JP2023510589A - ＨＢｃＡｇの検出方法及び抗体 - Google Patents
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Abstract
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）検出分野において、二重抗体サンドイッチ法を使用する手段によってＨＢｃＡｇを検出する方法、並びにＨＢｃＡｇを検出するための抗体及びキットが開示され、また、組織又は細胞試料におけるＨＢｃＡｇの免疫学的検出において使用され得るモノクローナル抗体も含まれる。
Description
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）検出の分野に関する。特に、本発明は、二重抗体サンドイッチ法を使用することによるＨＢｃＡｇの検出方法、並びに検出のために使用される抗体及びキットを提供する。本発明はまた、組織又は細胞試料のＨＢｃＡｇ免疫学的検出のために使用され得るモノクローナル抗体も提供する。
Ｂ型肝炎ウイルス感染、特に慢性ＨＢＶ感染は、世界的に最も重要な公衆衛生問題の１つである（非特許文献１）。
現在のところ、ＨＢＶ血清マーカー（例えばＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂのＢ型肝炎血清学的試験）が、進行中のＨＢＶ感染及び過去のＨＢＶ感染に関して、ルーチンの検出標準として広く使用されている。しかし、突然変異率が高いこととＨＢＶキャリアーが多数であることとが組み合わさった結果、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｅＡｂ、及びＨＢｃＡｂの慣用的なＢ型肝炎血清学的試験には、偽陰性が高率で生じる。さらに、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｅＡｂ及びＨＢｃＡｂのＢ型肝炎血清学的試験は、ウイルス複製及び感染力の度合いを定量的に反映できず、しばしば疑わしく、説明が困難な結果を生じ、また、試験された個体がＨＢＶに感染しているかどうかを直接決定できない。
ＨＢＶ ＤＮＡは、ＨＢＶ複製の直接の指標であり、そのドットブロット試験（又はＰＣＲ試験）は、Ｂ型肝炎患者及びＨＢＶキャリアーにおける感染及び感染力を判断するための判断基準である。ＰＣＲ試験及びドットブロット試験はどちらも、ＨＢＶ感染及び感染力の直接指標として使用され得るが、これらは大規模スクリーニング及びルーチンの使用に適していない。
ＨＢＶ ＤＮＡに非常に関連し得る、全ての血清マーカー抗原（ＨＢＶプレＳ１、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｘＡｇ、ＤＮＡＰ、ＨＢＶプレＳ２等）のうち、ＨＢｃＡｇは、常に、ＨＢＶ ＤＮＡに直接関連する抗原と見なされてきており、ＨＢｃＡｇの検出は、複製性ウイルスの定量化、並びにＨＢｓＡｇ陰性ＨＢＶ感染患者及びＨＢＶ患者の診断に特有の重要性を有する。現在のところ、市場では、特異的ＨＢｃＡｇ検出試薬は開発されていない。報告されているか又は開発されているＨＢｃＡｇ免疫診断試薬は、通常、検出前の試料の前処理（ウイルス溶解、膜の破裂及びＨＢｃＡｂの不活性化）又はＨＢｃＡｇ－ＨＢｃＡｂ免疫複合体の検出を採用する。しかし、前者の方法は複雑な処置であり、臨床の顧客には容易には許容されず、血液ドナーの大規模スクリーニング及び疫学的調査には適していない一方、後者の方法は、検出法の特殊性のため、理想的な特異度及び感度を達成することが困難である。２００６年、特許文献１において、ｓＡｇ抗体を使用した後、膜を破壊し、ウイルスを溶解させ、ＨＢｃＡｇ検出のためコア粒子中のｃＡｇを検出することによって、ウイルス粒子が捕捉されたことが報告されたが、その感度は満足のいくものではなかった。
Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2;359(14):1486-1500
単純、正確で高感度のＨＢｃＡｇ発光検出試薬を開発することは、抗ウイルス有効性及びＨＢＶ患者の予後の評価において、喫緊の実用的な重要性を有する。
広範な実験研究後、本発明者らは、予期せぬことに、特定のエピトープに結合する一対の抗体を発見したが、これらは二重抗体サンドイッチ法によるＨＢｃＡｇの検出に特に適したものであった。これに基づいて、本発明者らは、新規ＨＢｃＡｇ定量的検出キット及び検出法を開発した。この検出法は、ＤＮＡ法のものに匹敵するレベルの感度に到達し、迅速でハイスループットの検出を実現するため、大きな臨床適用価値を有する。
キット
したがって、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）第１の抗体、第１の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第１の抗体を発現する組換え細胞であって、第１の抗体がＨＢｃＡｇタンパク質の１５０位～１８３位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片より選択される、第１の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
（ｉｉ）第２の抗体、第２の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第２の抗体を発現する組換え細胞であって、第２の抗体がＨＢｃＡｇタンパク質の１４１位～１５４位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片より選択される、第２の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
を含むキットを提供する。
したがって、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）第１の抗体、第１の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第１の抗体を発現する組換え細胞であって、第１の抗体がＨＢｃＡｇタンパク質の１５０位～１８３位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片より選択される、第１の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
（ｉｉ）第２の抗体、第２の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第２の抗体を発現する組換え細胞であって、第２の抗体がＨＢｃＡｇタンパク質の１４１位～１５４位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片より選択される、第２の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
を含むキットを提供する。
本明細書において、「ＨＢｃＡｇタンパク質の１５０位～１８３位に含まれるエピトープ」という表現、又は類似の表現は、エピトープがＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸１５０～アミノ酸１８３内にあるか又はこれと重複して存在することを意味する。言い換えると、ＨＢｃＡｇタンパク質の１５０位～１８３位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｃＡｇタンパク質又はその断片のアミノ酸１５０～アミノ酸１８３に特異的に結合可能な抗体又はその抗原結合断片である。
或る特定の例示的な実施の形態において、ＨＢｃＡｇタンパク質は、配列番号１７に示される配列を有する。
或る特定の実施の形態において、第２の抗体は、ＨＢｃＡｇタンパク質の１４１位～１５２位に含まれるエピトープに特異的に結合可能な抗体又はその抗原結合断片より選択される。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体は、以下の抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号３に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号４に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号５に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号６に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号７に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号８に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉ）配列番号１に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号２に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
より選択される。
（ｉ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号３に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号４に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号５に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号６に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号７に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号８に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉ）配列番号１に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号２に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
より選択される。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体は、
（ａ）（ｉ）配列番号１に示される配列、（ｉｉ）配列番号１に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号２に示される配列、（ｖ）配列番号２に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号２に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
（ａ）（ｉ）配列番号１に示される配列、（ｉｉ）配列番号１に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号２に示される配列、（ｖ）配列番号２に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号２に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
或る特定の実施の形態において、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される置換は保存的置換である。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨ、及び配列番号２に示される配列を有するＶＬを含む。
或る特定の実施の形態において、第２の抗体は、以下の抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１１に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１２に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１３に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１４に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉ）配列番号９に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１０に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
より選択される。
（ｉ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１１に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１２に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１３に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１４に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉ）配列番号９に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１０に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
より選択される。
或る特定の実施の形態において、第２の抗体は、
（ａ）（ｉ）配列番号９に示される配列、（ｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に示される配列、（ｖ）配列番号１０に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号１０に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
（ａ）（ｉ）配列番号９に示される配列、（ｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に示される配列、（ｖ）配列番号１０に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号１０に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
或る特定の実施の形態において、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される置換は保存的置換である。
或る特定の実施の形態において、第２の抗体は、配列番号９に示される配列を有するＶＨ、及び配列番号１０に示される配列を有するＶＬを含む。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、重鎖定常領域（ＣＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、マウス重鎖定常領域とマウス軽鎖定常領域とを含む。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＡ抗体である。或る特定の実施の形態において、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、ＩｇＧ抗体である。
或る特定の実施の形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群より選択される。
或る特定の実施の形態において、抗体はネズミ抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
いくつかの実施の形態において、第２の抗体は検出可能標識を有する。
他の実施の形態において、キットは、第２の抗体に特異的に結合可能な第３の抗体を更に含み、第３の抗体は検出可能標識を有する。
本明細書において使用される場合、検出可能標識は、蛍光、分光、光化学、生化学、免疫学、電気、光学又は化学手段によって検出可能な、任意の物質であり得る。こうした標識が、免疫学的検出（例えば酵素連結イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ等）に適していることが特に好ましい。こうした標識は、当該技術分野に既知であり、限定されるわけではないが、酵素（例えばセイヨウワサビ（horseradish）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性核種（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドット又はシアニン誘導体（例えばＣｙ７、Ａｌｅｘａ ７５０））、化学発光物質（例えばアクリジニウムエステル化合物）、及び上記標識によって修飾されたアビジン（例えばストレプトアビジン）に結合するためのビオチンを含む。本発明によって含まれる標識は、当該技術分野に知られる方法によって検出され得る。例えば、放射性標識は、写真フィルム又はシンチレーション計算装置を使用して検出可能であり、蛍光標識は、放出された光を検出する光検出装置を使用して検出可能である。酵素標識は、一般的に、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生じる反応産物を検出することによって検出される。比色標識は、着色標識を単純に視覚化することによって、検出される。化学発光物質（例えばアクリジニウムエステル化合物）は、典型的には、トリガー溶液及び／又は触媒を発光物質に提供することによって放出された光で検出される。ビオチンは、典型的には、上記のような標識によって修飾されたアビジン（例えばストレプトアビジン）をビオチンに提供し、ビオチンに連結されたアビジンが所持する標識を検出することによって検出される。或る特定の実施の形態において、上述のような検出可能標識は、潜在的な立体障害を減少させるため、多様な長さを有するリンカーを通じて、本発明の抗体又はその抗原結合断片に付着され得る。
或る特定の実施の形態において、検出可能な標識は、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えばアクリジニウムエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンより選択される。
或る特定の実施の形態において、キットは、対応する検出可能標識の検出を可能にするための試薬を更に含み得る。例えば、検出可能標識が酵素である場合、キットは、対応する酵素のための色素原性物質、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼのためのо－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳ若しくはルミノール化合物、又はアルカリホスファターゼのためのｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）若しくはＡＭＰＰＤを更に含み得る。例えば、検出可能標識が化学発光試薬（例えばアクリジニウムエステル化合物）である場合、キットは、化学発光のためのプレトリガー溶液及び／又はトリガー溶液を更に含み得る。
或る特定の実施の形態において、キットは、固形キャリアーを更に含む。或る特定の実施の形態において、固形キャリアーは、ポリマー材料（例えば塩化ポリビニル、ポリスチレン、ポリアクリルアミド又はセルロース）で作製されたか若しくはコーティングされたウェルプレート、試験管、ビーズ（例えばラテックス粒子）若しくは膜（例えばニトロセルロース膜）、又は官能基（例えばアミノ、カルボキシル、ビオチン又はアビジン）でプレコーティングされた磁気ビーズを含む。或る特定の実施の形態において、固形キャリアーは、磁気ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えばマイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）より選択される。
或る特定の実施の形態において、キットは、固形キャリアー上に第１の抗体をコーティングするためのコーティング試薬、例えばコーティング緩衝剤（例えば、炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝剤、又はホウ酸緩衝剤）を更に含む。固形キャリアー上にタンパク質又はポリペプチドをコーティングする方法は当該技術分野に既知であり、例えば物理的吸着、アミン化若しくはカルボキシル化表面を介した共有カップリング、又はアビジン－ビオチン系、ポリリジンプレコーティング表面、プロテインＡ若しくはプロテインＧプレコーティング表面によって仲介される結合を含む。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体は、固形キャリアー表面上にコーティングされる。
或る特定の実施の形態において、キットは、別個のコンテナ中に、又は単一コンテナユニットの別個の区画中に、少なくとも固形キャリアーと第１の抗体とを含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、キットは、第１の抗体と、検出可能標識を有する第２の抗体とを含む。或る特定の例示的な実施の形態において、キットは、固形キャリアー表面上にコーティングされた第１の抗体と、検出可能標識を有する第２の抗体とを含む。或る特定の例示的な実施の形態において、キットは、１種類以上の第１の抗体と、検出可能標識を有する二次抗体とを含む。或る特定の例示的な実施の形態において、キットは、固形キャリアー表面上にコーティングされた１種類以上の第１の抗体と、検出可能標識を有する二次抗体とを含む。或る特定の実施の形態において、第１の抗体の更なる種類は、ＨＢｃＡｇタンパク質の１５０位～１８３位に含まれる、異なるエピトープを認識する。
或る特定の実施の形態において、キットは、ＨＢＶビリオンを溶解するための溶解剤を更に含む。本明細書において、ＨＢＶビリオンを溶解するための溶解剤は、デーン粒子を溶解して（すなわちウイルスエンベロープを破壊して）、ＨＢｃＡｇ抗原を露出することが可能な任意の作用物質を指す。こうした作用物質は、当業者に知られ、例えば表面活性剤、例えばＮＰ４０、ＬＤＳ又はＳＤＳを含む。
或る特定の実施の形態において、溶解剤は、ＬＤＳ又はＳＤＳを含む。或る特定の実施の形態において、キットは、中和剤を更に含み、中和剤はＣＨＡＰＳを含む。或る特定の実施の形態において、溶解剤は、２０％ＬＤＳ又は２０％ＳＤＳを含む。或る特定の実施の形態において、溶解剤は、２０％ＬＤＳ又は２０％ＳＤＳ及び平衡のための水（balance water）を含む。或る特定の実施の形態において、中和剤は１０％ＣＨＡＰＳを含む。或る特定の実施の形態において、中和剤は、１０％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ ＰＢＳを含む。或る特定の実施の形態において、中和剤は、１０％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ ＰＢＳ、及び平衡のための水を含む。
或る特定の実施の形態において、キットは、標準（例えば、ＨＢｃＡｇの異なる既知の量を含む一連の試料）、陽性対照試料（例えば、ＨＢｃＡｇの既知の量を含む試料）、陰性対照試料（例えば、ＨＢｃＡｇを含まない試料）、ＨＢＶウイルスを溶解するための溶解剤（及び任意選択で中和剤）、及び試験しようとする試料の収集及び保管のためのデバイス（例えば血液収集デバイス）からなる群より選択される１つ以上の試薬又はデバイスを更に含む。
抗体の調製
第１の態様に記載される第１の抗体及び第２の抗体は、当該技術分野に知られる多様な方法によって、例えば遺伝子操作組換え技術によって、調製され得る。例えば、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、化学合成又はＰＣＲ増幅によって得られ得る。生じたＤＮＡ分子を発現ベクター内に挿入して、次いで宿主細胞内にトランスフェクションしてもよい。次いで、トランスフェクションされた宿主細胞を、特定の条件下で培養して、本発明の抗体を発現させてもよい。
第１の態様に記載される第１の抗体及び第２の抗体は、当該技術分野に知られる多様な方法によって、例えば遺伝子操作組換え技術によって、調製され得る。例えば、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、化学合成又はＰＣＲ増幅によって得られ得る。生じたＤＮＡ分子を発現ベクター内に挿入して、次いで宿主細胞内にトランスフェクションしてもよい。次いで、トランスフェクションされた宿主細胞を、特定の条件下で培養して、本発明の抗体を発現させてもよい。
第１の態様に記載される抗原結合断片は、インタクトな抗体分子の加水分解によって得られ得る（Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照されたい）。或いは、これらの抗原結合断片はまた、組換え宿主細胞によって直接産生されてもよい（Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999)、Little et al., Immunol. Today, 21:364-370 (2000)によって概説される)。例えば、Ｆａｂ’断片は宿主細胞から直接得られてもよく、Ｆａｂ’断片は化学的にカップリングされて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)）。さらに、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片はまた、組換え宿主細胞の培地から直接単離され得る。これらの抗原結合断片を調製するための他の技術は、当業者に既知である。
したがって、第２の態様において、本発明は、
（ｉ）第１の抗体、第１の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第１の抗体を発現する組換え細胞であって、第１の抗体が第１の態様におけるように定義される、第１の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
（ｉｉ）第２の抗体、第２の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第２の抗体を発現する組換え細胞であって、第２の抗体が第１の態様におけるように定義される、第２の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
を含む、キットを提供する。
（ｉ）第１の抗体、第１の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第１の抗体を発現する組換え細胞であって、第１の抗体が第１の態様におけるように定義される、第１の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
（ｉｉ）第２の抗体、第２の抗体をコードする単離核酸分子、単離核酸分子を含むベクター、又は第２の抗体を発現する組換え細胞であって、第２の抗体が第１の態様におけるように定義される、第２の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
を含む、キットを提供する。
或る特定の実施の形態において、ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターである。或る特定の実施の形態において、ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ等である。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体を発現する組換え細胞は、第１の抗体をコードする単離核酸分子又は単離核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞であり、第２の抗体を発現する組換え細胞は、第２の抗体をコードする単離核酸分子又は単離核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。こうした宿主細胞には、限定されるわけではないが、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）細胞、並びに真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞等）が含まれる。或る特定の実施の形態において、本発明の宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ（例えばＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＤＧ４４）である。
或る特定の実施形態において、第１の抗体を発現する組換え細胞は、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２であり、第２の抗体を発現する組換え細胞は、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７である。
検出法及び使用
第３の態様において、本発明は、試料中のＨＢｃＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出する方法であって、
（１）第１の抗体と試料を接触させて、抗体－抗原複合体を形成する工程であって、第１の抗体が第１の態様におけるように定義される、工程と、
（２）第２の抗体と抗体－抗原複合体を接触させて、抗体－抗原－抗体複合体を形成する工程であって、第２の抗体が第１の態様におけるように定義される、工程と、
（３）抗体－抗原－抗体複合体の量を決定する工程と、
を含む、方法を提供する。
第３の態様において、本発明は、試料中のＨＢｃＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出する方法であって、
（１）第１の抗体と試料を接触させて、抗体－抗原複合体を形成する工程であって、第１の抗体が第１の態様におけるように定義される、工程と、
（２）第２の抗体と抗体－抗原複合体を接触させて、抗体－抗原－抗体複合体を形成する工程であって、第２の抗体が第１の態様におけるように定義される、工程と、
（３）抗体－抗原－抗体複合体の量を決定する工程と、
を含む、方法を提供する。
この方法を、診断目的で、又は非診断目的で使用してもよい。或る特定の実施の形態において、本発明の方法は、非診断目的のために使用される。こうした実施の形態において、試験される試料は、ＨＢｃＡｇを含むことが知られており、すなわち、試料の被験体は、本発明の方法による検出の前に診断されており、したがって、本発明の方法は、試料の診断には役立たない。したがって、本発明の方法の直接の目的は、試料の被験体の診断結果を得ることではなく、既知の診断情報を伴う試料に対する更なる正確で定量的な検出を実行することである。
いくつかの実施の形態において、第２の抗体は検出可能標識を有する。或る特定の実施の形態において、工程（３）に記載される決定は、（３ａ）検出可能標識の量を検出する工程と、（３ｂ）工程（３ａ）で得られた検出可能標識の量と、ＨＢｃＡｇの既知の量と検出可能標識の量との間の関係の標準曲線とを比較して、それによってＨＢｃＡｇの含量を得る工程とを含む。或る特定の実施の形態において、工程（３）で記載される決定は、（３ａ）検出可能標識の量（例えば発光値）を検出する工程と、（３ｂ）工程（３ａ）で得られた検出可能標識の量（例えば発光値）と、カットオフ値とを比較して、比が１未満である場合、試料は陰性と見なされ、比が１以上である場合、試料はＨＢｃＡｇ陽性と見なされる工程とを含む。或る特定の実施の形態において、検出可能標識がアクリジニウムエステル化合物である場合、カットオフ値は９０００である。
他の実施の形態において、第２の抗体は検出可能標識を持たない。こうした実施の形態において、工程（３）で記載される決定は、検出可能標識を有する第３の抗体を使用して、抗体－抗原－抗体複合体を検出することを含む。或る特定の実施形態において、第３の抗体は、第２の抗体に特異的に結合可能である（例えば第２の抗体の定常領域に特異的に結合可能である）。或る特定の実施の形態において、工程（３）で記載される決定は、（３ａ）抗体－抗原－抗体複合体を、検出可能標識を有する第３の抗体と接触させる工程と、（３ｂ）検出可能標識の量を決定する工程と、（３ｃ）工程（３ｂ）で得られた検出可能標識の量と、ＨＢｃＡｇの既知の量と検出可能標識の量との間の関係の標準曲線とを比較し、それによってＨＢｃＡｇの含量を得る工程とを含み得る。或る特定の実施の形態において、工程（３）で記載される決定は、（３ａ）抗体－抗原－抗体複合体を、検出可能標識を有する第３の抗体と接触させる工程と、（３ｂ）検出可能標識の量（例えば発光値）を検出する工程と、（３ｃ）工程（３ｂ）で得られた検出可能標識の量（例えば発光値）と、カットオフ値とを比較して、比が１未満である場合、試料は陰性と見なされ、比が１以上である場合、試料はＨＢｃＡｇ陽性と見なされる工程とを含む。或る特定の実施の形態において、検出可能標識がアクリジニウムエステル化合物である場合、カットオフ値は９０００である。
或る特定の実施の形態において、検出可能標識は、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えばアクリジニウムエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンからなる群より選択される。
或る特定の実施の形態において、工程（３）では、決定は、酵素イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイより選択される。
或る特定の実施の形態において、工程（１）の前に、方法は、試料を処理する工程を更に含み、処理は、試料と溶解剤を混合して、ウイルスを溶解させることを含む。或る特定の実施の形態において、処理は、溶解反応を中和剤で終結させることを更に含む。
或る特定の実施の形態において、溶解剤、中和剤は、第１の態様におけるように定義される。
或る特定の実施の形態において、第１の抗体は、固形キャリアーの表面上にコーティングされる。或る特定の実施の形態において、固形キャリアーは、磁気ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えばマイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）からなる群より選択される。
或る特定の実施の形態において、工程（２）及び／又は工程（３）の前に、洗浄工程が更に含まれる。洗浄工程は未反応物質を除去し得る。
或る特定の実施の形態において、試料は、全血、血漿、及び血清より選択される。
別の態様において、本発明はまた、試料中のＨＢｃＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出するための検出キット製造における、第１の態様に従ったキットの使用にも関する。
或る特定の実施の形態において、キットを使用して、第３の態様に従った方法によって、試料中のＨＢｃＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出する。
２Ａ７ ｍＡｂ及びその使用
組織又は細胞試料のＨＢｃＡｇ免疫学的検出（例えば免疫組織化学又は免疫蛍光）で現在使用される抗ＨＢｃＡｇ抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、検出感度を改善し得るが、しばしば、高いバックグラウンド及びより低い特異性等の欠点を有し、免疫組織化学結果の標準化が困難である。しかし、組織又は細胞試料におけるＨＢｃＡｇの免疫学的検出のための抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の使用に関する報告はない。
組織又は細胞試料のＨＢｃＡｇ免疫学的検出（例えば免疫組織化学又は免疫蛍光）で現在使用される抗ＨＢｃＡｇ抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、検出感度を改善し得るが、しばしば、高いバックグラウンド及びより低い特異性等の欠点を有し、免疫組織化学結果の標準化が困難である。しかし、組織又は細胞試料におけるＨＢｃＡｇの免疫学的検出のための抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の使用に関する報告はない。
本発明者らは予期せぬことに、組織又は細胞試料におけるＨＢｃＡｇの免疫学的検出に適したモノクローナル抗体を見出し、このモノクローナル抗体に基づく検出効果は、市販のポリクローナル抗体のものと匹敵するレベルに到達可能であり、これは驚くべき、予期せぬことであり、非常に好ましい技術的効果である。
したがって、第４の態様において、本発明はまた、ＨＢｃＡｇに特異的に結合可能なモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片が、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１１に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１２に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１３に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１４に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、又は、
（ｉｉ）モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１０に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義されるか、又は、
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体が、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７によって産生されるモノクローナル抗体である、
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（ｉ）モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片が、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１１に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１２に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１３に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１４に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、又は、
（ｉｉ）モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１０に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義されるか、又は、
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体が、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７によって産生されるモノクローナル抗体である、
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
或る特定の実施の形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）（ｉ）配列番号９に示される配列、（ｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に示される配列、（ｖ）配列番号１０に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号１０に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
（ａ）（ｉ）配列番号９に示される配列、（ｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号９に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に示される配列、（ｖ）配列番号１０に示される配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号１０に示される配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
或る特定の実施の形態において、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される置換は保存的置換である。
或る特定の実施の形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９に示される配列を有するＶＨ、及び配列番号１０に示される配列を有するＶＬを含む。
或る特定の実施の形態において、モノクローナル抗体は、重鎖定常領域（ＣＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。或る特定の実施の形態において、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＡ抗体である。
或る特定の実施の形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群より選択される。或る特定の実施の形態において、モノクローナル抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
別の態様において、本発明はまた、試料中のＨＢｃＡｇを検出するための試薬の製造における、第４の態様に従ったモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用にも関する。
或る特定の実施の形態において、試料は組織試料（例えば組織切片）又は細胞試料である。
或る特定の実施の形態において、検出は免疫学的検出である。或る特定の実施の形態において、免疫学的検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）及びウェスタンブロットからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能標識を有する。
別の実施の形態において、試料中のＨＢｃＡｇを検出するための試薬は、検出可能標識を有する二次抗体を更に含む。
或る特定の実施の形態において、二次抗体は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に含まれる定常領域が得られた種（例えばマウス）の抗体に特異的である。
或る特定の実施の形態において、二次抗体は、抗免疫グロブリン抗体、例えば抗ＩｇＧ抗体である。
或る特定の実施の形態において、検出可能標識は、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、蛍光色素、又はビオチンより選択される。
或る特定の例示的な実施の形態において、免疫学的検出が免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、又はウェスタンブロットより選択される場合、検出可能マーカーは酵素より選択される。
或る特定の例示的な実施の形態において、免疫学的検出が免疫蛍光（ＩＦ）より選択される場合、検出可能標識は蛍光色素より選択される。
用語の定義
本発明において、別に明記しない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるウイルス学、生化学、及び免疫学の実験処置は、全て、対応する分野で広く用いられるルーチンの処置である。一方、本発明のよりよい理解のために、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
本発明において、別に明記しない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるウイルス学、生化学、及び免疫学の実験処置は、全て、対応する分野で広く用いられるルーチンの処置である。一方、本発明のよりよい理解のために、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
本明細書で使用した際、「ＨＢｃＡｇ」という用語は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のコア抗原を指し、これはヌクレオカプシドタンパク質としても知られ、当業者に既知である（例えばＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫデータベース寄託番号第ＧＵ３５７８４２．１号を参照されたい）。ＨＢｃＡｇタンパク質は、ＶＬＰ組み立てに関与する組み立て領域をＮ末端に、アルギニンリッチドメイン（Arginine Rich Domain、ＡＲＤ）をＣ末端に含む。
本明細書で使用した際、ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列に言及する際には、配列番号１７に示される配列を使用して記載される。例えば、「ＨＢｃＡｇのアミノ酸残基１５０～１８３」という表現は、配列番号１７に示されるポリペプチドの１５０位～１８３位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者は、突然変異又は変異（限定されるわけではないが、置換、欠失及び／又は付加を含む、例えば異なる遺伝子型又はサブ遺伝子型（subgenotypes）のＨＢｃＡｇ）は、生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然に生成され得るか、又はＨＢｃＡｇのアミノ酸配列中に人工的に導入され得ることを理解する。したがって、本発明において、「ＨＢｃＡｇ」という用語は、例えば配列番号１７に示される配列及びその天然又は人工変異体を含む、全てのこうした配列を含むものとする。さらに、ＨＢｃＡｇの配列断片を記載する際、配列番号１７の配列断片だけではなく、その天然又は人工変異体における対応する配列断片もまた含む。例えば、「ＨＢｃＡｇのアミノ酸残基１５０～１８３」という表現は、配列番号１７のアミノ酸残基１５０～１８３、及びその変異体（天然又は人工）中の対応する断片を含む。本発明に従って、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、最適整列、すなわち最高の同一性パーセントを得るための配列の整列のために比較される配列の同等の位置に位置する断片を指す。
本明細書において使用される場合、巨大球体粒子としても知られる「デーン粒子」という用語は、二重層構造を持つインタクトな感染性Ｂ型肝炎ウイルス粒子を指す。ＨＢｃＡｇは、通常、デーン粒子のコア中に存在する。したがって、ＨＢｃＡｇを検出するためには、典型的には、ＨＢｃＡｇが露出され遊離し得るように、デーン粒子の外殻をまず溶解する必要がある。
本明細書において使用される場合、「特異的結合」という用語は、２つの分子（すなわち結合分子及びターゲット分子）の間の非ランダム結合反応、例えば抗体と、抗体が向けられている抗原との間の反応を指す。２つの分子間の結合アフィニティは、ＫＤ値によって記載され得る。ＫＤ値は、モル濃度（Ｍ）として表される、ｋｄ（特異的結合分子－ターゲット分子相互作用の解離率、ｋｏｆｆとしても知られる）対ｋａ（特異的結合分子－ターゲット分子相互作用の会合率、ｋｏｎとしても知られる）の比、すなわちｋｄ／ｋａから得られる解離定数である。ＫＤ値が小さければ小さいほど、２つの分子間の結合はより緊密であり、アフィニティはより高い。或る特定の実施の形態において、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に対して特異的である抗体）は、約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ又はそれ未満のアフィニティ（ＫＤ）で抗原に結合する抗体を指す。ＫＤ値は、当該技術分野に既知の方法によって、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＢＩＡＣＯＲＥ装置中で決定され得る。
本明細書において使用される場合、「免疫学的アッセイ」という用語は、抗原と抗体との間の特異的相互作用／結合アフィニティを利用するアッセイを指し、こうしたアッセイは、一般的に、試料中の特異的抗原又は抗体の存在又はレベルを検出するために使用され得る。こうした免疫学的アッセイは、当業者に既知であり、限定されるわけではないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫比濁法、表面プラズモン共鳴法等を含む。免疫学的アッセイの詳細な説明に関しては、例えば、Fundamental Immunology, Ch. 7 Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y. (1989)を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、一般的に、各対が１つの軽鎖（ＬＣ）及び１つの重鎖（ＨＣ）を有する、２対のポリペプチド鎖で構成される免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ（カッパ）軽鎖及びλ（ラムダ）軽鎖と分類され得る。重鎖は、μ、δ、γ、α、又はεと分類され得て、したがって、抗体のアイソタイプは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与はせず、多様なエフェクター機能、例えば免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子と免疫グロブリンとの結合の仲介を示す。ＶＨ領域及びＶＬ領域はまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、非常に多様性のある領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗原結合部位を形成する。アミノ酸の領域又はドメインへの割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917の定義、又はChothia et al. (1989) Nature 342:878-883による定義に従い得る。
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合に関与する抗体の可変領域中のアミノ酸残基を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含む。これらのＣＤＲの正確な境界は、当該技術分野に知られる多様な番号付け系に従って、例えばＫａｂａｔ番号付け系（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け系（Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917、Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883）、又はＩＭＧＴ番号付け系（Lefranc et al. al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）に従って定義され得る。所定の抗体に関して、当業者は、各番号付け系によって定義されたＣＤＲを容易に同定するであろう。また、異なる番号付け系の間の対応は当業者に既知である（例えば、Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003を参照されたい）。
本発明において、本発明の抗体又はその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、当該技術分野に知られる多様な番号付け系に従って決定され得る。或る特定の実施の形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、好ましくは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴ番号付け系によって決定される。或る特定の実施の形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、好ましくはＫａｂａｔ番号付け系によって同定される。
本明細書において使用される場合、「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」残基という用語は、上に定義するようなＣＤＲ残基以外の抗体の可変領域中のアミノ酸残基を指す。
「抗体」という用語は、抗体を産生するいかなる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体は、組換え抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプのもの、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体であってもよい。
本明細書において使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体が結合するものと同じ抗原に特異的に結合する能力を保持する、及び／又は抗原に特異的に結合する全長抗体と競合する、全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、これはまた、「抗原結合部分」とも称される。一般的には、Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989)（全ての目的のためにその全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって、産生され得る。抗原結合断片の限定されない例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、ディアボディ、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、直線状（linear）抗体、ナノボディ（この技術はDomantisに由来する）、及びポリペプチドに特異的抗原結合能を与えるために十分な抗体の部分を少なくとも含むポリペプチドが含まれる。操作された抗体変異体は、Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136に概説される。
本明細書において使用される場合、「全長抗体」という用語は、２つの「全長重鎖」及び２つの「全長軽鎖」からなる抗体を指す。ここで、「全長重鎖」は、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン、重鎖定常領域ＣＨ３ドメインからなるポリペプチド鎖を指し、全長抗体がＩｇＥアイソタイプのものである場合、抗体は、任意選択で、重鎖定常領域ＣＨ４ドメインを含む。好ましくは、「全長重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチド鎖である。「全長軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるポリペプチド鎖である。全長抗体鎖の２対は、ＣＬとＣＨ１との間のジスルフィド結合及び２つの全長重鎖のＨＲ間のジスルフィド結合によって共に連結される。本発明の全長抗体は、単一種、例えばヒトに由来してもよく、また、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。本発明の全長抗体は、同じ抗原を特異的に認識する／同じ抗原に特異的に結合するＶＨ及びＶＬ対によって形成される２つの抗原結合部位を含む。
本明細書において使用される場合、「Ｆｄ」という用語は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指し、「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨドメインからなる抗体断片を指し（Ward et al., Nature 341:544546 (1989)）、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指し、「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を通じて連結された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指し、「Ｆａｂ’断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２断片中の２つの重鎖断片を連結するジスルフィド結合を還元することによって得られる断片を指し、インタクトな軽鎖及び重鎖Ｆｄ断片（ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる）からなる。
本明細書において使用される場合、「Ｆｖ」という用語は、抗体の１つのアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる抗体断片を意味する。Ｆｖ断片は、一般的に、完全抗原結合部位を形成し得る最小の抗体断片と見なされる。一般的に、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与えると考えられる。しかし、１つの可変領域のみ（例えば３つの抗原特異的ＣＤＲしか含まないＦｄ断片）は、インタクトな結合部位よりもおそらくより低いアフィニティではあるが、抗原を認識して抗原に結合することが可能である。
本明細書において使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、抗体の第１の重鎖の第２の定常領域及び第３の定常領域と、第２の重鎖の第２の定常領域及び第３の定常領域とを、ジスルフィド結合によって連結することによって形成される抗体断片を指す。抗体のＦｃ断片は、多くの異なる機能を有するが、抗原結合には関与しない。
本明細書において使用される場合、「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨがリンカーによって連結されている、単一ポリペプチド鎖を指す（例えばBird et al., Science 242:423-426 (1988)、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)、及びPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Eds. Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい）。こうしたｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有し得る。適切な従来技術のリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４又はその変異体を含むリンカーが使用され得る（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）。本発明で有用な他のリンカーが、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731、Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061に記載され、Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56及びRoovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載される。いくつかの場合、ジスルフィド結合はまた、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にも存在し得る。
本明細書において使用される場合、「ディアボディ」という用語は、そのＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、使用されるリンカーが、同じ鎖の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎ、それによって、ドメインが、別の鎖の相補ドメインとの対形成を強いられて、２つの抗原結合部位を生じるものを意味する（例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)、及びPoljak RJ et al, Structure 2:1121-1123 (1994)を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」という用語は、当業者に一般的に理解される意味を有し、全長抗体が結合するものと同じ抗原に特異的に結合する能力を保持する、単一単量体可変抗体ドメイン（例えば単一重鎖可変領域）で構成される抗体断片を指す。単一ドメイン抗体はまた、ナノボディとしても知られる。
前述の抗体断片は各々、全長抗体が結合するものと同じ抗原に特異的に結合する能力、及び／又は抗原への特異的結合に関して、全長抗体と競合する能力を保持する。
抗体の抗原結合断片（例えば上述の抗体断片）は、当業者に知られる慣用技術（例えば組換えＤＮＡ技術又は酵素的若しくは化学的断片化法）を使用して、所定の抗体（例えば本明細書に提供される抗体）から得ることができ、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体に関して使用されるものと同じ方式によって、特異性に関してスクリーニングされ得る。
本明細書において、正確に明記しない限り、用語「抗体」が言及される場合、抗体はインタクトな抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、その軽鎖及び／又は重鎖の部分が１つの抗体（特定の種由来であってもよく、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属していてもよい）由来である一方、軽鎖及び／又は重鎖の別の部分が別の抗体（同じ若しくは異なる種由来であってもよく、又は同じ若しくは異なる抗体クラス又はサブクラスに属してもよい）由来であるが、にもかかわらずターゲット抗原への結合活性をなお保持する、抗体を指す（Cabilly et al.に対する米国特許第４，８１６，５６７号、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)）。例えば、「キメラ抗体」という用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が第１の抗体（例えばネズミ抗体）由来であり、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が第２の抗体（例えばヒト抗体）由来であるような抗体（例えばヒト－ネズミキメラ抗体）を含み得る。
本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、遺伝子操作された非ヒト抗体を指し、こうした抗体のアミノ酸配列は、ヒト抗体の配列に対する相同性が増加するよう修飾されている。一般的に、ヒト化抗体のＣＤＲ領域の全て又は一部は、非ヒト抗体（ドナー抗体）由来であり、非ＣＤＲ領域（例えば可変ＦＲ及び／又は定常領域）の全て又は一部は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は、一般的に、限定されるわけではないが、抗原特異性、アフィニティ、反応性等を含む、ドナー抗体の予期される特性を保持する。ドナー抗体は、所望の特性（例えば抗原特異性、アフィニティ、反応性等）を持つ、ネズミ、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類（例えばカニクイザル（cynomolgus monkey））抗体であり得る。
本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上で調製されたネズミモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡは、ターゲットネズミハイブリドーマから得ることができ、標準的分子生物学技術を用いて、非ネズミ（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作され得る。
キメラ抗体を調製するため、当該技術分野に知られる方法を用いて、ネズミ免疫グロブリン可変領域を、ヒト免疫グロブリン定常領域に連結してもよい。例えば、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に機能可能であるように連結して、全長重鎖遺伝子を得てもよい。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野に知られ（例えば、Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的ＰＣＲ増幅によって得られ得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよいが、一般的に、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。例えば、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に機能可能であるように連結して、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）を得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野に知られ（例えば、Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって得られ得る。軽鎖定常領域は、κ定常領域又はλ定常領域であり得るが、一般的に、好ましくはκ定常領域である。
ヒト化抗体を調製するため、当該技術分野に知られる方法を使用して、ネズミＣＤＲ領域をヒトフレームワーク配列内に移植してもよい（例えば、Winterに対する米国特許第５，２２５，５３９号；Queen et alに対する米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号、並びにLo, Benny, KC, editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入可能である核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を発現可能である場合、ベクターは発現ベクターと称される。ベクターによって運ばれる遺伝物質要素が宿主細胞において発現され得るように、ベクターを形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入してもよい。ベクターは当業者に既知であり、限定されるわけではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、ファージ、例えばλファージ又はＭ１３ファージ及び動物ウイルスを含む。ベクターとして使用され得る動物ウイルスには、限定されるわけではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、限定されるわけではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御する多様な要素を含み得る。さらに、ベクターはまた、複製起点部位も含み得る。
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入することができる細胞を指し、大腸菌若しくは枯草菌（Bacillus subtilis）等の原核細胞、酵母細胞若しくはアスペルギルス等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞若しくはＳｆ９等の昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞若しくはヒト細胞等の動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較される２つの配列が、或る特定の部位に塩基又はアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々が或る特定の部位にアデニンを有するか、又は２つのポリペプチドの各々が或る特定の部位にリジンを有する）場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較される部位の総数に対する２つの配列で共通する同一の部位の数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位のうち６個が一致している場合、これら２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を有する（６個の部位のうち３個が一致している）。概して、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。かかるアラインメントは、Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.）等のコンピュータプログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いて決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムにより、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用い、ギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量を用いて決定することができる。
本明細書において使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの予期される特性に不都合に影響を及ぼさない、又はこうした特性を変化させないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当該技術分野に知られる標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ仲介突然変異誘発によって導入され得る。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を持つ別のアミノ酸残基、例えば対応するアミノ酸残基と物理的又は機能的に類似である（例えば類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学特性等を有する）残基で置換される置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野に定義されてきている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該技術分野に既知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)、Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)、及びBurks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)（これらは引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
本明細書に含まれる２０の慣用的アミノ酸は、慣用的使用に従って表記される。例えば、Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。本発明において、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同じ意味を有し、交換可能に用いられる。本発明において、アミノ酸は、一般的に、当該技術分野に既知である一文字及び三文字略語によって示される。例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａによって表され得る。
本明細書において使用される場合、「被験体」という用語は、限定されるわけではないが、多様な動物、特に哺乳動物、例えばヒトを含む。
本発明は、特異的抗体に基づくＨＢｃＡｇ検出のためのキット、及びキットに基づいて確立された二重抗体サンドイッチ法を提供する。従来技術と比較して、本発明の技術的解決は、ＤＮＡ法のものに匹敵する検出感度を達成することができ、大きな臨床適用価値を有する迅速なハイスループット検出を実現し得る。
さらに、本発明はまた、多様な組織又は細胞試料に関する免疫学的検出、例えば免疫組織化学及び免疫蛍光の分野で使用することができ、市販のポリクローナル抗体のものと類似の検出効果を有し、したがって広い適用可能性を有する、抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体も提供する。
本発明の実施形態を以下で図面及び実施例を参照して詳細に説明するが、当業者であれば、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な対象及び有利な態様は、当業者には添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
配列情報
本出願で言及されるいくつかの配列の情報を、以下の表に記載する。
本出願で言及されるいくつかの配列の情報を、以下の表に記載する。
生物学的物質の寄託
本発明は、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ、武漢大学、中国・武漢）に寄託されている、以下の生物学的物質に関する。
１）ＣＣＴＣＣ第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有し、寄託日が２０１９年１１月２８日である、ハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２、
２）ＣＣＴＣＣ第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有し、寄託日が２０１９年１１月２８日である、ハイブリドーマ細胞株２Ａ７。
本発明は、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ、武漢大学、中国・武漢）に寄託されている、以下の生物学的物質に関する。
１）ＣＣＴＣＣ第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有し、寄託日が２０１９年１１月２８日である、ハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２、
２）ＣＣＴＣＣ第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有し、寄託日が２０１９年１１月２８日である、ハイブリドーマ細胞株２Ａ７。
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
別に明記しない限り、本発明で使用される分子生物学実験法及びイムノアッセイは、基本的に、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及びFM Ausubel et al., Refined Laboratory Manual for Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照し、製品製造者によって推奨される条件に従って、制限酵素を使用した。実施例中で供給源を示されていない試薬は全て、当該技術分野で慣用的な試薬であるか、又は市販の入手可能な試薬である。当業者は、実施例が、例によって本発明を記載しており、保護されるよう求められるような本発明の範囲を限定することは意図されないことを認識する。
実施例１：ｃ１８３抗原の調製
１．１ Ｃ１８３クローン（その配列は配列番号１７に示された）を構築し、大腸菌発現系を用いることによって、Ｃ１８３Ｂ抗原を調製した。
１．１ Ｃ１８３クローン（その配列は配列番号１７に示された）を構築し、大腸菌発現系を用いることによって、Ｃ１８３Ｂ抗原を調製した。
１．２ Ｃ１８３抗原の精製
細菌液を収集し、超音波処理して、超音波処理した液体を１２０００ｒｐｍ及び１０℃で１０分間遠心分離し、上清を収集した。次いで、水槽中に６５℃で２０分間静置させ、上清を収集した。
細菌液を収集し、超音波処理して、超音波処理した液体を１２０００ｒｐｍ及び１０℃で１０分間遠心分離し、上清を収集した。次いで、水槽中に６５℃で２０分間静置させ、上清を収集した。
試料を１×ＰＢ７．４に対して透析し、その後、中程度の圧のＤＥＡＥ－ＦＦクロマトグラフィ（ＧＥ媒体）を行った。
ブレークスルーピーク溶液（ターゲットタンパク質）を収集した後、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００によって精製した。次いで、第１の試料ピークを収集した。
実施例２：抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体の調製
２．１ マウス免疫
２．１．１ 免疫原の調製。免疫原は、大腸菌で組換え的に発現されたＨＢｃＡｇ（Ｃ１８３抗原）タンパク質であった。組換え抗原を０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、等体積のフロイントのアジュバントと混合して、油中水エマルジョンを形成した（混合物が完全に乳化されたかどうかを判断する方法。混合物の小滴を水の表面上に滴下し、混合物が集積したままで分散しないならば、実質的にホモジナイズされていると見なした）。最初の免疫にフロイントの完全アジュバントを使用する一方、続くブースター免疫にはフロイントの不完全アジュバントを使用し、融合７２時間前の最後のブースター免疫に関しては、アジュバントを添加しなかった。
２．１ マウス免疫
２．１．１ 免疫原の調製。免疫原は、大腸菌で組換え的に発現されたＨＢｃＡｇ（Ｃ１８３抗原）タンパク質であった。組換え抗原を０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、等体積のフロイントのアジュバントと混合して、油中水エマルジョンを形成した（混合物が完全に乳化されたかどうかを判断する方法。混合物の小滴を水の表面上に滴下し、混合物が集積したままで分散しないならば、実質的にホモジナイズされていると見なした）。最初の免疫にフロイントの完全アジュバントを使用する一方、続くブースター免疫にはフロイントの不完全アジュバントを使用し、融合７２時間前の最後のブースター免疫に関しては、アジュバントを添加しなかった。
２．１．２ マウスの基本免疫。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、５００μＬ／マウス／時点の注射用量にて、上記免疫原を皮下マルチポイント注射することによって免疫し、後の力価決定のため、２００μＬの眼の静脈血を各免疫前に収集した。ブースター免疫を２週ごとに与えた。間接的ＥＬＩＳＡによって、血清力価を測定した。マウスの血清力価がプラトーに到達したら、免疫を停止し、融合まで２ヶ月間マウスを休ませた。
２．１．３ 融合７２時間前のブースター免疫（最終ブースト）。マウス脾臓細胞及びマウス骨髄腫細胞の融合７２時間前に、脾臓のブースター免疫を行った。このブースターのための免疫原はアジュバントを含まず、０．５ｍｇ／ｍＬ組換えタンパク質の１００μｌを注射した。脾臓免疫前に、マウスをエーテルで麻酔し、次いで、腹部皮膚を開いて脾臓を露出し、１００μＬの抗原を脾臓の長軸方向に沿って注射し、次いで、腹部切開を迅速に縫合した。
２．２ 融合ハイブリドーマの調製及びスクリーニング
融合７２時間前のブースター免疫後、マウス脾臓を採取して細胞懸濁物を作製し、マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０との融合に供して、ハイブリドーマ細胞を得た。その前にフィーダー細胞を調製した。ハイブリドーマ細胞の培養中、融合後の多数の骨髄腫細胞及び脾臓細胞は、１６４０－ＨＡＴ培地中で次々に死に、単一の細胞又はわずかな分散した細胞は生存が容易ではなく、したがって、他の細胞を添加して生存させる必要がある。添加される生存細胞はフィーダー細胞と称された。この実験室では、マウス腹腔マクロファージ又は１３日齢マウス胸腺細胞をフィーダー細胞として用いた。
融合７２時間前のブースター免疫後、マウス脾臓を採取して細胞懸濁物を作製し、マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０との融合に供して、ハイブリドーマ細胞を得た。その前にフィーダー細胞を調製した。ハイブリドーマ細胞の培養中、融合後の多数の骨髄腫細胞及び脾臓細胞は、１６４０－ＨＡＴ培地中で次々に死に、単一の細胞又はわずかな分散した細胞は生存が容易ではなく、したがって、他の細胞を添加して生存させる必要がある。添加される生存細胞はフィーダー細胞と称された。この実験室では、マウス腹腔マクロファージ又は１３日齢マウス胸腺細胞をフィーダー細胞として用いた。
２．２．１ マウスマクロファージの調製。以下の工程に従って行った。（ｉ）１匹の６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを頚椎脱臼（stretching neck）によって屠殺し、水道水でリンスし、７５％エタノール溶液中に５分間浸した。ウルトラクリーン作業台に腹部を上にしてマウスを置き、マウスの腹部皮膚をピンセットで持ち上げ、小さく切断し、大きなピンセットで皮膚を上方及び下方に裂き、腹部を完全に露出した。（ｉｉ）腹膜を無菌眼科鉗子で持ち上げ、次いで、５ｍＬシリンジで適切な量の培地を腹腔内に注入し、マウスの肢を別の無菌眼科鉗子でわずかに持ち上げ、最後にシリンジを用いて培地を吸引し、遠心管内に入れた。（ｉｉｉ）腹腔細胞液をＨＡＴ培地又はＨＴ培地中で溶解して、２×１０５／ｍＬの濃度でマクロファージフィーダー細胞を形成した。（ｉｖ）ウェルあたり０．１ｍＬで９６ウェル細胞培養プレートに添加し、インキュベーター中で培養するか、又は融合細胞と直接混合し、９６ウェル細胞培養プレートに添加することも可能であった。
２．２．２ マウス胸腺の調製。以下の工程に従って行った。（ｉ）１匹の１３日齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを頚椎脱臼によって屠殺し、水道水でリンスし、７５％エタノール溶液中に５分間浸した。ウルトラクリーン作業台に腹部を上にしてマウスを置いた。（ｉｉ）マウスの腹部皮膚を鉗子で持ち上げ、腹部及び胸部の外皮を切断した。（ｉｉｉ）別の対の清浄なハサミで胸腔を開き、乳白色の胸腺をピンセットで引き出し、２００メッシュの細胞篩を通じてホモジナイズ及び濾過に供して、胸腺フィーダー細胞液を得た。
２．２．３ マウス骨髄腫細胞の調製。以下の工程に従って行った。（ｉ）マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０－Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）は培養が容易であり、高い融合率を有するため、現在、最も理想的な融合細胞であるが、Ｓｐ２／０ハイブリドーマ細胞株は、ＮＳ－１よりも培養条件により感受性であり、過剰な希釈（３×１０５／ｍＬ未満の密度）及びアルカリｐＨ（７．３を超えるｐＨ）の条件では増殖が劣っていた。（ｉｉ）対数増殖期の細胞を融合用に選択した。（ｉｉｉ）融合前に、骨髄腫細胞を培養フラスコから遠心管内に移し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ×５分間）。細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地中に再懸濁し、計数した。（ｉｖ）一般的に、マウス骨髄腫細胞は融合の５日前に蘇生させるべきであり、各融合には約６つのフラスコの３５ｃｍ２ Ｓｐ２／０細胞が必要であった。
２．２．４ 免疫脾臓細胞の調製。以下の工程に従って行った。（ｉ）融合用のＢＡＬＢ／Ｃマウスの眼球を除去した後、放血によってマウスを屠殺し、収集した血液試料を抗血清にし、これは抗体検出用の陽性対照として使用可能であった。マウスを水道水でリンスし、７５％エタノール溶液中に５分間浸し、次いで、ウルトラクリーンベンチ中のマウス解剖板に右側臥位で置いた。（ｉｉ）腹腔を無菌的に開き、脾臓を取り出し、ハサミで切って小片にし、２００メッシュ細胞スクリーン上に置き、次いで、絞って、すりつぶし棒（grinding rod）（シリンジの内部コア）ですりつぶすと同時にＲＰＭＩ－１６４０培地をピペットで１滴ずつ添加した。（ｉｉｉ）適切な量のＲＰＭＩ－１６４０培地を補充し、３～５分間静置させ、上部懸濁物の２／３を５０ｍＬプラスチック遠心管に移した。上記プロセスを２～３回繰り返した。（ｉｖ）細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ×１０分間）。（ｖ）細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地中に再懸濁し、計数した。
２．２．５ ＰＥＧ仲介融合によるハイブリドーマの調製。以下の工程に従って行った。（１）融合前に、１ｍＬのＰＥＧ－１５００、１０ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０血清不含培地及び２００ｍＬの完全培地を３７℃にあらかじめ加熱した。（ｉｉ）調製された骨髄腫細胞及び脾臓細胞を、５０ｍＬ遠心管中で混合し（１×１０８脾臓細胞＋１×１０７骨髄腫細胞、約１０：１）、１５００ｒｐｍで８分間遠心分離した。遠心分離後、チューブの底を穏やかに弾いて細胞をほぐしてペーストを形成した。（ｉｉｉ）０．８ｍＬ（１×１０８脾臓細胞＋０．８ｍＬ ＰＥＧ）を１ｍＬピペットで遠心管に添加し、添加しながら穏やかに攪拌し、ＰＥＧを平均して６０秒以内に添加し、次いで３７℃にあらかじめ加熱した１０ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０完全培地を、穏やかに攪拌しながら添加した。最後に、ＲＰＭＩ－１６４０培地を４０ｍＬまで補充し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。（ｉｖ）上清を廃棄し、少量のＨＴ培地を添加して細胞を注意深く分散させ、調製したＨＴ培地内に細胞を移し、ウェルあたり０．１ｍＬで９６ウェル細胞培養プレートに添加し、ＣＯ２インキュベーター中で培養した。（ｖ）１２時間後、適切な量のＨＡＴ完全培地を調製し、各ウェルにウェルあたり０．１ｍＬを１滴ずつ添加した。５日後、ＨＴ完全培地を使用して、ウェル中の細胞上清の５０％～１００％を置換した。約９日～１４日後、検出のために上清を収集した。
２．２．６ ハイブリドーマのスクリーニング。間接的ＥＬＩＳＡをスクリーニングに使用し、１００ｎｇ／ｍＬの組換え抗原でのコーティングをウェルあたり０．１ｍＬで行い、次いで、５０μＬの細胞上清を検出のために添加し、陽性クローンウェルを選択した。
２．２．７ ハイブリドーマ細胞のクローニング。限界希釈法を使用することによって、細胞をまず、或る特定の濃度に従って連続希釈し、次いで、可能な限り多くのウェルで単一の細胞のみが増殖するように、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェル内に接種した。ハイブリドーマの陽性クローンは、１００％陽性となり、安定クローンと確認されるまで、一般的に２～３回のクローニングを必要とした。
２．３ モノクローナル抗体腹水の産生
２匹～３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に０．５ｍＬの液体パラフィン油を注入した。１週間後、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ハイブリドーマ細胞を血清不含培地に懸濁し、細胞の数を（１～２）×１０６／ｍＬに調整し、細胞０．５ｍＬを各マウスの腹腔内に注入した。７日～１０日後、マウス腹部は明らかに肥大しており、マウスを頚椎脱臼により屠殺し、水道水でリンスし、７５％エタノール中に５分間浸し、腹部を上にして、マウス解剖台上にマウスの肢を注射針で固定した。マウスの腹部皮膚をピンセットで持ち上げ、切断して小さい開口部を作り、次いで、マウスの両側部から背中まで切断して切開を行い、大きなピンセットで皮膚を上下に引き裂いて、腹部を完全に露出した。無菌眼科鉗子で腹膜を持ち上げ、腹膜中央に小さいスリットを作り、次いで、１ｍＬピペットを使用して、小さいスリットを通じて、腹腔中の全ての腹水を採取した。収集した腹水を混合し、遠心管中、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を収集した。
２匹～３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に０．５ｍＬの液体パラフィン油を注入した。１週間後、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ハイブリドーマ細胞を血清不含培地に懸濁し、細胞の数を（１～２）×１０６／ｍＬに調整し、細胞０．５ｍＬを各マウスの腹腔内に注入した。７日～１０日後、マウス腹部は明らかに肥大しており、マウスを頚椎脱臼により屠殺し、水道水でリンスし、７５％エタノール中に５分間浸し、腹部を上にして、マウス解剖台上にマウスの肢を注射針で固定した。マウスの腹部皮膚をピンセットで持ち上げ、切断して小さい開口部を作り、次いで、マウスの両側部から背中まで切断して切開を行い、大きなピンセットで皮膚を上下に引き裂いて、腹部を完全に露出した。無菌眼科鉗子で腹膜を持ち上げ、腹膜中央に小さいスリットを作り、次いで、１ｍＬピペットを使用して、小さいスリットを通じて、腹腔中の全ての腹水を採取した。収集した腹水を混合し、遠心管中、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を収集した。
２．４ モノクローナル抗体腹水の精製
硫酸アンモニウム沈殿、及びプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（GE、米国より購入）による精製によって、精製したモノクローナル抗体を得た。
硫酸アンモニウム沈殿、及びプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（GE、米国より購入）による精製によって、精製したモノクローナル抗体を得た。
上記方法により、以下のモノクローナル抗体：１Ｂ１１、２Ａ７、６Ｅ１、１４Ｃ６、１８Ｂ２－２、１４Ｃ７、５Ｈ４、１Ｆ９を得た。これらのうち、得られたハイブリドーマ細胞株２Ａ７及び１８Ｂ２－２を、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に上述のように寄託した。
実施例３：抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏエピトープ同定
３．１ ペプチド合成
ＨＢＶ配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＣＡＡ５９６６９．１を参照配列として使用して、３１個のポリペプチドを合成した（Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltdに委託）。これらの３１個のポリペプチド（ｓ１～ｓ３１）は共に、ＨＢｃＡｇの全長１８３アミノ酸を含んだ。Ｓ１～Ｓ３１のポリペプチド情報は以下の表１に示され、ＨＢｃＡｇの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ３５７８４２．１に示された。
３．１ ペプチド合成
ＨＢＶ配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＣＡＡ５９６６９．１を参照配列として使用して、３１個のポリペプチドを合成した（Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltdに委託）。これらの３１個のポリペプチド（ｓ１～ｓ３１）は共に、ＨＢｃＡｇの全長１８３アミノ酸を含んだ。Ｓ１～Ｓ３１のポリペプチド情報は以下の表１に示され、ＨＢｃＡｇの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ３５７８４２．１に示された。
３．２ ポリペプチドＳ１～Ｓ３１と、抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体との反応性の分析
３．２．１ 反応プレートの調製
ポリペプチドを、５０ｍＭ ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝剤、最終濃度５０ｍＭ、ｐＨ９．６）、ｐＨ９．６で、５μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、１００μＬのコーティング溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、２℃～８℃で１６時間～２４時間、次いで、３７℃で２時間、コーティングを行った。ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄を行い、次いで２００μＬのブロッキング溶液（２０％ウシ血清及び１％カゼインを含む２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液、ｐＨ７．４）を各ウェルに添加し、ブロッキングのため、３７℃で２時間静置させた。ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、後の使用のためにアルミニウムホイルの袋中、２℃～８℃で保管した。
３．２．１ 反応プレートの調製
ポリペプチドを、５０ｍＭ ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝剤、最終濃度５０ｍＭ、ｐＨ９．６）、ｐＨ９．６で、５μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、１００μＬのコーティング溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、２℃～８℃で１６時間～２４時間、次いで、３７℃で２時間、コーティングを行った。ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄を行い、次いで２００μＬのブロッキング溶液（２０％ウシ血清及び１％カゼインを含む２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液、ｐＨ７．４）を各ウェルに添加し、ブロッキングのため、３７℃で２時間静置させた。ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、後の使用のためにアルミニウムホイルの袋中、２℃～８℃で保管した。
３．２．２ 抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ検出
２．１で得られた抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体を、定性的ＥＬＩＳＡ検出のため、２０％新生ウシ血清を含むＰＢＳ溶液で、１μｇ／ｍＬに希釈した。
２．１で得られた抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体を、定性的ＥＬＩＳＡ検出のため、２０％新生ウシ血清を含むＰＢＳ溶液で、１μｇ／ｍＬに希釈した。
試料反応。ポリペプチドでコーティングされている３６枚のＥＬＩＳＡプレートを取り、各ウェルに１００μＬの希釈試料を添加し、インキュベーター中に入れて３７℃で３０分間反応させた。
酵素標識反応。試料反応工程が完了した後、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ）の１００μＬ反応溶液を各ウェルに添加し、インキュベーター中に入れて、３７℃で３０分間反応させた。
発色反応。酵素標識反応工程が完了した後、ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色剤（Beijing Wantai Bio-pharmaceutical Co., Ltd.より購入）を各ウェルに添加し、インキュベーター中に入れて、３７℃で１５分間反応させた。
反応終結及び読み取り値の測定。発色反応工程が完了した後、５０μＬの停止溶液（Beijing Wantai Bio-pharmaceutical Co., Ltd.より購入）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、各ウェルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレート読み取り装置によって測定した。
３６種類のポリペプチドと、抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体との反応性の判定。反応後の読み取り値に従って判定を行った。測定値／バックグラウンド値の比が５より大きい場合、陽性と判定された。
３．２．３ 抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体の認識特性の分析
結果を表２に示した。得られた抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体の認識タイプは（認識特性に従って）５つの群、すなわちｓＡ、ｓＢ、ｓＣ、ｓＤ、ｓＥに分けることができ、このうち、ｓＡ群抗体によって認識されるポリペプチドはＳ２９／Ｓ３０であり、２Ａ７、１４Ｃ６、及び１４Ｃ７はｓＡ群に属した。ｓＢ群抗体によって認識されるポリペプチドはＳ３１であり、１Ｆ９及び１８Ｂ２－２はｓＢ群に属した。ｓＣ群抗体によって認識されるポリペプチドはＳ１であり、ｓＤ群抗体によって認識されるポリペプチドはｓ２６、ｓ２７であり、ｓＥ群抗体によって認識されるポリペプチドはｓ１５及びｓ１６であった。
結果を表２に示した。得られた抗ＨＢｃＡｇマウスモノクローナル抗体の認識タイプは（認識特性に従って）５つの群、すなわちｓＡ、ｓＢ、ｓＣ、ｓＤ、ｓＥに分けることができ、このうち、ｓＡ群抗体によって認識されるポリペプチドはＳ２９／Ｓ３０であり、２Ａ７、１４Ｃ６、及び１４Ｃ７はｓＡ群に属した。ｓＢ群抗体によって認識されるポリペプチドはＳ３１であり、１Ｆ９及び１８Ｂ２－２はｓＢ群に属した。ｓＣ群抗体によって認識されるポリペプチドはＳ１であり、ｓＤ群抗体によって認識されるポリペプチドはｓ２６、ｓ２７であり、ｓＥ群抗体によって認識されるポリペプチドはｓ１５及びｓ１６であった。
対応するエピトープと抗体２Ａ７、１８Ｂ２－２の検出結果を表３に示し、この表は、２Ａ７のエピトープが１４１ａａ～１５２ａａにあり、１８Ｂ２－２のエピトープが１５０ａａ～１８３ａａにあることを示した。
実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏのエピトープ同定
４．１ 真核プラスミド構築
ＨＢＶ遺伝子のＨＢｃＡｇ配列及びそのＮ末端の－２９～－１の配列からなる、総数２２２アミノ酸を含む断片中の配列を、真核発現ベクター（ＥＨＲＰベクター、厦門大学、National Research Center of Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）中のＣＭＶプロモーター下流に構築し、その構造の模式図を図１に示し、ここで、Ｃ１４９～Ｃ１８３は、Ｃ末端からそれぞれの数字に対応するアミノ酸位まで一部切除された（truncated）ＨＢｃＡｇ配列（＋１位より始まる）を指し、ｐｃａ－Ｃ１８３は－２９～１８３断片を指し、ｐｃｂ－Ｃ１８３は－２０～１８３断片を指し、ｐｃｃ－Ｃ１８３は－１０～１８３断片を指した。
４．１ 真核プラスミド構築
ＨＢＶ遺伝子のＨＢｃＡｇ配列及びそのＮ末端の－２９～－１の配列からなる、総数２２２アミノ酸を含む断片中の配列を、真核発現ベクター（ＥＨＲＰベクター、厦門大学、National Research Center of Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）中のＣＭＶプロモーター下流に構築し、その構造の模式図を図１に示し、ここで、Ｃ１４９～Ｃ１８３は、Ｃ末端からそれぞれの数字に対応するアミノ酸位まで一部切除された（truncated）ＨＢｃＡｇ配列（＋１位より始まる）を指し、ｐｃａ－Ｃ１８３は－２９～１８３断片を指し、ｐｃｂ－Ｃ１８３は－２０～１８３断片を指し、ｐｃｃ－Ｃ１８３は－１０～１８３断片を指した。
４．２ 真核発現及びウェスタンブロット評価
２９３β５細胞を６ウェルプレートに入れ、接着１２時間後に細胞密度が約８０％～９０％に到達したら、トランスフェクションを行い、ｌｉｐｏ３０００トランスフェクション試薬を用いて、構築された真核発現プラスミドを２９３β５細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクション１２時間後に培地（ＤＭＥＭ＋１０％Ｇｉｂｃｏ ＦＢＳ）での置換を行い、培養を４８時間続けた。細胞上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３００μＬの細胞溶解溶液を各ウェルに添加し、４℃で１時間静置させて溶解を行った。溶解物を１．５ｍｌ ＥＰ試験管中に収集し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を清浄な１．５ｍｌ ＥＰ試験管内に収集し、溶解した試料をウェスタンブロット分析に供した（二次抗体はproteintec社より購入したヤギ抗マウスＨＲＰであった）。
２９３β５細胞を６ウェルプレートに入れ、接着１２時間後に細胞密度が約８０％～９０％に到達したら、トランスフェクションを行い、ｌｉｐｏ３０００トランスフェクション試薬を用いて、構築された真核発現プラスミドを２９３β５細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクション１２時間後に培地（ＤＭＥＭ＋１０％Ｇｉｂｃｏ ＦＢＳ）での置換を行い、培養を４８時間続けた。細胞上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３００μＬの細胞溶解溶液を各ウェルに添加し、４℃で１時間静置させて溶解を行った。溶解物を１．５ｍｌ ＥＰ試験管中に収集し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を清浄な１．５ｍｌ ＥＰ試験管内に収集し、溶解した試料をウェスタンブロット分析に供した（二次抗体はproteintec社より購入したヤギ抗マウスＨＲＰであった）。
４．３ 結果の分析
ｉｎ ｖｉｖｏ真核発現によって構築された、異なる長さの抗原を用いてモノクローナル抗体を評価し、結果を図２に示した。結果は、２Ａ７－２１の認識部位が１４１ａａ～１５２ａａであることを立証した。
ｉｎ ｖｉｖｏ真核発現によって構築された、異なる長さの抗原を用いてモノクローナル抗体を評価し、結果を図２に示した。結果は、２Ａ７－２１の認識部位が１４１ａａ～１５２ａａであることを立証した。
実施例５：二重抗体サンドイッチ法における、磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体及びアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体のスクリーニング
本実施例において、慣用的な二重抗体サンドイッチ法の実験条件を採用して、磁気ビーズをコーティングするためのモノクローナル抗体及びアクリジニウムエステルで標識するためのモノクローナル抗体の最適な対形成をスクリーニングした。
本実施例において、慣用的な二重抗体サンドイッチ法の実験条件を採用して、磁気ビーズをコーティングするためのモノクローナル抗体及びアクリジニウムエステルで標識するためのモノクローナル抗体の最適な対形成をスクリーニングした。
５．１ ＨＢｃＡｇ磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体の調製
磁気微粒子溶液を調製し、磁気微粒子は、１．５μｍ～３μｍの粒子サイズを持ち、表面上を親水性ポリマー及びカルボキシル基でコーティングされた磁気ビーズであった。調製法は以下の通りであった。１：１：１の質量比の磁気微粒子、ＥＤＣ及びＮＨＳに、ｐＨ５．０の５０ｍＭ ＭＥＳ溶液を添加して、磁気微粒子濃度を４ｍｇ／ｍＬにした。これを次いで、活性化のため、２５℃の環境温度で２０分間、垂直回転装置上に装填した。活性化された磁気微粒子及び抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体を、磁気微粒子ｍｇあたり１５μｇの抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の比で、標識のため垂直回転装置上に装填し、２５℃の環境温度で３時間、反応を行った。反応後の磁気微粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、グリシン、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気微粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、終結のため、２５℃の反応温度で２時間、垂直回転装置上に装填した。終結後、磁気微粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．５％（Ｗ／Ｖ）カゼイン、０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び保存剤を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気微粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、後の使用のために２℃～８℃で保存した。
磁気微粒子溶液を調製し、磁気微粒子は、１．５μｍ～３μｍの粒子サイズを持ち、表面上を親水性ポリマー及びカルボキシル基でコーティングされた磁気ビーズであった。調製法は以下の通りであった。１：１：１の質量比の磁気微粒子、ＥＤＣ及びＮＨＳに、ｐＨ５．０の５０ｍＭ ＭＥＳ溶液を添加して、磁気微粒子濃度を４ｍｇ／ｍＬにした。これを次いで、活性化のため、２５℃の環境温度で２０分間、垂直回転装置上に装填した。活性化された磁気微粒子及び抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体を、磁気微粒子ｍｇあたり１５μｇの抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の比で、標識のため垂直回転装置上に装填し、２５℃の環境温度で３時間、反応を行った。反応後の磁気微粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、グリシン、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気微粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、終結のため、２５℃の反応温度で２時間、垂直回転装置上に装填した。終結後、磁気微粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．５％（Ｗ／Ｖ）カゼイン、０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び保存剤を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気微粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、後の使用のために２℃～８℃で保存した。
ａａ１５０～ａａ１８３を認識するモノクローナル抗体（１８Ｂ２－２、１Ｆ９）で、上述の方法に従って、ＭＳ３００磁気ビーズをコーティングして、磁気微粒子溶液を調製した。
５．２ ＨＢｃＡｇアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体の調製
アクリジニウムエステル標識抗体溶液を調製し、調製法は以下の通りであった。５０μｇの標識しようとする抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体に、３００μＬの体積に到達するようにＮａＣｌ含有リン酸緩衝液を添加し、次いで、５μＬのアクリジニウムエステルストック溶液を添加し、振盪し、混合して、暗所中、室温で３０分間反応を行った。反応後、ＮａＣｌ及びグリシンを含むリン酸緩衝液２００μＬを添加し、手動で２０回上下を反転させることによって混合し、反応を暗所中、室温で３０分間行った。反応後、産物を透析バッグに移し、暗所中、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４である透析液に対して２℃～８℃で透析し、ＰＢＳ緩衝液を２時間ごとに全部で３回交換して、非標識アクリジニウムエステルを除去した。ウシ血清アルブミンが０．１％（Ｖ／Ｖ、１：１００）の最終濃度を有するように、標識産物に、実際の体積に従って、１０％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを添加し、次いで、等体積のグリセロールを添加し、手動で上下を反転させることによって混合し、後の使用のため、暗所中、－１５℃で保管した。
アクリジニウムエステル標識抗体溶液を調製し、調製法は以下の通りであった。５０μｇの標識しようとする抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体に、３００μＬの体積に到達するようにＮａＣｌ含有リン酸緩衝液を添加し、次いで、５μＬのアクリジニウムエステルストック溶液を添加し、振盪し、混合して、暗所中、室温で３０分間反応を行った。反応後、ＮａＣｌ及びグリシンを含むリン酸緩衝液２００μＬを添加し、手動で２０回上下を反転させることによって混合し、反応を暗所中、室温で３０分間行った。反応後、産物を透析バッグに移し、暗所中、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４である透析液に対して２℃～８℃で透析し、ＰＢＳ緩衝液を２時間ごとに全部で３回交換して、非標識アクリジニウムエステルを除去した。ウシ血清アルブミンが０．１％（Ｖ／Ｖ、１：１００）の最終濃度を有するように、標識産物に、実際の体積に従って、１０％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを添加し、次いで、等体積のグリセロールを添加し、手動で上下を反転させることによって混合し、後の使用のため、暗所中、－１５℃で保管した。
６つのＨＢｃＡｇモノクローナル抗体（１Ｂ１１、２Ａ７、６Ｅ１、１４Ｃ６、１４Ｃ７、５Ｈ４）を上述の方法によってアクリジニウムエステルで標識した。
５．３ 実験法
５．３．１ 試料：
ＨＢＶウイルス陽性（ＰＣＲ検出）臨床血清試料を準備し、１×１０７、１×１０６、１×１０５、１×１０４、１×１０３の異なるＤＮＡ装填に達するように２０％ＮＢＳで希釈して、検出用の陽性試料を得た。ＨＢＶウイルス陰性（ＰＣＲ検出）臨床血清試料も準備した。
５．３．１ 試料：
ＨＢＶウイルス陽性（ＰＣＲ検出）臨床血清試料を準備し、１×１０７、１×１０６、１×１０５、１×１０４、１×１０３の異なるＤＮＡ装填に達するように２０％ＮＢＳで希釈して、検出用の陽性試料を得た。ＨＢＶウイルス陰性（ＰＣＲ検出）臨床血清試料も準備した。
５．３．２ 試料の装填：
２５μｌの試料に１２．５μｌの２０％ＬＤＳを添加し、混合し、次いで３７℃で３０分間インキュベーションした。３０μｌの１０％ＣＨＡＰＳを添加し、混合して中和し、次いで、５０μｌの磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション完了後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μｌのアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体を添加し、振盪し、混合して、３７℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、１００μｌ～２００μｌのプレトリガー溶液を添加してプレトリガーを行った。プレトリガー溶液を除去した後、１００μｌ～２００μｌのトリガー溶液を添加して、トリガー及び検出を行った。
２５μｌの試料に１２．５μｌの２０％ＬＤＳを添加し、混合し、次いで３７℃で３０分間インキュベーションした。３０μｌの１０％ＣＨＡＰＳを添加し、混合して中和し、次いで、５０μｌの磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション完了後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μｌのアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体を添加し、振盪し、混合して、３７℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、１００μｌ～２００μｌのプレトリガー溶液を添加してプレトリガーを行った。プレトリガー溶液を除去した後、１００μｌ～２００μｌのトリガー溶液を添加して、トリガー及び検出を行った。
上述の方法によって、各アクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体と対形成した各磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体の直交検出を行い、Ｐ／Ｎ（陽性試料の平均値対陰性試料の平均値の比）を計算した。結果を以下の表に示した。
表４－１及び表４－２は、ＨＢｃＡｇ ａａ１５０～ａａ１８３を認識する（すなわちＨＢｃＡｇのアルギニンリッチドメイン（ＡＲＤ）を認識する）抗体を使用して磁気ビーズをコーティングし、標識抗体としてＨＢｃＡｇの１ａａ～１４９ａａ中の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用することによって、異なるＤＮＡ装填を含む試料の検出結果を示した（Ｐ／Ｎ＞３は陽性に相当した）。結果は、ＨＢｃＡｇ １４１ａａ～１５４ａａエピトープを認識する３つの抗体（２Ａ７、１４Ｃ６、１４Ｃ７）を標識抗体として使用した場合、異なるＨＢＶ ＤＮＡ装填を含む試料の検出効果は、他の抗体対のものよりも有意に優れていることを示した。
実施例６：酵素イムノアッセイ及びＨＢｃＡｇを検出するための検出試薬
モノクローナル抗体１８Ｂ２－２をリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢ、ｐＨ７．４）で希釈し、ポリ塩化ビニルプレート上にコーティングし、モノクローナル抗体２Ａ７をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Beijing Wantai Bio-pharmaceuticals, Co., Ltd.）で標識した。試験しようとする試料は、１μｇ／ｍｌの濃度のＣ１８３抗原希釈物、１μｇ／ｍｌの濃度のＣ１４９抗原（厦門大学のLaboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerによって開発）希釈物、陽性試料１／２、陰性試料１／２、及び２０％ｎｂｓを含んだ。
モノクローナル抗体１８Ｂ２－２をリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢ、ｐＨ７．４）で希釈し、ポリ塩化ビニルプレート上にコーティングし、モノクローナル抗体２Ａ７をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Beijing Wantai Bio-pharmaceuticals, Co., Ltd.）で標識した。試験しようとする試料は、１μｇ／ｍｌの濃度のＣ１８３抗原希釈物、１μｇ／ｍｌの濃度のＣ１４９抗原（厦門大学のLaboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerによって開発）希釈物、陽性試料１／２、陰性試料１／２、及び２０％ｎｂｓを含んだ。
試料を実施例５におけるものと同じ方法で処理して、ウイルスを溶解した。続いて、２Ａ７－ＨＲＰ（１／５００希釈）を添加して、４０分間インキュベーションし、プレートを５回洗浄し、各５０μｌの色素原溶液Ａ及びＢ（Beijing Wantai Bio-Pharmaceuticals, Co., Ltd.）を添加し、１５分間インキュベーションした。最後に、停止溶液（２Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を添加し、穏やかに振盪し、よく混合して、４５０～６２０の波長の値をマイクロプレート読み取り装置上で読み取った。結果を図３に示し、本発明の酵素イムノアッセイ検出試薬は、ＨＢｃＡｇを特異的に検出し得たが、ｃ１４９（すなわちＨＢｅＡｇ）を検出せず、優れた特異性を有することが示された。
実施例７：化学発光検出法及びＨＢｃＡｇを検出するための試薬
７．１ 検出キットの調製
７．１．１ 磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体の調製
磁気微粒子は、１．５μｍ～３μｍの粒子サイズを持ち、表面上を親水性ポリマー及びカルボキシル基でコーティングされた磁気ビーズであった。調製法は以下の通りであった。１：１：１の質量比の磁気微粒子、ＥＤＣ及びＮＨＳに、ｐＨ５．０の５０ｍＭ ＭＥＳ溶液を添加して、磁気微粒子濃度を４ｍｇ／ｍＬにして、次いで、活性化のため、２５℃の環境温度で２０分間、垂直回転装置上に装填した。活性化された磁気微粒子及び１８Ｂ２－２モノクローナル抗体を、磁気微粒子ｍｇあたり１５μｇのＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の比で、標識のため垂直回転装置上に装填し、２５℃の環境温度で３時間、反応を行った。反応した磁気微粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、グリシン、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、終結のため、２５℃の反応環境温度で２時間、垂直回転装置上に装填した。終結後、磁気粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．５％（ｗ／ｖ）カゼイン、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び保存剤を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気微粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、後の使用のために２℃～８℃で保存した。
７．１ 検出キットの調製
７．１．１ 磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体の調製
磁気微粒子は、１．５μｍ～３μｍの粒子サイズを持ち、表面上を親水性ポリマー及びカルボキシル基でコーティングされた磁気ビーズであった。調製法は以下の通りであった。１：１：１の質量比の磁気微粒子、ＥＤＣ及びＮＨＳに、ｐＨ５．０の５０ｍＭ ＭＥＳ溶液を添加して、磁気微粒子濃度を４ｍｇ／ｍＬにして、次いで、活性化のため、２５℃の環境温度で２０分間、垂直回転装置上に装填した。活性化された磁気微粒子及び１８Ｂ２－２モノクローナル抗体を、磁気微粒子ｍｇあたり１５μｇのＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の比で、標識のため垂直回転装置上に装填し、２５℃の環境温度で３時間、反応を行った。反応した磁気微粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、グリシン、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、終結のため、２５℃の反応環境温度で２時間、垂直回転装置上に装填した。終結後、磁気粒子を洗浄溶液で３回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．５％（ｗ／ｖ）カゼイン、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び保存剤を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液を添加して、磁気微粒子が４ｍｇ／ｍＬの濃度を有するようにし、後の使用のために２℃～８℃で保存した。
７．１．２ アクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体の調製
調製法は以下の通りであった。５０μｇの標識しようとする２Ａ７モノクローナル抗体に、３００μＬの体積に到達するようにＮａＣｌ含有リン酸緩衝液を添加し、次いで、５μＬのアクリジニウムエステルストック溶液を添加し、振盪し、よく混合して、暗所中、室温で３０分間反応を行った。反応後、ＮａＣｌ及びグリシンを含むリン酸緩衝液２００μＬを添加し、手動で２０回上下を反転させることによって混合し、反応を暗所中、室温で３０分間行った。反応後、産物を透析バッグに移し、暗所中、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４である透析液に対して２℃～８℃で透析し、ＰＢＳ緩衝液を２時間ごとに全部で３回交換して、非標識アクリジニウムエステルを除去した。ウシ血清アルブミンが０．１％（Ｖ／Ｖ、１：１００）の最終濃度を有するように、標識産物に、実際の体積に従って、１０％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを添加し、等体積のグリセロールを添加し、手動で上下を反転させることによって混合し、後の使用のため、暗所中、－１５℃で保管した。
調製法は以下の通りであった。５０μｇの標識しようとする２Ａ７モノクローナル抗体に、３００μＬの体積に到達するようにＮａＣｌ含有リン酸緩衝液を添加し、次いで、５μＬのアクリジニウムエステルストック溶液を添加し、振盪し、よく混合して、暗所中、室温で３０分間反応を行った。反応後、ＮａＣｌ及びグリシンを含むリン酸緩衝液２００μＬを添加し、手動で２０回上下を反転させることによって混合し、反応を暗所中、室温で３０分間行った。反応後、産物を透析バッグに移し、暗所中、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４である透析液に対して２℃～８℃で透析し、ＰＢＳ緩衝液を２時間ごとに全部で３回交換して、非標識アクリジニウムエステルを除去した。ウシ血清アルブミンが０．１％（Ｖ／Ｖ、１：１００）の最終濃度を有するように、標識産物に、実際の体積に従って、１０％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを添加し、等体積のグリセロールを添加し、手動で上下を反転させることによって混合し、後の使用のため、暗所中、－１５℃で保管した。
７．２ 検出法
１．調製。７．１で得られたキットを静置させ、室温（１８℃～３０℃）で１５分～３０分間平衡化した。
２．液体調製。後の使用のため、５０ｍｌの濃縮洗浄溶液（２０×）を蒸留水又は脱イオン水で１０００ｍｌに希釈した。
３．試料添加。試験しようとする試料２５μｌを、それぞれ、対応するウェルに添加した。
４．溶解。実施例５で記載するものと同じ方法を採用してウイルスを溶解した。
５．反応。５０μｌの磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体１８Ｂ２－２を試料ウェルに添加し、よく混合した後、プレートを密封フィルムで密封し、３７±１℃で１５分間インキュベーションした。１５分～２０分間インキュベーションした後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μｌのアクリジニウムエステル標識抗体２Ａ７を添加し、１０分～１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、１００μｌ～２００μｌのプレトリガー溶液を添加してプレトリガーを行った。次いで、プレトリガー溶液を除去し、１００μｌ～２００μｌのトリガー溶液を添加して、トリガー及び検出を行った。
１．調製。７．１で得られたキットを静置させ、室温（１８℃～３０℃）で１５分～３０分間平衡化した。
２．液体調製。後の使用のため、５０ｍｌの濃縮洗浄溶液（２０×）を蒸留水又は脱イオン水で１０００ｍｌに希釈した。
３．試料添加。試験しようとする試料２５μｌを、それぞれ、対応するウェルに添加した。
４．溶解。実施例５で記載するものと同じ方法を採用してウイルスを溶解した。
５．反応。５０μｌの磁気ビーズコーティングモノクローナル抗体１８Ｂ２－２を試料ウェルに添加し、よく混合した後、プレートを密封フィルムで密封し、３７±１℃で１５分間インキュベーションした。１５分～２０分間インキュベーションした後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、５０μｌのアクリジニウムエステル標識抗体２Ａ７を添加し、１０分～１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、０．０５％～０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄を行い、次いで、１００μｌ～２００μｌのプレトリガー溶液を添加してプレトリガーを行った。次いで、プレトリガー溶液を除去し、１００μｌ～２００μｌのトリガー溶液を添加して、トリガー及び検出を行った。
結果判定
閾値：カットオフ（Ｃ．Ｏ．）＝９０００
結果判定：（Ｓ＝各ウェルの発光値）
陰性結果：（Ｓ／Ｃ．Ｏ．＜１）：試料の発光値がカットオフ値未満である場合、陰性と決定し、これは、ＨＢＶコア抗原が試料中に検出されないことを意味した。
陽性結果：（Ｓ／Ｃ．Ｏ．≧１）：試料の発光値がカットオフ値以上である場合、陽性と決定し、これは、ＨＢＶコア抗原が試料中で検出されることを意味した。
閾値：カットオフ（Ｃ．Ｏ．）＝９０００
結果判定：（Ｓ＝各ウェルの発光値）
陰性結果：（Ｓ／Ｃ．Ｏ．＜１）：試料の発光値がカットオフ値未満である場合、陰性と決定し、これは、ＨＢＶコア抗原が試料中に検出されないことを意味した。
陽性結果：（Ｓ／Ｃ．Ｏ．≧１）：試料の発光値がカットオフ値以上である場合、陽性と決定し、これは、ＨＢＶコア抗原が試料中で検出されることを意味した。
実施例８：ＨＢｃＡｇ検出キットの特異度及び感度分析
８．１ コア抗原検出キットの特異度分析
８．１．１ キットの調製
ＨＢＶコア抗原を検出するための発光診断キット（発光検出試薬法）を、実施例７に記載されるような方法に従って調製した。
８．１ コア抗原検出キットの特異度分析
８．１．１ キットの調製
ＨＢＶコア抗原を検出するための発光診断キット（発光検出試薬法）を、実施例７に記載されるような方法に従って調製した。
８．１．２ 試料の検出
Ｂ型肝炎血清学試験のＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｅＡｂ及びＨＢｃＡｂ５の全ての項目で陰性結果を有する、２０１９年４月から現在までに収集された総数８０の試料を、－２０℃で凍結保存した。
Ｂ型肝炎血清学試験のＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｅＡｂ及びＨＢｃＡｂ５の全ての項目で陰性結果を有する、２０１９年４月から現在までに収集された総数８０の試料を、－２０℃で凍結保存した。
８．１．３ 検出項目
血清試料各々を、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に関する化学発光検出に供し、この方法は実施例７に示された。
血清試料各々を、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に関する化学発光検出に供し、この方法は実施例７に示された。
８．１．４ 検出結果
全ての試料を検出した後、キットの特異度に関して結果を分析した。各試料の検出結果を以下の表に示した。
全ての試料を検出した後、キットの特異度に関して結果を分析した。各試料の検出結果を以下の表に示した。
８．１．５ 結果及び分析
表７中の結果から、Ｓ／Ｃ．Ｏ．＜１は、ＨＢＶコア抗原が試料中で検出されなかったことを示し、特異度が優れていることが見て取れる。
表７中の結果から、Ｓ／Ｃ．Ｏ．＜１は、ＨＢＶコア抗原が試料中で検出されなかったことを示し、特異度が優れていることが見て取れる。
８．２ コア抗原検出キットの感度分析
８．２．１ キットの調製
（発光検出試薬法によって）ＨＢＶコア抗原を検出するための発光診断キットを、実施例７に記載されるような方法に従って調製した。
８．２．１ キットの調製
（発光検出試薬法によって）ＨＢＶコア抗原を検出するための発光診断キットを、実施例７に記載されるような方法に従って調製した。
８．２．２ 試料の検出
８．２．２．１． Ｂ型肝炎ウイルス核酸定量的ＰＣＲ検出試薬によって検出される、１．６０Ｅ＋０８コピー／ｍＬのＤＮＡ装填を含む１つの新鮮な血清試料を、３倍勾配、１１ポイントで、２０％ＮＢＳでの線形希釈に供し、２０％ＮＢＳを陰性対照として使用した。実施例８に記載される方法に従って検出を行い、参照曲線を作成した。
８．２．２．１． Ｂ型肝炎ウイルス核酸定量的ＰＣＲ検出試薬によって検出される、１．６０Ｅ＋０８コピー／ｍＬのＤＮＡ装填を含む１つの新鮮な血清試料を、３倍勾配、１１ポイントで、２０％ＮＢＳでの線形希釈に供し、２０％ＮＢＳを陰性対照として使用した。実施例８に記載される方法に従って検出を行い、参照曲線を作成した。
８．２．２．２． Ｃ１８３Ｂ抗原を２０％ＮＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、３倍勾配、１１ポイントで希釈に供し、Ｃ１８３Ｂ抗原を含まない２０％ＮＢＳを陰性対照として使用した。実施例８に記載される方法に従って検出を行い、上記参照曲線を使用して、各ポイントでの抗原検出に対応する値を変換した。結果を以下の表に示した。
８．２．２．３． 結果及び分析
表８のデータにおいて、１より大きいＳ／Ｃ．Ｏは陽性に相当する一方、１未満は陰性に相当した。結果は、ｃ１８３の抗原検出感度が０．０５ｎｇ／ｍｌであり、試料検出感度が約１０４コピー／ｍｌ（ＤＮＡ装填）であることを示した。
表８のデータにおいて、１より大きいＳ／Ｃ．Ｏは陽性に相当する一方、１未満は陰性に相当した。結果は、ｃ１８３の抗原検出感度が０．０５ｎｇ／ｍｌであり、試料検出感度が約１０４コピー／ｍｌ（ＤＮＡ装填）であることを示した。
実施例９：ＨＢｃＡｇ検出キット及びＰＣＲ検出法の比較
９．１ キットの調製
９．１．１ （発光検出試薬法によって）ＨＢＶコア抗原を検出するための発光診断キットを、実施例７に記載されるような方法に従って調製した。
９．１ キットの調製
９．１．１ （発光検出試薬法によって）ＨＢＶコア抗原を検出するための発光診断キットを、実施例７に記載されるような方法に従って調製した。
９．１．２ Ｂ型肝炎ウイルス核酸定量的ＰＣＲ検出試薬を、Shenzhen Piji Bioengineering Co., Ltd.より購入した。
９．２ 検出試料
２０１９年４月から現在までに収集された総数８２のＢ型肝炎ウイルス感染血清試料を、－２０℃で凍結保存した。
２０１９年４月から現在までに収集された総数８２のＢ型肝炎ウイルス感染血清試料を、－２０℃で凍結保存した。
９．３ 検出項目
各血清試料に対して、Ｂ型肝炎ウイルス核酸の定量的ＰＣＲ検出を行った。
各血清試料に対して、Ｂ型肝炎ウイルス核酸の定量的ＰＣＲ検出を行った。
各血清試料に対して、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原の化学発光検出を行った。
９．４ 検出結果
ＨＢＶコア抗原検出とＨＢＶウイルス核酸検出との間の相関を、全ての項目の検出結果を比較することによって、分析した。結果を以下の表に示した。
ＨＢＶコア抗原検出とＨＢＶウイルス核酸検出との間の相関を、全ての項目の検出結果を比較することによって、分析した。結果を以下の表に示した。
９．５ 結果の分析
表９において、Ｓ／Ｃ．Ｏ．＞１は、コア抗原が試料中で検出されることに相当し、Ｓ／Ｃ．Ｏ．＜１は、コア抗原が試料中で検出されないことに相当した。ＨＢｃＡｇ検出の結果と、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ装填結果との間で相関分析を行った。特に、ウイルス含量の対数及び各試料の発光強度を取り、線形相関分析を行った。図４に示すように、Ｒ２は０．８３６８であり、この結果は、本発明のＨＢｃＡｇ検出法の検出成績が優れており、試料のＤＮＡ装填を評価するために使用され得ることを示した。
表９において、Ｓ／Ｃ．Ｏ．＞１は、コア抗原が試料中で検出されることに相当し、Ｓ／Ｃ．Ｏ．＜１は、コア抗原が試料中で検出されないことに相当した。ＨＢｃＡｇ検出の結果と、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ装填結果との間で相関分析を行った。特に、ウイルス含量の対数及び各試料の発光強度を取り、線形相関分析を行った。図４に示すように、Ｒ２は０．８３６８であり、この結果は、本発明のＨＢｃＡｇ検出法の検出成績が優れており、試料のＤＮＡ装填を評価するために使用され得ることを示した。
実施例１０：他の免疫学的アッセイにおける２Ａ７モノクローナル抗体の使用
１０．１ ＨＢｃＡｇ免疫蛍光検出抗体としての２Ａ７の使用
ＨｅｐＧ２（厦門大学、Laboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）及びＨＢＶ １．１倍ゲノムを安定に組み込んだＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞（厦門大学、Laboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）を、ウェルあたり６００００細胞で２４ウェルプレート中にプレーティングした。細胞接着のため１２時間置いた後、培地を除去し、２０ｍＭ ＰＢＳで洗浄を１回行った。４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、細胞を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００で１０分間透過処理し、２％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。次いで、２％ＢＳＡによって１：１０００の希釈比で希釈した２Ａ７モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで４回洗浄した。蛍光二次抗体、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８（Beyotime、カタログ番号第Ａ０４２８号）を添加し、室温で４０分間インキュベーションを行った。ＰＢＳで４回洗浄した後、核に関してＤＡＰＩ染色を行った。実験完了後、Ｏｐｅｒａ ｐｈｅｎｉｘレーザー共焦点ハイコンテントイメージング系を用い、６３×水浸対物レンズ（water objective）で細胞の写真撮影を行った。
１０．１ ＨＢｃＡｇ免疫蛍光検出抗体としての２Ａ７の使用
ＨｅｐＧ２（厦門大学、Laboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）及びＨＢＶ １．１倍ゲノムを安定に組み込んだＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞（厦門大学、Laboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）を、ウェルあたり６００００細胞で２４ウェルプレート中にプレーティングした。細胞接着のため１２時間置いた後、培地を除去し、２０ｍＭ ＰＢＳで洗浄を１回行った。４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、細胞を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００で１０分間透過処理し、２％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。次いで、２％ＢＳＡによって１：１０００の希釈比で希釈した２Ａ７モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで４回洗浄した。蛍光二次抗体、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８（Beyotime、カタログ番号第Ａ０４２８号）を添加し、室温で４０分間インキュベーションを行った。ＰＢＳで４回洗浄した後、核に関してＤＡＰＩ染色を行った。実験完了後、Ｏｐｅｒａ ｐｈｅｎｉｘレーザー共焦点ハイコンテントイメージング系を用い、６３×水浸対物レンズ（water objective）で細胞の写真撮影を行った。
結果を図５に示し、２Ａ７は、細胞質において、ＨＢＶゲノムが組み込まれたＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞に明確な免疫反応を有したが、ＨＢＶゲノムが組み込まれていない細胞には結合を示さず、優れた特異性を示した。上記結果は、２Ａ７が正確な検出のため、ＨＢｃＡｇの免疫蛍光抗体として使用され得ることを示した。
１０．２ ＨＢｃＡｇ免疫組織化学検出のためのモノクローナル抗体としての２Ａ７の使用
現在、ＨＢｃＡｇ免疫組織化学検出に使用される抗ＨＢｃＡｇ抗体はポリクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体は、しばしば、高いバックグラウンド及び低い特異性を有し、これらを使用した免疫組織化学結果は標準化が容易ではない。免疫組織化学検出のための抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の使用に関する報告はない。本実験において、免疫組織化学検出抗体としての２Ａ７モノクローナル抗体の性能を調べた。
現在、ＨＢｃＡｇ免疫組織化学検出に使用される抗ＨＢｃＡｇ抗体はポリクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体は、しばしば、高いバックグラウンド及び低い特異性を有し、これらを使用した免疫組織化学結果は標準化が容易ではない。免疫組織化学検出のための抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体の使用に関する報告はない。本実験において、免疫組織化学検出抗体としての２Ａ７モノクローナル抗体の性能を調べた。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＨＢＶ－ＴＧ（厦門大学、Laboratory of National Infectious Disease Diagnostic Reagent and Vaccine Engineering Technology Research Centerより得た）及び正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.より得た）の肝臓組織パラフィン切片を、脱ワックス、再水和、抗原回収、洗浄、ブロッキングに供し、次いで、室温で１時間反応させるため、抗ＨＢｃ市販ポリクローナル抗体及び２Ａ７モノクローナル抗体を添加した。洗浄後、二次抗体を添加し、室温で１０分間反応させた。洗浄後、発色溶液を添加して染色を行った後、塩酸識別（hydrochloric acid differentiation）、対比染色、及びマウントを行った。
結果を図６に示した。市販のポリクローナル抗体同様、２Ａ７モノクローナル抗体は、ＨＢＶトランスジェニックマウスの組織パラフィン切片を正確に検出可能であり、正常マウスの組織パラフィン切片に結合せず、２Ａ７もまた、正確な検出のため、ＨＢｃＡｇの免疫組織化学抗体として使用され得ることが示された。
本発明の特定の実施形態が詳細に説明されるが、当業者は、公開された全ての教示に照らして、詳細に様々な修正及び変更を加えることができること、並びにこれらの変更が全て本発明の範囲内にあることを理解する。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれに相当するものによって与えられる。
Claims (26)
- （ｉ）ＨＢｃＡｇタンパク質の１５０位～１８３位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片より選択される、第１の抗体と、
（ｉｉ）ＨＢｃＡｇタンパク質の１４１位～１５４位に含まれるエピトープに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合断片より選択される、第２の抗体と、
を含むキット。 - 前記第２の抗体が、ＨＢｃＡｇタンパク質の１４１位～１５２位に含まれるエピトープに特異的に結合可能な抗体又はその抗原結合断片より選択される、請求項１に記載のキット。
- 前記第１の抗体が、以下の抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号３に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号４に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号５に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号６に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号７に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号８に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉ）配列番号１に示されるＶＨ中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号２に示されるＶＬ中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは前記ＶＨ中に含まれる前記３つのＣＤＲ、及び／又は前記ＶＬ中に含まれる前記３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
より選択される、請求項１又は２に記載のキット。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号１に示される配列、（ｉｉ）配列番号１に示される前記配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１に示される前記配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号２に示される配列、（ｖ）配列番号２に示される前記配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号２に示される前記配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される前記置換は保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１に示される前記配列を有するＶＨ、及び配列番号２に示される前記配列を有するＶＬを含む、
請求項３に記載のキット。 - 前記第２の抗体が、以下の抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１１に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１２に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１３に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１４に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉ）配列番号９に示されるＶＨ中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１０に示されるＶＬ中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは前記ＶＨ中に含まれる前記３つのＣＤＲ、及び／又は前記ＶＬ中に含まれる前記３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号９に示される配列、（ｉｉ）配列番号９に示される前記配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号９に示される前記配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に示される配列、（ｖ）配列番号１０に示される前記配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号１０に示される前記配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される前記置換は保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９に示される前記配列を有するＶＨ、及び配列番号１０に示される前記配列を有するＶＬを含む、
請求項５に記載のキット。 - 前記第１の抗体及び／又は前記第２の抗体が、重鎖定常領域（ＣＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含み、
好ましくは、前記第１の抗体及び／又は前記第２の抗体が、ネズミ重鎖定常領域とネズミ軽鎖定常領域とを含み、
好ましくは、前記第１の抗体及び／又は前記第２の抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＡ抗体である、
請求項１～６のいずれか一項に記載のキット。 - 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群より選択される、及び／又は前記抗体がネズミ抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第２の抗体が検出可能標識を有するか、又は前記キットが、前記第２の抗体に特異的に結合可能な第３の抗体を更に含み、前記第３の抗体が検出可能標識を有し、
好ましくは、前記検出可能標識が、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えばアクリジニウムエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンより選択される、
請求項１～８のいずれか一項に記載のキット。 - 前記キットが固形キャリアーを更に含み、
好ましくは、前記固形キャリアーが、磁気ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えばマイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）より選択され、
好ましくは、前記第１の抗体が前記固形キャリアーの表面上にコーティングされている、
請求項１～９のいずれか一項に記載のキット。 - 前記キットが、標準（例えば、ＨＢｃＡｇの異なる既知の量を含む一連の試料）、陽性対照試料（例えば、ＨＢｃＡｇの既知の量を含む試料）、陰性対照試料（例えば、ＨＢｃＡｇを含まない試料）、ＨＢＶウイルスを溶解するために使用される溶解剤、及び試験しようとする試料の収集及び保管のためのデバイス（例えば血液収集デバイス）からなる群より選択される１つ以上の試薬又はデバイスを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキット。
- （ｉ）第１の抗体、前記第１の抗体をコードする単離核酸分子、前記単離核酸分子を含むベクター、又は前記第１の抗体を発現する組換え細胞であって、前記第１の抗体が請求項１～８のいずれか一項におけるように定義される、第１の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
（ｉｉ）第２の抗体、前記第２の抗体をコードする単離核酸分子、前記単離核酸分子を含むベクター、又は前記第２の抗体を発現する組換え細胞であって、前記第２の抗体が請求項１～８のいずれか一項におけるように定義される、第２の抗体、単離核酸分子、ベクター、又は組換え細胞と、
を含む、キット。 - 前記第１の抗体を発現する前記組換え細胞が、前記第１の抗体をコードする単離核酸分子又は前記単離核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞であり、
前記第２の抗体を発現する前記組換え細胞が、前記第２の抗体をコードする単離核酸分子又は前記単離核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である、
請求項１２に記載のキット。 - 前記第１の抗体を発現する前記組換え細胞が、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０３号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株１８Ｂ２－２であり、
前記第２の抗体を発現する前記組換え細胞が、China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７である、
請求項１２に記載のキット。 - 試料中のＨＢｃＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出する方法であって、
（１）第１の抗体と前記試料を接触させて、抗体－抗原複合体を形成する工程であって、前記第１の抗体が請求項１～８のいずれか一項におけるように定義される、工程と、
（２）第２の抗体と前記抗体－抗原複合体を接触させて、抗体－抗原－抗体複合体を形成する工程であって、前記第２の抗体が請求項１～８のいずれか一項におけるように定義される、工程と、
（３）前記抗体－抗原－抗体複合体の量を決定する工程と、
を含む、方法。 - 前記第２の抗体が検出可能標識を有するか、又は工程（３）に記載されるような前記決定が検出可能標識を含む第３の抗体を使用することを含み、
好ましくは、前記検出可能標識が、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えばアクリジニウムエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンより選択される、
請求項１５に記載の方法。 - 工程（３）において、前記決定が、酵素イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイより選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
- 前記第１の抗体が、固形キャリアー表面上にコーティングされ、
好ましくは、前記固形キャリアーが、磁気ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えばマイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）より選択される、
請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試料が、全血、血漿及び血清からなる群より選択される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（１）の前に、前記方法が、前記試料を処理する工程を更に含み、前記処理が、ウイルスを溶解するように、前記試料と溶解剤を混合することを含む、及び／又は、
工程（２）及び／又は工程（３）の前に、前記方法が洗浄工程を更に含む、
請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。 - 試料中のＨＢｃＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出するための検出キットの製造における、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキットの使用。
- ＨＢｃＡｇに特異的に結合可能なモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）前記モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片が、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１１に示される配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１２に示される配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１３に示される配列を有するＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号１４に示される配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１５に示される配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１６に示される配列を有するＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、又は、
（ｉｉ）配列番号９に示される重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１０に示される軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、好ましくは重鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は軽鎖可変領域中に含まれる３つのＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ若しくはＩＭＧＴ番号付け系によって定義される、抗体若しくはその抗原結合断片、又は、
（ｉｉｉ）China Center for Type Culture Collection（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、ＣＣＴＣＣ番号第Ｃ２０１９３０２号の寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株２Ａ７によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体若しくはその抗原結合断片、
である、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。 - 前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号９に示される配列、（ｉｉ）配列番号９に示される前記配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｉｉｉ）配列番号９に示される前記配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、
及び／又は、
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に示される配列、（ｖ）配列番号１０に示される前記配列と比較した際、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は（ｖｉ）配列番号１０に示される前記配列と比較した際、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される前記置換は保存的置換であり、
好ましくは、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９に示される前記配列を有するＶＨ、及び配列番号１０に示される前記配列を有するＶＬを含む、
請求項２２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。 - 前記モノクローナル抗体が、重鎖定常領域（ＣＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含み、
好ましくは、前記モノクローナル抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＡ抗体である、
請求項２２又は２３に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群より選択される、及び／又は前記モノクローナル抗体がネズミ抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 試料中のＨＢｃＡｇを検出するための試薬製造における、請求項２２～２５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用であって、
好ましくは、前記試料が組織試料（例えば組織切片）又は細胞試料であり、
好ましくは、前記検出が免疫学的検出であり、好ましくは、前記免疫学的検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）及びウェスタンブロットより選択され、
好ましくは、前記モノクローナル抗体又は前記その抗原結合断片が、検出可能標識を有するか、又は、前記試薬が検出可能標識を有する二次抗体を更に含み、
好ましくは、前記検出可能標識が、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、蛍光色素又はビオチンより選択され、
好ましくは、前記二次抗体が抗免疫グロブリン抗体である、
使用。
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