KR20170033714A - 노로바이러스 재조합 항원 및 그 항원에 특이적인 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노로바이러스 재조합 항원 및 그 항원에 특이적인 항체에 관한 것으로, 본 발명에서 제조된 재조합 노로바이러스 항원은 식중독 병원체를 확보 후 바이러스 재조합 항원을 제작하여 항체제작 시에 사용할 수 있으며, 제작된 항체의 민감도, 특이도 측정에도 사용 가능하며, 본 발명의 항체는 노로바이러스 검출 및 진단하는 것에 큰 도움이 될 것이다.

Description

노로바이러스 재조합 항원 및 그 항원에 특이적인 항체{A NOROVIRUS RECOMBINANT ANTIGEN AND AN ANTIBODY SPECIFIC FOR THE SAME}

본 발명은 노로바이러스 재조합 항원 및 그 항원에 특이적인 항체에 관한 것이다.

노로바이러스는 전염성 위장염(epidemic gastroenteritis)에 연관된 비박테리아성 병원체(nonbacterial pathogen)이다. 노로바이러스는 노로바이러스의 게놈 및 캡시드 단백질 서열에 기초된 5개의 유전적으로 별개 의 유전자군(genogroup)으로 조직된다. 사람 노로바이러스(HuNV) 균주(strains)는 유전자군 GI, GII 및 GIV에 속하고, 이것은 유전자형(genotypes) 또는 클러스터(clusters)로 더 나누어진다. GI 유전자군은 8개의 클러스터(GI.1 - GI.8)를 가지며, GII 유전자군은 17개(GII.1 - GII.17)을 갖는다. GIV는 오직 한개의 클러스터,GIV.1을 갖는다. 각각의 클러스터는 다른 것과 항원적으로 별개이며, 각 클러스터 내의 균주들이 또한 별개다.

Norovirus의 Genogroup 은 (GI, GII, GIII, GIV, 및 GV) 5가지로 분류되어 있으며, 다섯 가지 genogruop 중에서 GII strain은 사람 감염에 주된 genogruop 이다. 현재까지 밝혀진 genotypes은 적어도 19개로 매우 유전적으로 다양하며, 특히 GII.4 strain은 전체 Norovirus 감염에 80% 정도 연관 되어있어 target 항원으로써 항체발굴에 유리하다.

Norovirus major structural capsid protein은 shell domain (S), Protruding domain (P) 으로 나눠진다. P domain은 P1, P2 domain 으로 재분류되는데,(도 1) P2 doamin 이 바이러스 입자 표면에 노출이 되어 있기 때문에 항체 결합 부위와 연관이 많고, target region 으로 적합하다. 식중독 최다발생요인인 노로바이러스에 대한 재조합항원을 제작하여 항체 제작의 항원으로 사용할 수 있으며, 노로바이러스에 대한 효과적인 항바이러스 치료제가 요구된다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제10-2009-0039707호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 노로바이러스에 대한 재조합항원을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 노로바이러스에 대한 효과적인 항체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노로바이러스의 프로트루딩 도메인(Protruding domain) 서열의 일부이며, 서열번호 1 내지 6으로 구성된 군으로부터 선택된 노로바이러스 재조합 항원을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항원 또는 항원의 일부를 특이적으로 인지하는 노로바이러스의 유전형(genogroup) II 에 특이적인 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다:

서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 8로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 9로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 10으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 11로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체;

서열번호 13으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 14로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 15로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 18로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및

서열번호 19로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 20으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 21로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 22로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 23으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 24로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단일클론 항체는 상기 단일클론 항체는 서열번호 25로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 26으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄;

서열번호 27로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 28로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄; 및

서열번호 29로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 30으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄로 구성된 군으로부터 선택된 단일클론 항체된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 항체 또는 그 기능적인 단편은 상기 서열로 한정된 항체에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

또 본 발명의 상기 본 발명의 단일클론 항체 생산 세포주를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 세포주는 KCCM11752P, KCCM11753P, 및 KCCM11754P로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 세포주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 기탁된 세포주는 2015년 8월20일 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩 소재 한국미생물보존센터에 기탁하였다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항-노로바이러스 단일클론 항체 또는 그 기능적인 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항-노로바이러스 단일클론 항체 또는 그 기능적인 단편을 유효성분으로 포함하는 노로바이러스 유래한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항-노로바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 노로바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 1) 샘플과 상기 본 발명의 또는 그 기능적인 단편을 접촉시키는 단계; 및

2) 상기 또는 그 기능적인 단편과 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는

대상체의 노로바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법을 제공한다.

또 본 발명은 1) 샘플과 상기 본 발명의 조성물을 접촉시키는 단계; 및

2) 상기 조성물 내 항-노로바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는

대상체의 노로바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법을 제공한다.

또 본 발명은 1)상기 본 발명의 또는 그 기능적인 단편; 및 2) 용기를 포함하는 노로바이러스 진단용 키트를 제공한다.

또 본 발명은 1) 상기 본 발명의 노로바이러스 진단용 조성물; 및 2) 용기를 포함하는 노로바이러스 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 단클론 항체 또는 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 포함하는 인간노로바이러스에 의한 질병의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 진단용 조성물은 본 발명의 단클론 항체 및 면역학적 분석에 사용되는 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 공지의 모든 정량분석방법에 사용되는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 상기 정량분석방법의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 면역블롯팅, 면역침전법, 효소면역분석법, 단백질 칩, 래피트 어세이 및 마이크로 어레이 방법 등이 있다.

상기에서 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지로는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 효소로는 과산화효소(peroxidase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase), β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을사용할 수 있으며, 형광물질로는 플루오르신 이소티옥시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌린(phycobilin) 단백질, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin) 및 오르토프탈릭 알데히드(orthophthalic aldehyde)등을 사용할 수 있다. 발광물질로는 이소루미놀(isolumino), 루시게닌(lucigenin) 등을 사용할 수 있으며, 방사성 물질로는 131I, 14C, 3H 등을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따라, 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 시료내 노로바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

(1) 인간 노로바이러스 단백질에 특이적인 제 1 항체를 고상체에 고정시키는 단계,

(2) 상기 고상체에 검사하고자 하는 시료 용액을 가하여 시료내 로타바이러스가 상기 항체에 결합하도록 반응시키는 단계,

(3) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,

(4) 발색 효소에 결합된, 노로바이러스 단백질에 특이적인 제 2 항체를 상기 고상체에 가하여 단계 (2)에서 결합된 제 1 항체와 노로바이러스의 복합체에 결합하도록 반응시키는 단계,

(5) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,

(6) 세척한 고상체에 효소 기질 용액을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 하는 단계, 및

(7) 반응 결과 나타나는 발색 정도를 측정하여 시료내 노로바이러스의 농도를 측정하는 단계.

또한, 상기한 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 노로바이러스를 측정하기 위한 본 발명의 키트는 고상체에 고정된 항-노로바이러스 제 1 항체, 효소에 결합된 항-노로바이러스 제 2 항체, 시료 희석 용액, 효소 기질 용액, 세척액 및 노로바이러스 표준 용액을 포함한다.

상기 효소 면역 측정법 및 이를 위한 측정용 키트에 있어서, 사용된 항-노로바이러스 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 기탁된 세포주 클론으로부터 생산된, 노로바이러스에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단일클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

발색 반응에 의해 노로바이러스의 농도를 정량적으로 측정하기 위한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 사용하는 것이 바람직하고, 이 경우에 있어 효소의 기질 용액으로는 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액을 사용한다.

또는 정량적 분석을 위하여 본 발명의 항체에 형광물질 (예, Alexa488)을 접하여 직접적으로 측정하는 방법도 있다.

또한 검사하고자 하는 시료는 분비물, 예를 들면 분변을 1:20 정도의 비율로 희석한 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 고상체로는 일반적으로 마이크로플레이트의 웰을 사용한다.

전술한 효소 면역 측정법외에, 본 발명에 따른 항-노로바이러스 단일클론 항체를 이용한 면역 측정법으로서, 면역 크로마토그래피법을 이용하여 시료내 노로바이러스의 감염 여부를 측정할 수도 있다.

상기 면역 크로마토그래피에 의한 측정 방법은 착색 미립자에 결합된 항-노로바이러스 항체와 시료를 면역 반응시키고,모세관 현상에 의해 착색 미립자-항체-바이러스 복합체가 연속 이동하는 과정을 통해 멤브레인상에 미리 고정시킨 별도의 항-노로바이러스 항체 밴드와 상기 복합체가 결합하도록 함으로써, 밴드 위치의 착색 여부에 의해 시료내 노로바이러스의 존재 여부를 검출하는 방법이다.

상기한 방법은 샘플 부재, 착색 미립자에 결합된 항-노로바이러스 제 1 항체가 일시적으로 고정되어 있는 면역 반응 부재, 항-노로바이러스 제 2 항체 밴드(판정 라인)와 대조용 항체 밴드(대조 라인)를 함유하는 결과 표시 부재 및 흡수부재를 포함하는 면역 크로마토그래피 킷트를 사용하여 실시할 수 있다.

상기 각 부재들은 모세관 현상에 의해 시료 용액이 연속적으로 이동하도록 부분적으로 겹쳐지게 순서대로 일렬 배치되며, 상기 대조 라인은 판정 라인과 일정 간격을 두고 떨어져 위치하도록 한다.

면역 반응 부재에는 착색 미립자에 결합된 항-노로바이러스 제 1 항체가 멤브레인상에 일시적으로 고정되어 있어, 샘플 부재에 의해 흡수된 시료 용액내 노로바이러스와 면역 반응에 의해 복합체를 형성한 후, 모세관 현상에 의해 결과 표시 부재상으로 연속 이동하게 된다.

또한, 결과 표시 부재에는 항-노로바이러스 제 2 항체 밴드와 대조용 항체 밴드로 이루어지는, 총 2개의 항체 밴드가 일정 간격을 두고 표면상에 고착되어 있다.

상기 항-노로바이러스 제 2 항체 밴드는 시료내 노로바이러스의 존재를 나타내는 결과 판정 라인으로, 상기 면역 반응부재에서 형성된 착색 미립자-항체-바이러스 복합체가 이동중에 이 밴드 지점을 통과하면서 항-노로바이러스 제 2항체와 특이적으로 반응하여 결합체를 형성하게 되고, 이에 따라 밴드 위치에 착색이 일어나게 된다.

반면, 통상 제 2 항체 밴드로부터 시료 이동 방향으로 하단 0.5 내지 2㎝ 정도의 지점에 위치하는 대조용 항체 밴드는 염소 항-마우스 IgG와 같은 일반적인 항체를 포함하고 있어, 상기 판정 라인을 통과한 미결합 시료 성분들과 면역 반응함으로써, 본 검사가 정상적으로 시행되었는지를 확인해 주는 역할을 한다.

이후, 나머지 시료 성분들은 모세관 현상에 의해 계속 이동되어 흡수 부재에 의해 흡수된다.

본 발명의 면역 크로마토그래피 키트에 사용된 항-노로바이러스 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 클론으로부터 생산된, 노로바이러스에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단일클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 노로바이러스 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 항 바이러스 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면,하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제,바람직하게는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이러한 목적에 적합한 제형으로는 정제, 환제, 당제 (dragee), 산제, 캡슐제, 시럽제, 용액제, 겔제, 현탁제,에멀젼, 마이크로에멀젼 등의 다양한 경구투여용 제제; 및 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입제 및 하이포스프레이 (hypospray)와 같은 분무제 등과 같은 비경구투여용 제제가 바람직하다. 주사 또는 주입용 제제의 경우에는 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체 분자는 사용 전에 적절한 무균 액체롤 재조정하여 사용할 수 있는 건조된 형태로 제제화될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 위장관 내에서 분해되기 쉬운 항체 분자를 포함하므로, 상기 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의하여 투여되어야 하는 경우에는 분해로부터 항체를 보호하고, 항체를 방출한 후에는 위장관으로 흡수되는 약제를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 또한 본 발명의 항체를 상기에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 동물, 바람직하게는 포유동물,더욱 바람직하게는 사람에게 투여되는 단계를 포함하는 노로바이러스를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물 또는 약학적 제제의 유효성분으로서 상기 항체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.001 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별, 약제조합, 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 기능적 항체 단편으로는 경쇄, 중쇄, 가변 영역, Fab, Fab', F(ab') 2 , scFv, Diabody, Tribody, dsFv, CDR을 함유하는 펩타이드 등을 들 수 있다.

Fab는 IgG를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단된다),H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합된 분자량 약 5만의 항원결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 당해 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.

F(ab')2 는 IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단된다), Fab가 힌지영역의 S-S 결합을 개재하여 결합된 것보다 약간 큰 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 F(ab') 2 는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 S-S 결합시켜 작제할 수 있다.Fab'는 상기 F(ab') 2 의 힌지영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

scFv는 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(P)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 scFv는 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

Diabody는 항원 결합 특이성이 동일하거나 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Diabody는 예를 들면, 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, 3 내지 15 잔기의 폴리펩타이드 링커를 갖는 scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 Diabody를 발현시켜 제조할 수 있다.

또한, linker P 길이가 3-10 일 때는 tribody가 형성되어, tribody로 포함할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL 중 각각 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를 당해 시스테인 잔기 간의 S-S 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 기재된 방법[참조: Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체구조 예측에 근거하여 선택할 수 있다.

인간 항체 gene을 phage 표면 단백질에 융합시킨 형태로 E.coli에서 발현시켜 phage의 표면에 다양한 항체를 display 할 수 있다. 이 기술을 phage display라고 하며, 인체 내에 존재하는 다양한 조합의 항체 library를 제작할 수 있다. 이 library로부터 패닝 방법에 의하여 특정 항원에 결합하는 인간 단일클론 항체를 선별할 수 있다.　

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명으로 인간 Norovirus 감염에 연관이 있는 GII strain 과 약 80% 를 차지하고 있는 GII. 4 strain 의 여러 가지 strain Norovirus 재조합 단백질(도 9) 에 결합력을 보이는 서로 다른 VH domain 나노항체 4종을 Phage-display 기법을 이용하여 발굴 해냈고, 다양 (diversity)하고 affinity를 향상과 VH domain 항체보다 더 안정한 나노항체 발굴을 위해 VL library를 shuffling 하여 새로운 VH-VL shuffled library를 제작하였다. 그 후 다시 Phage-display 기법을 적용하여, 6종의 나노항체를 더 발굴 해낼 수 있었다.

나노항체의 유효성을 검증하기 위하여 실제 Norovirus 에 감염된 환자의 stool sample 에 대해 결합력을 보이는지에 대한 실험을 진행하였는데, 10종의 clone이 사람 감염에 주된 Norovirus genogruop인 GI, GII stool sample에 특이적인 결합력을 보이는 것을 Phage-ELISA를 이용하여서 확인하였고, 그중 scFv-1B2, scFv-2D12 ,scFv-2F10 위 세 clone 이 scFv format 인 항체 중 GI,GII stool 결합력이 좋기 때문에 기탁신청을 하였다.

본 발명의 clone들은 앞으로 Norovirus를 protein level에서 노로바이러스 검출 및 진단하는 것에 큰 도움이 될 것이고, 또한 본 발명에 사용된 재조합 노로바이러스 항원은 식중독 병원체를 확보 후 바이러스 재조합항원을 제작하여 항체제작 시에 사용할 수 있으며, 제작된 항체의 민감도, 특이도 측정에도 사용 가능하다.

도 1은 Norovirus ORF2 VP1 major structural capsid protein 구성 요소, 구조,
도 2는 노로바이러스 유전체 구조 및 비리온 구조와 재조합 노로바이러스제작 하기 위한 설계도,
도 3은 Norovirus GII의 VP1의 첫 번째 Fragment의 phylogenetic tree,
도 4는 Norovirus GII의 VP1의 두 번째 Fragment의 phylogenetic tree,
도 5는 Norovirus GII의 VP1의 세 번째 Fragment의 phylogenetic tree,
도 6은 TrxA tagged된 Norovirus rPro (VP1)를 발현 및 정제한 재조합 Norovirus 단백질 rPro(VP1)- Noro rPro1~rPro6 SDS-PAGE Gel 사진 MW= ~55KDa,
도 7은 정제된 Trx-His 단백질,
도 8은 재조합 Norovirus VP1 단백질 과 G2.4 VP1의 sequence alignment,
도 9는 재조합 Norovirus VP1 단백질 의 GII, GII.4 source strain,
도 10은 Norovirus recombinant protein의 phylogenetic tree,
도 11은 Phage display 기법 개요,
도 12는 Biopanning Input 및 Output 결과 (cfu/mL),
도 13은 Phage-ELISA 개요도,
도 14는 선택된 Norovirus 항체의 phylogenetic tree,
도 15는 선택된 Norovirus 항체가 각각의 Norovirus recombinant protein에 결합력을 보여주는 그래프. VH-1,2,3,4 는 RDDVL.1 phage library clone , scFv-1은 다른 library clone 이다,
도 16은 scFv library 만드는 과정. phage VH clone 에 VL 부분을 집어넣기 위하여 제한효소(SfiI/ NotI enzyme 사용)로 양쪽을 잘라주고 같은 제한효소로 잘려져 있는 VL 부분을 집어 넣어주고 DNA ligase를 ligation을 16℃에서 overnight 하여 scFv 형태를 만든다,
도 17은 Ligation 확인을 위하여 도 16에서 만든 library를 Restriction enzyme (Res) 로 digest후 전기영동 진행한 gel 사진,
도 18은 Biopanning Input 및 output 결과(cfu/mL),
도 19는 새롭게 선택된 Norovirus 항체의 phylogenetic tree,
도 20은 새로 선택된 Norovirus 나노항체가 각각 Norovirus recombinant protein에 결합을 보여주는 그래프. 각각의 clone들은 새로 만든 scFv phage-library clone 이다,
도 21은 선별된 6가지 Norovirus 항체가 Norovirus stool sample에 특이적인 결합력을 나타내는 그래프. GI stool은 Norovirus 감염환자의 stool sample 이고 Negative 1,2,3,4 는 Norovirus 비감염자의 stool sample 이다,
도 22는 선별된 10가지 항체들 이 GI, GII stool 에 Norovirus 항체가 Norovirus stool sample에 특이적인 결합력을 나타내는 그래프. Negative stool 은 앞서 사용한 negative 1,2,3,4 의 mixture 이다.
도 23은 선별된 3 클론의 항체의 아미노산 서열이고, 밑줄로 표시된 부분은 CDR부위이다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Norovirus 나노항체 발굴을 위한 항원 제작과정

유행성 바이러스성 위장염을 일으키는 노로바이러스 검체를 인제대학교 의과대학 정주영/한태희 교수에게서 분양받아 cloning하였다. 요약하면, TA vector에 삽입된 유전자를 primer[Forward:ACAGAATTCCATGAGGCAACTGGAACCTGTG(서열번호 31), Reverse:ATAGTCGACCACATCAGATTGTGCTGGG(서열번호 32)]를 10pmol씩 사용하여 20μL를 94℃ 3min denaturation 60℃ annealing 72℃ extension 조건으로 30cycle을 증폭한 후, 제한효소(EcoRI, SalI)를 처리하였다. pGEX 4T-3 vector를 이용하여 접합한 후 대장균에 형질전환시켜 유전자가 발현되도록 배양하였다. 타겟 유전자를 IPTG를 이용하여 발현시키고, 단백질을 정제하였다.

GST tag이 있는 재조합 Norovirus 단백질은 GST을 chaperons 없이 발현시킬 경우에는 soluble 발현이 안 되는 것으로 보고되는 문제가 있으며, 또한 향 후 GST tag을 재조합 Norovirus 단백질로부터 제거하기 위해 번거러운 정제과정이 필요함으로 Norovirus VP1 유전자를 pET32b 발현 벡터(Novagen, Germany)에 클로닝 및 발현하여 TrxA-His tagged norovirus VP1 재조합단백질 (55 kDa)을 TALON affinity 방법(Clonetech, TALON?Metal Affinity Resins User Manual 참조, 타카라코리아메디컬)으로 정제하여 확인하였다. 구체적으로 서울대학교에서 제작한 Norovirus rVP1 P2 domain 유전자를 포함하고 있는 plasmid에서 제한효소 EcoRI/ SalI을 이용하여 Norovirus rVP1 P2 domaim 유전자만을 절단하고, 같은 제한효소를 사용하여 절단한 클로닝 벡터 pET32b에 클로닝하였다. 클로닝한 벡터를 컴피턴트 세포 BL21trxB에 형질전환하였다. 발현여부를 확인하기 위하여 IPTG 유도법을 통하여 발현을 유도하고, SDS-PAGE 방법을 통하여 확인하였다. 발현이 확인된 클론은 대량배양을 통하여 (1L 이상) 단백질을 대량 생산하고, TALON?Metal Affinity Resins을 이용하여 정제하였다.

또한 norovirus 항체 발굴을 위한 biopanning 과정에서 TrxA-His tagged norovirus VP1 재조합단백질의 control 사용도 위하여 Trx-His 단백질 (20 kDa)을 pET32b 발현 벡터에 발현 및 TALON affinity 방법으로 정제하였다.

본 조사의 결과를 기반으로 P2 domain에 variation이 있는 6가지 재조합 Norovirus recombinant protein (Noro rPro 1~6)은, 전체 Norovirus 감염에 주된 연관이 있는 GII.4 sequence와 유사함을 알 수 있다(참고 도 8). 앞서 언급한 6가지 재조합 단백질을 biopanning 방법으로 Norovirus 항체 발굴에 사용하여 여러 가지 Norovirus strain에 결합할 수 있는 항체를 개발하는 것이 본 발명의 목적이다.

실시예 2: Norovirus 재조합 항원에 특이적으로 결합하는 나노항체 발굴

Norovirus recombinant protein에 특이적으로 결합하는 나노항체 발굴을 위하여 본 발명자들이 구축한 VH 도메인 RDDVL.1 phage-항체 라이브러리를 사용하여 biopanning을 진행하였다. (도 11)

Biopanning를 진행하기 위해, Norovirus recombinant protein 과 TrxA-His를 4℃에서 overnight 코팅한다. 코팅된 모든 well을 PBS로 3번 wash한 후 각각 250μL MPBS (3%milk PBS)를 넣고 37℃에서 한 시간 반응하여 blocking하였다. blocking 이 끝난 뒤 각각 immunoplate를 3번 wash 한 후, TrxA 코팅된 plate 에 200u phage 나노항체를 넣고 상온에서 1시간 동안 shaking하며 반응하여 non-specific하게 결합하는 항체를 depletion하였다. depletion된 phage-항체의 상층액은 재조합 Norovirus rPro 2와 4가 코팅된 plate에 각각 100μL씩 옮긴 뒤 1시간 반응하였다. 각각의 immunoplate 들은 PBST　(PBS with 0.1% Tween20) 로 10번 wash, PBS로 5번 wash 하였다. 결합 된 phage-항체 용출을 위해 100μL 100mM glycine-HCl, pH2.1를 immunoplate 에 넣고, 10분 동안 incubation을 진행한 뒤 용출액을 1.5mL tube 에 옮기고 1M Tris-HCl로 용출 액을 중화시켰다. phage 나노항체를 증폭하기 위해, 용출된 용액 150μL를 5mL TG1 cells에 넣어 준 뒤 titer를 측정하였다. 남은 용액들은 agar plate 에 도말한 뒤에 glycerol stock을 만들었다. 그 후 stock에서 phage 나노항체를 발현시키고 PEG8000/2.5M NaCl 용액으로 phage를 precipitation 진행하였다. 10mM Tris-HCl 용액으로 pellet을 풀어준 뒤 TG1 cells 에 감염시킴으로써 각각 증폭된 stock의 phage titer를 측정하였다. 그 다음 여기서 얻은 phage 나노항체를 phage display 다음 round 에 사용하였다. 두 번째, 세 번째 phage display는 첫 round와 비슷하지만 코팅하는 단백질의 양, 결합된 항체를 용출하기 전 사용하는 용액의 조성, wash 하는 횟수가 다르다. 총 3회 (R3)까지 Phage display를 진행한 후 round 별로 얻은 input, output titer 값은 도 12와 같다.

실시예 3: Norovirus 발굴항체 특성 분석(phage-ELISA 및 DNA 서열 분석)

Norovirus 재조합 단백질에 결합하는 clone 선별하기 위해 Phage-(ELISA) 를 진행하였다(도 13). Noro rPro-2 와 Noro rPro-4에서 각각 96 콜로니를 골라내어 총 192 콜로니로 실험을 진행하였다. 노로 phage 나노항체를 실험 전 날 TG1에서 발현시켰다. Immunoplate에 Norovirus recombinant protein 6가지를 1μg/mL, TrxA 단백질을 0.5μg/mL로 100μL 코팅하였다. 다음날 코팅된 plate를 3번 PBST(0.05%)로 wash해 주고 MPBST(3% milk PBST)을 채우고 37℃에서 한 시간 incubation 진행하였다. 전날 발현시킨 phage 나노항체를 MPBS(3% milk PBST)로 상온에서 1시간 blocking을 진행하였다. Norovirus 재조합 단백질과 TrxA가 blocking 된 plate를 3번 wash한 뒤, phage 나노항체를 100μL 넣고 상온에서 1시간 30분 동안 incubation을 진행하였다. Incubation 후 plate를 6번 wash, Anti-M13 conjugated HRP 를 200ng/mL로 plate 에 넣고 상온에서 1시간 동안 incubation 을 진행하였다. Incubation 후 6번 wash 하고, TMB를 100μL씩 plate에 넣어 주어 용액의 색 변화로 signal을 관찰하였다. 일정수준 signal이 올라왔을 때 stop reagent를 넣어주고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 192clone 중 Target/TrxA ratio를 >2.2, 흡광도(A450nm), TrxA <0.6 , 적어도 1 Target > 0.2로 cutoff를 했을 때, 30종의 clone 이 선별되었다. phage-ELISA를 통해 선별된 phage-항체의 plasmid DNA를 정제 후 DNA sequencing 하여 단일 DNA 서열을 가진 phage-항체 클론을 선별하였다. 이후 DNA 서열을 아미노산 서열로 번역 및 분석하여 단일 아미노산 서열을 가지는 phage-항체를 재선별하였다. 이 중에서 unique sequence를 가지는 VH 도메인 나노항체 4종을 얻을 수 있었다. (도 14,및 15)

실시예 4: VL shuffling를 통한 Norovirus 항체 최적화

Norovirus VH domain 항체의 specificity, affinity 및 diversify optimization을 위해 앞서 얻은 Norovirus에 결합하는 VH domain clone 들에게 VL library를 shuffling 하여 scFv library를 만들었다 (도 16).

norovirus VH domain 항체 (~375bp)에 VL domain (~375 bp)이 삽입된 것을 확인하기 위하여 plasmid를 정제하여 제한효소(SfiI, 및 NotI)로 처리한 후 scFv의 size가 생성되는 여부를 agarose 전동장치로 확인하였다 (도 17)

scFv의 length 는 약 ~750bp 이므로 새로 제작한 antibody 들의 9개의 clone 모두가 VL library를 shuffling 됐음을 확인할 수 있다.(도 17)

실시예 5: High affinity Norovirus 항체 발굴

Norovirus recombinant protein에 특이적으로 결합하는 나노항체 효율 향상을 위하여 새롭게 만든 scFv phage- library 를 사용하여 위의 RDDVL.1 phage-항체 라이브러리 같은 동일한 방법으로 총 3회의 biopanning을 진행하였다.(도 11)

여기서 각각 biopanning에서 얻은 phage-scFv 나노항체의 input, output titer 값은 도 18과 같다.

실시예 6: High affinity Norovirus 항체 특성분석

Norovirus 재조합 단백질에 결합력이 향상된 나노항체를 다시 선별하기 위해 Phage-ELISA(실시예 3의 방법과 방법은 동일하고 사용한 norovirus 항체만 다름)를 진행하였다.(도 13) 새로 만든 scFv phage-library의 phage display Round 3에서 총 186 콜로니를 선택하여 위에서 언급한 동일한 phage-ELISA실험을 진행하였다.

총 186 클론 중 Target/TrxA ratio > 11, 흡광도(A450nm) TrxA <0.08 , 적어도 1 Target(Noro rPro-1 ~6)에 > 1으로 cutoff로 하여 총 61종의 clone을 선별하여 DNA와 아미노산 서열을 분석하였고 이 중에서 unique 아미노산 sequence를 가지는 나노항체 6종을 선별하였다 (도 19, 및 20).

실시예 7: 선별 Norovirus 나노항체의 유효성 테스트

실제 Norovirus 감염환자의 stool sample을 이용하여 발굴한 나노항체의 유효성 테스트를 하기 위해 Phage-ELISA를 진행하였다.(도 13)

상기 실시에에서 얻어낸 Norovirus 나노항체로 실험을 진행하였다.

Immunoplate에 Norovirus positive와 negative stool sample을 1%로 100μL 코팅하였다. 다음날 코팅된 plate를 3번 PBST(0.05%)로 wash 해 주고 MPBST (3% milk PBST)을 넣고 37℃에서 한 시간 반응한 후 3번 PBST로 세척하였다. 전날 TG1 대장균에서 발현시킨 phage 나노항체를 100μL 넣고 상온에서 1시간 30분 동안 incubation을 진행하였다. Incubation 후 plate를 6번 wash, Anti-M13 conjugated HRP 를 200ng/mL로 plate에 넣고 상온에서 1시간 동안 incubation 을 진행하였다. Incubation 후 6번 wash 하고, TMB를 100μL씩 plate에 넣어 주며 용액의 색 변화로 signal을 관찰하였다. 일정수준 signal이 올라 왔을 때 stop reagent를 넣어주고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

scFv-1 제외 한 선별된 나노 항체들이 GI, GII stool sample 에 강한 결합력을 보이며, Negative stool sample 과 BSA 에는 약한 결합력을 보이거나 거의 결합력이 나타나지 않음을 보였다 (도 21, 및 22) 도에서 scFv-1B2, scFv-2D12 , scFv-2F10 clone은 기탁의뢰하였다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11752P 20150820 한국미생물보존센터(국외) KCCM11753P 20150820 한국미생물보존센터(국외) KCCM11754P 20150820

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation BODITECH MED SNU R&DB FOUNDATION <120> A NOROVIRUS RECOMBINANT ANTIGEN AND AN ANTIBODY SPECIFIC FOR THE SAME <130> HY151143 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro rPro1 <400> 1 Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp Val Arg Asn Asn 1 5 10 15 Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile Lys Leu Ile Ala 20 25 30 Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly Asp Asp Val Phe 35 40 45 Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro Asp Phe Asp Phe 50 55 60 Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr Lys Pro Phe Ser 65 70 75 80 Val Pro Val Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser Arg Phe Pro Ile 85 90 95 Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Ser Ala Phe Val Val Gln 100 105 110 Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu Leu Gly Thr Thr 115 120 125 Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly Asp Val Thr His 130 135 140 Ile Pro Gly Ser His Asn Tyr Thr Met Asn Leu Ala 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Asn Thr Pro Asn Val His Leu Ala Pro 260 265 270 Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser 275 280 285 Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asp Leu Asp Cys Leu 290 295 300 Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln Tyr Leu Tyr Gln Glu Ala Ala Pro Ala 305 310 315 320 Gln Ser Asp Val <210> 6 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro rPro6 <400> 6 Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp Val Arg Asn Asn 1 5 10 15 Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile Lys Leu Ile Ala 20 25 30 Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly Asp Asp Val Phe 35 40 45 Thr Val Ser Cys Arg Val Phe Ile Arg Pro Ser Pro Gly Phe Asp Phe 50 55 60 Ile Phe Leu Ser Ser Pro Thr Val Glu Ser Arg Asn Lys Pro Phe Ser 65 70 75 80 Val Pro Val Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser Arg Phe Pro Ile 85 90 95 Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Ser Ala Phe Val Val Gln 100 105 110 Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu Leu Gly Thr Thr 115 120 125 Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly Asp Val Thr His 130 135 140 Ile Thr Gly Ser Arg Asn Tyr Thr Met Asn Leu Ala Ser Gln Asn Trp 145 150 155 160 Ser Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Thr Pro Ala Pro Leu Gly Thr Pro 165 170 175 Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Val Leu Thr Gln Thr Thr Arg Thr 180 185 190 Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Tyr Ala Gly Ser Ala 195 200 205 Asp Phe Ala Pro Lys Leu Gly Arg Val Gln Phe Glu Thr Asp Thr Asp 210 215 220 His Asp Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys Phe Thr Pro Val Gly Val 225 230 235 240 Ile Gln Asp Gly Gly Thr Thr His Gly Asn Glu Arg Leu Leu Trp Val 245 250 255 Leu Pro Ser Tyr Ser Gly Lys Asn Ser Asp Ser Val His Leu Ala Arg 260 265 270 Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Phe Leu Phe Phe Arg Ser 275 280 285 Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asp Leu Asp Cys Leu 290 295 300 Leu Pro Gln Gly Gly Val Gln Tyr Phe Tyr Gln Glu Ala Ala Pro Ala 305 310 315 320 Gln Ser Asp Val <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of Noro-1B2-VH <400> 7 Gly Phe Thr Phe Asp Glu His Ala Met His 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of Noro-1B2-VH <400> 8 Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of Noro-1B2-VH <400> 9 Lys Ile Arg Gly Asp Pro Asn Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of Noro-1B2-VL <400> 10 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of Noro-1B2-VL <400> 11 Thr Ala Ser Ser Arg Thr Ala 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of Noro-1B2-VL <400> 12 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of Noro-2D12-VH <400> 13 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of Noro-2D12-VH <400> 14 Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of Noro-2D12-VH <400> 15 Ser Gly Cys His Ser Glu Tyr His Leu Glu Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of Noro-2D12-VL <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of Noro-2D12-VL <400> 17 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of Noro-2D12-VL <400> 18 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asp Thr 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of Noro-2F10-VH <400> 19 Gly Phe Thr Phe Asp Glu His Ala Met His 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of Noro-2F10-VH <400> 20 Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of Noro-2F10-VH <400> 21 Lys Ile Arg Gly Asp Pro Asn Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of Noro-2F10-VL <400> 22 Arg Ala Ser Gly Thr Leu Gly Asn His Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of Noro-2F10-VL <400> 23 Asp Ala Ser Ile Arg Ala Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of Noro-2F10-VL <400> 24 Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro-1B2-VH <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu His 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Lys Ile Arg Gly Asp Pro Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro-1B2-VL <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Asp Thr Ala Ser Ser Arg Thr Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro-2D12-VH <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Arg Tyr Cys Gly Thr Ser Gly Cys His Ser Glu Tyr 100 105 110 His Leu Glu Ser Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 28 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro-2D12-VL <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro-2F10-VH <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu His 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Lys Ile Arg Gly Asp Pro Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro-2F10-VL <400> 30 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Thr Leu Gly Asn His 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 acagaattcc atgaggcaac tggaacctgt g 31 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 atagtcgacc acatcagatt gtgctggg 28

Claims (18)

1. 노로바이러스의 프로트루딩 도메인(Protruding domain) 서열의 일부이며, 서열번호 1 내지 6으로 구성된 군으로부터 선택된 노로바이러스 재조합 항원.
2. 제1항의 항원 또는 그 항원의 일부를 특이적으로 인지하는 노로바이러스의 유전형(genogroup) II 에 특이적인 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
3. 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편:
   
   서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 8로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 9로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 10으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 11로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체;
   
   서열번호 13으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 14로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 15로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 18로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및
   
   서열번호 19로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 20으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 21로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 22로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 23으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 24로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체.
4. 제2항에 있어서, 상기 기능적 단편은 단일 측쇄 항체(scFv)인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
5. 제2항에 있어서, 상기 기능적 단편은 항원결합 분절(Fab)인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
6. 제2항에 있어서, 상기 기능적 단편은 제2항의 CDR부위를 포함하는 경쇄 또는 중쇄인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
7. 제2항에 있어서, 상기 기능적 단편은 제2항의 CDR부위를 포함하는 가변 도메인(Variable domain)인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
8. 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 25로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 26으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄;
   서열번호 27로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 28로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄; 및
   서열번호 29로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 30으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄로 구성된 군으로부터 선택된 단일클론 항체.
9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 생산 세포주.
10. 제9항에 있어서, 상기 세포주는 KCCM11752P, KCCM11753P, 및 KCCM11754P로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 세포주인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 생산 세포주.
11. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-노로바이러스 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물.
12. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-노로바이러스 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 노로바이러스 유래한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
13. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-노로바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 노로바이러스 진단용 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 노로바이러스 진단용 조성물.
15. 1) 샘플과 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-노로바이러스 단일클론 항체를 접촉시키는 단계; 및
    2) 상기 단일클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
    대상체의 노로바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법.
16. 1) 샘플과 제11항의 조성물을 접촉시키는 단계; 및
    2) 상기 조성물 내 항-노로바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
    대상체의 노로바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법.
17. 1) 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-노로바이러스 단일클론 항체; 및
    2) 용기
    를 포함하는 노로바이러스 진단용 키트.
18. 1) 제13항의 노로바이러스 진단용 조성물; 및
    2) 용기
    를 포함하는 노로바이러스 진단용 키트.
    
    
    

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