EA029346B1

EA029346B1 - Моноклональное антитело человека против белка vp1 вируса jc

Info

Publication number: EA029346B1
Application number: EA201590111A
Authority: EA
Inventors: Роберто Буриони; Массимо Клементи
Original assignee: Помона Ричерка С.Р.Л.
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2018-03-30
Also published as: CN104520318A; CN104520318B; EP2867257A2; JP2015524389A; MX2014015850A; EP2867257B1; WO2014002035A3; BR112014032682A2; ES2673230T3; BR112014032682B1; CA2877598A1; WO2014002035A2; ITTO20120570A1; MX356745B; JP6320375B2; CA2877598C; EA201590111A1; US10011648B2; KR20150023893A; KR102085305B1

Abstract

Изобретение относится к нейтрализующему моноклональному антителу человека, направленному против белка VP1 вируса JC, который представляет собой вирус, вызывающий прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (PML), а также к его применению для терапевтического или профилактического лечения инфекции JCV или заболевания, связанного с инфекцией JCV, такого как прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия (PML), и его применению в диагностике инфекций JCV или заболеваний, связанных с инфекцией JCV.

Description

Изобретение относится к нейтрализующему моноклональному антителу человека, направленному против белка УР1 вируса 1С, который представляет собой вирус, вызывающий прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию ^ΜΕ), а также к его применению для терапевтического или профилактического лечения инфекции 1СУ или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ такого как прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия ^ΜΕ), и его применению в диагностике инфекций 1СУ или заболеваний, связанных с инфекцией 1СУ

029346

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и, в частности, к области нейтрализующих антител, направленных против антигенов вирусных патогенов.

Более конкретно, изобретение относится к моноклональному антителу, направленному против белка УР1 вируса ЛС ОСУ).

Вирус ЛС (ЛСV) представляет собой полиомавирус человека семейства Ро1уотаутбае и возбудитель, вызывающий невероятно тяжелое, зачастую летальное демиелинизирующее заболевание, называемое прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатией (РМЬ). Вирус ЛС содержит не покрытый оболочкой икосаэдрический капсид, который содержит геном двухцепочечной кольцевой ДНК. Основным компонентом капсида является белок УР1 вируса. Исследования структуры, проведенные на вирионах, выявили, что капсид полиомавируса состоит из 72 пентамеров, образованных мономерами УР1, связанными через С-конец. УР1 связывается с рецепторами клеток-мишеней и, таким образом, запускает инфекцию.

Вирусом ЛС инфицировано свыше 85% взрослого населения. Вслед за первичной инфекцией вирус ЛС остается латентным в почках и лимфоидных органах. У здоровых индивидуумов такой вирус может реплицироваться в клетках почечного канальца и экскретироваться с мочой, не вызывая какого-либо заболевания. Однако в случае тяжелой иммуносупресии у индивидуумов, у которых проводили пересадку органов, у онкологических пациентов, у пациентов, получавших лечение новыми видами иммуномодулирующей терапии на основе моноклональных антител, или у людей, страдающих СПИДом, вирус ЛС может распространяться в центральную нервную систему и вызывать прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ). В эпоху пре-сАКТ (комбинированной противоретровирусной терапии) частота возникновения РМЬ у пациента с ВИЧ находилась в диапазоне от 0,3 до 8%, но широкое применение противоретровирусных видов лечения привело к ее значительному снижению. Инфекция ВИЧ представляет собой случай иммунодефицита, до сих пор наиболее часто связанного с РМЬ, приблизительно 80% случаев, с последующими гематологическими опухолями (приблизительно 8%), солидными опухолями (приблизительно 3%), пересадкой органов и аутоиммунными заболеваниями, лечение которых проводят иммуномодуляторами.

Однако в последнее десятилетие сообщалось об увеличении числа случаев РМЬ, не связанных ВИЧ/не связанных со СПИД. Большое число этих новых случаев возникает у индивидуумов, получающих иммунотерапевтическое лечение, доступное в настоящее время лекарственными средствами. На 29 февраля 2012 г. в мире было документально подтверждено 212 случаев РМЬ, связанной с лечением натализумабом, у 99571 пациентов, страдающих рассеянным склерозом, получавших лечение этим лекарственным средством. РМЬ также коррелирует с другими видами иммуномодулирующих средств, включая эфализумаб, микофенолатмофетил и ритуксимаб.

Для лечения РМЬ было предпринято несколько терапевтических подходов, которые были направлены против различных фаз репликации вируса, таких как, например, проникновение в клетку-мишень и репликация генома. Однако ни одна из них не дала существенного положительного эффекта. Исходя из взаимосвязи РМЬ и условий тяжелой иммуносупрессии, также были предприняты иммунологические подходы. Например, было показано, что пациенты, страдающие РМЬ с благоприятным прогнозом, отличаются более выраженным ЛСУ-специфическим клеточным и гуморальным ответом. Возможная важность специфического ответа против ЛСУ, в частности против УР1, была подтверждена сильной нейтрализующей активностью сыворотки животного (кролика), иммунизированного белком УР1 ЛСУ (Оо1бтапп С. е1 а1., Лоита1 о£ У1го1о§у, Мау 1999, радек 4465-4469).

Таким образом, для лечения пациентов, страдающих РМЬ, можно использовать альтернативную терапию, основанную на антителах против ЛСУ. В частности, в виду важной роли белка УР1 на ранних фазах инфекции ЛСУ, лучшими кандидатами могли бы быть антитела против белка УР1 ЛСУ.

Такая необходимость удовлетворена авторами настоящего изобретения, которым впервые удалось получить полностью моноклональные антитела человека, направленные на белок УР1 ЛСУ и обладающие нейтрализующей активностью против вируса, что делает их подходящими для применения в терапии РМЬ.

Эти результаты следует рассматривать как новые и неожиданные в свете уровня техники, т.к. до настоящего времени не было описано моноклональное антитело против УР1 ЛСУ человека, особенно нейтрализующее моноклональное антитело против УР1 ЛСУ человека.

В документе ОоИтапп С. е1 а1. кирга описана гипериммунная сыворотка антител кролика против УР1, индуцируемых вирусоподобными частицами, обладающими нейтрализующими свойствами против ЛСУ.

В патентной заявке Японии ЛР 9067397 А упомянут способ получения нейтрализующего антитела против ЛСУ, который предусматривает иммунизацию крысы синтетическим пептидом, соответствующим участку белка УР1, сбор антисыворотки у крыс и выделение фракции γ-глобулинов. В этом патенте не упоминается о выборе моноклонального антитела, в частности антитела, получаемого у человека.

Очевидно, что моноклональное антитело против УР1 ЛСУ, обозначенное как аЬ34756, поставляемое АЬсат®, Великобритания, представляет собой антитело мыши, используемое для детекции вируса с по- 1 029346

мощью ЕЬ1§А и Вестерн-блоттинга, не подходит для терапевтического применения, в частности, у человека.

Таким образом, ни одно из известных из уровня техники антител против 1СУ не является возможно подходящим для терапевтического или профилактического применения при инфекции 1СУ или заболеваний, коррелирующих с инфекцией 1СУ, у человека.

Также следует отметить, что перед тестированием, проведенным авторами настоящего изобретения, у специалиста в данной области не было оснований предполагать получение полностью моноклональных антител против 1СУ человека, способных нейтрализовать вирус 1С. так как не было научной публикации, в которой безошибочно было определено наличие нейтрализующих антител против 1СУ при гуморальном ответе человека. В качестве примера можно указать статью С. В1оотдгеп с( а1., N. Епд1. I. Меб., 2012; 366: 1870-80, в которой авторы предлагают стратификации рисков РМЬ у пациентов, страдающих рассеянным склерозом. В качестве стратификации рисков авторы предполагают три фактора риска, которыми являются наличие или отсутствие антител против ГОУ, предшествующее применение иммуносупрессоров и продолжительность лечения натализумабом, но они не предлагают и ни коим образом не упоминают осуществление оценки на наличие нейтрализующих антител при гуморальном ответе человека. С другой стороны, в уровне техники отмечаются технические сложности, связанные с детекцией гуморального ответа против 1СУ у человека, например, в документе РарНае1 Р. νίδεί6ί апб ВатЬата баутап, Лбуапес5 ίη ехрептеп1а1 тебюше апб Ью1о§у 2006; 577(): 73-84 и у ХУепбу А. Кпо№1е8, Лбеапеех ίη ехрег1теп1:а1 тебюте апб Ью1о§у 2006; 577 (): 19-45.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело против белка УР1 вируса 1С, отличающееся тем, что оно представляет собой антитело человека и способно нейтрализовать вирус 1С.

В рамках настоящего описания под термином "моноклональное антитело" понимают любую пептидную структуру, способную связываться с антигеном, в данном случае белком УР1 ГО.У. Таким образом, этот термин включает полноразмерные иммуноглобулины и функциональные фрагменты иммуноглобулина, которые, как правило, содержат вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, а также могут содержать одиночный вариабельный домен. В частности, но ими не ограничиваясь, примерами функциональных фрагментов иммуноглобулина являются фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ¹, Е(аЬ')₂, Εν, одноцепочечные антитела (ксЕу) и однодоменные антитела. Одноцепочечные антитела, например, сконструированы способом, описанным в патенте и§ 4946778, выданном Ьабпет е( а1. Одноцепочечные антитела содержат вариабельные области легкой и тяжелой цепи, соединенные гибкой связывающей молекулой (линкером). Фрагмент антитела, обозначенный как однодоменное антитело, даже меньше, чем одноцепочечное антитело, т.к. содержит один выделенный домен νΗ. Методики получения однодоменных антител, имеющих, по меньшей мере частично, аналогичную способность к связыванию в виде полноразмерного антитела, описаны в уровне техники и входят в компетенцию специалиста в данной области. В документах \Уагб е( а1. в "Вшбшд АоМйек оГ а Керегй1ге оГ §шд1е 1ттипод1оЬи1ш УапаЬ1е Оотаиъ §есге(еб Ггот ЕхсНепсЫа сой, №1ите, 341: 544-6 описан способ получения на основе скрининга вариабельной области тяжелой цепи антитела (УН-однодоменного антитела) с достаточной высокой аффинностью к эпитопу-мишени, чтобы связываться с ним в выделенной форме.

Термин "иммуноглобулин", как используется в настоящем описании, включает 1дС (в том числе 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4), 1дА, 1дМ, Ι§Ό и 1дЕ как в мономерной, так и в полимерной форме.

Термин "нейтрализующее вирус 1С" или "способное нейтрализовать вирус 1С" означает, что моноклональное антитело по изобретению способно блокировать цикл репликации вируса 1С на одной из его фаз, таким образом, влияя на его биологическую активность и по меньшей мере на одно из связанных с ним заболеваний.

В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело против 1СУ по изобретению способно связываться с конформационным эпитопом белка УР1 ГОУ, содержащим по меньшей мере один аминокислотный остаток первичной последовательности белка УР1 ГОУ, выбранного из группы, состоящей из Ι62, §65, А127, Ό130, N131, А133 и А175 или любого их сочетания. В конкретном варианте осуществления конформационный эпитоп содержит аминокислотные остатки Ι62, §65, А127, Ό130, N131, А133 и А175 первичной последовательности белка УР1 ГОУ.

Нумерация аминокислотных остатков основана на нумерации аминокислотной последовательности белка УР1 штамма Маб1 (§ЕО ГО N0: 7). §ЕО ГО N0: 7 доступна из базы данных ишРтоЖВ/§№188-Рто1: (§№188 ГО: Р03089 идентификатор признаков: РК0_0000115021).

Под термином "конформационный эпитоп" понимают все аминокислотные остатки, даже если они несмежные в первичной последовательности белка, которые непосредственно участвуют в связывании с антителом или, если они мутированы так, что не меняют основную конформацию белка, влияют на ту же аффинность связывания самого антитела.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело по изобретению содержит, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность §Е0 ГО N0: 1 (или кодируется последовательностью §Е0 ГО N0: 3), и вариабельный домен легкой цепи содержит последователь- 2 029346

ность δΕΟ ΙΌ N0: 2 (или кодируется последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 4). Такое специфическое моноклональное антитело также называется 0ΡΕ1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к моноклональному антителу человека, направленному против белка УР1 вируса 1С. как определено выше, для применения в терапевтическом или профилактическом лечении инфекции 1СУ или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ. предпочтительно прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии (РМЬ).

Специалист в данной области без излишней изобретательской деятельности сможет определить эффективные дозы и получить фармацевтическую композицию с моноклональным антителом по изобретению, которую можно использовать в рамках настоящего изобретения.

Моноклональное антитело по настоящему изобретению также подходит для применения в области диагностики, т.к. отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Такое моноклональное антитело, которое показало высокую аффинность (приблизительно 1 нМ) в случае рекомбинантного УР1 штамма Маб1 и в той же концентрации, что и коммерческое антитело мыши (АЬсаш®), обладает в значительной степени улучшенным сигналом ΕΜδΑ. Даже при оценке посредством иммунофлуоресцентного анализа, проводимом на клетках С0δ-7, инфицированных 1СУ (штамм Маб4), было показано, что антитело имеет большую чувствительность и специфичность по сравнению с коммерческим антителом АЬсат®. Кроме того, важно отметить, что моноклональное антитело по настоящему изобретению не показало реактивности в отношении рекомбинантного УР1 ВКУ (вирус, принадлежащий семейству Ро1уотаутбае как и 1СУ; УР1 1СУ и ВКУ обладают приблизительно 75% гомологией нуклеотидной последовательности) посредством ΕΟδΑ, что, таким образом, указывает на его высокую специфичность только для УР1 1СУ.

Таким образом, в рамках настоящего изобретения находится способ диагностики ίη νίίτο и соответствующий набор для диагностики инфекции 1СУ, где моноклональное антитело по настоящему изобретению используют в качестве специфического для 1СУ диагностического реагента.

Иммунодиагностический способ ίη νίίτο включает стадию приведения биологического образца от пациента, у которого подозревают инфекцию 1СУ, в контакт с моноклональным антителом по изобретению в условиях, подходящих для связывания моноклонального антитела по изобретению с антигеном УР1 1СУ, если он присутствует в образце, и стадию качественной и количественной детекции связывания моноклонального антитела по изобретению и антигена УР1 1СУ.

Способ иммунодиагностики по изобретению, например, проводят как иммуноферментный анализ ЕЬКА или как иммунофлуоресцентный анализ. Образец, на котором проводят анализ, представляет собой, например, кровь, плазму, сыворотку, мочу, спинно-мозговую жидкость, биопсию или любой другой биологический образец, считающийся подходящим.

Иммунодиагностический набор для проведения способа содержит моноклональное антитело по изобретению в качестве специфического реагента и инструкции для проведения анализа, а также необязательно другие компоненты, которые изменяются в зависимости от типа анализа, и, по существу, известны специалисту в данной области. Примеры дополнительных компонентов, которые могут необязательно содержаться в наборе, которые предназначены для качественной и/или количественной детекции успешного связывания антитела и антигена, представляют собой одну или несколько твердых подложек (таких как, например, планшеты для микротитрования), "слепой" раствор, один или несколько стандартных растворов, содержащих известные количества представляющего интерес антигена, контрольные растворы, растворы для разбавления образца, подлежащего тестированию, антитело для детекции, конъюгированное с детектируемым маркером (например, флуоресцентную молекулу) или с ферментом, способным взаимодействовать с субстратом, образуя детектируемый продукт, буферные промывающие растворы, растворы, содержащие субстрат фермента, останавливающие растворы и т.д.

Способ и набор по изобретению можно подходящим образом использовать для стратификации риска развития РМЬ у пациентов с различными предрасполагающими состояниями.

Примеры, которые следуют ниже, иллюстрируют идентификацию и характеризацию нейтрализующего моноклонального антитела человека в объеме настоящего изобретения, а также характеризацию эпитопа, распознаваемого указанным антителом. Эти примеры приведены только в качестве иллюстрации и без намерения ограничения объема изобретения, как определяют в прилагаемой формуле изобретения.

Пример 1.

Конструировали комбинаторную библиотеку фагового дисплея фрагментов антитела человека (одновалентных РаЬ), 1§01/изотип к и с ожидаемым размером 2х10⁷ элементов в фагмидном векторе рРЭ способами, аналогичными способам, описанным ранее (РкнкаШ Р., е1 а1., Нитап топос1опа1 гесотЬшаШ РаЬк кресШс Еог НСУ апйдепк оЫатеб Ьу гереПоие с1ошпд ίη рйаде Фкр1ау сотЬта1опа1 νесίο^к. Кек. Уио1., 1997. 148(2): р. 165-9). Библиотеку получали из костного мозга человека в возрасте 68 лет, результаты тестирования посредством ЕБ-ΙδΑ сыворотки которого были положительными на наличие антител против УР1/1СУ. ЕБ-ΙδΑ проводили путем покрытия 96-луночного планшета 100 нг/лунку рекомбинантного белка УР1 1СУ (Маб1, АЬсат®) в фосфатно-солевом буфере (ΒΒδ). К покрытому УР1 планшету в

- 3 029346

двух повторениях добавляли несколько разведений сыворотки. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч, а затем промывали 0,1% ΡΒδ ΤΆΕΕΝ 20. Связанные антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой (ΗΚΡ) антитела против ΙβΕΤ человека (51§ша-ЛШпсй®).

Биопэннинг фаговой экспрессионной комбинаторной библиотеки антител для отбора антитела против УР1 проводили, как описано ранее (^ййатзоп Κ.Α. е! а1., Нитап топос1опа1 апйЪоФез адатз! а р1е!йога о£ У1га1 раШодепз 1гот 81п§1е сотЪта!опа1 ИЪгапез. Ргос. №11. Асаб. 5сг ϋδΑ, 1993, 90(9): р. 4141-5). В кратком изложении в каждом цикле биопэннинга использовали препарат фага (0,1 мл/лунку) в концентрации 10¹² фагов на миллилитр для отбора антитела на планшетах с высоким связыванием для ΕΕΙδΑ (Соз1аг®), покрытых УР1 из штамма Маб1. Проводили всего 5 циклов биопэннинга и получаемые из 3 последних циклов фага преобразовывали в систему фагмид, экспрессирующих растворимые ЕаЪ.

Для получения отобранных молекул ЕаЪ для дальнейшей характеризации использовали клетки ЕзсйепсЫа сой из штамма ХЕ-1-Ъ1ие (Адйеп! Тесйпо1о§1ез®), трансформированные вектором экспрессии ЕаЪ. В кратком изложении препараты ЕаЪ получали способами замораживание-оттаивание из культуры. Пять мл δΒ (бульона зирег Ъго1й), содержащего ампициллин (50 мкг/мл, δ^βта-Α1ά^^сй®) инокулировали трансформированными бактериями и выращивали их в течение 7 ч при 37°С во вращающейся мешалке. Добавляли изопропил-ЗГО-тиогалактопиранозид (ΙΡΤΟ, 1 ммоль/л, δ^βта-Α1ά^^сй®) к растущим бактериям, которые дополнительно инкубировали в течение ночи при 30°С. Затем клетки центрифугировали, ресуспендировали в 1 мл ΡΒδ/1% бычьего сывороточного альбумина (ΒδΑ) и подвергали процедуре замораживание-оттаивание (3 раза). Клеточный дебрис переводили в осадок центрифугированием при 13000д при комнатной температуре в микроцентрифуге и использовали супернатант в анализе ΕΕΙδΑ без дополнительной обработки. ΕΕΙδΑ проводили, как описано ранее.

Клоны, которые давали Οϋ₄₅₀>0,8 посредством ΕΕΙδΑ против νΡ1 1СУ, рассматривали как положительные и подвергали дальнейшей характеризации.

Анализировали 105 клонов, 11 клонов тестировали как положительные (10,5%). Реактивность против ΒδΑ не демонстрировали.

Для подтверждения специфичности положительных клонов посредством ΕΕΙδΑ их тестировали иммунофлуоресцентным анализом на клетках ΕΟδ-7 (трансформированные клетки фибробластов почки африканской зеленой мартышки), инфицированных ЮТ штамма Маб4 (в ΕΕΙδΑ использовали рекомбинантный белок νΡ1 из штамма Маб1). В качестве вторичного антитела использовали антисыворотку козы против ЕаЪ человека, конъюгированную с флуоресцеинизотиоцианатом (δ^βта-Α1ά^^сй®). Для всех клонов с положительным результатом тестирования ΕΕΙδΑ подтверждали способность связываться с инфицированными клетками, при этом не детектировали реактивность с неинфицированными клетками. Клоны с отрицательным результатом тестирования ΕΕΙδΑ были не способны связываться с инфицированными клетками.

Нуклеиновую кислоту из клонов с положительным результатом тестирования ΕΕΙδΑ получали с использованием набора δр^η М1шргер ^1а§еп®) и секвенировали на секвенаторе 373А (Ρе^к^пΕ1те^®). Для секвенирования тяжелой цепи использовали праймер ЗЕ(ДОг (5'-етсеттеАССАсесАесссле-з ’) (δΕΘ ΙΌ ΝΟ: 5), который связывается с (+)-цепью. Для легкой цепи использовали праймер δΕΟΚΕ (5'-АТА6ТА.6ТТ6ТТСА6СА66СА-3') ду φφθ· который связывается с (+)-цепью. Анализ последовательности проводили с использованием средств ΒΕΑδΤ и ^ОТ и демонстрировали, что все клоны происходят из одного и того же подсемейства генов νΗ для тяжелой цепи и генов Vк для легкой цепи и обладают одинаковой последовательностью. Кроме того, последовательность ДНК антитела является новой. Также следует отметить, что в литературе до настоящего времени не было описано антитело человека, которое направлено против белка νΡ1 ΣΕν. Таким образом, это первое моноклональное антитело человека против νΡ1 ΣΕν, которое описывается. Это антитело идентифицировали под названием ОКЕ1.

Для тестирования нейтрализующей активности антитела ОКЕ1 против νΡ1 человека в 24-луночный планшет (Согшпд®) высевали 5х10⁴/лунку клеток ΕΟδ-7 в полной среде Г)М1:М. ΕΟδ-7 представляют собой пермиссивные клетки для инфекции ΣΕν.

На следующие сутки добавляли приблизительно 100 бляшкообразующих единиц .1СУ (штамма Маб4) к 100 мкл серийных разведений ΘΚΕ1 (двукратные разведения приблизительно от 20 мкг/мл до 0,3 мкг/мл). Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем добавляли к клеткам ΕΟδ-7. Затем их инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После одного промывания ΡΒδ в каждую лунку добавляли 500 мкл свежей среды и инкубировали клетки в течение 6 суток при 37°С.

Оценка нейтрализующей активности.

Нейтрализующую активность антител оценивали посредством иммунофлуоресценции. В кратком изложении оценку иммунофлуоресценции проводили на 6 сутки после инфекции. Препараты получали фиксацией клеток в течение 15 мин смесью метанола/этанола (отношение 1:1) при комнатной температуре и с использованием в качестве первичного антитела коммерческого антитела мыши против νΡ1 ΑΕсат® (1 мкг/мл) и конъюгированного с ΕΙΤΕ антитела мыши против ЕаЪ (δ^βта-Α1ά^^сй®) в качестве вторичного антитела, следуя инструкциям производителя.

Оценку проводили путем сравнения числа положительных клеток в лунках, в которые добавляли

- 4 029346

вирус к ОРЕ1, с инфицированными клетками при отсутствии антитела (100% инфекция).

Данные, наблюдаемые под флуоресцентным микроскопом, также подтверждали роботизированной системой регистрации флуоресценции (ΙΝ Се11 ЛпаП/сг §181ет 1000, ОБ НеаЬЬсаге), выполненной с возможностью автоматического отличия положительных клеток от фона, которые указывали на то, что антитело в виде фрагмента РаЬ было способно ингибировать более 50% инфекции 1СУ в концентрации 1 нг/мкл.

Аналогичные эксперименты также экспериментально демонстрировали, что не все сыворотки от пациентов, реакционноспособные в отношении УР1 1СУ, способны нейтрализовать вирус.

С этой целью приблизительно 100 образцов сыворотки тестировали ЕБ1ЗА в разведении 1:400 (разведение в РВЗ/1% ВЗА) для подтверждения наличия антител против 1СУ. В кратком изложении планшет ЕБ1ЗА (Со81аг®) покрывали 25 мкл/лунку раствора, содержащего 100 нг рекомбинантного УР1 (АЬсат®), и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующие сутки планшет промывали водой и блокировали РВЗ-1% ВЗА (мас./об.) в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляли 40 мкл однократного разведения (1:400 в РВЗ/1% ВЗА) тестируемой сыворотки, а затем инкубировали планшет в течение 1 ч при 37°С. После 5 промываний РВЗ-0,1% Т\уееп 20 (Зщта-А1бпсЬ®) посредством автоматического промывателя для микропланшетов ЕБ1ЗА (ЕТ1-Зу81ет КакЬег, Ωί;·ι8οπη) добавляли 40 мкл/лунку коммерческого конъюгированного с пероксидазой хрена антитела против 1§О человека (8щта-А1бпсЬ®). следуя инструкциям производителя. Затем планшет инкубировали в течение 45 мин при 37°С. После нескольких промываний, как описано ранее, для проведения ферментативной реакции в каждую лунку добавляли 40 мкл субстрата (раствор 1:1 Н₂О₂ и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, набор субстрата ТМВ, ТЬегто ЗДепОПс). Приблизительно через 15 мин ферментативную активность блокировали добавлением 40 мкл/лунку 1н. Н₂ЗО₄ (Саг1о ЕгЬа) и измеряли колориметрическую реакцию спектрофотометром (микропланшетный спектрофотометр модель 680, Вю-Раб) при длине волны 450 нм.

В качестве отрицательного контроля в каждый эксперимент вводили антиген ВЗА или другой подходящий антиген, Ο.Ό.450 которого использовали для детекции возможной неспецифической реактивности.

Небольшое количество сыворотки, для которой демонстрировали реактивность против УР1 1СУ>1 Ο.Ό. 450, анализировали с использованием анализа нейтрализации. В кратком изложении, за сутки до инфекции в 24-луночный планшет (Согшпд®) высевали 5х10⁴/лунку клеток СОЗ-7 (пермиссивных для инфекции 1СУ) в полной среде НМЕМ. На следующие сутки 200 мкл среды, содержащей 1СУ (Маб1), добавляли к 200 мкл разведения 1:200 тестируемой сыворотки (конечное разведение сыворотки составляет 1:400, такое же разведение, как используют для анализа ЕБ1ЗА). Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем добавляли к клеткам СОЗ7. Затем их инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После одного промывания РВЗ в каждую лунку добавляли 500 мкл свежей среды и инкубировали клетки в течение 6 суток при 37°С.

Нейтрализующую активность тестируемых образцов оценивали посредством опосредованной иммунофлуоресценции. Препараты получали фиксацией клеток в течение 15 мин смесью метанола/ацетона (отношение 1:1) при комнатной температуре и с использованием в качестве первичного антитела коммерческого антитела мыши против УР1 АЬсат® (1 мкг/мл) и конъюгированного с Р1ТС антитела мыши против 1§О (Зщта-А1бпсЬ®) в качестве вторичного антитела, следуя инструкциям, предоставленным производителем.

Оценку проводили посредством сравнения числа положительных клеток в лунках, в которых к тестируемому образцу добавляли вирус, с клетками, инфицированными при отсутствии образца (100% инфекция).

Анализ демонстрировал, что, несмотря на реактивность по отношению к УР1, выявляемую ЕБ1ЗА, для довольно большого числа образцов сыворотки не демонстрировали нейтрализующую активность против 1СУ. Получаемые результаты проиллюстрированы на графике на фиг. 1. На графике фиг. 1 представлен процент нейтрализующей активности некоторых образцов тестируемой сыворотки. Для всех приведенных образцов сыворотки посредством ЕБ1ЗА демонстрировали реактивность >1 Ο.Ό.450 по отношению к УР1.

Иммунофлуоресценция и иммуногистохимия на образцах биопсии.

С использованием антитела ОРЕ1 против УР1 1СУ по настоящему изобретению в анализах иммунофлуоресценции и иммуногистохимии можно определять наличие 1СУ в образцах биопсии. Эти антитела фактически демонстрировали высокую чувствительность и специфичность к белку УР1 1СУ, при этом, с другой стороны, не демонстрировали реактивность к УР1 ВКУ.

Образцы биопсии могут представлять собой свежие или фиксированные, или парафинированные образцы. В случае фиксированных и покрытых парафином образцов при необходимости образец депарафинируют и восстанавливают антигенность стандартными способами. Затем образец инкубируют при 37°С в течение 30 мин с ОРЕ1 (10 мкг/мл в РВЗ). После периода инкубации образец промывают 5 раз в РВЗ, а затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С с конъюгированным с Р1ТС или с пероксидазой хрена антителом против РаЬ человека (З1дта-А1бпсЬ®), следуя инструкциям производителя. В случае

- 5 029346

использования антитела конъюгированного с пероксидазой хрена необходимо добавлять субстрат (диаминобензидин, набор субстрата ΌΆΒ, Тйетто δοίοηΙίΓίο). который в присутствии пероксидазы образует коричневый осадок. который позволяет визуализировать возможное связывание антитела.

Анализ оценки проводят путем наблюдения образца под флуоресцентным микроскопом или с использованием автоматической системы детекции флуоресценции. если используют конъюгированное с Р1ТС антитело. или посредством световой микроскопии или с использованием атематической системы визуализации. если используют конъюгированное с пероксидазой хрена антитело.

ЕЬ18А с захватом для детекции 1СУ в биологических образцах.

Для проведения анализа ЕЬ18А с антителом ОКЕ1 против ΥΡ1 1СУ человека планшет для ЕЬ18А (СоШаг®) покрывают 25 мкл/лунку раствора. содержащего 40 нг антитела овцы против Ρά человека в ΡΒ8 (конечная концентрация 1.6 мкг/мл). и инкубируют при 4°С в течение ночи. На следующие сутки планшет промывают водой и блокируют ΡΒ8-1% В8А (мас./об.) в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляют 40 мкл ОКЕ1 (конечная концентрация приблизительно 4 нг/мкл в ΡΒ8/1% В8А) на лунку и инкубируют затем планшет в течение 1 ч при 37°С. После 5 промываний ΡΒ8-0.1% Т\уееп 20 (8щта-А1бпсН®) посредством автоматического промывателя для микропланшетов ЕЬ18А (ЕТ1-8у81ет Какйет. Ωίαδοπη) 40 мкл в каждую лунку добавляют несколько разведений биологического образца. подлежащего тестированию. (серийные 10-кратные разведения. начиная от неразведенного состояния до разведений 1:1000). Затем планшет инкубируют в течение 1 ч при 37°С. После нескольких промываний. как описано ранее. в каждую лунку добавляют 40 мкл коммерческого антитела мыши против ΥΡ1 (АЬеат®. разведенного в ΡΒ8/Β8А) в разведении 1:1000. Планшет оставляют отстаиваться в течение 1 ч при 37°С. После дополнительных промываний добавляют 40 мкл/лунку поликлонального препарата антител козы. которые связываются с участком Рс 1§О мыши и являются конъюгированными с пероксидазой хрена ((Рсспецифическое) конъюгированное с пероксидазой антитело против 1§О мыши. продуцируемое у козы. 8щта-А1бпсН®). Планшет инкубируют в течение 45 мин при 37°С. После 5 промываний ΡΒ8-Т\уееη20. проводимых. как описано ранее. в каждую лунку добавляют 40 мкл субстрата (раствор 1:1 Н₂О₂ и 3.3'.5.5'-тетраметилбензидина. набор субстрата ТМВ. Тйетто 8с1епййс) для проведения ферментативной реакции.

Приблизительно через 15 мин блокируют ферментативную активность добавлением 40 мкл/лунку 1н. Н₂8О₄ (Саг1о ЕгЬа) и измеряют колориметрическую реакцию спектрофотометром (микропланшетный спектрофотометр модель 680. Β^ο-Каά) при длине волны 450 нм.

В качестве отрицательного контроля в каждый эксперимент вводят антиген Β8А или другой подходящий антиген. ΟΌ₄₅₀ которого используют для детекции возможной неспецифической реактивности.

Пример 2. Определение характера (линейный или конформационный) эпитопа. распознаваемого моноклональным антителом ОКЕ1.

Для определения характера (линейный или конформационный) эпитопа. распознаваемого моноклональным антителом ОКЕ1. проводили анализы вестерн-блоттинга и ОоРблоттинга с использованием денатурированного белка и белка дикого типа.

На фиг. 2 представлены результаты анализа вестерн-блоттинг в денатурирующих условиях. Белок денатурировали β-меркаптоэтанолом (β-тег) или додецилсульфатом натрия (8Ό8).

Коммерческое антитело мыши обозначают как АЬсат. тогда как моноклональное антитело ОКЕ1 против ΥΡ11СУ обозначают как ОКЕ.

На фиг. 3 представлены результаты анализа ОоРблоттинг. проводимого с денатурированным ΥΡ1 и νΡ1 в конформации дикого типа. Коммерческое антитело мыши обозначают как АЬсат. тогда как моноклональное антитело ОКЕ1 против ΥΡ1 1СУ обозначают как ОКЕ 1§О.

Результаты демонстрируют. что ОКЕ1 не способно связываться с денатурированной формой белка. и что способно только распознавать неденатурированный белок. В подтверждение этого факта коммерческое антитело мыши (АЬсат®. аЬ34756). направленное против линейного эпитопа νΡ1. наоборот являлось способным распознавать обе формы белка. Таким образом. эти результаты приводят к заключению. что эпитоп. распознаваемый моноклональным антителом ОКЕ1 представляет собой конформационный эпитоп.

Определение специфичности моноклонального антитела ОКЕ1.

В литературе широко описана высокая гомология нуклеотидной последовательности (приблизительно 70%) генома вируса ΒΚ (ΒΚν) и генома 1СУ. которые представляют собой основные полиомавирусы. способные инфицировать человека.

Для определения. способно ли ОКЕ1 распознавать только 1СУ. тестировали его реактивность анализом ЕЬ18А против рекомбинантного белка ΥΡ1 1СУ (АЬсат®. аЬ74569) и против рекомбинантного белка νΡ1 ΒΚν (АЬсат®. аЬ74567). ОКЕ1 оказалось способным связываться только с белком ΥΡ11СУ. что указывает на его абсолютную специфичность.

Характеризация эпитопа. распознаваемого моноклональным антителом ОКЕ1. посредством сканирующего аланином сайт-специфического мутагенеза.

Аминокислотные последовательности белков ΥΡ1 1СУ и ΒΚν ΥΡ1 выравнивали посредством про- 6 029346

граммы С1ив!а1Х, таким образом, чтобы идентифицировать участки, несущие остатки, которые обладают значительным различием (таким как заряд и полярность) в двух белках и которые могут обуславливать различие в связывании, которым обладает антитело по изобретению по отношению к двум белкам. Этим анализом в УР1 1СУ и ВКУ идентифицировали 33 аминокислотных остатка, абсолютно отличных (по заряду и полярности).

Для определения критических остатков УР1, участвующих в связывании с моноклональным антителом ОКЕ1, ранее идентифицированные остатки индивидуально подвергали мутации в аланин (или в глицин в случае, когда исходный остаток являлся аланином). В кратком изложении, сайт-специфический мутагенез проводили на наборе ροΌΝΆ™ 3.1 ехргеввюп уссЮг/УЗ-НБ ТОРО® ТА Ехргеввюп (Ы£е ТссНпо1ощс5™)· в который предварительно клонировали нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР1, из штамма 1СУ Маб1. Используемые для мутагенеза праймеры конструировали, чтобы их длина составляла приблизительно 30 нуклеотидов, и они обладали областью перекрытия 15-20 нуклеотидов на 5'-конце, таким образом, чтобы получать эффективный продукт мутагенеза. После реакции амплификации продукт ПЦР расщепляли ферментом ΌρηΙ в течение 4 ч при 37°С, чтобы удалить метилированную ДНК, используемую в качестве матрицы. После расщепления 1 мкл продукта амплификации использовали для трансформации электрокомпетентных клеток. Выделяли небольшое число трансформированных колоний и проверяли посредством секвенирования для анализа, была ли введена желаемая мутация. Затем мутантный УР1 клонировали в другой вектор экспрессии (рС'АСЕН Аббдепе №11160).

Клетки НЕК 293Т (эпителия почки человека) трансфицировали векторами рСАО-УР1ти! и оценивали связывание антитела против УР1 с этими мутантными УР1 посредством РАС§ (клеточного сортера с активацией флуоресценции). В кратком изложении, клетки НЕК 293Т трансфицировали 4 мкг вектора, в который клонировали мутантный УР1. После центрифугирования и фиксации 4% параформальдегидом трансфицированные клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с ОКЕ1 или коммерческим антителом АЬсаш®, направленным против С-концевой линейной последовательности, разведенным в пермеабилизирующем растворе в концентрации 1 мкг/мл. Затем промывали клетки и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с конъюгированными с Р1ТС моноклональными антителами против антитела человека или антитела мыши, следуя инструкциям производителя (§1дта-А1Дг1сН®), и затем анализировали посредством РАС§. Реактивность, наблюдаемую с немутантным белком УР1, принимали за 100% связывание, наоборот нетрансфицированные клетки использовали в качестве отрицательного контроля.

Для анализа данных, получаемых посредством РАС§, для графического редактирования использовали программное обеспечение ОгарНРаб Рпвт.

Посредством анализа РАС§ наблюдали, что остатки, которые, если они мутантные, нарушают связывание, представляют собой: 162А, §65А, А127О, И130А, Ν131Λ, А133О, А175О (нумерация аминокислот на основе остатков штамма Маб1 УР1, где нумерация начинается с Ме! в положении 1) (фиг. 4). При этом в этом анализе не рассматривали мутантные остатки, способные изменять конформацию белка, или существенное уменьшение их экспрессии ίη νίίτο.

Для структурной характеризации эпитопа, распознаваемого ОКЕ1, использовали кристаллографическую модель, уже описанную ранее в литературе и содержащейся в базе данных со свободным доступом РСЗВ-РЭВ (ююю.гсвЬ.огд), с кодом доступа 3ΝΧΟ Щлхлу.гсвЬ.огд/рбЬ/ехрКге/ еxρ1ο^е.άο?5ΐ^исΐи^еIά=3NXО). Использование этой модели позволило уточнить, что остатки, которые являются удаленными на одинарном мономере, с другой стороны, являются близкорасположенными на двух смежных мономерах в пентамерной форме и полностью смежных с положением белка, участвующего в связывании с сиаловой кислотой. Эти структурные данные объясняют значительную нейтрализующую активность ОКЕ1.

Получаемые экспериментальные данные демонстрируют, что ОКЕ1 распознает конформационный, а нелинейный, эпитоп, содержащий, по меньшей мере, следующие остатки: Ι62, §65, А127, Ό130, N131, А133, А175 (нумерация аминокислот на основании нумерации остатков штамма Маб1 УР1, где нумерация начинается с Ме! в положении 1).

В частности, выявлено, что остатки, которые, если мутированы, нарушают связывание ОКЕ1, очень близко расположены к области, которая является важной для связывания белка УР1 и его рецептора, и это объясняет нейтрализующую активность ОКЕ1.

Анализ ЕЬ1§А для определения ίη νίίτο наличия нейтрализующих антител в биологических образцах.

Для определения наличия нейтрализующих антител в биологических образцах (в частности, но не только, в цереброспинальной жидкости, сыворотке или плазме) в анализе ЕЬ1§А использовали эпитоп, распознаваемый ОКЕ1 (нейтрализующее антитело). Настройку быстрой и эффективной системы детекции проводили с использованием двух стратегий: одна из них, в которой конкурентный анализ ЕЬ1§А проводят с образцами и ОКЕ1, другая стратегия, в которой в качестве антигена используют наименьший участок УР1 (содержащий остатки между положениями 50 и 140 исходного белка), который все еще может распознаваться нейтрализующим антителом. Так же разрабатывали вариант последнего анализа, где

- 7 029346

биологические образцы, подлежащие тестированию, получали, чтобы конкурировать в жидкой фазе с УР1, который является мутантным только по остаткам, распознаваемым ОКЕ1, таким образом, чтобы более эффективно удалять из реакции антитела, способные распознавать участки УР1, которые отличаются от участков, распознаваемых ОКЕ1.

Анализ ЕЬ18А для определения ίη νίΐτο наличия нейтрализующих антител посредством конкуренции за белок УР1 с моноклональным антителом ОКЕ1.

Для отличия ОКЕ1 от других антител человека в биологическом образце, подлежащем тестированию, ОКЕ1 метили способами экспрессируемого слияния генов с аминокислотной последовательностью ΌΎΚΌΌΌΌΚ, таким образом, чтобы только оно являлось распознаваемым коммерческим моноклональным антителом РЬАО® М2, конъюгированным с пероксидазой хрена (81дта-А1бг1сЬ®).

Планшет ЕЬ18А (Со81аг®) покрывали 25 мкл/лунку раствора, содержащего 300 нг рекомбинантного УР1 (АЬсат®, аЬ74569), и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующие сутки планшет промывали водой и блокировали РВ8-1% В8А (мас./об.) в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляли 40 мкл нескольких разведений (серийных 10-кратных разведений, начиная от неразведенного состояния до разведений 1:1000) биологического образца, подлежащего тестированию, и затем инкубировали планшет в течение 1 ч при 37°С. В дальнейшем добавляли 40 мкл антитела ОКЕ1 против УР1 1СУ (конечная концентрация приблизительно 1 нг/мкл в РВ8/1% В8А) в каждую лунку с различными разведениями образца и инкубировали планшет в течение 30 мин при 37°С. После 5 промываний РВ8-0,1% Т\уссп 20 (81дтаА1бпсН®) посредством автоматического промывателя микропланшетов для ЕЬ18А (ЕТ1-8у§1ет Какйег, О1а8огт) добавляли 40 мкл/лунку коммерческого конъюгированного с пероксидазой хрена антитела РЬАО® М2 (8щта-А1бпс11®). Затем планшет инкубировали в течение 45 мин при 37°С. После нескольких промываний, как указано ранее, в каждую лунку добавляли 40 мкл субстрата (раствор 1:1 Н₂О₂ и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, набор субстрата ТМВ, Тйетто 8шепййс) для прохождения ферментативной реакции. Приблизительно через 15 мин ферментативную активность блокировали добавлением 40 мкл/лунку 1н. Н₂8О₄ (Саг1о ЕгЬа) и измеряли колориметрическую реакцию спектрофотометром (микропланшетный спектрофотометр модель 680, Вю-Кай) при длине волны 450 нм.

В качестве отрицательного контроля в каждый эксперимент вводили антиген В8А или другой подходящий антиген, Ο.Ό.450 которого использовали для детекции возможной неспецифической реактивности.

Для оценки ингибирования связывания ОКЕ1 наблюдали различие оптической плотности, детектируемой в лунках, в которые добавляли моноклональное антитело с различными разведениями биологического образца, подлежащего тестированию, и в лунках, в которые добавляли одно моноклональное антитело.

В частности, если оптическая плотность в лунках, в которые добавляли моноклональное антитело с различными разведениями биологического образца, является ниже, чем оптическая плотность, наблюдаемая с одним моноклональным антителом, существовала конкуренция за связывание эпитопа на УР1 между ОКЕ1 и антителами в образце, таким образом, свидетельствуя о наличии 1СУ-ОКЕ1 -подобных антител в образце и, таким образом, о наличии нейтрализующих и защитных антител.

Анализ ЕЬ18А для определения ίη νίΐτο в биологических образцах наличия антител, способных распознавать аналогичный эпитоп, связываемый моноклональным антителом ОКЕ1.

Для определения минимального участка УР1, который содержит эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом ОКЕ1, и все еще сохраняет конформационные признаки, нуклеотидную последовательность, кодирующую УР1 из штамма Маб1 1СУ, расщепляли ДНКазами, таким образом, чтобы получать в случайном порядке нарезанные последовательности УР1. Различные участки УР1 клонировали в фагмиду для отбора посредством биопэннинга против ОКЕ1 участка УР1, все еще распознаваемого моноклональным антителом. После того как определяли участок, все еще распознаваемый ОКЕ1, фрагмент анализировали посредством специального программного обеспечения для определения конформации ίη 51Йсо и по возможности сравнивали ее с конформацией полноразмерного белка УР1.

Принимая во внимание результаты этого прогнозирования, отобранная нуклеотидная последовательность, кодирующая минимальный участок, распознаваемый ОКЕ1 и содержащий остатки между положениями 50 и 140 исходного белка, клонировали в бактериальный вектор экспрессии рЕТ15Ь в рамку считывания с меткой 6χΗίδ и участком расщепления тромбина (рЕТт1шУР1). Для клонирования использовали участки рестрикции Хйо1 и ВатН1 (содержащиеся в клонируемой вектором области, но не в УР1). С этой целью представляющую интерес область УР1 амплифицировали ПЦР посредством введения соответственно участков рестрикции Хйо1 и ВатН1 на 5'- и 3'-конце. Отбор клонов, которые содержали рЕТт1шУР1, проводили на основании устойчивости к ампициллину и посредством анализа последовательности.

Для очистки фрагмента одну колонию, содержащую рЕТт1шУР1 инокулировали в 10 мл ЬВ с 50 мкг/мл ампициллина и выращивали при 37°С в течение ночи. На следующие сутки 5 мл культуры пересевали в 500 мл среды ЬВ с 50 мкг/мл ампициллина. Культуру анализировали через определенные промежутки времени с использованием спектрофотометра для проверки роста бактерий. Когда культура до- 8 029346

стигала ΟΙ) 600 0,6-1, в среду добавляли 0,4 мМ изопропил-β-Ό-1-тиогалактопиранозида (ΙΡΤΟ) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи.

На следующие сутки бактериальную культуру центрифугировали в течение 15 мин при 3900 д и ресуспендировали бактериальный осадок в 20 мл буфера А (50 мМ Тпз рН 7,5, 5% глицерина, 250 мМ НаС1, 30 мМ имидазола). Затем клетки лизировали с использованием ультразвукового аппарата. Суспензию центрифугировали в течение 45 мин при 12000 д и фильтровали с использованием 0,4 мкм фильтров для удаления бактериального дебриса.

Затем очищали фрагмент аффинной хроматографией на никелевой колонке. Перед нанесением образца на колонку смолу промывали 3 об. буфера А, 3 об. буфера В (20 мМ Тпз рН 7,5, 5% глицерин, 250 мМ НаС1, 500 мМ имидазол) и повторно уравновешивали 8 об. буфера А. На данной стадии образец пропускали через колонку. 50 мл буфера А использовали для отмывания колонки от несвязавшегося образца и элюировали образец в 0-100% градиенте буфера В. После элюирования колонку повторно уравновешивали буфером А. После концентрирования фрагмент расщепляли тромбином таким образом, чтобы удалять гистидиновый хвост, который может оказывать влияние на биологический образец, подлежащий тестированию. Для устранения следовых количеств элюирующего буфера, которые могут повлиять на возможное использование очищенного фрагмента, элюируемый объем подвергали диализу против ΡΒδ. Качество и концентрацию фрагмента, которые в дальнейшем будет называться мини-УР1, анализировали посредством 12% δΌδ-геля.

Для ΕΚΙδΑ 96-луночный планшет (Соз1аг®) покрывали 25 мкл/лунку раствора, содержащего 300 нг фрагмента мини-УР1 (получаемого, как описано ранее), и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующие сутки планшет промывают водой и блокировали ΡΒδ-1% ΒδΑ (мас./об.) в течение 1 ч при 37°С.

По окончании инкубации планшета добавляли 40 мкл биологического образца, подлежащего тестированию в нескольких разведениях (серийных 10-кратных разведениях, начиная от неразведенного состояния до разведений 1:1000) и инкубировали планшет в течение 1 ч при 37°С. После 5 промываний ΡΒδ-0,1% Т\ееп 20 ^1дта-А1йпсЬ®) посредством автоматического промывателя для микропланшетов ΕΚΙδΑ (ЕТ1^уз1ет КазНег, ^^аδо^^η) добавляли 40 мкл/лунку поликлонального препарата конъюгированных с пероксидазой хрена антитела козы, которые связываются с участком Рс 1дО человека ^1дтаА1йпсН®). Планшет инкубировали в течение 45 мин при 37°С. После 5 промываний ΡΒδ-Т^ееп 20, проводимых, как описано ранее, в каждую лунку добавляли 40 мкл субстрата (раствор 1:1 Н₂О₂ и 3,3',5,5'тетраметилбензидина, набор субстрата ТМВ, ТНегто ЗиепДйс) для прохождения ферментативной реакции. Приблизительно через 15 мин ферментативную активность блокировали добавлением 40 мкл/лунку 1н. Η₂δΟ₄ (Саг1о ЕгЬа) и измеряли колориметрическую реакцию спектрофотометром (микропланшетный спектрофотометр модель 680, Βίο-Кай) при длине волны 450 нм.

В качестве отрицательного контроля в каждый эксперимент вводили антиген ΒδΑ или другой подходящий антиген, Ο.Ό.₄₅₀ которого использовали для детекции возможной неспецифической реактивности. В качестве положительного контроля использовали моноклональное антитело ОКЕ1 в конечной концентрации 1 нг/мкл.

Образцы, которые демонстрировали высокую реактивность по отношению к мини-VΡ1 ПО сравнению с ΒδΑ, считали положительными и, таким образом, содержащими 1СУ-ОКЕ1-подобные антитела с нейтрализующей и, таким образом, защитной активностью.

Анализ ΕΡΙδΑ для определения ίη νίΐίο наличия в биологических образцах антител, способных распознавать аналогичный эпитоп, связываемый моноклональным антителом ОКЕ1 (вариант с конкуренцией мутантным νΡ1).

Для повышения точности предыдущего анализа разрабатывали другой вариант эксперимента путем добавления стадии предварительной инкубации образца, подлежащего тестированию, с νΡ1, мутантным по остаткам, которые являются важными для связывания ОКЕ1 с белком.

Для получения белка νΡ1, модифицированного по участкам связывания с ОКЕ1, и который в дальнейшем будет действовать посредством исключения антитела в биологических образцах, использовали стратегию сайт-специфического мутагенеза путем введения некоторых изменений: вследствие того, что некоторые остатки, которые необходимо подвергать мутации, являются очень близкорасположенными, несколько остатков подвергали мутации одновременно. Сначала мутации подвергали остатки Ι62 и δ65 с использованием следующего ниже праймера Р\:

5' -д!'Ь'Ь'Ьад'Ьаадса6Са^621/А'Ьс'Ьа'Ьа6са^655/Ада'Ьас-3 ' 8) и

51-'Ьдас'Ь'Ьас'Ьаааасссс'Ьаада'Ьдс'Ьса'Ьс'Ьдд-3 ' (§ЕЦ ГО ΝΟ: 9) в качестве обратного. В качестве матрицы использовали набор вектора (κΊ)\Α^ΊΛ1 3.1/ν5-Ηΐ3 ΤΟΡΟ® ТА Ехргеззюп (Ьйе ТесНпо1од1ез), в который предварительно клонировали νΡ1 из штамма Май1 ΙΟν. Амплификацию продукта, также содержащего мутантный белок, получали посредством ПЦР. Для удаления матрицы ДНК, используемой для реакции (которая точное не будет содержать желаемых мутаций), продукт реакции расщепляли ΌρηΙ в течение 4 ч при 37°С. В дальнейшем электрокомпетентные клетки трансформировали 2 мкл предварительного обработанного продукта амплификации. Клетки, содержащие плазмиду, выбирали на основании устойчивости к ампициллину, а затем проверяли анализом последовательности. Век- 9 029346

тор, для которого демонстрировали мутации, введенные с первой реакцией амплификации, использовали в качестве матрицы для второй реакции амплификации, в которой мутации подвергали положения 127 А, 130Ό, 131Ν, 133А. Для введения этих мутаций в качестве праймера Рш использовали

5 ’ -сас-Ьс-Ьаа-ЬдддсаадСа^127А/еас-Ьса-ЬдСс^130п/АСС-Ь^131м/Адд-ЬдСа^133А/еддд-3 ' (§Е(^ щ N0’ 10) и 5 ’ -сЦТдсссаРРададТдсасаРРсаЦсааас-З ’ (§ЕР ГО N0: 11) в качестве обратного праймера. Продукт ПЦР расщепляли ΌρηΙ в течение 4 ч при 37°С. В дальнейшем электрокомпетентные клетки трансформировали 2 мкл предварительно обработанного продукта амплификации. Клетки, содержащие плазмиду, выбирали на основании устойчивости к ампициллину, а затем проверяли анализом последовательности. УР1, для которого анализом последовательности выявляли все из вводимых мутаций, клонировали в бактериальный вектор экспрессии рЕТ15Ь в рамку считывания с меткой 6хИз и участок расщепления тромбина (рЕТ-УР1ти1). Затем очищали мутантный УР1 (УР1ти1) с использованием аналогичного протокола, как использовали для очистки мини-УР1.

Для ЕП8А 96-луночный планшет (Соз1аг®) покрывали 25 мкл/лунку раствора, содержащего 300 нг мини-УР1 (получаемого, как описано ранее), и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующие сутки планшет промывали водой и блокировали РБ8-1% Б8Л (мас./об.) в течение 1 ч при 37°С. В то же время 50 мкг/мл мутантного УР1 предварительно инкубировали с несколькими разведениями (серийными 10-кратными разведениями, начиная от неразведенного состояния до разведений 1:1000) биологического образца, подлежащего тестированию, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После окончания инкубации планшета добавляли 40 мкл смеси различных разведений сыворотки (другой биологический образец) с мутантным УР1 и инкубировали планшет в течение 1 ч при 37°С. После 5 промываний РВ80,1% Тшееп 20 (81дта-А1йпсЬ®) посредством автоматического промывателя для микропланшетов ЕП8А (ЕТ1-8уз1ет КазЬег, Όία8οπη) добавляли 40 мкл/лунку поликлонального препарата конъюгированных с пероксидазой хрена антител козы, которые связываются с участком Рс 1дО человека (81дта-А1йпсЬ®). Планшет инкубировали в течение 45 мин при 37°С. После 5 промываний РВ8-Тшееп 20, проводимых, как описано ранее, в каждую лунку добавляли 40 мкл субстрата (раствор 1:1 Н₂О₂ и 3,3',5,5'тетраметилбензидина, набор субстрата ТМВ, ТЬегто 8с1епййс) для прохождения ферментативной реакции. Приблизительно через 15 мин ферментативную активность блокировали добавлением 40 мкл/лунку 1н. Η₂80₄ (Саг1о ЕгЬа) и измеряли колориметрическую реакцию спектрофотометром (микропланшетный спектрофотометр модель 680, Βίο-Кай) при длине волны 450 нм.

В качестве отрицательного контроля в каждый эксперимент вводили антиген В8А или другой подходящий антиген, 0.Ό.450 которого использовали для детекции возможной неспецифической реактивности. В качестве положительного контроля использовали моноклональное антитело 1СУ-ОКР1 в конечной концентрации 1 нг/мкл.

Образцы, для которых демонтировали более высокую реактивность по отношению к пептиду миниУР1 по сравнению с В8А, считали положительными и, таким образом, содержащими 1СУ-ОКЕ1подобные нейтрализующие и, таким образом, защитные антитела.

- 10 029346

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ΡΟΜΟΝΑ К1СЕКСА З.К.Ь.

<120> МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ БЕЛКА νΡ1 ВИРУСА ЛС

<130> РС1236ЕС

<160> 11

<170> РаЕепЫп уегзЧоп 3.3

<210> 1

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Ното зарЧепз

<400> 1

Тгр 1

О1у

Рго

О1у

Ьеи 5

να1

Ьуз

Рго

Бег

О1п 10

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

ТЬг 15

Суз

А1а

να1

Бег

О1у

Α1α

Бег

να1

Бег

О1у

11е

Азп

Туг

Тгр

Бег

Тгр

20

25

30

11е

Агд

Ьеи

Туг

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

11е

О1у

Туг

να1

Туг

35

40

45

Бег

О1у

ТЬг

Туг

Азп

Рго

Бег

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

να1

Бег

50

55

60

11е

Бег

Ьеи

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

О1п

РЬе

Бег

Ьеи

Азп

Ьеи

Агд

Бег

65

70

75

80

να1

ТЬг

Α1α

Азр

ТЬг

Α1α

να1

Туг

Суз

Α1α

Агд

Азр

Агд

О1у

85

90

95

Азр

Бег

О1у

Бег

Туг

Ьуз

Туг

МеЕ

Азр

να1

Тгр

О1у

100

105

110

Ьуз

О1у

ТЬг

να1

ТЬг

να1

Бег

115

120

<210>

2

<211>

105

<212>

БЕЛОК

<213>

Ното

зαр^еηз

<400>

2

να1

МеЕ

ТЬг

О1п

Бег

Рго

Бег

Ьеи

Бег

Α1α

Бег

να1

О1у

Азр

Агд

1

5

10

15

να1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

Α1α

Бег

О1п

Бег

11е

Бег

Туг

Ьеи

Азп

- 11 029346

20

25

30

Тгр

Туг

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

А1а

35

40

45

А1а

Зег

Ьеи

О1п

Зег

О1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

О1у

50

55

60

Зег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

О1п

Рго

О1и

Азр

65

70

75

80

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Суз

О1п

Зег

Туг

Зег

ТЬг

Рго

Агд

ТЬг

РЬе

85

90

95

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 3

<211> 363

<212> ДНК

<213> Ното зартепз

<400> 3 Ьддддсссад	дасЬддЬдаа	дсссЬсасад
дссЬссдЬса	дсадЬддЬаЬ	ЬааЬЬасЬдд
сЬддадЬдда	ЬЬддсЬаЬдЬ	дЬаЬЬссадЬ
адЬсдадЬЬЬ	ссаЬаЬсасЬ	адасасдЬсЬ
дЬдасЬдссд	сддасасддс	сдЬдЬаЬЬас
адЬЬссЬасЬ	асаадЬасЬа	саЬддасдЬс
Ьса

ЬсссЬдЬссс	ЬсассЬдсдс	ЬдЬсЬсЬддЬ	60
адсЬддаЬсс	дссЬсЬассс	адддаадддс	120
дддасЬасдЬ	асЬасаассс	дЬсссЬсаад	180
аадаассадЬ	ЬсЬсссЬдаа	ссЬдаддЬсЬ	240
ЬдЬдсдадад	аЬадддддда	ЬадсЬсдддд	300
Ьддддсааад	ддассасддЬ	сассдЬсЬсс	360

363

<210> 4

<211> 315

<212> ДНК

<213> Ното зар1епз

<400> 4

дЬдаЬдассс адЬсЬссаЬс сЬсссЬдЬсЬ дсаЬсЬдЬад дадасададЬ сассаЬсасЬ 60

Ьдссдддсаа дЬсададсаЬ ЬадсадсЬаЬ ЬЬаааЬЬддЬ аЬсадсадаа ассадддааа 120

дссссЬаадс ЬссЬдаЬсЬа ЬдсЬдсаЬсс адЬЬЬдсааа дЬддддЬссс аЬсааддЬЬс 180

адЬддсадЬд даЬсЬдддас адаЬЬЬсасЬ сЬсассаЬса дсадЬсЬдса ассЬдаадаЬ 240

ЬЬЬдсаасЬЬ асЬасЬдЬса асададЬЬас адЬассссЬс даасдЬЬсдд ссаадддасс 300

ааддЬддааа Ьсааа 315

- 12 029346

<210>	5
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Праймер 5Ει2Οζ

<400> 5

дРсдРРдасс аддсадссса д 21

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер БЕРКЬ

<400> 6

аВадаадВВд ВВсадсаддс а 21

<210> 7

<211> 354

<212> БЕЛОК

<213> Вирус НС

<400> 7

МеВ 1

А1а

Рго

ТЬг

Ьуз 5

Агд

Ьуз

О1у

О1и

Агд 10

Ьуз

Азр

Рго

Уа1

О1п 15

Уа1

Рго

Ьуз

Ьеи

11е

Агд

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Ьеи

О1и

Уа1

Ьуз

ТЬг

20

25

30

О1у

Уа1

Азр

Бег

11е

ТЬг

О1и

Уа1

О1и

Суз

РЬе

Ьеи

ТЬг

Рго

О1и

МеВ

35

40

45

О1у

Азр

Рго

Азр

О1и

Н1з

Ьеи

Агд

О1у

РЬе

Бег

Ьуз

Бег

11е

Бег

11е

50

55

60

Бег

Азр

ТЬг

РЬе

О1и

Бег

Азр

Бег

Рго

Азп

Агд

Азр

МеВ

Ьеи

Рго

Суз

65

70

75

80

Туг

Бег

Уа1

А1а

Агд

11е

Рго

Ьеи

Рго

Азп

Ьеи

Азп

О1и

Азр

Ьеи

ТЬг

85

90

95

Суз

О1у

Азп

11е

Ьеи

МеВ

Тгр

О1и

А1а

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

ТЬг

О1и

Уа1

100

105

110

11е

О1у

Уа1

ТЬг

Бег

Ьеи

МеВ

Азп

Уа1

Нтз

Бег

Азп

О1у

О1п

А1а

ТЬг

115

120

125

- 13 029346

Ηΐ3

Азр Азп О1у А1а О1у Ьуз

Рго

Уа1

С1п О1у

ТЬг 140

Зег

РЬе

Н1з

РЬе

130

135

РЬе

Зег

Уа1

О1у

О1и

А1а

Ьеи

О1и

Ьеи

С1п

О1у

Уа1

Ьеи

РЬе

Азп

145

150

155

160

Туг

Агд

ТЬг

Ьуз

Туг

Рго

Азр

О1у

ТЬг

11е

РЬе

Рго

Ьуз

Азп

А1а

ТЬг

165

170

175

ναι

О1п

Зег

О1п

Уа1

МеЕ

Азп

ТЬг

О1и

Н1з

Ьуз

А1а

Туг

Ьеи

Азр

Ьуз

180

185

190

Азп

Ьуз

А1а

Туг

Рго

Уа1

О1и

Суз

Тгр

Уа1

Рго

Азр

Рго

ТЬг

Агд

Азп

195

200

205

О1и

Азп

ТЬг

Агд

Туг

РЬе

О1у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

О1у

О1и

Азп

Уа1

Рго

210

215

220

Рго

Уа1

Ьеи

Н1з

11е

ТЬг

Азп

ТЬг

А1а

ТЬг

Уа1

Ьеи

Азр

О1и

225

230

235

240

РЬе

О1у

Уа1

О1у

Рго

Ьеи

Суз

Ьуз

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Туг

Ьеи

Зег

А1а

245

250

255

ναι

Азр

Уа1

Суз

О1у

МеЕ

РЬе

ТЬг

Азп

Агд

Зег

О1у

Зег

С1п

О1п

Тгр

260

265

270

Агд

О1у

Ьеи

Зег

Агд

Туг

РЬе

Ьуз

Уа1

С1п

Ьеи

Агд

Ьуз

Агд

Уа1

275

280

285

Ьуз

Азп

Рго

Туг

Рго

11е

Зег

РЬе

Ьеи

ТЬг

Азр

Ьеи

11е

Азп

Агд

290

295

300

Агд

ТЬг

Рго

Агд

Уа1

Азр

О1у

С1п

Рго

МеЕ

Туг

О1у

МеЕ

Азр

А1а

С1п

305

310

315

320

ναι

О1и

Уа1

Агд

Уа1

РЬе

О1и

О1у

ТЬг

О1и

Ьеи

Рго

О1у

Азр

325

330

335

Рго

Азр

МеЕ

Агд

Туг

Уа1

Азр

Ьуз

Туг

О1у

С1п

Ьеи

О1п

ТЬг

Ьуз

340

345

350

МеЕ Ьеи

<210> 8 <211> 30

<212> ДНК

- 14 029346

30

<213>

Искусственная последовательность

<220>

<223>

Праймер Р» для ПЦР

<400> 8

дЕЕЕЕадЕаа дсадсаЕсЕа ЕадсадаЕас

<210> 9

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер Κθν для ПЦР

<400> 9

ЕдасЕЕасЕа ааассссЕаа даЕдсЕсаЕс Едд 33

<210> 10

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер Р» для ПЦР

<400> 10

сасЕсЕааЕд ддсааддаас ЕсаЕдссдсЕ ддЕддаддд

39

<210> 11

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер Κθν для ПЦР

<400> 11

сЕЕдсссаЕЕ ададЕдсаса ЕЕсаЕсааас 30

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Моноклональное антитело, направленное против белка УР1 вируса 1С. отличающееся тем, что является антителом человека и способно нейтрализовать вирус ГО причем антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность 8ЕО ГО N0: 1 и вариабельная область легкой цепи содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 2, или вариабельная область тяжелой цепи кодируется последовательностью 8Е0 ГО N0: 3 и вариабельная область легкой цепи кодируется последовательностью 8Е0 ГО N0: 4.
2. Моноклональное антитело по п.1, которое способно связываться с конформационным эпитопом белка УР1 1СУ, содержащим по меньшей мере один аминокислотный остаток первичной последовательности белка УР1 1СУ, выбранный из группы, состоящей из 162, 865, А127, Ό130, N131, А133, А175 и любого их сочетания.
3. Моноклональное антитело по п.2, где конформационный эпитоп белка УР11СУ содержит аминокислотные остатки 162, 865, А127, Ό130, N131, А133 и А175 первичной последовательности белка УР1 ГОУ.
4. Моноклональное антитело по любому из пп.1-3, которое представляет собой полноразмерный иммуноглобулин или функциональный фрагмент иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Ρν, одноцепочечных антител (8сРу) и однодоменных антител.

- 15 029346
5. Применение моноклонального антитела по любому из пп.1-4 для терапевтического или профилактического лечения инфекции 1СУ или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ.
6. Применение по п.5, где заболевание, связанное с инфекцией 1СУ, представляет собой прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ).
7. Фармацевтическая композиция для терапевтического или профилактического лечения инфекции 1СУ или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ, содержащая моноклональное антитело по любому из пп.1-4.
8. Применение фармацевтической композиции по п.7 для терапевтического или профилактического лечения инфекции 1СУ или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ.
9. Применение по п.8, где заболевание, связанное с инфекцией 1СУ, представляет собой прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ).
10. Способ ίπ νίΐΓΟ диагностики инфекции К'У или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ, включающий стадию приведения биологического образца пациента, у которого подозревают инфекцию 1СУ, в контакт с моноклональным антителом по любому из пп.1-4 в условиях, подходящих для связывания моноклонального антитела с антигеном УР1 1СУ при его наличии в образце, и стадию качественной или количественной детекции связывания моноклонального антитела с антигеном УР1 1СУ, где такое связывание указывает на инфекцию 1СУ или заболевание, связанное с инфекцией 1СУ.
11. Способ по п.10, где заболевание, связанное с инфекцией 1СУ, представляет собой прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ).
12. Способ по п.10 или 11, который представляет собой иммунологический анализ ЕЫ8Л или иммунологический флуоресцентный анализ или иммуногистохимический анализ.
13. Иммунодиагностический набор для диагностики инфекции 1СУ или заболевания, связанного с инфекцией 1СУ, содержащий моноклональное антитело по любому из пп.1-4 и инструкции для проведения способа ίπ νίΐΓΟ иммунодиагностики.
14. Иммунодиагностический набор по п.13, где указанный способ ίπ νίΐΓΟ иммунодиагностики представляет собой способ по любому из пп.10-12.
15. Набор по п.13 или 14, где заболевание, связанное с инфекцией 1СУ, представляет собой прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ).
16. Способ нейтрализации вируса 1СУ у человека, страдающего инфекцией 1СУ, включающий введение пациенту эффективного количества моноклонального антитела по любому из пп.1-4.

Ь* Ъ Ъ Л

образцы