CN113533714A - 制备检测mcm5/nmp22双指标免疫层析试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种同时检测微小染色体维持蛋白5(Minichromosome maintenance protein5，MCM5)和核基质蛋白22(Nuclear matrix protein22，NMP22)免疫层析试剂盒，主要成分为免疫层析试纸条，由PVC底板上依次粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。其中结合垫吸附有MCM5抗体‑微球和NMP22抗体‑微球，硝酸纤维素膜固定MCM5抗体形成检测线1(T1线)，固定NMP22抗体形成检测线2(T2线)，固定抗IgG抗体形成质控线(C线)。本发明同时公开了MCM5抗体和NMP22抗体偶联微球过程。本发明建立MCM5/NMP22免疫层析试剂盒，同时检测尿液中MCM5和NMP22浓度，用于筛查早期膀胱癌及监测膀胱癌的预后和复发。

Description

制备检测MCM5/NMP22双指标免疫层析试剂盒
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及制备出MCM5抗体-荧光微球和NMP22抗体-荧光微球，建立检测 MCM5/NMP22免疫层析试剂盒过程。
背景技术
膀胱癌是最常见泌尿系的恶性肿瘤，在我国已列为十大高发肿瘤之一，成为严重威胁人民健康、导致死亡的主要肿瘤。膀胱癌是高度可治疗性的，早期发现膀胱癌尤为重要。由于膀胱癌的复发率高，50％～70％的浅表性肿瘤会在5年之内复发，且其中10％～20％进展为浸润性肿瘤，需要对膀胱癌患者进行长期和连续的监测，因此，需要开发一种敏感性高，特异性强，非侵入性的检测方法，检测尿液中膀胱癌特异性标志物成为早期诊断膀胱癌并监测膀胱癌进展和复发的关键。
近年来，多种无创性的肿瘤标记物在膀胱癌中应用日益受到重视，微小染色体维持蛋白5(Minichromosome maintenance protein5，CMC5)和核基质蛋白22(NuclearMatrix Protein22，NMP22)是膀胱癌特异性标记物，检测尿液中MCM5和NMP22浓度可用于早期筛查膀胱癌及监测膀胱癌的进展和复发。
细胞异常增殖是肿瘤发生发展过程中最核心的特征，其增殖活性与细胞周期密切相关，而细胞周期又受 DNA复制起始因子调控，因此，检测DNA复制起始因子在肿瘤细胞中的表达水平，有助于肿瘤的筛查和预后判断。微小染色体维持蛋白(Minichromosomemaintenance protein)是真核细胞DNA复制的主要调控因子之一，在DNA复制的起始和延长过程中发挥着重要作用，MCM家族成员包括MCM2-7六个亚单位，共同形成异质六聚体复合物，由于其独特的超微结构，MCM被作为肿瘤标志物。
MCM家族成员中MCM5是细胞DNA复制的基础成分，在静止期细胞、终末分化细胞和衰老细胞缺乏MCM5表达，在正常膀胱上皮中MCM5表达仅限于基底干细细胞中；但增殖、转化膀胱细胞中过度表达MCM5，能准确反映出细胞增殖活性，是细胞进入增殖期敏感而特异性指标。非侵入性和侵入性膀胱癌表达MCM5在所有层膀胱细胞中，包括表层上皮细胞，MCM5过度表达被视为特异性增殖的癌前病变标志物。过度表达MCM5 的癌前病变细胞或癌细胞可脱落到到尿液中，因此，测定尿沉积物中MCM5含量表明膀胱癌细胞的存在。研究证明，免疫荧光法检测尿液沉积物中MCM5含量用于诊断膀胱癌，其灵敏度为92％，特异性为78％，尿液中MCM5成为早期筛查膀胱癌和评估预后的特异性指标。
NMP22为核有丝分裂蛋白复合物的一个亚单位，并与有丝分裂期间纺锤体的形成有关。其主要功能为协调核有丝分裂期间染色体正确、均等地分配到子细胞中，故NMP22多分布于细胞有丝分裂较为活跃的组织细胞中，如上皮细胞，尤其尿路上皮细胞。NMP22具有明显的组织和细胞特异性，多种细胞癌变时都伴随 NMP22改变，故NMP22作为尿路上皮特异性肿瘤的标记物。在膀胱癌细胞凋亡时，含NMP22癌细胞释放进入尿液中，膀胱癌患者尿中NMP22含量明显升高。研究表明，检测NMP22诊断膀胱癌的敏感性，pTa期为51.7-55％，pT1期为46.1-83％，pT2期及更高期为70-83％。经过活检证实的膀胱癌患者进行NMP22检测，用10U/ml为临界值，结果显示NMP22对表浅性膀胱癌的敏感性为36-46.7％，对浸润性膀胱癌的敏感性达73-90％。
研究发现，检测MCM5诊断原发性或复发性膀胱癌，灵敏度为69％，特异性为50％，负性预测值为93％，曲线下面积为0.75；NMP22诊断膀胱癌的灵敏度为52％，特异性为83％，负性预测值为92％，曲线下面积为 0.72。然而，MCM5与NMP22联合检测时，诊断膀胱癌的灵敏度为95％，特异性为72％，是明显优于MCM5 或NMP22单一指标。
因此，本发明制备出同时检测MCM5和NMP22双指标免疫层析试剂盒，测定尿液中MCM5和NMP22浓度，用于早期筛查膀胱癌，监测膀胱癌的预后和复发。
发明内容
本发明公开了一种检测尿中MCM5和NMP22免疫层析试剂盒，主要成分试纸条，由PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，看图1免疫层析试纸条示意图。结合垫上吸附MCM5抗体-微球和NMP22抗体-微球；硝酸纤维素膜设有固定MCM5抗体形成质控线1(T1线)，固定NMP22抗体形成检测线2(T2线)和固定抗IgG抗体形成质控线(C线)。
所述的微球可以是荧光微球，彩色微球，金标微球，磁性微球及上转换发光微球的一种，本发明选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光微球，激发光波长360-420nm，发射光波长600-650nm。
所述荧光微球，表面修饰官能团为氨基、羧基、羟基或环氧基的一种，优选为羧基修饰过荧光微球。选用荧光微球直径范围是100-300nm，优选为直径100nm和200nm荧光微球。
本发明公开了MCM5抗体和NMP22抗体偶联荧光微球制备过程，步骤如下：
(1)5-20mM碳二亚胺(EDC)和10-40mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；(2) 加入MCM5抗体或NMP22抗体进行偶联反应；(3)加入100-400mM Tris缓冲液终止偶联反应；(4)洗涤后，将用Tris缓冲液悬浮MCM5抗体-荧光微球或NMP22抗体-荧光微球，2-8℃，保存备用。
本发明公开了一种结合垫吸附有MCM5抗体-荧光微球和NMP22抗体-荧光微球的制备过程：
用Tris缓冲液稀释MCM5抗体-荧光微球浓度到0.05-0.5mg/ml，NMP22抗体-荧光微球浓度到 0.05-0.5mg/ml，用4-10ul/cm速度，将上述荧光微球喷涂到结合垫上，25-37℃，烘干4-12小时，干燥密封，备用。
本发明公开了一种硝酸纤维素膜上T线和C线的制备过程：
用磷酸盐缓冲液稀释MCM5抗体浓度到1.0-4.0mg/ml，NMP22抗体浓度到1.0-4.0mg/ml和抗IgG抗体浓度到0.5-2.5mg/ml，用0.4-1.0ul/cm速度，将上述抗体液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T1线，T2 线和C线，间隔为4-6mm，25-37℃，烘干4-12小时，干燥密封，备用。
本发明公开了一种试纸条组装过程：
在PVC底板中间粘贴硝酸纤维素膜，一端粘贴吸水纸，位于硝酸纤维素膜上方，重叠2-3mm；另一端粘贴结合垫，位于硝酸纤维素膜上方，重叠2-3mm；在结合垫另一端粘贴样品垫，位于样品垫上方，重叠2-3mm，形成试纸板，切割成宽3-5mm试纸条，看图1免疫层析试纸条示意图。
本发明公开了一种试纸卡组装过程：
本发明含有外壳，由壳面和壳底座两部分构成。将上述试纸条置于壳底座上，合上壳面，形成试纸卡。所述壳面上对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗口，壳面上对应于样品垫位置设有样品孔，看图2免疫层析试纸卡正面图。
细胞裂解液，20-200mM Tris，pH7.0-9.0，0-200mM NaCl，0.1-1.0％Tritox-100，0.01-0.1％NaN3。
校准品：20-200mM Tris，pH7.0-9.0，0.5-5.0mM EDTA，0.5-5.0mM DTT，10-100mMNaCl，0.1-1.0％BSA，0.1-1.0％Urea，0.1-1.0％PVP，0.01-0.1％Tween-20，0.01-0.1％NaN3，0-100ng/ml MCM5蛋白，0-100ng/ml NMP22蛋白，作为MCM5/NMP22校准品。
本发明用双抗体夹心免疫层析原理：样品中MCM5和NMP22通过层析作用向前移动，与结合垫吸附MCM5抗体-荧光微球或NMP22抗体-荧光微球结合，形成MCM5-MCM5抗体-荧光微球复合物或NMP22-NMP22抗体-荧光微球复合物；在毛细动力作用下，NMP22-NMP22抗体-荧光微球复合物，其荧光微球直径为100nm，先进入硝酸纤维素膜，通过T1线，与硝酸纤维素膜T2线固定NMP22抗体结合，而形成荧光微球-NMP22抗体 -NMP22-NMP22抗体复合物，聚集在T2线；MCM5-MCM5抗体-荧光微球复合物，其荧光微球直径为200nm，后进入硝酸纤维素膜，与硝酸纤维素膜T1线固定MCM5抗体结合，而形成荧光微球-MCM5抗体-MCM5-MCM5 抗体复合物，聚集在T1线；游离MCM5抗体-荧光微球或NMP22抗体-荧光微球在T1线或T2线处不结合，继续向前移动，并与C线固定抗IgG抗体结合，未结合成分继续移动到吸水纸位置。T1线捕获的荧光微球量与样品中MCM5浓度成正相关，T2线捕获的荧光微球量与样品中NMP22浓度成正相关，而C线捕获的荧光微球，表明完成免疫层析过程。通过免疫荧光分析仪对T1线、T2线和C线信号进行扫描，根据T1线信号强度与样品中MCM5浓度成正相关，获得样品中MCM5浓度；根据T2线信号强度与样品中NMP22浓度成正相关，获得样品中NMP22浓度。
免疫荧光分析仪，其特征在于：激发光波长为350-430nm，接收波长为600-650nm。用此分析仪对试纸卡结果进行判读，可实现自动化，提供简单、快速、可靠的检测结果。
将MCM5和NMP22校准品加到MCM5/NMP22试纸卡样品孔中，反应5-20分钟，用免疫荧光分析仪，测定试纸卡上T1线，T2线和C线荧光强度，制备MCM5和NMP22浓度标准曲线，获得MCM5和NMP22浓度与荧光强度单位相关参数后，设立免疫荧光分析仪自动检测MCM5和NMP22浓度系统，进一步检测样品中MCM5和 NMP22浓度。
本发明建立检测MCM5/NMP22免疫层析试剂盒，操作简单，快速，特异性高，定量检测出尿液中MCM5和NMP22 浓度，能满足临床检验要求。
具体实施方式
结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步骤实验过程。
一.制备MCM5/NMP22免疫层析试剂盒
MCM5/NMP22免疫层析试剂盒包括有免疫层析试纸条，细胞裂解液和MCM5/NMP22校准品，制备过程如下。
(一)MCM5抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒(Europium Chelate PS-COOH)，购于Bangs Laboratories Inc.可选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-300nm。
本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把MCM5单克隆抗体，购于Bio-Rad，偶联到EuropiumChelate PS-COOH 上，直径200nm，步骤如下：
1.取0.1ml Europium Chelate PS-COOH，浓度为10mg/ml，加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15 分钟，去除上清液。
2.加1.2ml 20mM pH6.0 MES缓冲液到离心管中，悬浮微球。
3.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液。
4.加0.2ml上述MES缓冲液含5mM EDC和10mM Sulfo-NHS到离心管中，混均，25℃，反应30分钟。
5.再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中。
6.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液。
7.加0.2ml pH7.0 PBS含45ug MCM5单克隆抗体到上述离心管中，25℃，反应2小时。
8.加20ul 200mM Tris，pH7.4到离心管中，25℃，反应30分钟。
9.加1.2ml Tris缓冲液，20mM Tris，pH7.4，0.2％BSA，0.01％Tween-20到离心管中。
10.离心，15000rpm，15分钟，去除上清液。
11.用上述Tris缓冲液悬浮MCM5抗体-荧光微球，4℃储存，备用。
(二)NMP22抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
本发明实施例中，NMP22单克隆抗体，购于Abnova，偶联到Europium Chelate PS-COOH上，直径100nm，步骤如下：
1.取0.1ml Europium Chelate PS-COOH，浓度为10mg/ml，加入1.5ml离心管中，离心，20000rpm，20 分钟，去除上清液。
2.加1.2ml 20mM pH6.0 MES缓冲液到离心管中，悬浮荧光微球。
3.离心，20000rpm，20分钟，去除上清液。
4.加0.2ml上述MES缓冲液含5mM EDC和10mM Sulfo-NHS到离心管中，混均，25℃，反应30分钟
5.再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中。
6.离心，20000rpm，20分钟，去除上清液。
7.加0.2ml pH7.0 PBS含40ug NMP22单克隆抗体到上述离心管中，25℃，反应2小时。
8.加20ul 200mM Tris，pH7.4到离心管中，25℃，反应30分钟。
9.加1.2ml Tris缓冲液，20mM Tris，pH7.4，0.2％BSA，0.01％Tween-20到离心管中。
10.离心，20000rpm，20分钟，去除上清液。
11.用上述Tris缓冲液悬浮NMP22抗体-荧光微球，4℃储存，备用。
(三)处理样品垫和结合垫
本发明选用玻璃纤维MF1样品垫，购于GE Healthcare，浸泡在样品垫处理液，50mMTris，pH8.0，0.5％ BSA，0.2％Tween-20，0.01％NaN3，室温下，1小时，再30℃，烘干8小时，干燥封闭，备用。
本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫，购于EMD Millipore，浸泡在结合垫处理液，20mM Tris，pH7.5，5mM NaCl，0.5％BSA，0.1％PVP，5％Sucrose，0.2％Tween-20，0.01％NaN3，室温下，1小时，再30℃，烘干8小时，干燥封闭，备用。
(四)喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
1.用Tris缓冲液，20mM Tris，pH 7.5，10mM NaCl，1.0％BSA，10％Sucrose，0.1％PVP，0.2％Tween20，稀释MCM5抗体-铕螯合物荧光微球到0.12mg/ml，稀释NMP22抗体-铕螯合物荧光微球到0.15mg/ml。用 XYZ三维划膜喷金仪(HM3035)，购于上海金标科技生物有限公司，微定量喷头方式，5ul/cm速度，将MCM5 抗体-荧光微球和NMP22抗体-荧光微球喷涂到GFDX结合垫上，30℃，烘干6小时，干燥封存，备用。
2.用磷酸缓冲液，10mM NaPO4，pH7.5，2％Sucrose，调节MCM5抗体，购于NovusBiologicals，到2.0mg/ml，调节NMP22抗体，购于MyBioSource，到2.0mg/ml，调节抗鼠IgG抗体到1.5mg/ml。将硝酸纤维素膜放在XYZ三维划膜喷金仪(HM3035)上，用微定量划线方式，0.8ul/cm速度，将上述3个抗体液分别喷涂到硝酸纤维素膜上形成T1线，T2线和C线，两线间距5mm，30℃，烘干8小时，干燥封存备用。
(五)组装免疫层析试纸卡
试纸条组装在湿度小于30％，25-37℃房间进行。免疫层析试纸条，看图1免疫层析试纸条示意图，包括 PVC底板及沿底板长度方向顺次粘覆于底板上的22mm样品垫、10mm结合垫、25mm硝酸纤维素膜、30mm吸水纸；其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔MCM5抗体涂层形成T1线、NMP22抗体涂层形成T2线和由抗鼠IgG抗体涂层形成C线；结合垫喷涂有MCM5抗体-铕螯合物荧光微球和NMP22抗体- 铕螯合物荧光微球。
本发明实施例中，T1线与T2线平行设置，T1线与T2线之间的距离为5mm，T2线与C线平行设置，T2线与C线之间的距离为5mm。
吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近C线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。
结合垫位于硝酸纤维素膜靠近T1线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。
样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，重叠长度为3mm；样品垫重叠在结合垫上方。
将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm试纸条。
将上述试纸条装入壳底座中，合上壳面，构成试纸卡，如图2，壳面上设置有加样孔(9)检测窗口(10)，露出试纸条局部区域；加样孔位于样品垫(2)上部，露出部分样品垫区域；检测窗口位于硝酸纤维素膜 (4)上部，以露出全部T1线(5)，T2线(6)和C线(7)。
(六)制备细胞裂解液和MCM5/NMP22校准品
1.制备细胞裂解液
50mM Tris，pH8.0，10mM NaCl，0.5％BSA，1.0％Tritox-100，0.02％NaN3作为细胞裂解液。
2.制备MCM5/NMP22校准品
Tris缓冲液，50mM Tris，pH7.5，1.0mM EDTA，1.0mM DTT，20mM NaCl，0.5％BSA，0.2％PVP，0.2％Urea， 0.01％Tween-20，0.02％NaN3，稀释MCM5浓度到0，5，10，20，40，80ng/ml，稀释NMP22浓度到0，5， 10，20，40，80ng/ml，作为MCM5/NMP22校准品。
二.免疫荧光分析仪检测MCM5和NMP22浓度过程
(一)MCM5/NMP22免疫层析试剂盒操作过程
取10ml尿样品加到离心管中，离心，3000rpm，5分钟，去除上清液，留下离心管底部沉淀物；加120ul 细胞裂解液到离心管底部沉淀物中，溶解沉淀物，3000rpm，离心5分钟，取120ul上清液，加到 MCM5/NMP22免疫层析试纸卡样品孔中，反应5-20分钟，用免疫荧光分析仪，选定激发波长365nm，检测波长610nm，测定试纸条卡T1线，T2线及C线相对荧光强度单位(Relative fluorescence units，RFU)。
(二)建立免疫荧光分析仪检测MCM5和NMP22浓度系统
1.建立MCM5和NMP22浓度标准曲线
20ul MCM5/NMP22校准品与100ul细胞裂解液混合，加到MCM5/NMP22免疫层析试纸卡样品孔中，进行膜层析反应，5-20分钟后，用免疫荧光分析仪测定试纸条卡T1线，T2线及C线的RFU。以MCM5校准品浓度为纵坐标，T1线RFU为横坐标，制备MCM5校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝0.0017x-2.3832， R2＝0.9969，看图3MCM5浓度与RFU相关曲线，通过此标准曲线得到MCM5浓度标准卡，作为对样品中含 MCM5浓度进行定量分析依据。
Figure RE-GSB0000188084700000061
以NMP22校准品浓度为纵坐标，T2线RFU为横坐标，制备NMP22校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝0.0024x -2.8132，R2＝0.9985，看图4NMP22浓度与RFU相关曲线，通过此标准曲线得到NMP22浓度标准卡，作为对样品中所含NMP22浓度进行定量分析依据。
Figure RE-GSB0000188084700000071
输入上述标准卡到免疫荧光分析仪，建立免疫荧光分析仪自动显示检测样品中MCM5和NMP22浓度系统。
2.测定MCM5/NMP22免疫层析试剂盒重复性和准确度
制备成40ng/ml的MCM5和40ng/ml NMP22校准品作为样本，用上述免疫层析试剂盒重复测定MCM5/NMP22 样本15次，分别计算平均值(M)和标准差(SD)，SD/Mx100％＝变异系数(CV)，(1-M/样本浓度)x100％＝相对偏差(Bias)，结果见下表。
Sample MCM5 NMP22
39.2 41.63
38.25 40.38
38.34 41.85
39.15 40.46
40.21 42.51
39.28 41.19
37.18 40.36
38.48 39.64
39.35 40.28
38.26 41.62
37.62 40.83
39.47 41.17
37.18 42.05
39.31 40.69
38.72 41.37
M 38.66667 41.06867
SD 0.8783 0.7835
CV 2.30％ 1.90％
Bias 3.30％ -2.50％
MCM5的CV为2.3％，Bias为3.3％，NMP22的CV为1.9％，Bias为-2.5％，说明此MCM5/NMP22免疫层析试剂盒重复性和准确度良好。
3.MCM5/NMP22免疫层析试剂盒检测尿中MCM5和NMP22浓度
取10ml尿液加到离心管中，离心，3000rpm，5分钟，去除上清液，留下离心管底部沉淀物；加120ul细胞裂解液到离心管底部沉淀物中，溶解沉淀物，3000rpm，离心5分钟；取120ul上清液加到MCM5/NMP22 免疫层析试纸卡加样孔中，进行膜层析反应，5-20分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测MCM5和NMP22浓度，结果如下：
尿液标本 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RFU 748 945 1168 847 2794 1819 838 4638 31467 21457
MCM5 0ng/ml 0ng/ml 0ng/ml 0ng/ml 2.3ng/ml 0.7ng/ml 0ng/ml 5.5ng/ml 51ng/ml 34ng/ml
RFU 682 859 745 13589 926 3548 943 2754 19871 16584
NMP22 0ng/ml 0ng/ml 0ng/ml 30ng/ml 0ng/ml 5.7ng/ml 0ng/ml 3.8ng/ml 45ng/ml 37ng/ml

Claims (7)

1.一种快速定量检测MCM5/NMP22免疫层析试剂盒，主要成分为免疫层析试纸条，由PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述的结合垫吸附MCM5抗体-微球和NMP22抗体-微球；所述硝酸纤维素膜上固定有MCM5抗体形成检测线1(T1线)，固定有NMP22抗体形成检测线2(T2线)，固定抗IgG抗体形成质控线(C线)。
2.MCM5/NMP22免疫层析试剂盒含细胞裂解液，20-200mM Tris，pH7.0-9.0，0-200mMNaCl，0.1-1.0％Tritox-100，0.01-0.1％NaN3。
3.根据权利要求1所述的微球有荧光微球，彩色微球，金标微球，磁性微球及上转换发光微球，本发明选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光微球。
4.根据权利要求1所述的微球，表面修饰官能团为氨基、羧基、羟基或环氧基的一种，微球直径为100-300nm，本发明选用直径100nm和200nm，羧基修饰的微球。
5.根据权利要求1所述MCM5抗体和NMP22抗体标记荧光微球制备过程，步骤如下：
(1)用碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；(2)加入MCM5抗体或NMP22抗体进行偶联反应；(3)加入Tris液终止偶联反应；(4)洗涤后，用Tris缓冲液悬浮MCM5抗体-荧光微球和NMP22抗体-荧光微球，2-8℃，保存备用。
6.MCM5/NMP22荧光免疫层析试剂卡制备过程，步骤如下：
(1)制备MCM5抗体-荧光微球和NMP22抗体-荧光微球液，喷涂到结合垫上，在25-37℃条件下，干燥4-12小时；(2)制备检测线和质控线：将MCM5抗体液，NMP22抗体液及抗IgG抗体液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T1线，T2线和C线，在25-37℃条件下，干燥4-12小时；(3)免疫层析试纸条组装：PVC底板上依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，形成试纸板，将试纸板切割成3-5mm试纸条；(4)将上述试纸条装入外壳中，形成免疫层析试纸卡。
7.根据权利要求1所述的MCM5/NMP22免疫层析试剂盒，同时检测尿液中MCM5和NMP22浓度，用于筛查早期膀胱癌及监测膀胱癌的预后和复发。
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