CN116731181B - 抗人cd10蛋白的兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体的轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5‑7所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明制备得到的兔单克隆抗体与CD10蛋白结合的特异性高，亲和力好，在免疫检测CD10蛋白时具有高准确性和良好的可靠性，能够适用于多种病理组织和细胞样本中CD10蛋白的检测，为免疫学检测研究组织或细胞中的人CD10蛋白的分布、表达或生物学功能提供了有效的抗体原材料。

Description

抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD10，又被称为急性淋巴细胞白血病抗原(Common acute LymphoblasticLeukemia Antigen，CALLA)，是一种分子量为110kDa的锌依赖性细胞膜金属蛋白酶，能水解疏水性氮基酸的α-氨基所形成的肽键，产生以苯丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸为第一位残基的多肽，底物包括脑啡肽、缓激肽、血管紧张素Ⅰ/Ⅱ、神经降压肽、催产素、P物质以及趋化肽(甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸三肽)等；CD10广泛分布于肾、肝、小肠、胎盘、脉络丛、脑、生殖腺、肾上腺皮质和淋巴结的生发中心B细胞以及乳腺和涎腺的肌上皮细胞等，在肾脏和肠道上皮细胞的刷缘上高度表达。此外，CD10在多种肿瘤中呈阳性表达，例如生发中心及其来源的肿瘤、子宫内膜间质肿瘤以及肾近曲小管及其来源的肿瘤，在卵巢透明细胞癌、Wolffian肿瘤、肌上皮瘤、胰腺实性假乳头状肿瘤均可见阳性。CD10常用于滤泡淋巴瘤与其它低度恶性中、小B细胞淋巴瘤的鉴别诊断，以及肾透明细胞癌与其它来源的透明细胞癌、子宫内膜间质肉瘤与子宫平滑肌肉瘤的鉴别诊断，还可用来标记乳腺肿瘤的基底膜，从而确定基底膜是否被浸润。鉴于CD10是一个在多组织中表达且与多种肿瘤相关的细胞表面抗原，开发特异性好、灵敏度高的抗CD10抗体用于实现人CD10蛋白的检测对相关肿瘤的诊断和预后判断具有重要的指导意义。
临床上通常采用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)实验检测肿瘤细胞和组织中相应抗原的表达情况，技术核心为特异性结合该抗原的单克隆抗体，抗体性能的优劣直接决定着检测结果的可靠性和精度。然而，市面上高特异性的抗CD10蛋白的抗体较少，能够应用免疫组织化学检测的则更少，因此，开发特异性强、具备良好CD10蛋白结合能力的单克隆抗体已成为亟待解决的问题，对进一步研究CD10的功能和作用机制以及对CD10抗原靶点在相关疾病研究进行细胞和组织定位具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中抗人CD10蛋白抗体的特异性差、难以用于免疫学检测尤其是免疫组织化学检测等问题，本发明提供了抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体在制备人CD10蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5-7所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示。
进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
进一步地，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体。
本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。
进一步地，所述重组载体的出发载体为哺乳动物表达载体pBR322。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的重组载体或者所述宿主细胞的基因组中整合有如上所述的核酸分子。
进一步地，所述宿主细胞为人肾上皮细胞293F细胞。
本发明第五方面提供了如上所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体、如上所述的宿主细胞在制备人CD10蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
进一步地，免疫检测方法为酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞分析法中的一种或多种。
本发明的优点及积极效果为：
本发明制备得到的兔单克隆抗体与CD10蛋白结合的特异性高，亲和力好，在免疫检测CD10蛋白时具有高准确性和良好的可靠性，能够适用于多种病理组织和细胞样本中CD10蛋白的检测，为免疫学检测研究组织或细胞中的人CD10蛋白的分布、表达或生物学功能提供了有效的抗体原材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1表达纯化所得的重组人CD10蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图2为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的哺乳动物出发载体的图谱，从左至右分别为预先携带重链恒定区和抗体轻链恒定区的pRB322载体图谱；
图3为本发明实施例2兔单克隆抗体4D8与不同细胞样本结合的免疫印迹检测结果图；
图4为本发明实施例3利用兔单克隆抗体4D8通过免疫组织化学法检测人肝组织样本中CD10蛋白的特异性定位和表达情况；
图5为本发明实施例3利用兔单克隆抗体4D8通过免疫组织化学法检测人扁桃体组织样本中CD10蛋白的特异性定位和表达情况；
图6为本发明实施例3利用对照阳性抗体通过免疫组织化学法检测人肝组织样本中CD10蛋白的特异性定位和表达情况；
图7为本发明实施例3利用对照阳性抗体通过免疫组织化学法检测人扁桃体组织样本中CD10蛋白的特异性定位和表达情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
在本发明的上下文中，术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”等类似词语具有相同含有，可互换使用，均指特异性结合人(Human)CD10蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，CDR由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
术语“抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)”是抗体分子中可以与抗原结合的区域，其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和一个恒定区片段)组成，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc′片段。F(ab′)2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备单链抗体(scFv)一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，在临床诊断和治疗上应用广泛。
术语“可变片段(Fv)”位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。
术语“单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)“是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成的最小抗体片段，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以来自单一物种，例如兔，或者可以是嵌合的或人源化的抗体，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”抗体是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的结构、来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明利用哺乳动物表达系统表达得到的具有生物活性的重组人CD10蛋白为抗原免疫兔子，之后基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗CD10蛋白的兔单克隆抗体的重链和轻链序列，将编码重链、轻链的核酸连接至表达载体中后，转化宿主细胞并培养，最后通过亲和纯化得到抗CD10兔单克隆抗体。相较于传统的通过获得杂交瘤细胞再制备腹水得到抗体的方法，本发明采用重组表达载体制备抗体，有更高的保存稳定性，更易于扩大生产量。
抗体的生物学功能在于抗体的互补决定区(CDR)与抗原决定簇之间的空间构象互补，因此，CDR序列的长度和氨基酸组成极大决定了抗体结合抗原的特异性和亲和力。本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以特异性识别重组表达以及人血清或组织细胞表面的天然CD10蛋白，通过蛋白印迹法检测表达CD10蛋白的阳性细胞样本(人Burkitt′s淋巴瘤细胞株Daudi和Raji)和不表达人CD10蛋白的阴性细胞样本(人骨肉瘤细胞U-2OS)，发现仅在阳性细胞中检测出单一条带且条带清晰、无拖带，表明抗体具有高特异性，进一步由免疫组织化学法检测多个表达CD10蛋白的组织，其能够准确检测出所有23个阳性样本，与对照用的市售阳性抗体的检测结果吻合率高达100％，证实该抗体在免疫检测CD10蛋白具有高准确性和良好的可靠性，能够适用于多种病理组织和细胞样本中CD10蛋白的检测，为免疫学检测研究组织或细胞中的人CD10蛋白的分布、表达或生物学功能提供了有效的抗体原材料，特别是用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明的兔单克隆抗体的VL的氨基酸序列SEQ ID NO.3所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。
示例性地，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。对应地，包含所述轻链恒定区的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含所述重链恒定区的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，本发明的兔单克隆抗体可以为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括但不限于：(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fv片段，由抗体的一个重链可变区和一个轻链可变区构成；(iv)(Fv)2片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fv片段，一个重链可变区和一个轻链可变区通过接头连接形成；(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接成。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。
本发明的抗体片段具有氨基酸序列如SEQ ID NO.5-10所示的CDR区，更优选地具有氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的可变区，能够保留完整的抗原识别和结合部位，进而与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。
用来制备抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体的免疫原为重组人CD10蛋白，其采用哺乳动物细胞表达系统表达得到，人CD10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体。
核酸分子可以是DNA形式(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(例如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或是非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当序列较长时，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链和轻链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
本发明另一实施例提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。
构建所述重组载体的出发载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子也可以别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，以及显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明再一实施例提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的重组载体或者所述宿主细胞的基因组中整合有如上所述的核酸分子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离以得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，上述所述的重组载体的出发载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明实施例还提供了如上所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体、如上所述的宿主细胞在制备人CD10蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
所述抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备人CD10蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
本发明的抗体可以单独使用，也可以与可检测标记物(为检测目的)结合或偶联。用于检测目的的可检测标记物包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在免疫检测时，将本发明的抗体作为抗原结合抗体(捕获抗体)，其特异性识别和结合待检样本中的CD10蛋白，之后通过与其连接的可检测标记物产生可识别的信号变化，或者通过偶联有可检测标记物的检测抗体特异性结合本发明的抗体以产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测人CD10蛋白。本发明提供的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体能够用于建立特异性好、准确性高的免疫学检测方法。
可选地，免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)和流式细胞分析(Flow Cytometry，FC)。
在较佳的实施方式中，所述免疫检测方法为免疫印迹法或免疫组织化学法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体的制备
1、抗原制备
本实施例选择人CD10蛋白(SwissProt：P08473；NP No：NP_000893.2)的胞外活性区域结合其特异性区域、抗原表位、二级结构和三级结构，最终选取人CD10蛋白第52位(含)至第750位(含)氨基酸片段(以下简称：人CD10蛋白52-750aa)为抗原区域，将人CD10蛋白52-750aa构建至pYURK-RaFC载体，之后将pYURK-RaFC载体转入293F细胞，在293F细胞中表达出具有生物活性的重组人CD10蛋白，作为免疫原。具体包括以下步骤：
1)质粒构建：使用包含人CD10 cDNA的文库(武汉爱博泰克生物科技有限公司)为模板，以一对特异性引物扩增人CD10蛋白第52位至第750位目的片段；PCR反应体系包括：1μL模板，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，25μL 2×Gloria Hi-Fi PCR Master Mixwith GC Buffer(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20705)，22μL纯水(N.FH2O)；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行30次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
其中，人CD10蛋白52-750aa的核酸序列如下：
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDIL
RDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATE
NWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYY
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PILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNG
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RIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGA
AVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDG
DLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAY
RAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIG
TLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW(见SEQ ID NO.11)。
扩增人CD10蛋白52-750aa引物对的核酸序列如下：
CD10-F：5′-GGCAAGGGAGGTGGCGGATCATACGATGATGGTATTTGCAAGTCAT-3′(见SEQ IDNO.12)；
CD10-R：5′-CGGCCAAGCTGGGGATCCTTACCAAACCCGGCACTTCTTT-3′(见SEQ IDNO.13)。
将扩增的PCR产物纯化后，采取同源重组的方式装载在表达载体上，所使用的真核表达载体为pYURK-RaFC(N端)，经测序验证之后保存质粒，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
2)蛋白表达：稀释293F细胞使其体积为285mL，细胞密度为1.1×106cells/mL，按照每摇瓶95mL细胞悬液分装，转染前混匀细胞并取样计数，当细胞密度达到2.2×106cells/mL时将携带人CD10蛋白52-750aa核酸序列的pYURK-RaFC(N端)转染进细胞中。
3)蛋白纯化：采用FC亲和纯化方法获得抗CD10蛋白单克隆抗体重组蛋白。包括：
孵育：纯水冲洗灭菌的10mL纯化柱管1-2次，移液器吸取1mL Protein A基质(购自天地人和，货号SA023100)加入纯化柱管中，待乙醇流完后纯水清洗6个柱体积(纯化柱中基质的体积)，之后用Binding Buffer平衡6个柱体积，将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm、4℃条件下孵育过夜。
流穿：孵育结束，配平离心，600rpm、4℃离心10min，将离心后的上清倒入新离心管中，同时留约5mL上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完。
洗杂与洗脱：纯化柱管中加入6mL Binding Buffer洗柱，洗脱基质中的杂蛋白并收集流出液。预先加入0.1mL的1M Tris HCl(pH 9.0)用于调节蛋白溶液的pH，加入1mLWashing Buffer洗柱，洗下与基质结合的蛋白并收集流出液，收集管均放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测，直到G250不变蓝，结束Washing Buffer预洗脱。预先加入0.1mL的1M Tris HCl(pH 9.0)用于调节蛋白溶液的pH，加入1mL Elution Buffer洗柱，洗下与基质结合的蛋白并将流出液收集，收集管均放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。
制样：按照20μL蛋白和20μL 2×loading bufffer制样，分别将收集的流穿液与洗脱液进行SDS-PAGE电泳。
结果如图1所示，从左至右，泳道1为marker，泳道2为2μg BSA，泳道3和4为2μg浓缩后流穿液，泳道5和6为2μg浓缩后洗脱液。由图1中的结果可以看出：CD10蛋白52-750aa表达在上清液中，得到的蛋白量为2mL，蛋白浓度为1.23mg/mL，纯度为95％。
2、动物免疫
以上述纯化所得重组人CD10蛋白(52-750aa)为免疫原，免疫2只日本大耳白兔，每只白兔免疫300μg，首次免疫后每间隔3周取150μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人CD10蛋白的滴度，并将最后一次免疫后血清纯化成抗体，利用WB和IHC检测相应样本，取血清滴度高且检测最好的兔子，用150μg免疫原皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物，取脾脏。
3、分离和培养脾脏中B淋巴细胞
分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司，货号64010-00-100)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
B淋巴细胞的分选和培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。
4、编码兔单克隆抗体基因的克隆
收集能够识别和结合人CD10蛋白的B淋巴细胞阳性克隆，裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司，货号R1100-250)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来，并经测序确定序列。PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL2×GloriaHiFi(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL H2O。PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
上述所述的正向引物和反向引物的核酸序列如下所示：
VL-F：5′-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3′(SEQ ID NO.14)；
VL-R：5′-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3′(SEQ ID NO.15)；
VH-F：5′-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3′(SEQ ID NO.16)；
VH-R：5′-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3′(SEQ ID NO.17)。
将扩增得到的cDNA进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，得到如SEQ ID NO.3所示的轻链可变区(VL)氨基酸序列和如SEQ ID NO.4所示的重链可变区(VH)氨基酸序列；之后查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)获得恒定区的序列，得到如SEQ IDNO.1所示的轻链和如SEQ ID NO.2所示的重链，并将抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体命名为4D8，4D8涉及的具体序列见表1。
表1本发明的兔单克隆抗体4D8的氨基酸序列信息汇总
5、兔单克隆抗体4D8的生产和纯化
为了获得多株识别人CD10蛋白的兔单克隆抗体，将挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322预先携带轻链和重链恒定区，其表达图谱见图2，图中，pRB322origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(左图)，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(右图)。具体方法步骤如下：
将含兔单克隆抗体CH和CL的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，将上述扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将上游具有信号肽编码基因的VL基因和VH基因构建到表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染后培养72-96h，培养获得包含针对人CD10蛋白的兔单克隆抗体的上清液。
需要说明的是，本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，具体可参见专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”或“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
使用protein A亲和凝胶树脂从培养上清液中纯化出识别人CD10蛋白的兔单克隆抗体4D8，亲和层析实验步骤包括：将培养上清转移至灭菌的50mL离心管中，1000g、4℃(或常温)离心10min，收集上清液；将预处理后的Protein A Agarose(购自天地人和，货号SA023100)悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育室温3-4h或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将Protein AAgarose悬浮液转移到吸附柱中，常温离心1min，使固液分离，收集流穿液。加入十倍柱体积的洗涤缓冲液(磷酸缓冲液，pH为7.0)并重新悬浮颗粒，离心收集洗杂液，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入洗脱缓冲液(柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0)，离心获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋(购自索莱宝，货号YA1070)中，透析过夜，得到的抗体浓度为0.62mg/mL，体积为4mL，纯度大于95％，收取抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
实施例2针对兔单克隆抗体4D8的免疫印迹分析(Western blot，WB)
细胞培养：在48孔细胞培养板中，传代培养细胞，当汇合度处于70-80％时，吸出培养液上清，使用PBS溶液小心清洗细胞两次，备用。细胞包括高表达CD10的阳性细胞(人Burkitt′s淋巴瘤细胞株Daudi和Raji)和不表达人CD10蛋白的阴性细胞(人骨肉瘤细胞U-2OS)样本。
免疫印迹实验：将上述细胞分别裂解，得到蛋白提取液，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后按常规操作在电转移系统中将凝胶上的蛋白带转移到PVDF膜上，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入纯化后的兔单克隆抗体4D8(1：1000稀释)，4℃孵育过夜；之后用TBST洗膜后，加入1：200000稀释的羊抗兔二抗(Alexa594AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))，室温孵育1h；再次用TBST洗膜，加入ECL超敏显色液，显影，结果见图3。
CD10蛋白全长为750aa，理论分子量为86kd，蛋白表面有2个磷酸化修饰位点，6个二硫键，6个糖基化修饰位点，对其大小有一定影响，结合CST、RD公司WB检测结果，预估CD10分子量为100kd。由图3可以看出，100KD处有明显单一条带，且仅在阳性样本Daudi和Raji细胞株中检测出相应条带，说明筛选得到的兔单克隆抗体4D8特异性较高，与CD10蛋白的亲和力好。
实施例3针对兔单克隆抗体4D8的免疫组织化学分析
1、芯片选择
人CD10蛋白在人组织中广泛分布，选择TMA000-24-H_1.30病理芯片(自制)，包含人扁桃体、人卵巢、人肝、人结外NK/T细胞淋巴瘤、人结肠浸润性腺癌、人子宫内膜样癌、人肝细胞癌、人前列腺腺癌、人高级别尿路上皮癌、人卵巢浆液性癌、人肝胆管癌、人恶性胶质瘤、人乳腺、人宫颈、人肺、人脑(神经元)、人乳腺浸润性导管癌、人宫颈鳞状细胞癌、人肺鳞癌、人小细胞肺癌、人胎盘、人子宫内膜间质肉瘤、人肺腺癌共计23个样本，均为表达CD10蛋白的阳性样本。
2、免疫组织化学法(IHC)染色及分析
IHC实验的操作参见TMA000-24-H_1.30病理芯片说明书，具体包括如下步骤：
样本准备和烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中，将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min；前述的脱蜡液1-3购自无锡市江原实业技贸有限公司；
抗原修复：0.01M Tris-EDTA修复液(pH9.0)高压热修复；
内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温孵育10min；
封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时；
一抗孵育：除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS工作液稀释的兔单克隆抗体4D8(一抗稀释比1：1000)，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(购自Dako公司，货号K5007)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的二抗工作液，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
显色：在切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后，将切片浸入大量蒸馏水中终止显色，终止显色后，将切片入流水中清洗10min；
复染：将稍沥干的组织切片浸入Mayer’s苏木素复染1min，之后用流水清洗3min；
返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；
脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54-58℃)下完全干燥；
封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；
最后进行切片扫描。
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性，其中阳性表达信号必须在相应细胞和组织特定的抗原部位有棕黄色着色才能视为阳性。本实施例中CD10蛋白特异性定位在细胞膜和细胞质中，在组织中广泛表达，在相应组织的细胞膜和细胞质显色为棕黄色判定为阳性结果。切片扫描结果显示，在23个阳性样本中均有特异性染色，部分阳性结果展示见图4-5，相应组织采用对照阳性抗体检测的结果见图6-7，其中图4和6分别为人肝(human liver)采用兔单克隆抗体4D8和对照阳性抗体的检测结果，图5和7分别为人扁桃体(human tonsil)采用兔单克隆抗体4D8和对照阳性抗体的检测结果，从图中可以看出兔单克隆抗体4D8定位在细胞核、细胞质中，呈现清晰的棕黄色染色且无非特异性染色，特异性高，背景干净。
进一步根据市售的对照抗体(购自基因科技，货号GT200429克隆GM106)染色情况计算吻合率(A)，判定抗体分级情况：优，A≥90％；良，90％＞A≥85％；中好，85％＞A≥75％；中(一般)，75％＞A≥50％；差，50％＞A≥25％；阴性，25％＞A≥0％。本发明的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体4D8与对照抗体吻合率(A)为23/23＝100％。
总的来说，结合免疫印迹和免疫组化的结果，证实本发明提供的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体能够特异的识别重组表达的以及细胞表面的天然人CD10蛋白，而且在检测时无非特异性染色，能够有效避免假阳性结果，可满足病理样本的高准确性和高精度检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区，轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5-7所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
4.根据权利要求3所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；
所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1或2所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；
所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
6.一种核酸分子，其特征在于，用于编码如权利要求1-5任一项所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体。
7.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求7所述的重组载体或者基因组中整合有如权利要求6所述的核酸分子。
9.如权利要求1-5任一项所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体在制备人CD10蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的抗人CD10蛋白的兔单克隆抗体在制备人CD10蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用，其特征在于，免疫检测方法为酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞分析法中的一种或多种。
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