KR20150023893A

KR20150023893A - Jc 바이러스의 vp1 단백질에 대한 인간 단클론 항체

Info

Publication number: KR20150023893A
Application number: KR1020157002126A
Authority: KR
Inventors: 로베르토 부리오니; 마시모 클레멘티
Original assignee: 포모나 리세르사 에스.알.엘.
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2015-03-05
Also published as: CN104520318B; BR112014032682B1; EA201590111A1; US10011648B2; JP2015524389A; EP2867257A2; EP2867257B1; JP6320375B2; MX2014015850A; CA2877598C; EA029346B1; US20150191530A1; CA2877598A1; CN104520318A; MX356745B; ES2673230T3; ITTO20120570A1; KR102085305B1; BR112014032682A2; WO2014002035A2

Abstract

본 발명은 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)의 원인이 되는 바이러스인, JC 바이러스의 VP1 단백질에 대한 인간 중화 단클론 항체, 및 JCV 감염 또는 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)과 같은 JCV 감염과 연관된 질환의 치료적 또는 예방적 치료에서 그의 용도, 및 JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환의 진단에서 그의 용도에 관한 것이다.

Description

JC 바이러스의 VP1 단백질에 대한 인간 단클론 항체 {A HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE VP1 PROTEIN OF JC VIRUS}

본 발명은 면역학 분야 안에 있고, 특히 바이러스 병원체의 항원에 대한 중화(neutralizing) 항체의 분야 안에 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 JC 바이러스(JCV)의 VP1 단백질에 대한 단클론 항체에 관한 것이다.

JC 바이러스 (JCV)는 폴리오마비리다에 과(Polyomaviridae fiamily)의 인간 폴리오마바이러스이며, 진행성 다소성 백질뇌증 (progressive multifocal leukoencephalopathy, PML)으로 지칭되는, 매우 심각하고, 종종 치명적인, 탈수초성(demyelinating) 질환에 대해 원인이 되는 물질이다. JC 바이러스는 원형 이중-가닥 DNA 게놈을 에워싸는, 외피가 없는(envelope-less) 20면체(icosahedral) 캡시드를 갖는다. 주요 캡시드 성분은 바이러스 단백질 VP1이다. 비리온에 대한 구조적 연구는 폴리오마바이러스 캡시드가 C 말단(terminal end)을 통해 연결된 VP1 모너머에 의해 형성된 72 펜타머로 이루어지는 것을 밝혔다. VP1은 표적 세포 상의 수용체에 결합하고, 그렇게 함으로써 감염을 시작한다.

JC 바이러스는 성인 인간의 85% 초과를 감염시킨다. 일차 감염 후, JC 바이러스는 신장 및 림프 기관에 정지상태로(quiescent) 머무른다. 건강한 개체에서 이 바이러스는 임의의 질환을 유발하지 않고, 신장 소관(tubule) 세포에서 복제할 수 있고 요도에서 배출된다. 그러나, 극심한 면역-억제의 경우에, 기관 이식을 받은 개체에서, 종양성(oncologic) 환자에서, 신규 단클론 항체-기반 면역조절 요법에 의해 치료받는 환자에서, 또는 AIDS로부터 고통받는 사람들에서, JC 바이러스는 중추 신경계로 퍼지고 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)을 유발할 수 있다. cART (조합 항레트로바이러스 요법(combination antiretroviral therapy)) 이전 시대에서, HIV 환자에서 PML 발생율은 0.3% 내지 8% 범위이나, 항레트로바이러스 치료의 광범위한 이용은 그의 유의한 감소를 가져왔다. HIV 감염은 PML과 가장 흔히 연관되는 면역결핍증의 원인으로 케이스의 약 80%이고, 혈액 종양 (약 8%), 고형 종양 (약 3%), 기관 이식, 및 면역조절제로 치료된 자가면역 질환이 그 뒤를 따른다.

그러나, 지난 10 년 간 점점 더 많은 수의 비-HIV/AIDS-관련된 PML 사례가 보고되었다. 다수의 이 새로운 케이스들은 최근 이용가능한 약물에 의한 면역요법에 적용되는 개체에서 발생한다. 2012년 2월 29일까지, 전 세계에서 이 약물로 치료받는 다발성 경화증으로부터 고통받는 99571명의 환자에 대해, 나탈리주마브 치료와 관련된 PML의 212 사례가 기록되었다. PML은 또한 에팔리주마브, 마이코페놀레이트 모페틸, 및 리툭시마브를 포함하는, 다른 면역조절 요법과도 상관 있다.

PML의 치료를 위해, 예를 들면 표적 세포 안으로의 도입 및 게놈의 복제와 같은, 상이한 바이러스 복제 주기 단계를 겨냥하는, 여러 치료 전략이 시도되었다. 그러나, 그것들 중 어느 것도 유의한 이로운 효과를 제공하지 않았다. PML과 극심한 면역-억제 상태(condition) 사이의 관련성에 기반하여, 면역학적 접근이 또한 시도되었다. 예를 들어, 보다 좋은 예후를 갖는 PML로부터 고통받는 환자는 더욱 강력한 JCV-특이적 세포-매개 및 체액성 반응이 특징인 것으로 나타났다. 특이적 항-JCV 반응의 (특히 VP1에 대한) 잠재적인 중요성은, JCV VP1 단백질에 의해 면역화된 동물 (토끼) 혈청의 강력한 중화 활성에 의해 확인되었다 (Goldmann C et al. Journal of Virology, May 1999, pages 4465-4469).

따라서 항-JCV 항체에 기반한 대안적 요법이 PML로부터 고통받는 환자의 치료에 적용될 수 있다. 특히, JCV 감염의 초기 단계에서의 VP1 단백질의 핵심 역할을 고려하면, 가장 최선의 후보자는 JCV VP1 단백질에 대한 항체일 수 있다.

그와 같은 요구는, PML의 치료적 처치에서 사용하기에 적합하도록 만드는, JCV VP1 단백질에 대한 완전(fully) 인간 단클론 항체를 수득하고 상기 바이러스에 대해 중화 활성을 갖는 것에, 최초로 성공한, 본 발명자들에 의해 이제 충족되었다.

이 결과들은 어떠한 인간 항-JCV VP1 단클론 항체도, 특히 인간 항-JCV VP1 중화 단클론 항체는 지금까지 기술되지 않았기 때문에, 당해 기술분야의 상태를 고려하면 새롭고 놀라운 것으로 여겨진다.

Goldmann C et al. 서두(supra)는 JCV에 대한 중화 특성을 갖는 바이러스-유사 입자에 의해 유발되는 토끼 항-VP1 항체를 갖는 과-면역(hyper-immune) 혈청을 기술한다.

일본 특허 출원 JP9067397A는 VP1 단백질의 부위에 해당하는 합성 펩티드에 의해 쥐를 면역화시키는 단계, 쥐로부터 면역 혈청을 수거하는 단계, 및 감마-글로불린의 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 중화 항-JCV 항체를 수득하는 방법을 언급하였다. 이 특허에서 단클론 항체의 선별, 특히 남성으로부터 유래된 것이라는 것은 언급되지 않았다.

영국, Abcam^®에 의해 판매되는, ab34756로 명명되는 항-JCV VP1 단클론 항체는 ELISA 및 웨스턴 블롯을 통해 바이러스를 검출하는데 이용되는 뮤라인 항체로, 명백히 치료적 적용에 적합하지 않으며, 특히 인간에서 가장 적합하지 않다.

따라서, 선행 기술의 어떤 항-JCV 항체도 인간 환자에서 JCV 감염 또는 인간 환자의 JCV 감염과 관련된 질환을 위한 치료적 또는 예방적 적용에 이용하기에 잠재적으로 적합하지 않았을 것이다.

또한 본 발명자들에 의해 행해진 테스트 이전에, 항-JCV 항체의 존재가 인간 체액성 반응에서 정확하게 평가된 어떠한 과학적 문헌도 이용가능하지 않았기 때문에 당해 기술 분야의 통상의 기술자들이 JC 바이러스를 중화시킬 수 있는 완전 인간 항-JCV 단클론 항체를 수득하는 것을 합리적으로 예상하지 않았을 것이라는 것이 지적되었다. 예로서, G. Bloomgren et al. N Engl J Med 2012; 366: 1870-80에 의한 논문이 언급되며, 저자들은 다발성 경화증으로부터 고통받는 환자에서 PML에 대한 위험도 계층화(risk stratification)를 제안한다. 위험도 계층화를 위해, 저자들은 항-JCV 항체의 존재 또는 부존재, 면역억제제의 이전의 사용, 및 나탈리주마브에 의한 치료 기간의 3가지의 위험 요인을 제안하지만, 그들은 인간 체액성 반응에서 중화 항체의 존재의 어떠한 평가도 제안하거나 언급하지 않는다. 반면, 선행 기술은 예를 들면 Raphael P. Viscidi and Barbara Clayman, Advances in experimental medicine and biology 2006; 577(): 73-84 및 Wendy A. Knowles, Advances in experimental medicine and biology 2006; 577(): 19-45에서, 인간에서의 체액성 항-JCV 반응의 검출과 연관된 기술적 문제를 지적한다.

따라서, 본 발명의 첫째 목적은 인간 항체이고 JC 바이러스를 중화시킬 수 있는 사실을 특징으로 하는, JC 바이러스의 VP1 단백질에 대한 단클론 항체이다.

본 발명의 범주 안에서, 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 항원, 이 경우 JCV VP1 단백질에 결합할 수 있는 임의의 펩티드 구조를 의미하는 것으로 의도된다. 따라서 이 용어는 전장(full-length) 면역글로불린 및 일반적으로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하나, 또한 단일 가변 도메인을 포함할 수 있는, 기능적 면역글로불린 단편을 포함한다. 기능적 면역글로불린 단편의 특정한, 그러나 제한되지 않는 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 단편, 단일쇄 항체 (scFv), 및 단일 도메인 항체이다. 단일쇄 항체는 예를 들면 Ladner 등의 US 4,946,778 특허에서 기술된 방법에 따라 만들어진다. 단일쇄 항체는 유연한(flexible) 결합 모이어티 (링커)를 통해 연결된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 단일 도메인 항체로 명명되는 항체 단편은 그것이 단리된 단일 VH 도메인을 포함하기 때문에, 단일쇄 항체보다 훨씬 작다. 전장 항체와 적어도 부분적으로 동일한 결합 능력을 갖는 단일 도메인 항체를 수득하기 위한 기법은 공지 기술에서 기술되었고, 당해 기술 분야의 통상의 기술자의 기술 안에 있다. "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli, Nature 341: 544-6에서 Ward, 등은 단리된 형태로 그에 결합하기에 충분히 강력한 표적 에피토프에 대한 친화도를 갖는 항체의 중쇄 가변 영역 (VH 단일 도메인 항체)을 수득하기 위한 스크리닝 방법을 기술한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"은 모너머 및 폴리머 형태로, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4를 포함), IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함한다.

용어 "JC 바이러스를 중화시키는(neutralizing the JC virus)" 또는 "JC 바이러스를 중화시킬 수 있는(capable of neutralizing the JC virus)"은 본 발명의 단클론 항체 목적이 JC 바이러스 복제 주기를 그의 단계 중 하나에서 차단할 수 있고, 그렇게 함으로써 그것의 생물학적 활성 및 그와 함께 연관된 하나 이상의 질병에 영향을 미치는 것을 의미한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-JCV 단클론 항체는 I62, S65, A127, D130, N131, A133 및 A175, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 JCV VP1 단백질의 일차 서열의 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는, JCV VP1 단백질의 입체형태적(conformational) 에피토프에 결합할 수 있다. 보다 특정한 구체예에서, 입체형태적 에피토프는 JCV VP1 단백질의 일차 서열의 아미노산 잔기 I62, S65, A127, D130, N131, A133 및 A175를 포함한다.

아미노산 잔기의 넘버링(numbering)은 Mad1 균주 유래의 VP1 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 7)의 넘버링에 기반한다. 서열번호 7은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스 (Swiss ID: P03089 특성 식별자(feature identifier): PRO_0000115021)에서 이용가능하다.

용어 "입체형태적 에피토프(conformational epitope)"는 단백질의 일차 서열에서 인접하지(contiguous) 않는 경우에도, 항체와의 결합에 직접적으로 포함되거나, 또는 단백질의 전반적 형태를 변화시키지 않기 위해 돌연변이되는 경우에도 항체 그 자신의 모든 동일한 결합 친화도에 영향을 미치는, 모든 아미노산 잔기를 의미하는 것으로 의도된다.

더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 단클론 항체는 적어도 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1의 서열을 갖고 (또는 서열번호 3의 서열에 의해 코딩됨), 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2의 서열을 갖는다 (또는 서열번호 4의 서열에 의해 코딩됨). 그러한 특정한 단클론 항체는 또한 GRE1로 명명된다.

본 발명의 다른 양태는 JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환, 바람직하게는 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)의 치료적 또는 예방적 치료에 사용하기 위한, 이전에 정의된 JC 바이러스의 VP1 단백질에 대한 인간 단클론 항체이다.

본 발명의 범주 안에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물 안으로 유효 용량의 확인 및 본 발명의 단클론 항체의 제제화는 지나친 진보적인 노력 없이, 당해 기술 분야의 통항의 기술자의 기술 안에 있다.

본 발명의 단클론 항체는 또한 그것이 높은 민감도 및 특이도를 특징으로 하기 때문에 진단 분야에서 이용하기에 적합하다. 단클론 항체는 Mad1 균주 유래의 재조합 VP1에 대해 높은 친화도 (약 1nM)를 나타냈고, 상용 뮤라인 항체 (Abcam^®)와 동일한 농도에서, ELISA에 의한 높게 개선된 신호를 보여준다. JCV-감염된 (Mad4 균주) COS-7 세포에서 수행된 면역형광 분석에 의해 평가되는 경우에도, 상기 항체는 상용 Abcam^®항체와 비교하여 보다 높은 민감도 및 특이도를 나타냈다. 게다가, 본 발명의 단클론 항체가 ELISA에 의해 재조합 BKV VP1 (JCV와 같이 폴리오마비리다에 계에 속하는 바이러스; JCV 및 BKV VP1은 대략 75%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 보임)에 대한 어떠한 반응성도 나타내지 않으며, 그렇게 함으로써 유일하게 JCV VP1에 대해 그것의 높은 특이도를 나타낸다는 것을 주목하는 것이 중요하다.

따라서, 본 발명의 단클론 항체가 JCV-특이적 진단 시약으로서 이용되는, JCV 감염의 진단에 대한 인 비트로 진단 방법 및 관련 키트는 본 발명의 범주 안에 있다.

인 비트로 면역진단 방법은 만일 시료에 존재할 경우 JCV VP1 항원에 본 발명의 단클론 항체가 결합하기에 적합한 조건 하에서, JCV에 의해 감염된 것으로 의심받는 환자 유래의 생물학적 시료를 본 발명의 단클론 항체와 접촉시키는 단계 및 본 발명의 단클론 항체와 JCV VP1 항원 사이의 결합을 정성적 및 정량적으로 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 면역진단 방법은 예를 들면 ELISA 면역효소적 분석 또는 면역형광 분석으로 수행된다. 분석이 수행되는 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 세팔로-라키딕(cephalo-rachidic) 액체, 생검(biopsy), 또는 적합한 것으로 간주되는 기타 생물학적 시료이다.

상기 방법을 수행하기 위한 면역진단 키트는 특이적 시약으로서 본 발명의 단클론 항체, 및 분석을 수행하기 위한 설명서, 및 결국 분석의 유형에 따라 다양하고, 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된, 기타 성분을 포함한다. 키트에 선택적으로 포함될 수 있는 추가 성분의 예는, 하나 이상의 고형 지지체 (예를 들면 마이크로타이터(microtiter) 플레이트와 같은), 블랭크(blank) 용액, 공지된 양의 관심대상의 항원을 포함하는 하나 이상의 표준 용액, 대조군 용액 테스트되는 시료의 희석 용액, 검출가능한 마커 (예를 들면 형광 분자) 또는 검출가능한 산물을 형성하는 기질과 반응가능한 효소와 연결된 검출 항체, 버퍼 세척 용액, 효소 기질을 포함하는 용액, 중지 용액(stop solution), 등의 항체와 항원 사이의 성공적 결합의 정성 및/또는 정량 검출을 위한 수단이다.

본 발명의 방법 및 키트는 다양한 소인성(predisposing) 조건을 갖는 환자에서 PML이 발병할 위험을 계층화하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

다음의 실시예들은 본 발명의 범주 안의 인간 중화 단클론 항체의 확인 및 특성 규명, 및 상기 항체에 의해 인식된 에피토프의 특성 규명을 설명한다. 이 실시예들은 첨부된 청구항에서 정의된 본 발명의 범주의 예시로서, 그리고 제한 의도 없이 오직 제공된다.

실시예 1

전술된 것과 유사한 방법을 통해 pPD 파지미드 벡터에서 IgG1/k 동형의, 2x10⁷ 요소(element) 추정 크기를 갖는 인간 항체 단편 (1가 Fab)의 조합 파지 디스플레이 라이브러리(combinatorial phage display library)를 제조하였다 (Plaisant, P., et al., Human monoclonal recombinant Fabs specific for HCV antigens obtained by repertoire cloning in phage display combinatorial vectors. Res Virol, 1997. 148(2): p. 165-9). ELISA에 의해 그의 혈청이 항-VP1/JCV 항체의 존재에 대해 양성으로 검정된 68세 남성의 골수로부터 라이브러리를 생성하였다. 인산완충식염수(PBS) 중 100 ng/웰의 재조합 JCV VP1 단백질(Mad1, Abcam^®)에 의해 96-웰 플레이트를 코팅함으로써 ELISA를 수행하였다. 수 개의 혈청 희석액을 2회 반복으로(in duplicate) VP1-코팅 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 0.1% PBS/TWEEN 20으로 세척하였다. 결합된 항체를 퍼옥시다제와 결합된 항-인간 IgG1 항체 (HRP) (Sigma-Aldrich^®)에 의해 검출하였다.

항-VP1 항체를 선별하기 위해 파지-발현 조합 항체 라이브러리의 바이오패닝(biopanning)을 전술된 바와 같이 수행하였다 (Williamson, R.A., et al., Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries . Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(9): p. 4141-5). 요약하면, Mad1 균주 유래 VP1에 의해 코팅된 고(high)-결합 ELISA 플레이트 (Costar^®) 상에서 항체를 선별하기 위하여 각 바이오패닝 사이클에서 밀리리터 당 10¹²개의 파지 농도의 파지 제제(phage preparation)(0.1 ml/웰)를 사용하였다. 총 5회의 바이오패닝 사이클을 수행하고 마지막 3회 사이클로부터 수득된 파지를 가용성 Fab를 발현하는 파지미드 시스템으로 변환하였다.

추가의 특성 규명을 위해 선별된 Fab 분자를 생산하기 위하여 Fab 발현 벡터에 의해 형질전환된 XL-1-블루 균주 유래 에세리키아 콜라이 세포 (Agilent Technologies^®)를 이용하였다. 요약하면, 배양물로부터 동결-융해 과정에 의해 Fab 제제를 얻었다. 5 ml의 앰피실린 함유 (50 mg/ml; Sigma-Aldrich^®) SB (수퍼 브로스(super broth))를 형질전환된 박테리아로 접종하고 회전 교반기에서 37℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG, 1mmol/l; Sigma-Aldrich^®)를 성장중인 박테리아에 첨가하여, 30℃에서 밤새 더 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 원심분리하고, 1 ml의 PBS/1% 우혈청알부민 (BSA) 중에 재현탁하고, 동결-융해 과정 (3 라운드)을 수행하였다. 세포 파편을 소형원심분리기(microfuge)에서 실온에서 13000 g로 원심분리에 의해 펠릿으로 만들고, 상층액을 추가 과정 없이 ELISA 분석에서 이용하였다. ELISA를 전술된 바와 같이 수행하였다.

JCV VP1에 대한 ELISA에 의해 OD₄₅₀> 0.8의 수율을 낸 클론을 양성으로 고려하고 추가로 규명하였다.

105개의 클론을 분석하고, 11개의 클론을 양성으로 검정하였다 (10.5%). BSA에 대한 반응성은 입증되지 않았다.

ELISA에 의한 양성 클론의 특이도를 확인하기 위하여, 이들 클론을 Mad4 JCV 균주에 의해 감염된 COS-7 세포 (Transformed African Green Monkey Kidney Fibroblast Cell) 상에서 면역형광 분석에 의해 테스트하였다 (Mad1 균주 유래 재조합 VP1 단백질을 ELISA에서 이용). 플루오레세인 이소티오시아네이트와 결합된 고트 항-인간 Fab 항혈청 (Sigma-Aldrich^®)을 2차 항체로 이용하였다. 모든 ELISA-검정 양성 클론은 감염된 세포에 결합할 수 있는 것으로 확인된 반면, 감염되지 않은 세포에 의해서는 반응성이 검출되지 않았다. ELISA-검정 음성 클론은 감염된 세포에 결합할 수 없었다.

ELISA-검정 양성 클론 유래 핵산을 Spin Miniprep 키트(Qiagen^®)에 의해 수득하고 373A 염기서열분석기 (PerkinElmer^®)에서 시퀀싱하였다. 중쇄를 시퀀싱하기 위하여, (+) 가닥에 결합하는 프라이머 SEQGz (5'-GTCGTTGACCAGGCAGCCCAG-3') (서열번호 5)를 이용하였다. 경쇄를 위하여, (+) 가닥에 결합하는 프라이머 SEQKb (5'-ATAGAAGTTGTTCAGCAGGCA-3') (서열번호 6)를 이용하였다. BLAST 및 IMGT 도구에 의해 서열 분석을 수행하고, 모든 클론이 중쇄에 대한 VH 유전자 및 경쇄에 대한 Vk 유전자의 동일 서브패밀리로부터 유래된다는 것과, 동일한 서열을 공유한다는 것을 보여주었다. 또한, 항체의 DNA 서열은 신규한 것이다. 이는, 지금까지 문헌에서 인간 항체가 JCV VP1 단백질을 겨냥하는(directed) 것으로 기술된 적이 없었다는 것을 가리킨다는 점에서도 또한 중요하다. 그러므로, 이것은 기술되는 첫번째 인간 항-JCV VP1 단클론 항체이다. 이 항체는 명칭 GRE1로 식별되었다.

인간 항-VP1 GRE1 항체의 중화 활성을 테스트하기 위하여, 5x10⁴/웰 COS-7 세포를 24-웰 플레이트 (Corning^®)에 있는 완전 DMEM 배지에 씨딩하였다. COS-7은 JCV에 의한 감염이 허용된 세포이다.

그 다음날, JCV (Mad4 균주)의 약 100 포커스 형성 유닛(focus forming unit)을 GRE1의 점진적(progressive) 희석액 100 μl에 첨가하였다 (2-배 희석, 약 20 ㎍/ml 내지 0.3 ㎍/ml). 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 한 후 COS-7 세포에 첨가하였다. 그 후, 그들을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS에 의한 1회 세척 후, 500 μl의 신선한 배지를 각 웰에 첨가하고 세포를 6일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

중화 활성의 평가

항체의 중화 활성을 면역형광법에 의해 평가하였다. 요약하면, 감염 후 6일차에 면역형광법을 수행하였다. 제조사의 가이드라인에 따라, 세포를 15분 동안 메탄올/아세톤 혼합액 (1:1 비율)으로 실온에서 고정시키고 상용 Abcam^® 쥐(뮤라인) 항-VP1 항체 (1 ㎍/ml)를 1차 항체로 이용하고, FITC-접합된 뮤라인 항-Fab (Sigma-Aldrich^®)를 2차 항체로 이용함으로써 슬라이드를 제조하였다.

바이러스가 GRE1에 첨가된 웰에서의 양성 세포의 수를, 항체의 부재하에서 감염된 세포 (100% 감염)와 비교함으로써 평가를 수행한다.

또한, 형광 현미경 하에서 관찰된 데이터를, 배경으로부터 양성 세포를 자동으로 구별할 수 있는 로봇화된 형광 판독 시스템 (IN Cell Analizer Sistem 1000, GE Healthcare)에 의해 확인하였고, Fab 단편으로서의 항체가 1 ng/μl의 농도로 50%를 초과하는 JCV 감염까지 억제할 수 있다는 것을 나타냈다.

또한, 유사 실험은 JCV VP1에 대해 반응성인 환자 유래의 모든 혈청이 바이러스를 중화시킬 수 있는 것은 아니라는 것을 실험적으로 입증하였다.

이러한 목적으로, 항-JVC 항체의 존재를 확인하기 위하여 약 100개의 혈청을 1:400 희석률 (PBS/1% BSA 중 희석)로 ELISA에 의해 시험하였다. 요약하면, ELISA 플레이트 (Costar^®)를 100 ng의 재조합 VP1 (Abcam^®)을 함유하는 용액 25 μl/웰 로 덮고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 플레이트를 물로 세척하고 PBS-1% BSA (w/v)로 1시간 동안 37℃에서 블로킹하였다. 그 후, 시험될 혈청의 단일 희석액 (PBS/1% BSA 중 1:400) 40μl을 첨가한 후 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제조사에 지시에 따라, ELISA 마이크로플레이트에 대한 자동 세척기 (ETI-System Kasher, DiaSorin)에 의해, PBS-0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich^®)으로 5회 세척한 후, 40 μl/웰의 상용 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항-인간 Ig G 항체를 첨가하였다 (Sigma-Aldrich^®). 그 후, 플레이트를 45분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 수 회 세척한 후, 효소 반응이 일어나도록 전술된 바와 같이, 40 μl의 기질 (H₂O₂ 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 1:1 용액, TMB substrate kit, Thermo Scientific)을 각 웰에 첨가하였다. 약 15분 후, 효소 활성을 40 μl/웰의 1N H₂SO₄ (Carlo Erba)을 첨가함으로써 블로킹하고, 분광광도계 (Model 680 Microplate Reader, Bio-Rad)에 의해 450nm의 파장에서 발색 반응을 측정하였다.

BSA 항원 또는 다른 적합한 항원을 각 실험에서 음성 대조군으로 도입하고, 그의 O.D.₄₅₀를 가능한 비-특이적 반응성을 검출하는데 이용하였다.

JCV VP1 >1 O.D. 450에 대해 반응성을 나타내는 소량의 혈청을 중화도(neutralization) 분석에 의해 분석하였다. 요약하면, 감염 전날, 5x10⁴/웰 COS-7 세포 (JCV에 의한 감염이 허용됨)를 24-웰 플레이트 (Corning^®)의 완전 DMEM 배지 중에 씨딩하였다. 그 다음날, 200 μl의 JCV (Mad1)-함유 배지를 테스트될 혈청의 1:200 희석액 중 200 μl에 첨가하였다 (혈청의 최종 희석률은 1:400, ELISA 분석에 대해 사용된 동일 희석률). 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, COS7 세포에 첨가하였다. 그 후, 그들을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 1회의 PBS 세척 후, 500 μl의 신선한 배지를 각 웰에 첨가하고 세포를 6일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

테스트된 시료의 중화 활성을 간접 면역형광법에 의해 평가하였다. 제조사에 의해 제공된 가이드라인에 따라, 세포를 15분 동안 메탄올/아세톤 혼합액 (1:1 비율)으로 실온에서 고정시키고 상용 Abcam^® 뮤라인 항-VP1 항체 (1 ㎍/ml)를 1차 항체로 이용하고, FITC-접합된 뮤라인 항-IgG (Sigma-Aldrich^®)를 2차 항체로 이용함으로써 슬라이드를 제조하였다.

바이러스가 테스트된 시료에 첨가된 웰에서의 양성 세포의 수를, 시료의 부재하에서 감염된 세포 (100% 감염)와 비교함으로써 평가를 수행하였다.

이 분석은, ELISA에 의한 VP1에 대한 반응성에도 불구하고, 무시될 수 없는 개수의 혈청이 항-JCV 활성을 중화시키지 않는다는 것을 보여준다는 것을 입증하였다. 수득된 결과는 도 1의 그래프에 나타난다. 도 1의 그래프에서 테스트된 혈청 중 일부의 중화 활성 퍼센트가 기록되어 있다. 모든 기록된 혈청이 VP1 지향 반응성이 >1 O.D.450라는 것을 ELISA에 의해 입증하였다.

생검 시료에서의 면역형광법 및 면역조직화학법

면역형광법 및 면역조직화학법 분석에서 본 발명의 항-JCV VP1 GRE1 항체를 이용함으로써, 생검 시료에서 JCV의 존재가 결정될 수 있다. 실제로 이 항체는 JCV VP1 단백질에 대한 높은 민감도 및 특이도를 나타낸 반면, 반대로 BKV VP1에 대해서는 반응성을 보이지 않았다.

생검 시료는 신선한(fresh) 또는 고정된 또는 파라핀화된 시료일 수 있다. 고정된 및 파라핀화된 시료의 경우, 필요하다면, 표준 절차에 따라 시료는 탈파라핀화되고(deparaffinized) 항원성이 회복된다. 그 후, 시료를 37℃에서 30분 동안 GRE1 (PBS 중 10 μl/ml)과 함께 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 제조사의 가이드라인에 따라, 시료를 PBS 중에 5회 세척한 다음, FITC- 또는 홀스래디쉬-퍼옥시다제-접합 항-인간 Fab (Sigma-Aldrich^®)에 의해 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다 . 홀스래디쉬 퍼옥시다제와 접합된 항체의 사용의 경우, 퍼옥시다제의 존재하에서 가능한 항체 결합을 가시화하게 만드는 갈색 침전물을 생성하는, 기질 (디아미노벤지딘, DAB substrate kit , Thermo Scientific)을 첨가하는 것이 요구된다.

FITC-접합 항체를 이용할 경우 형광 현미경하에서 또는 자동화된 형광 검출 시스템에 의해 시료를 관찰함으로써, 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항체를 이용할 경우 광학 현미경에 의해 또는 자동화 이미징 시스템에 의해 이 분석의 평가를 수행한다.

생물학적 시료 중 JCV 를 검출하기 위한 포획 ELISA

인간 항-JCV VP1 GRE1 항체에 의한 ELISA 분석을 수행하기 위하여, ELISA 플레이트(Costar^®)를 PBS 중 40 ng의 양(sheep) 항-인간 Fd 항체를 함유한 용액 25 μl/웰 (1.6 ㎍/ml 최종 농도)로 덮고 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 그 다음날, 플레이트를 물로 세척하고 1시간 동안 37℃에서 PBS-1% BSA (w/v)에 의해 블로킹한다. 그 후, 40 μl의 GRE1 (PBS/1% BSA 중 최종 농도 약 4 ng/ml)를 웰마다 첨가한 다음 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. ELISA 마이크로플레이트에 대한 자동 세척기 (ETI-System Kasher, DiaSorin)에 의해, PBS-0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich^®)로 5회 세척한 후, 테스트될 생물학적 시료의 여러 희석액 40 μl (연속 10-배 희석, 미희석부터 1:1000까지의 희석률)를 각 웰에 첨가한다. 그 후, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 수 회 세척한 후, 전술된 바와 같이, 상용 뮤라인 항-VP1 항체 (PBS/BSA 중 희석된 Abcam^®)의 1:1000 희석액 중 40 μl를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에 휴지상태로 방치한다. 추가 세척 후, 고트 항체의 폴리클로날 제제 40 μl/웰을 첨가하고, 그것을 뮤라인 IgG의 Fc 부위에 접합하고 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (고트에서 생성된 항-쥐 IgG (Fc 특이)-퍼옥시다제 항체, Sigma-Aldrich^®)와 접합한다. 플레이트를 45분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 전술된 바와 같이 수행된 PBS-Tween20에 의한 5회 세척 후, 효소 반응이 일어나도록, 40 μl의 기질 (H₂O₂과 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 1:1 용액, TMB substrate kit, Thermo Scientific)을 각 웰에 첨가한다. 약 15분 후, 40 μl/웰의 1N H₂SO₄ (Carlo Erba)를 첨가함으로써 효소 활성을 블로킹하고 분광광도계 (Model 680 Microplate Reader, Bio-Rad)에 의해 450nm의 파장에서 발색 반응을 측정한다.

BSA 항원 또는 다른 적합한 항원을 각 실험에서 음성 대조군으로 도입하고, 그의 OD₄₅₀을 가능한 비-특이 반응성을 검출하는데 이용한다.

실시예 2

GRE1 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프의 (선형 또는 입체형태적) 속성의 정의

GRE1 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프의 (선형 또는 입체형태적) 속성을 정의하기 위해, 웨스턴 블롯 및 도트 블롯 분석을 변성(denatured) 단백질 및 야생형 단백질 둘 다를 가지고 수행하였다.

도 2는 변성 조건 하에서 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 단백질을 β-머캅토에탄올 (β-mer) 또는 소듐 도데실 술페이트 (SDS)에 의해 변성시켰다. 상용 뮤라인 항체는 Abcam으로 명명되고, 반면 GRE1 항-JCV VP1 단클론 항체는 GRE로 명명된다.

도 3은 변성된 VP1 및 야생형 입체형태(conformation)에서의 VP1에 의해 수행된 도트 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 상용 뮤라인 항체는 Abcam으로 명명되고, 반면에 GRE1 항-JCV VP1 단클론 항체는 IgG GRE로 명명된다.

결과는 GRE1이 단백질의 변성된 형태에 결합할 수 없으나, 비-변성된 단백질만을 인식할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 사실을 확증하기 위해, VP1 선형 에피토프에 대한 상용 뮤라인 항체 (Abcam^®, ab34756)가, 대신에, 두 단백질 형태 모두를 인식할 수 있다. 따라서, 이 결과는 GRE1 단클론 항체에 의해 인식된 에피토프가 입체형태적 에피토프라는 결론으로 이어진다.

GRE1 단클론 항체의 특이성의 정의

BK 바이러스 게놈과 남성을 감염시킬 수 있는 주요한 폴리오마바이러스인, JCV 게놈 사이의 높은 뉴클레오티드 서열 상동성 (대략 70%)은, 문헌에서 광범위하게 기술되었다.

GRE1이 오직 JCV를 인식할 수 있는 지를 결정하기 위해, 재조합 JCV VP1 단백질 (Abcam^®, ab74569) 및 재조합 BKV VP1 단백질에 (Abcam^®, ab74567)에 대한 그것의 반응성을 ELISA 분석에 의해 테스트하였다. GRE1은 JCV VP1 단백질에만 결합할 수 있는 것으로 판명되고, 이는 그것의 절대적 특이성을 가리킨다.

알라닌 스캐닝 위치-지정 돌연변이에 의해 RE1 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프의 특성 규명

두 단백질 사이에 중요한 차이 (예를 들면 전하 및 극성)를 나타내고 본 발명의 항체가 두 단백질에 대해 갖는 결합 차이에 대해 원인이 될 수 있는 잔기를 포함하는 부위를 확인하기 위하여, JCV VP1 및 BKV VP1 단백질의 아미노산 서열을 ClustalX 프로그램에 의해 정렬하였다. JCV 및 BKV VP1 사이에 완전하게 다른(전하 및 극성과 같은) 33개의 아미노산 잔기를 이 분석을 통해 확인하였다.

GRE1 단클론 항체와의 결합에 포함되는 중요한 VP1 잔기를 알아내기 위해, 이전에 확인된 잔기를 개별적으로 알라닌으로 (또는 원 잔기가 알라닌인 경우, 글리신으로) 돌연변이시켰다. 요약하면, 위치-지정 돌연변이를 Mad1 균주 JCV유래의 VP1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이전에 클로닝하였던 pcDNA^TM 3.1 발현 벡터/V5-His TOPO^®TA 발현 키트 (Life Technologies^TM)에서 수행하였다. 돌연변이에서 이용된 프라이머는 효과적인 돌연변이 산물을 수득하기 위한 방법으로 약 30개의 길이로 이루어진 뉴클레오티드이고, 5' 말단에서 15-20개의 뉴클레오티드 오버랩 영역을 나타내도록 설계되었다. 증폭 반응 후, 주형으로 사용된 메틸화된 DNA를 제거하기 위해, PCR 산물을 효소 DpnI로 37℃에서 4시간 동안 처리하였다(digest). 처리 후, 일렉트로-컴피턴트 세포를 형질전환하기 위해 1 μL의 증폭 산물을 이용하였다. 형질전환된 콜로니를 단리하고 원하는 돌연변이가 삽입되었는지를 분석하기 위해, 시퀀싱에 의해 확인하였다. 그리고 나서 돌연변이된 VP1을 다른 발현 벡터(pCAGEN, Addgene #11160)에 클로닝하였다.

HEK 293T (인간 상피 신장) 세포를 pCAG-VP1mut 벡터로 형질감염시켰고, 이 돌연변이된 VP1와 항-VP1 항체의 결합을 FACS (형광 활성 세포 분류기)에 의해 평가하였다. 요약하면, HEK293T 세포를 돌연변이된 VP1가 클로닝된 벡터 4μg으로 형질감염시켰다. 원심분리 및 4% 파라포름알데히드로 고정화 후, 1 μg/ml의 농도의 삼투화(permeabilizing) 용액 중에 희석된, GRE1 또는 C 말단 선형 서열에 대한 Abcam^® 상용 항체와 함께 형질감염된 세포를 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그리고 나서 제조사(Sigma-Aldrich^®)의 설명서에 따라, 세포를 세척하고, 항-인간 또는 항-마우스 FITC-접합된 단클론 항체와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 후 FACS로 분석하였다. 비-감염 세포를 음성 대조군으로 사용하는 것 대신, 비-돌연변이된 VP1 단백질에 의해 관찰된 반응성을 100% 결합으로서 간주하였다.

소프트웨어 GraphPad Prism을 FACS에 의해 얻어진 데이터의 분석 및 그래픽 편집에 이용하였다.

FACS 분석에 의해, 돌연변이되는 경우, 결합이 파괴된 잔기는 다음인 것으로 관찰되었다: I62A, S65A, A127G, D130A, N131A, A133G, A175G (위치 1의 Met로부터 시작하는 넘버링을 갖는, Mad1 균주 VP1의 잔기에 기반한 아미노산 넘버링) (도 4). 대신에, 단백질의 입체형태를 변화시키거나 인 비트로에서 그의 발현을 급격하게 감소시시킬 수 있는 돌연변이된 잔기는 이 분석에서 고려되지 않았다.

이미 이전에 문헌에서 기술되었고 접근 코드(accession code) 3NXG (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3NXG)에 의해 프리-접근 RCSB-PDB 데이터뱅크 (www.rcsb.org)에 제출되었던 결정구조적(crystallographic) 모델을 GRE1에 의해 인식되는 에피토프의 구조적 특성 규명에 이용하였다. 이 모델의 이용은 단일 모너머에서 멀리 떨어져 있는 잔기가, 반대로 펜타머 형태에서 두 가까운 모너머에 매우 가깝고 시알산과의 결합에 포함되는 단백질의 부위에 절대적으로 인접하다는 것을 인지하도록 허용한다. 이 구조적 데이터는 상당한 GRE1의 중화 활성을 설명한다.

수득된 실험 데이터는 GRE1이 적어도 다음의 잔기를 하나 이상 포함하는, 입체형태적이고, 선형이 아닌 에피토프를 인지한다는 것을 나타낸다: I62, S65, A127, D130, N131, A133, A175 (위치 1의 Met로부터 시작하는 넘버링을 갖는, Mad1 균주 VP1의 잔기에 기반한 아미노산 넘버링).

특히, 돌연변이될 경우, GRE1의 결합을 파괴하는 잔기가, VP1 단백질 및 그것의 수용체 사이의 결합에 중요한 영역과 매우 가깝고, 이것이 GRE1의 중화 활성을 설명한다는 것을 밝혀냈다.

생물학적 시료에서의 중화 항체의 존 재의 인 비트로 결정을 위한 ELISA 분석

생물학적 시료에서 (특히, 전적으로는 아니지만, 뇌척수액, 혈청, 또는 혈장에서) 중화 항체의 존재를 결정하기 위해, GRE1 (중화 항체)에 의해 인식되는 에피토프를 ELISA 분석에 이용하였다. 빠르고 효율적인 검출 시스템의 준비(setting-up)를 두 개의 전략에 의해 수행하였다: 그 중 하나는 경쟁적 ELISA 분석을 시료 및 GRE1를 가지고 수행하는 것이고, 다른 하나는 중화 항체에 의해 여전히 인식될 수 있는 VP1의 최소 부분 (위치 50 내지 140 of the 원 단백질의 위치 50 내지 140의 잔기를 포함하는)을 항원으로서 이용하는 것이다. GRE1에 의해 인식되는 것과 상이한 VP1 부위를 인식할 수 있는 항체를 반응으로부터 보다 효율적으로 빼기(subtract) 위해, GRE1에 의해 인식된 잔기 중에서 오직 돌연변이된 VP1에 대해 테스트되는 생물학적 시료가 액체 상에서 경쟁하도록 이루어진, 상기 분석의 변형을 또한 준비하였다.

GRE1 단클론 항체와의 VP1 단백질의 경쟁에 의한 중화 항체의 존재의 인 비트로 결정을 위한 ELISA 분석

테스트되는 생물학적 시료에서 다른 인간 항체로부터 GRE1를 구별하기 위해, GRE1을 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (Sigma-Aldrich^®)와 접합된 상용 단클론 항체 FLAG®M2에 의해 오직 인식되도록, 아미노산 서열 DYKDDDDK에 의한 유전자 발현 융합 방법에 의해 표지하였다 .

ELISA 플레이트 (Costar^®)를 300 ng의 재조합 VP1 (Abcam® ab74569)을 포함하는 용액 25 μL/웰로 덮고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 플레이트를 물로 세척하고, PBS-1% BSA (w/v)로 37℃에서 1 시간 동안 블록킹하였다. 그 후, 테스트되는 생물학적 시료의 여러 희석액 (연속 10-배 희석, 미희석부터 1:1000 희석액까지)의 40 μL를 첨가한 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 40 μL의 GRE1 항-JCV VP1 항체 (PBS/1% BSA 중 최종 농도 대략 1 ng/mL)를 다양한 시료 희석액을 갖는 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 마이크로플레이트에 대한 자동 세척기 (ETI-System Kasher, DiaSorin)에 의해, PBS-0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich®)으로 5회 세척한 후, 상용 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 FLAG® M2 항체 40 μL/웰을 첨가하였다 (Sigma-Aldrich®). 그리고 나서 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 수 회 세척한 후, 이전에 제시된 바와 같이, 효소 반응이 발생하도록, 40 μL의 기질 (H₂O₂ 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 1:1 용액, TMB substrate kit, Thermo Scientific)을 각 웰에 첨가하였다. 약 15분 후, 효소 활성을 40 μL/웰의 1N H₂SO₄ (Carlo Erba)을 첨가하는 것에 의해 블로킹하고, 분광광도계 (모델 680 마이크로플레이트 Reader, Bio-Rad)에 의해 450nm의 파장에서 발색 반응을 측정하였다.

BSA 항원 또는 다른 적합한 항원을 음성 대조군으로 각 실험에 도입하고, 그것의 O.D.₄₅₀ 을 비-특이적 반응을 검출하는 데 이용하였다.

GRE1 결합의 억제를 평가하기 위해 테스트되는 생물학적 시료의 상이한 희석액과 함께 단클론 항체가 첨가된 웰 및 단클론 항체가 홀로 첨가된 웰에서 검출되는 흡광도에서의 차이가 관찰되었다.

특히, 생물학적 시료의 상이한 희석액과 함께 단클론 항체가 첨가된 웰에서의 흡광도가 단클론 항체 홀로에 의해 관찰된 흡광도보다 더 낮을 경우, GRE1과 시료 중의 항체 사이에서 VP1상의 에피토프 결합에 대한 경쟁이 있었고, 그리하여 시료에서 JCV-GRE1-유사 항체의 존재를 나타내며, 이에 따라 중화 및 방어 항체의 존재를 나타낸다.

GRE1 단클론 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프를 인식할 수 있는 생물학적 시료에서 항체의 존재의 인 비트로 결정을 위한 ELISA 분석

GRE1 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하고, 입체형태적 특징을 아직 보유하는 VP1의 최소 부위를 결정하기 위해, M무작위로 절단된 VP1 서열을 얻기 위해 ad1 균주 JCV 유래의 VP1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 DNase로 처리하였다. GRE1에 대한 바이오-패닝(bio-panning)을 통해, 단클론 항체에 의해 여전히 인식되는 VP1 부분을 선별하기 위해, 다양한 VP1 부위를 파지미드에서 클로닝하였다. 일단 GRE1에 의해 여전히 인식되는 부위를 결정되면, 인 실리코 입체형태를 결정하고 가능한 그것을 전장 VP1 단백질의 입체형태와 비교하기 위해 단편을 특정 소프트웨어에 의해 분석하였다.

이 예측의 결과를 참작하여, GRE1에 의해 인식되는 최소 부분을 코딩하고, 원 단백질의 위치 50 내지 140의 잔기를 포함하는, 선별된 뉴클레오티드 서열을 6xHis-태그 및 트롬빈 절단 부위 (pETminiVP1)를 갖는 프레임 중에(in frame with), 박테리아 발현 벡터 pET15b에서 클로닝하였다. 5' 및 3'에서 제한효소 부위XhoI 및 BamHI (벡터 클로닝 영역에 존재하지만, VP1 안에는 없음)를 클로닝하는 데 이용하였다. 목적 달성을 위해, 관심대상의 VP1 영역을 PCR에 의해 각각 XhoI 및 BamHI 제한효소 부위를 삽입에 의해, 증폭하였다. pETminiVP1를 포함하는 콜로니의 선별을 앰피실린 저항성 및 서열 분석에 기반하여 수행하였다.

단편의 정제를 위해, 1개의 pETminiVP1-함유 콜로니를 50 μg/mL 앰피실린을 갖는 10ml의 LB에 접종하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 5 ml의 배양물을 50 μg/mL 앰피실린을 갖는 500 ml의 LB 배지에 서브(sub)-접종하였다. 박테리아 성장을 체크하기 위해 배양물을 분광광도계에 의해 규칙적인 간격으로 분석하였다. 배양물이 0.6-1의 OD600에 도달하였을 때, 0.4 mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 배지에 첨가하고 실온에서 밤새 교반한 채로 두었다 .

다음날, 박테리아 배양물을 3900 rcf에서 15분 동안 원심분리하고, 박테리아 펠렛을 20 ml의 버퍼 A (50 mM Tris pH 7.5, 5 % 글리세롤, 250 mM NaCl, 30 mM 이미다졸) 중에 재현탁하였다. 그리고 나서 세포를 소니케이터를 이용하여 용해시켰다. 현탁액을 12,000 rcf에서 45분 동안 원심분리하고 0.4 μm 필터에 의해 여과시켜 박테리아 파편을 제거하였다.

그 후 단편을 니켈 컬럼에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 컬럼에 시료를 적용하기 전, 레진을 3배 부피의 버퍼 A, 3배 부피의 버퍼 B (20 mM Tris pH 7.5, 5 % 글리세롤, 250 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)로 세척하고, 8배 부피의 버퍼 A로 재-충진하였다(re-equilibrate). 이 때, 시료를 컬럼에 런닝(run)시켰다. 결합되지 않은 시료로부터 컬럼을 세척하기 위해 50 ml의 버퍼 A를 이용하였고, 시료를 0%-100% 구배의 버퍼 B로 용리시켰다. 용리 후, 컬럼을 버퍼 A로 재-충진하였다. 일단 농축되면, 테스트되는 생물학적 시료에 영향을 미칠 수 있는 히스티딘 꼬리를 제거하기 위해 단편을 트롬빈으로 처리하였다. 정제된 단편의 가능한 사용에 영향을 미칠 수 있는 용리 버퍼의 흔적을 제거하기 위해, 용리물을 PBS에 대해 투석시켰다. 이제 miniVP1로 불려질, 단편의 질(quality) 및 농도를 12% SDS 겔에 의해 분석하였다.

ELISA를 위해, 96-웰 플레이트 (Costar®)를 300 ng의 miniVP1 단편 (이전에 기술한 바와 같이 생산됨)을 포함하는 용액 25 μL/웰 로 덮었고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 물로 세척하고 37℃에서 1시간 동안 PBS-1% BSA (w/v)로 블로킹하였다.

플레이트의 인큐베이션의 완료에서, 생물학적 시료의 40μL의 여러 희석액 (연속 10-배 희석, 미희석부터 1:1000 희석액까지)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 마이크로플레이트 (ETI-System Kasher, DiaSorin)에 대한 자동 세척기에 의해, PBS-0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich®)으로 5회 세척을 한 후, 인간 IgG의 FC 부위에 결합하는 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합 고트 항체의 폴리클로날 제제 (Sigma-Aldrich®) 40 μL/웰을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이전에 기술한 바와 같이 PBS-Tween20으로 5회 세척을 수행한 후, 효소 반응이 발생하도록 40 μL의 기질 (H₂O₂ 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 1:1 용액, TMB substrate kit, Thermo Scientific)를 각 웰에 첨가하였다. 15분 후, 효소 활성을 1N H₂SO₄ (Carlo Erba)의 40 μL/웰을 첨가하는 것에 의해 블로킹하고, 450nm의 파장에서 분광광도계 (Model 680 마이크로플레이트 리더, Bio-Rad)에 의해 발색 반응을 측정하였다.

BSA 항원 또는 다른 적합한 항원을 음성 대조군으로 각 실험에 도입하고, 그의 O.D.₄₅₀을 가능한 비-특이적 반응성을 측정하는데 이용하였다. GRE1 단클론 항체를 1ng/μL의 최종 농도에서 양성 대조군으로 이용하였다.

BSA와 비교하여 miniVP1에 대해 보다 높은 반응성을 나타내는 시료를 양성으로, 따라서 중화 및, 이에 따라 방어, 활성을 갖는 JCV-GRE1-유사 항체를 포함하는 것으로 간주한다.

GRE1 단클론 항체( 돌연변이된 VP1 에 의해 경쟁하는 변이체 )에 의해 결합되는 동일 에피토프를 인식할 수 있는 생물학적 시료에서 항체의 존재의 인 비트로 결정을 위한 ELISA 분석

이전 분석의 설득력을 증가시키기 위해, 단백질에 대한 GRE1의 결합에 중요한 잔기에서 변이된 VP1과 함께 테스트되는 시료를 사전-인큐베이션하는 단계를 추가하는 것에 의한, 다른 버전의 실험을 준비하였다.

GRE1 결합 부위에서 변형되고, 생물학적 시료에서 선택되지 않은 항체에 의해 나중에 작용하게 될 VP1 단백질을 수득하기 위해, 위치-지정 돌연변이 전략을 일부 변형시켜 이용하였다: 돌연변이를 일으키는 일부 잔기가 매우 가깝기 때문에, 일부 잔기를 동시에 돌연변이시켰다. 첫째, 잔기 I62 및 S65은 다음 프라이머 Fw: 5'-gttttagtaagcaGCa ^62I/A tctataGca ^65S/A gatac-3' (서열번호 8) 및 역방향 프라이머로서 5'-tgacttactaaaacccctaagatgctcatctgg-3' (서열번호 9)를 이용하는 것에 의해 돌연변이시켰다. JCV 유래의 VP1을 이전에 클로닝하였던, 벡터 pcDNA^TM 3.1/V5-His TOPO^®TA 발현 키트 (Life Technologies)를 주형으로 이용하였다. 또한 돌연변이된 단백질을 포함하는 증폭 산물을 PCR에 의해 수득하였다. 반응에서 이용된 DNA 주형을 제거하기 위해 (분명하게 원하는 돌연변이를 포함하지 않을 것임), 반응 산물을 DpnI으로 37℃에서 4시간 동안 처리하였다. 그 후, 일렉트로-컴피턴트 세포를 2 μL의 이전에 처리된 증폭 산물로 형질전환시켰다. 플라스미드를 포함하는 세포를 앰피실린 저항성에 기반하여 선별하고, 그리고 나서 서열 분석에 의해 확인하였다. 첫번째 증폭 반응에 의해 삽입된 돌연변이를 보여주는, 벡터를 위치 127A, 130D, 131N, 133A가 돌연변이되는, 두번째 증폭 반응을 위한 주형으로 이용하였다. 이 돌연변이를 삽입하기 위해, 5'-cactctaatgggcaagGa ^127A/G actcatgCc ^130D/A GCt ^131N/A ggtgGa ^133A/G ggg-3' (서열번호 10)를 정방향(Fw) 프라이머로 사용하고, 5'-cttgcccattagagtgcacattcatcaaac-3' (서열번호 11)를 역방향(reverse) 프라이머로 사용하였다. PCR 산물을 37℃에서 4시간 동안 DpnI으로 처리하였다. 그 후, 일렉트로-컴피턴트(electro-competent) 세포를 2 μL의 이전에 처리된 증폭 산물로 형질전환시켰다. 플라스미드를 포함하는 세포를 앰피실린 저항성에 기반하여 선별하고 그 후 서열 분석으로 확인하였다. 서열 분석에 의해 모든 삽입된 돌연변이를 보이는 VP1을 박테리아 발현 벡터 pET15b에 6xHis-태그 및 트롬빈 절단 부위 (pET-VP1mut)의 프레임에, 클로닝하였다. 그 후 돌연변이된 VP1 (VP1mut)를 miniVP1의 정제에서 이용된 동일 프로토콜에 의해 정제하였다.

ELISA를 위해, 96-웰 플레이트 (Costar®)를 300 ng의 miniVP1 (이전에 기술된 바와 같이 생산됨)을 포함하는 용액의 25 μL/웰로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 물로 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 PBS-1% BSA (w/v)로 블로킹하였다. 그 동안에, 50μg/mL의 돌연변이된 VP1을 테스트되는 생물학적 시료의 여러 희석액(연속 10-배 희석액, 미희석부터 1:1000 희석액까지)과 함께 사전-인큐베이션하였고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트의 인큐베이션을 완료하고, 돌연변이된 VP1을 갖는 다양한 혈청 희석액(o 다른 생물학적 시료)의 혼합물의 40μL를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. ELISA 마이크로플레이트 (ETI-System Kasher, DiaSorin)에 대한 자동 세척기에 의해, PBS-0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich®)으로 5회 세척을 수행한 후, 인간 IgG의 Fc 부위에 결합하는 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 고트 항체의 폴리클로날 제재 (Sigma-Aldrich®)의 40 μL/웰 을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이전에 기술한 바와 같이 수행된 PBS-Tween20으로 5회 세척 후, 40 μL의 기질 (H₂O₂ 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 1:1 용액, TMB substrate kit, Thermo Scientific)을 각 웰에 첨가하여, 효소 반응을 발생시켰다. 약 15 분 후, 효소 활성을 40 μL/웰의 1N H₂SO₄ (Carlo Erba)을 첨가하는 것에 의해 블로킹하고, 발색 반응을 분광광도계 (Model 680 마이크로플레이트 Reader, Bio-Rad)에 의해 450nm 파장에서 측정하였다.

BSA 항원 또는 다른 적합한 항원을 음성 대조군으로 각 실험에 도입하고, 그것의 O.D.₄₅₀을 가능한 비-특이적 반응을 검출하는 데 이용하였다. JCV-GRE1 단클론 항체를 최종 농도 1ng/μL에서 양성 대조군으로 이용하였다.

BSA와 비교하여 miniVP1 펩타이드에 대해 더 높은 반응성을 나타내는 시료를 양성이고, 따라서 JCV-GRE1-유사 중화 및, 이에 따라 방어, 항체를 포함하는 것으로 간주하였다.

SEQUENCE LISTING <110> POMONA RICERCA S.R.L. <120> Human monoclonal antibody against the VP1 protein of JC virus <130> PC1236EC <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Trp Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys 1 5 10 15 Ala Val Ser Gly Ala Ser Val Ser Ser Gly Ile Asn Tyr Trp Ser Trp 20 25 30 Ile Arg Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Val Tyr 35 40 45 Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser 50 55 60 Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly 85 90 95 Asp Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Lys Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 35 40 45 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tggggcccag gactggtgaa gccctcacag tccctgtccc tcacctgcgc tgtctctggt 60 gcctccgtca gcagtggtat taattactgg agctggatcc gcctctaccc agggaagggc 120 ctggagtgga ttggctatgt gtattccagt gggactacgt actacaaccc gtccctcaag 180 agtcgagttt ccatatcact agacacgtct aagaaccagt tctccctgaa cctgaggtct 240 gtgactgccg cggacacggc cgtgtattac tgtgcgagag atagggggga tagctcgggg 300 agttcctact acaagtacta catggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 4 <211> 315 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtgatgaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 60 tgccgggcaa gtcagagcat tagcagctat ttaaattggt atcagcagaa accagggaaa 120 gcccctaagc tcctgatcta tgctgcatcc agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc 180 agtggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagtctgca acctgaagat 240 tttgcaactt actactgtca acagagttac agtacccctc gaacgttcgg ccaagggacc 300 aaggtggaaa tcaaa 315 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQGz primer <400> 5 gtcgttgacc aggcagccca g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQKb primer <400> 6 atagaagttg ttcagcaggc a 21 <210> 7 <211> 354 <212> PRT <213> JC virus <400> 7 Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Arg Lys Asp Pro Val Gln Val 1 5 10 15 Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr 20 25 30 Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met 35 40 45 Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile 50 55 60 Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met Leu Pro Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr 85 90 95 Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val 100 105 110 Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr 115 120 125 His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe 130 135 140 Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Leu Phe Asn 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr 165 170 175 Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys 180 185 190 Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn 195 200 205 Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro 210 215 220 Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu 225 230 235 240 Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala 245 250 255 Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp 260 265 270 Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val 275 280 285 Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg 290 295 300 Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln 305 310 315 320 Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp 325 330 335 Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Lys Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys 340 345 350 Met Leu <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR Fw primer <400> 8 gttttagtaa gcagcatcta tagcagatac 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR Rev primer <400> 9 tgacttacta aaacccctaa gatgctcatc tgg 33 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR Fw primer <400> 10 cactctaatg ggcaaggaac tcatgccgct ggtggaggg 39 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR Rev primer <400> 11 cttgcccatt agagtgcaca ttcatcaaac 30

Claims

인간 항체이고 JC 바이러스를 중화시킬 수 있다는 사실을 특징으로 하는, JC 바이러스의 VP1 단백질에 대한 단클론 항체.
청구항 1에 있어서, I62, S65, A127, D130, N131, A133, A175, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 JCV VP1 단백질의 일차 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, JCV VP1 단백질의 입체형태적(conformational) 에피토프에 결합할 수 있는 것인 단클론 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 JCV VP1 단백질의 입체형태적 에피토프는 JCV VP1 단백질의 일차 서열의 아미노산 잔기 I62, S65, A127, D130, N131, A133 및 A175를 포함하는 것인 단클론 항체.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 전장(full-length) 면역글로불린, 또는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 단일쇄 항체 (scFv) 및 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능적 면역글로불린 단편인 것인 단클론 항체.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1의 서열을 갖고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2의 서열을 갖거나, 또는 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 3의 서열에 의해 코딩되고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 4의 서열에 의해 코딩되는 것인 단클론 항체.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환의 치료적 또는 예방적 치료에 사용하기 위한 것인 단클론 항체.
청구항 6에 있어서, 상기 JCV 감염과 연관된 질환은 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)인 것인 단클론 항체.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체를 포함하는 약학적 조성물.
청구항 8에 있어서, JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환의 치료적 또는 예방적 치료에 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 JCV 감염과 연관된 질환은 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)인 것인 약학적 조성물.
JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환의 인 비트로 진단 방법으로서, 상기 방법은, JCV에 의해 감염된 것으로 의심받는 환자 유래의 생물학적 시료를 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 단클론 항체와, 시료에 존재할 경우 JCV VP1 항원에 상기 단클론 항체가 결합하기에 적합한 조건 하에서, 접촉시키는 단계, 및 JCV VP1 항원에 단클론 항체의 결합을 정성적으로 또는 정량적으로 검출하는 단계를 포함하고, 그러한 결합은 JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환을 나타내는 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 JCV 감염과 연관된 질환은 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)인 것인 방법.
청구항 11 또는 12에 있어서, 면역 ELISA 분석 또는 면역 형광 분석 또는 면역조직화학 분석인 것인 방법.
JCV 감염 또는 JCV 감염과 연관된 질환의 진단용 면역진단 키트로서, 상기 키트는 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 단클론 항체 및 인 비트로 면역진단 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 것인 면역진단 키트.
청구항 14에 있어서, 상기 인 비트로 면역진단 방법은 청구항 11 내지 13 중 어느 항에 따른 방법인 것인 면역진단 키트.
청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 JCV 감염과 연관된 질환은 진행성 다소성 백질뇌증 (PML)인 것인 면역진단 키트.
JCV 감염을 앓는 인간 환자에서 JCV 바이러스를 중화시키는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 5 중 어느 항에 따른 단클론 항체의 유효량을 상기 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.