGFBP4 抗体-荧光微球和SHBG抗体-荧光微球喷涂到GFDX结合垫上，30℃，烘干6小时，干燥封存，备用。
2.用磷酸缓冲液，10mM NaPO4，pH7.0，1％Trehalose，0.1％PVP，IGFBP4抗体购于Hytest，稀释到 1.5mg/ml，SHBG抗体购于Medix Biochemical，稀释到2.0mg/ml，抗鼠IgG抗体稀释到1.5mg/ml，将硝酸纤维素膜放在XYZ三维划膜喷金仪(HM3035)上，用微定量划线方式，0.8ul/cm速度，将上述3个抗体液喷涂到硝酸纤维素膜上形成T1线，T2线和C线，两线间距5mm，30℃，烘干8小时，干燥封存备用。
(五)组装免疫层析试纸卡
试纸条组装在湿度小于30％，25-37℃房间进行。免疫层析试纸条，看图1，包括PVC底板及沿底板长度方向顺次粘覆于底板上的22mm样品垫、10mm结合垫、25mm硝酸纤维素膜、30mm吸水纸；其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔IGFBP4抗体涂层形成T1线、SHBG抗体涂层形成T2线和由抗鼠 IgG抗体涂层形成C线；结合垫喷涂有IGFBP4抗体-铕螯合物荧光微球和SHBG抗体-铕螯合物荧光微球。本发明实施例中，T1线与T2线平行设置，T1线与T2线之间的距离为5mm，T2线与C线平行设置，T2线与C线之间的距离为5mm。
吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近C线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。
结合垫位于硝酸纤维素膜靠近T1线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。
样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，重叠长度为3mm；样品垫重叠在结合垫上方。
将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm试纸条。
将上述试纸条装入壳底座中，合上壳面，构成试纸卡，如图2，壳面上设置有加样孔(9)检测窗口(10)，露出试纸条局部区域；加样孔开口于样品垫(2)上部，露出部分样品垫区域；检测窗口开口于硝酸纤维素膜(4)上部，以露出全部T1线(5)，T2线(6)和C线(7)。
二.免疫荧光分析仪检测IGFBP4和SHBG浓度过程
(一)IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒操作过程
用IGFBP4/SHBG免疫层析试纸卡进行定量检测血液中IGFBP4和SHBG时，在样品孔上加入10ul IGFBP4/SHBG校准品液或10ul血清/浆，再加100ul层析液，20mM Tris，pH7.4，100mM NaCl，0.5％BSA， 0.5％Tween-20，到样品孔中，反应10-15分钟，T1线，T2线和C线产生相应的荧光信号，使用免疫荧光分析仪进行检测。
(二)建立免疫荧光分析仪检测IGFBP4和SHBG浓度系统
1.建立IGFBP4和SHBG浓度标准曲线
用PBS，pH7.4，含0.5％BSA稀释IGFBP4和SHBG蛋白，IGFBP4浓度为0，5，10，20，40，80ng/ml，SHBG 浓度为0，10，20，40，80，160mM/L，制备成IGFBP4/SHBG校准品。加10ulIGFBP4/SHBG校准品到 IGFBP4/SHBG免疫层析试纸卡样品孔中，再加100ul层析液到样品孔中，进行膜层析反应，10-15分钟后，用免疫荧光分析仪，选定激发波长365nm，检测波长610nm，测定试纸条卡T1线，T2线及C线相对荧光强度单位(Relative fluorescence units，RFU)。以IGFBP4校准品浓度为纵坐标，T1线RFU为横坐标，制备IGFBP4校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝0.0021x-2.6082，R2＝0.9869，看图3，通过此标准曲线得到IGFBP4浓度标准卡，作为对样品中所含IGFBP4浓度进行定量分析依据。以SHBG校准品浓度为纵坐标，T2线RFU为横坐标，制备SHBG校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝0.0022x-3.6342，R2＝0.9954，看图4，通过此标准曲线得到SHBG浓度标准卡，作为对样品中所含SHBG浓度进行定量分析依据。
Figure BSA0000206109090000061
Figure BSA0000206109090000062
输入上述标准卡到免疫荧光分析仪，建立免疫荧光分析仪自动显示检测样品中IGFBP4和SHBG浓度系统。
2.测定IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒重复性和准确度
制备成20ng/ml的IGFBP4和50mM/L SHBG校准品作为样本，用上述免疫层析试剂盒重复测定IGFBP4/SHBG 样本15次，分别计算平均值(M)和标准差(SD)，SD/M x100％＝变异系数(CV)，(1-M/样本浓度)x 100％＝相对偏差(Bias)，结果见下表。
Sample IGFBP4 SHBG
19.45 48.52
18.95 47.73
19.22 49.36
18.71 48.34
20.45 49.51
17.96 50.78
19.75 48.73
19.45 47.48
18.64 50.68
19.23 48.38
18.48 51.17
20.65 48.94
19.71 48.85
18.54 51.64
19.45 48.53
M 19.24267 49.24267
SD 0.731 1.27
CV 3.70％ 2.60％
Bias 1.80％ 1.50％
IGFBP4的CV为3.7％，Bias为1.8％，SHBG的CV为2.6％，Bias为1.5％，说明此IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒重复性和准确度良好。
3.用IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒检测血清中IGFBP4和SHBG浓度
10ul血清加到IGFBP4/SHBG免疫层析试纸卡加样孔中，再加100ul层析液到样品孔中，进行膜层析反应， 10-15分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测IGFBP4和SHBG浓度，结果如下：
血清样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RFU 11894 10751 7290 13667 15721 8421 10960 18182 6935 4371
IGFBP4 22.4ng/ml 20ng/ml 12.7ng/ml 26ng/ml 30.4ng/ml 15ng/ml 20.4ng/ml 35.6ng/ml 12ng/ml 6.6ng/ml
RFU 36793 42176 23765 18776 31456 15142 37458 10446 26578 48756
SHBG 77mM/L 89mM/L 44mM/L 38mM/L 66mm/L 30mM/L 78.8mM/L 19mM/L 55mM/L 104mM/L

Claims (7)

1.一种快速定量检测IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒，主要由免疫层析试纸条和层析液两部分组成；所述免疫层析试纸条包括PVC底板及PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。所述的结合垫吸附IGFBP4抗体-微球和SHBG抗体-微球；所述硝酸纤维素膜上固定有IGFBP4抗体形成检测线1(T1线)，固定有SHBG抗体形成检测线2(T2线)，固定抗IgG抗体形成质控线(C线)。
2.根据权利要求1所述的层析液，20-200mM Tris缓冲液，pH7.0-8.0，0.1-1.0％BSA，100-400mM NaCl，0.1-1.0％Tween-20。
3.根据权利要求1所述的微球有荧光微球，彩色微球，金标微球，磁性微球及上转换发光微球，本发明选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光微球。
4.根据权利要求1所述的微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，微球直径为100-300nm，本发明选用直径100nm和200nm，羧基修饰的微球。
5.根据权利要求1所述IGFBP4抗体和SHBG抗体标记荧光微球制备过程，步骤如下：
(1)用碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；(2)加入IGFBP4抗体和SHBG抗体进行偶联反应；(3)加入Tris液终止偶联反应；(4)洗涤后，用Tris缓冲液复溶IGFBP4抗体-荧光微球和SHBG抗体-荧光微球，2-8℃，保存备用。
6.IGFBP4/SHBG荧光免疫层析试剂卡制备过程，步骤如下：
(1)制备IGFBP4抗体-荧光微球和SHBG抗体-荧光微球液，喷涂到结合垫上，在25-37℃条件下，干燥4-12小时；(2)制备检测线和质控线：将IGFBP4抗体液，SHBG抗体液及抗IgG抗体液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T1线，T2线和C线，在25-37℃条件下，干燥4-12小时；(3)免疫层析试纸条组装：PVC底板上依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，形成试纸板，将试纸板切割成3-5mm试纸条；(4)将上述试纸条装入外壳中，形成免疫层析试纸卡。
7.根据权利要求1所述的IGFBP4/SHBG免疫层析试剂盒，检测血液或其他体液中IGFBP4和SHBG浓度，用于预测先兆子痫(PE)，妊娠糖尿病(GDM)，宫内生长受限(IUGR)及胎儿早产(PTB)发生的风险。
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