WO2022244860A1 - 抗ノロウイルス抗体 - Google Patents
抗ノロウイルス抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2022244860A1 WO2022244860A1 PCT/JP2022/020944 JP2022020944W WO2022244860A1 WO 2022244860 A1 WO2022244860 A1 WO 2022244860A1 JP 2022020944 W JP2022020944 W JP 2022020944W WO 2022244860 A1 WO2022244860 A1 WO 2022244860A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- norovirus
- antibody
- antigen
- seq
- added
- Prior art date
Links
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 claims abstract description 59
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 6
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- -1 MPC-11 Chemical compound 0.000 description 2
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 208000006339 Caliciviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 241001105894 Murine norovirus Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 241000532183 Norovirus GI Species 0.000 description 1
- 241000532184 Norovirus GII Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150030521 gI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Abstract
要約 多くの遺伝子型のノロウイルスに反応し、ノロウイルスを一括して検出することが可能な抗ノロウイルス抗体が開示されている。抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する。ノロウイルスに対して幅広く結合し、ヒトノロウイルスを幅広く特異的にかつ高感度に検出できる新規な抗ノロウイルス抗体並びにそれを用いたノロウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具が提供された。
Description
本発明は、抗ノロウイルス抗体並びにそれを用いたノロウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具に関する。
ノロウイルスは、ヒトに経口感染して、十二指腸から小腸上部で増殖し、感染性胃腸炎を起こす。十二指腸付近の小腸上皮細胞を脱落させ、おう吐、下痢、腹痛などの症状を引き起こす。感染から発症までの潜伏期間は１２時間～７２時間（平均１～２日）で、症状が収まった後も便へのウイルスの排出は１～３週間程度続き、７週間を越える排出も報告されている。食中毒報告患者のうち約７割がノロウイルス感染症である。
ノロウイルスは、約７，５００塩基のプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つエンベロープを持たないウイルスである。ノロウイルスのゲノムには３つの蛋白質コード領域（ＯＲＦ）が存在しており、ＯＲＦ１はウイルスの複製に関与する非構造タンパク質、ＯＲＦ２はカプシド構造タンパク質（ＶＰ１）、ＯＲＦ３はマイナーな構造タンパク質（ＶＰ２）をコードしていることが報告されている。また、ノロウイルスは、カプシド遺伝子配列の類似性をもとに、ゲノグループI～V（ＧI～ＧV）の５つのグループに分類され、このうち、ＧI、ＧII、ＧIVがヒト感染の主流となる。中でもゲノグループI（ＧI）とゲノグループII（ＧII）は遺伝的多様性に富んでおり、ヒト由来試料からは、進化系統の異なる様々なウイルスが検出され、ゲノグループIは９種或いはそれ以上ゲノタイプ（遺伝子型）、ゲノグループIIは２２種或いはそれ以上のゲノタイプに分類できるとされている。
ノロウイルスの検出は、カプシド構造タンパク質を、抗体を用いてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法（非特許文献１参照）やイムノクロマトグラフィー法（非特許文献２参照）により検出することが行われている。したがって、ノロウイルス抗原を的確に検出するためには、全ての遺伝子型に反応する抗体が必要となる。
しかしながら、抗原の共通領域を認識して反応する抗体は容易に入手できず、これまでは、特定のアミノ酸配列を有するノロウイルス抗原ペプチドまたはそれのフラグメントに対する抗体（例えば、特許文献１参照）を複数組み合わせた試薬を作製し、異なる遺伝子型のノロウイルスを其々検出することが行われている。
例えば、ゲノグループＧIIのノロウイルスに共通して反応する抗体を得るべく検討したところ、ＧIIに属するノロウイルスのカプシドの突出領域の特定部位に結合する抗体が、ＧIIのノロウイルスに対して幅広く結合し、当該ＧIIに属する遺伝子型（ＧII／１～ＧII／１７）のノロウイルスの略全てを特異的に検出することが報告されている（特許文献２参照）。
しかしながら、ノロウイルスは易変異性のウイルスでありカプシドの表面に露出している突出領域は変異が多く、突出領域に抗原抗体反応をすることで幅広い遺伝子型と反応する抗体を一時的に作製できたとしても、変異株が発生すると反応できなくなるという問題があった。
したがって、遺伝子型の異なる多数のノロウイルスを一括して検出できる抗体の創生が望まれていた。
一方、非特許文献３には、ノロウイルスのカプシドのshell領域と抗原抗体反応するモノクローナル抗体が記載されている。
「改良ノロウイルス抗原検出EIAキットの評価」、月刊医学と薬学 Vol.61 No.1 Page.93-98 (2009.01.25)
「ノロウイルス抗原迅速診断薬クイックナビ-ノロの評価 」、月刊医学と薬学 Vol.61 No.5 Page.779-785 (2009.05.25)
Gabriel I. Parra et al., PLOS ONE, June 2013, Volume 8, Issue 6, e67592
本発明は、多くの遺伝子型のノロウイルスに反応し、ノロウイルスを一括して検出することが可能な抗ノロウイルス抗体を提供することに関する。
本発明は、上記課題に鑑み、ノロウイルスに共通して反応する抗体を得るべく検討したところ、ノロウイルスのカプシドの表面に露出している突出領域ではなく、内部構造であるshell領域に着目し、ノロウイルスのカプシドのshell領域の特定部位に結合する抗体が、ノロウイルスに対して幅広く結合し、ヒトノロウイルスを幅広く特異的に検出できることを見出した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1) 配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する、抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
(2) 配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する、請求項１記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
(3) 前記抗ノロウイルス抗体がモノクローナル抗体である、(1)又は(2)記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
(4) 検体中のノロウイルスと、(1)～(3)のいずれか記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用した、ノロウイルスの免疫測定方法。
(5) (1)～(3)のいずれか記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片を含む、ノロウイルスの免疫測定器具。
(2) 配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する、請求項１記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
(3) 前記抗ノロウイルス抗体がモノクローナル抗体である、(1)又は(2)記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
(4) 検体中のノロウイルスと、(1)～(3)のいずれか記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用した、ノロウイルスの免疫測定方法。
(5) (1)～(3)のいずれか記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片を含む、ノロウイルスの免疫測定器具。
本発明により、ノロウイルスに対して幅広く結合し、ヒトノロウイルスを幅広く特異的にかつ高感度に検出できる新規な抗ノロウイルス抗体並びにそれを用いたノロウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具が提供された。
本発明の抗ノロウイルス抗体は、MMMASKDAPPSMDGASGAGQLVP（配列番号１）及びMKMASNDAAPSNDGAAGLVPE（配列番号２）で示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する抗体であり、ノロウイルスのカプシド構造タンパクのshell領域に存在するエピトープに結合するものである。配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示されるアミノ酸配列の共通性から、MMMASKDAPPSMDGASG（配列番号３）及びMKMASNDAAPSNDGAAG（配列番号４）中にエピトープが存在するものと考えられる。なお、この領域は、非特許文献３に記載されているモノクローナル抗体のエピトープとは異なる領域である。
ノロウイルスのカプシド構造タンパク（ＶＰ１）は、ｓｈｅｌｌ領域（Ｓドメイン）と突出領域（Ｐドメイン）から成ることが知られている。Ｓドメインは、ＶＰ１のアッセンブリーを司ると考えられている。一方、Ｐドメインは、更にＰ１とＰ２サブドメインに分かれ、Ｐ１サブドメインは、Ｓドメインと相互作用し、カプシドの物理的安定性を増強すること、Ｐ２サブドメインは，ウイルス粒子の最外郭に位置し、マウスノロウイルスでは中和抗体の標的となることが報告されている。
本発明の抗ノロウイルス抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはそれらの１つ以上の一部、例えば、重鎖、軽鎖、ＦｃまたはＦ（ａｂ）一部のような任意の要求された類型であることができる。
本発明で使用される抗ノロウイルス抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものが包含される。
抗ノロウイルスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、遺伝子組換ノロウイルス様中空粒子（ＶＬＰ）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングし、得られたモノクローナル抗体の中から、配列番号１及び配列番号２でそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択することによって作製できる。また、ポリクローナル抗体は、配列番号１及び配列番号２でそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドの少なくともいずれかを、そのまま、又は常用される担体に固定化して、マウス、ラット、ハムスター等の動物に免疫し、その血清からポリクローナル抗体を回収することにより作製することができる。
遺伝子組換ノロウイルスＶＬＰは、ノロウイルスのカプシドの遺伝子配列をトランスファープラスミドベクターに挿入し、バキュロウイルスＤＮＡと、前述のプラスミドをＳｆ９細胞に同時にトランスフェクションし、相同組み換えを利用し、組み換えウイルスを作製し増殖させシードウイルスを得、その後、Ｔｎ５細胞でタンパク質の発現を行うことにより細胞中又は培養上清中から目的の組換ウイルスＶＬＰを公知の方法で精製することにより得ることができる。なお、遺伝子組換ノロウイルスＶＬＰ自体は周知であり、抗ノロウイルス抗体の創製等のために広く用いられているものである。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ～１ｍｇ程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から採血し、血清成分を精製することでポリクローナル抗体を得ることができる。血清成分を精製する際には、感作抗原を固定化したアフィニティーカラム等を使用することができる。
また、モノクローナル抗体を作製する際には、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばＰ３Ｘ６３、ＮＳ－１、ＭＰＣ－１１、ＳＰ２／０等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００～６０００のＰＥＧ、３０～６０％濃度）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞（ハイブリドーマ）の形成が行われる。
融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日～７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
本発明の抗ノロウイルス抗体を任意の免疫測定方法に適用することにより、検体中のノロウイルスを特異的に測定・検出することができる。
免疫測定方法自体は周知であり、本発明の免疫測定は、抗体又はその抗原結合性断片として上記した本発明の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片を用いること以外は、周知の免疫測定方法のいずれをも採用することができる。したがって、免疫測定方法は、特に制限されず、サンドイッチ法、免疫凝集法、競合法等、周知の免疫測定方法のいずれをも採用することができる。これらの中でも抗ノロウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体を用いたサンドイッチ法が好ましく、固定化抗ノロウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体を用いる方法がさらに好ましい。
抗ノロウイルス抗体を固定化する支持体としては、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子、磁性粒子、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜等の不溶性支持体が好ましい。抗体の固定化方法は周知である。
また、標識抗ノロウイルス抗体としては、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ）、タンパク（例えば、アビジン）、低分子化合物（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、FITC）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム） 、ラテックス粒子（例えば、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子）、金属（例えば、金、銀、白金等の貴金属）コロイド粒子、炭素原子等を用いることができる。
検体中のノロウイルスの検出は、検体中のノロウイルスを固定化抗ノロウイルス抗体と反応させることにより行われるが、サンドイッチ法による場合には、検体含有液と固定化抗ノロウイルス抗体を反応させ、次いで前記標識抗体を反応させること、或いは固定化抗ノロウイルス抗体と標識抗体とを同時に反応させることにより行うことができる。反応終了後、検体中のノロウイルスと固定化抗ノロウイルス抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定すれば、検体中のノロウイルス量が測定できる。標識量の測定は、標識体の種類に応じた手段で行うことができる。例えば、標識として酵素、アビジンを用いた場合には、反応後、基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光（蛍光ラテックス粒子を含む）又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、及び炭素粒子等は、目視或いは反射光等で信号を測定する。
上記した免疫測定方法の中でも、ＥＬＩＳＡ及びイムノクロマトグラフ法がより好ましい。
本発明の抗ノロウイルス抗体を用いた免疫測定器具は、固定化された本発明の抗ノロウイルス抗体を含む。固定化抗ノロウイルス抗体の他、例えば検体用希釈液、標識抗ノロウイルス抗体、反応基質等により構成されるキットの形態にあってもよい。
実施例１ 抗ノロウイルスモノクローナル抗体の取得
常法により作製されたノロウイルス様中空粒子（VLPs）をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により、マウスミエローマ細胞と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、その培養上清を用いて、ノロウイルスに対する産生抗体の反応性を調べた。VLPsを140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7.3（以下、PBSと略す）で0.1μg/mLに希釈した。希釈したVLPsをプラスチック製マイクロタイタープレート(Nunc-Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, 商品名、Nalgen Nunc International社製)のウェルに、1ウェル当たり100μLのVLPs/PBS, pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下でVLPsをマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたVLPs/PBS溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS、0.05％(v/v)Tween20(以下PBS-Tと略す、Tweenは商品名)を200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行った。この洗浄工程を計3回行った。
常法により作製されたノロウイルス様中空粒子（VLPs）をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により、マウスミエローマ細胞と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、その培養上清を用いて、ノロウイルスに対する産生抗体の反応性を調べた。VLPsを140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7.3（以下、PBSと略す）で0.1μg/mLに希釈した。希釈したVLPsをプラスチック製マイクロタイタープレート(Nunc-Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, 商品名、Nalgen Nunc International社製)のウェルに、1ウェル当たり100μLのVLPs/PBS, pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下でVLPsをマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたVLPs/PBS溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS、0.05％(v/v)Tween20(以下PBS-Tと略す、Tweenは商品名)を200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行った。この洗浄工程を計3回行った。
その後、1％PerfectBlock(商品名、フナコシ社製ブロッキング剤)/PBS pH7.3を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件下でVLPs固相化マイクロタイタープレートのウェル内ブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。培養上清中の抗ノロウイルスモノクローナル抗体の反応性を確認するために、VLPs固相化マイクロタイタープレートに、培養上清100μL/ウェルで加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えておいた、培養上清をデカンテーションにより除去し、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。
その後、ウェルへPeroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins(Agilent Technologies社製)(以下、酵素標識抗体と称する)を100μl/ウェル（1万倍希釈）で加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えた酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへ3,3’,5,5’-T-テトラメチルベンジジン (以下、TMBと略す)溶液をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分、遮光で静置した。その後、直ちに313mM H2SO4溶液を100μL/ウェルで添加し、酵素反応を停止させた。
その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした。(Josephy P.D.,Mason R.P.et al.(1982) J. Biol. Chem. 257, 3669-3675)。上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
その結果、表1に示した抗ノロウイルスモノクローナル抗体を産生する細胞株を得られた。
取得した細胞株をブリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗ノロウイルスshell領域抗体（SMoAb）を得た。
実施例２ 抗ノロウイルス抗体エピトープの確認
実施例1で作製した抗ノロウイルスshell領域抗体（SMoAb）について、ノロウイルス遺伝子群に共通するアミノ酸配列を同定し、同定されたアミノ酸配列をもとに、ペプチド合成を行い、同定されたアミノ酸配列を有するペプチドを作製した。作製したペプチドをPBSで0.3μg/mLに希釈した。希釈したペプチドをプラスチック製マイクロタイタープレート(Nunc-Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, 商品名、Nalgen Nunc International社製)のウェルに、1ウェル当たり100μLのノロウイルスペプチド/PBS, pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下でノロウイルスペプチドをマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたノロウイルスペプチド/PBS溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行った。この洗浄工程を計3回行った。
実施例1で作製した抗ノロウイルスshell領域抗体（SMoAb）について、ノロウイルス遺伝子群に共通するアミノ酸配列を同定し、同定されたアミノ酸配列をもとに、ペプチド合成を行い、同定されたアミノ酸配列を有するペプチドを作製した。作製したペプチドをPBSで0.3μg/mLに希釈した。希釈したペプチドをプラスチック製マイクロタイタープレート(Nunc-Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, 商品名、Nalgen Nunc International社製)のウェルに、1ウェル当たり100μLのノロウイルスペプチド/PBS, pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下でノロウイルスペプチドをマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたノロウイルスペプチド/PBS溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行った。この洗浄工程を計3回行った。
その後、1％PerfectBlock(商品名、フナコシ社製ブロッキング剤)/PBS pH7.3を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件下でペプチド固相化マイクロタイタープレートのウェル内ブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。抗ノロウイルスモノクローナル抗体の反応性を確認するために、ノロウイルスペプチド固相化マイクロタイタープレートに、1μg/mLの抗ノロウイルスモノクローナル抗体100μL/ウェルで加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えておいた、抗体液をデカンテーションにより除去し、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。
その後、ウェルへ酵素標識抗体を100μl/ウェル（1万倍希釈）で加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えた酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへTMB溶液をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分、遮光で静置した。その後、直ちに313mM H2SO4溶液を100μL/ウェルで添加し、酵素反応を停止させた。
その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした(Josephy P.D.,Mason R.P.et al.(1982) J. Biol. Chem. 257, 3669-3675)。実施例１で得られたSMoAb２クローンと抗ノロウイルスポリクローナル抗体（PoAb）をマイクロタイタープレート上のペプチドと反応させ、酵素標識抗体、ペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液を用いて反応を確認した。反応が確認できたペプチドのアミノ酸配列は、表１に示した。
本発明のSoMb抗体は、No.1とNo,8の共通した配列を多く含むMMMASKDAPPSMDGASG（配列番号３）とMKMASNDAAPSNDGAAG（配列番号４）を認識していると考えられる。
実施例３ イムノクロマト（IC）法における抗ノロウイルスモノクローナル抗体の反応性
１． 抗ノロウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
ノロウイルスGIのカプシドの突出領域に反応するモノクローナル抗体（GIPMoAb）及びノロウイルスGIIのカプシドの突出領域に反応するモノクローナル抗体（GIIPMoAb）を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンに1μL/cmの量で線状に塗布し、テストラインとした。コントロールラインは、抗マウスグロブリン抗体を上記同様に塗布した。本実施例において、抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
１． 抗ノロウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
ノロウイルスGIのカプシドの突出領域に反応するモノクローナル抗体（GIPMoAb）及びノロウイルスGIIのカプシドの突出領域に反応するモノクローナル抗体（GIIPMoAb）を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンに1μL/cmの量で線状に塗布し、テストラインとした。コントロールラインは、抗マウスグロブリン抗体を上記同様に塗布した。本実施例において、抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
２． 抗ノロウイルス抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
実施例1で作製した抗ノロウイルスshell領域抗体（SMoAb）を0.5mg/mlになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1%になるように加え、撹拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに撹拌した。遠心操作により上清を除き、50ｍM Tris（pH9.0）、3.0%BSAに再浮遊し、抗ノロウイルス抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本実施例において、抗体固定化粒子と呼ぶ。
実施例1で作製した抗ノロウイルスshell領域抗体（SMoAb）を0.5mg/mlになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1%になるように加え、撹拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに撹拌した。遠心操作により上清を除き、50ｍM Tris（pH9.0）、3.0%BSAに再浮遊し、抗ノロウイルス抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本実施例において、抗体固定化粒子と呼ぶ。
３． 試験片の作製
抗体固定化メンブレンと他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）を貼り合わせて5mm幅に切断し、ノロウイルス試験片とした。これらを本実施例において、試験片と呼ぶ。
抗体固定化メンブレンと他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）を貼り合わせて5mm幅に切断し、ノロウイルス試験片とした。これらを本実施例において、試験片と呼ぶ。
４． 免疫測定
各試験片に、任意に希釈したノロウイルスVLPsと抗体固定化粒子を含む検体浮遊液を100μL滴加し、15分間静置した。
各試験片に、任意に希釈したノロウイルスVLPsと抗体固定化粒子を含む検体浮遊液を100μL滴加し、15分間静置した。
抗マウスIgG抗体及び抗ノロウイルス抗体の両方の塗布位置で発色を目視で確認できた場合に＋と判定した。抗マウスIgG抗体の塗布位置のみで発色を目視で確認でき、抗ノロウイルス抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は－と判定した。また、抗マウスIgG抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は無効と判定した。また、ラインの発色強度により、＋＋＋＞＋＋＞＋と記載する。
本発明の試験片と従来品であるノロウイルスのカプシドの突出領域に反応するモノクローナル抗体を用いた試験片と判定結果を比較した。
表２より、本発明の試験片は従来品と比較して、試験したGI遺伝子群の全てに反応した。さらに、従来品よりも強く反応しており、ノロウイルス抗原に対する抗体の結合親和性が高く、ノロウイルスをより高感度に検出可能であることが確認された。
Claims (5)
- 配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する、抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
- 配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示されるアミノ酸配列から成る各ペプチドと抗原抗体反応する、請求項１記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
- 前記抗ノロウイルス抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片。
- 検体中のノロウイルスと、請求項１又は２記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用した、ノロウイルスの免疫測定方法。
- 請求項１又は２記載の抗ノロウイルス抗体又はその抗原結合性断片を含む、ノロウイルスの免疫測定器具。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023522732A JPWO2022244860A1 (ja) | 2021-05-20 | 2022-05-20 | |
| EP22804768.4A EP4342989A1 (en) | 2021-05-20 | 2022-05-20 | Anti-norovirus antibody |
| KR1020237043425A KR20240009995A (ko) | 2021-05-20 | 2022-05-20 | 항노로바이러스 항체 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021-084985 | 2021-05-20 | ||
| JP2021084985 | 2021-05-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2022244860A1 true WO2022244860A1 (ja) | 2022-11-24 |
Family
ID=84141696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2022/020944 WO2022244860A1 (ja) | 2021-05-20 | 2022-05-20 | 抗ノロウイルス抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4342989A1 (ja) |
| JP (1) | JPWO2022244860A1 (ja) |
| KR (1) | KR20240009995A (ja) |
| TW (1) | TW202306977A (ja) |
| WO (1) | WO2022244860A1 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009542715A (ja) | 2006-06-30 | 2009-12-03 | キム ラボラトリーズ | ノロウイルス用抗体 |
| WO2013039165A1 (ja) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | デンカ生研株式会社 | 抗ヒトノロウイルスｇｉｉ抗体 |
| WO2020036135A1 (ja) * | 2018-08-13 | 2020-02-20 | 国立大学法人東京大学 | ヒトノロウイルス様粒子およびその使用 |
-
2022
- 2022-05-20 EP EP22804768.4A patent/EP4342989A1/en active Pending
- 2022-05-20 KR KR1020237043425A patent/KR20240009995A/ko unknown
- 2022-05-20 JP JP2023522732A patent/JPWO2022244860A1/ja active Pending
- 2022-05-20 WO PCT/JP2022/020944 patent/WO2022244860A1/ja active Application Filing
- 2022-05-20 TW TW111118834A patent/TW202306977A/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009542715A (ja) | 2006-06-30 | 2009-12-03 | キム ラボラトリーズ | ノロウイルス用抗体 |
| WO2013039165A1 (ja) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | デンカ生研株式会社 | 抗ヒトノロウイルスｇｉｉ抗体 |
| WO2020036135A1 (ja) * | 2018-08-13 | 2020-02-20 | 国立大学法人東京大学 | ヒトノロウイルス様粒子およびその使用 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| "Evaluation of an improved norovirus antigen detection EIA kit", JAPANESE JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACEUTICAL SCIENCE, vol. 61, no. 1, 25 January 2009 (2009-01-25), pages 93 - 98 |
| "Evaluation of the QuickNavi-Noro quick norovirus antigen diagnosing agent", JAPANESE JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACEUTICAL SCIENCE, vol. 61, no. 5, 25 May 2009 (2009-05-25), pages 779 - 785 |
| GABRIEL I. PARRA ET AL., PLOS ONE, vol. 8, June 2013 (2013-06-01), pages 67592 |
| HANSMAN, G. S. ET AL.: "Genetic and antigenic diversity among noroviruses.", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 87, 2006, pages 909 - 919, XP055057980 * |
| JOSEPHY P.D.MASON R.P. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 257, 1982, pages 3669 - 3675 |
| KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 497 |
| LI X; ZHOU R; WANG Y; SHENG H; TIAN X; LI H; QIU H: "Identification and characterization of a native epitope common to norovirus strains GII/4, GII/7 and GII/8.", VIRUS RESEARCH., vol. 140, 2009, pages 188 - 193, XP025991657 * |
| PARRA GABRIEL I., AZURE JOLYNN, FISCHER RENATE, BOK KARIN, SANDOVAL-JAIME CARLOS, SOSNOVTSEV STANISLAV V., SANDER PETER, GREEN KIM: "Identification of a Broadly Cross-Reactive Epitope in the Inner Shell of the Norovirus Capsid", PLOS ONE, vol. 8, no. 6, 2013, pages 1 - 7, XP055852704 * |
| XU MENG, LU FEIFENG, LYU CHENANG, WU QINGPING, ZHANG JUMEI, TIAN PENG, XUE LIANG, XU TING, WANG DAPENG: "Broad-range and effective detection of human noroviruses by colloidal gold immunochromatographic assay based on the shell domain of the major capsid protein", BMC MICROBIOLOGY., vol. 21, no. 22, 11 January 2021 (2021-01-11), pages 1 - 10, XP093007629 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202306977A (zh) | 2023-02-16 |
| EP4342989A1 (en) | 2024-03-27 |
| JPWO2022244860A1 (ja) | 2022-11-24 |
| KR20240009995A (ko) | 2024-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108490174B (zh) | 检测car-t细胞的方法及其应用 | |
| US9244072B2 (en) | Anti-human norovirus GII antibody | |
| JP5941615B2 (ja) | ヒトｃｘｃｌ１タンパク質の免疫学的測定方法 | |
| JPWO2007043582A1 (ja) | Ｓａｒｓウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、ｓａｒｓウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ | |
| JP2023510589A (ja) | ＨＢｃＡｇの検出方法及び抗体 | |
| KR100730529B1 (ko) | Ｈｃｖ 코어 항원의 검출 또는 정량 방법 및 이에사용하기 위한 검출 또는 정량용 시약 | |
| US20080138794A1 (en) | Method for detecting or measuring HBV | |
| KR101652962B1 (ko) | 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 | |
| EA029346B1 (ru) | Моноклональное антитело человека против белка vp1 вируса jc | |
| CN102232087A (zh) | 修饰的人igf-1/e肽的抗体 | |
| JP6808178B2 (ja) | ヒトパルボウイルスｂ１９抗原および抗体の同時検出方法及びキット | |
| CN106939034B (zh) | 用于鉴定受试者所感染的hev基因型的方法和试剂盒 | |
| CN109280644B (zh) | 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| KR20120132227A (ko) | 다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법 | |
| WO2022244860A1 (ja) | 抗ノロウイルス抗体 | |
| WO2022244861A1 (ja) | 抗ノロウイルス抗体 | |
| WO2022244862A1 (ja) | ノロウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
| JPH0328766A (ja) | Ｈｉｖ抗体の検出方法およびそれに用いるアッセイキット | |
| CN109266620B (zh) | 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN117229393B (zh) | 特异性结合腺相关病毒5的抗体及其应用 | |
| JP4829961B2 (ja) | プロスタシン部分ペプチド及び抗プロスタシン抗体 | |
| CN112159797A (zh) | 杂交瘤细胞株3g7 1b10、抗gii.4型诺如病毒p蛋白单克隆抗体和应用 | |
| CN117683121A (zh) | 抗水痘-带状疱疹病毒抗体及其应用 | |
| KR20120132223A (ko) | 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 22804768 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2023522732 Country of ref document: JP |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 18562053 Country of ref document: US |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20237043425 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 1020237043425 Country of ref document: KR |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2022804768 Country of ref document: EP |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2022804768 Country of ref document: EP Effective date: 20231220 |