KR20230083068A - 인간 코로나바이러스 oc43 n 단백질 특이적인 항체 및 그 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단클론 항체 및 그 응용에 관한 것이다.

Description

인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질 특이적인 항체 및 그 응용{AN ANTIBODY SPECIFIC FOR N PROTEIN OF HUMAN CORONAVIRUS OC43 AND AN APPLICATION THEREOF}

본 발명은 인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질 특이적인 항체 및 그 응용에 관한 것이다.

코로나바이러스(coronavirus)는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는 약 100 내지 120 nm 크기의 단일가닥 양성 RNA 바이러스로, 가장 외각에 있는 스파이크(spike; S) 단백질, 헤마글루티닌-에스테라제 (hemagglutinin-esterase; HE) 단백질, 막관통(transmembrane; M) 단백질, 작은 막(small membrane;E) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N) 단백질과 같은 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 코로나바이러스(Coronavirus)는 30kb의 positive-sense singlestranded RNA genome을 갖고 있고 있으며 이는 RNA virus 중 가장 크다.

베타코로나바이러스에 속하는 고병원성 코로나바이러스는 2002년(SARS-CoV), 2012년(MERS-CoV), 2019년(SARS-CoV-2)에 나타났으며, SARS-CoV-2의 대유행은 현재 전 세계적으로 큰 혼란에 빠져 있다. 베타 코로나바이러스의 S 단백질 결합에 의한 수용체 매개 숙주 세포 진입 기전에 대한 많은 연구가 있다: SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 S 단백질은 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2), MERS- CoV S 단백질은 DPP4(dipeptidyl peptidase 4)에 결합하고, HCoV-OC43 S 단백질은 9-O-아세틸화 시알산에 결합한다. 이러한 결과는 S 단백질이 병원성 코로나바이러스에 대한 치료제 개발을 위한 합리적인 표적임을 시사한다.

S 단백질 외에도 N 단백질은 코로나바이러스 감염에 대한 또 다른 치료 표적으로 간주된다. N 단백질 이합체는 바이러스 RNA에 결합할 수 있으며 코로나바이러스 복제에 필수적인 단백질이다. N 단백질은 N-말단 도메인(NTD)과 C-말단 도메인(CTD)을 포함하는 두 개의 주요 도메인으로 구성된다. 많은 연구자들이 구조 분석을 통해 SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV 및 HCoV-OC43의 N 단백질의 바이러스 RNA 결합을 특성화했다.

M과 N 단백질 간의 상호작용은 SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-OC43의 조립에 중요한 역할을 한다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허 제10-2229225호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 코로나바이러스 OC43에 대한 신규한 진단 전략을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편에 있어서,

상기 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편:

서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및

서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단클론 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 기능적 단편은 단일 측쇄 항체(scFv),항원결합 분절(Fab), 본 발명의 항체의 CDR부위를 포함하는 경쇄 또는 중쇄, 또는 상기 본 발명의 항체의 CDR부위를 포함하는 가변 도메인(Variable domain)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단클론 항체는 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 리포좀 내에 동시캡슐화된 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질 및 CpG-DNA 복합체를 동물에 주사하여 인간 코로나바이러스 OC43을 인식하는 단클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질은 서열번호 10에 기재된 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인간 코로나바이러스 OC43을 인식하는 단클론 항체를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 단클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 인간 코로나바이러스 OC43 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 샘플과 상기 본 발명의 단클론 항체를 접촉시키는 단계; 및

2) 상기 단클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 대상체의 인간 코로나바이러스 OC43 감염 여부에 대한 정보제공방법을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 상기 본 발명의 단클론 항체; 및 2) 용기를 포함하는 인간 코로나바이러스 OC43 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 단클론 항체를 유효성분으로 포함하는 인간 코로나바이러스 OC43 감염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제,호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co,³H,¹²⁵I 또는 ¹²⁵I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 검출용 키트는 상기 단클론항체, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 및 발색기질을 포함한다 본 발명의 검출용 키트에서 상기 단클론항체는 기판에 흡착된 상태로 제공될 수 있다 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다 표지체로는 HRP, 발색기질로는 TMB가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다 또한, 상기 검출용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 사람에서 인간 코로나바이러스 OC43을 진단하기 위한 검출용 키트를 제공한다 검출용 키트의 최종 검출방법으로는 면역크로마토그래피법 래피드 진단법, 효소면역흡착법(ELISA) 또는 웨스턴 블롯이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 본 발명의 검출용 키트에 사용되는 검출방법은 면역크로마토그래피법(immunochromatography) 및 효소면역흡착법일 수 있다.

상기 면역크로마토그래피법을 이용한 인간 코로나바이러스 OC43 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 결합된 금 축합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 검출용 키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료주입부이 구비되고, 상기 시료 주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 콜로이드 골드(Colloidal gold)-인간 코로나바이러스 OC43 항체가 축합된 복합체가 건조된 축합 패드, 상기 인간 코로나바이러스 OC43 항체와 동일한 항원을 검출할 수 있는 다른 항체가 고정된 검사선 및 상기 축합 패드에 존재하는 단클론항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 순차적으로 구비된 면역스트립일 수 있다.

상기 면역크로마토그래피법 진단법은 상기 인간 코로나바이러스 OC43 검출용 건조 조성물을 적용한 키트를 제작하여 사용하는 것으로 안정하여 장기간 보관하는 것이 가능하다.

상기 인간 코로나바이러스 OC43 검출용 키트에 인간 코로나바이러스 OC43을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 붉은 자주빛띠가 나타나면 인간 코로나바이러스 OC43 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 붉은 자주빛띠가 나타나면 인간 코로나바이러스 OC43 N 감염을 음성으로 판정할 수 있다.

또한, 교차반응(cross reaction) 검사에서 타호흡기바이러스 바이러스를 적용하여 검사결과가 음성으로 나오는 것을 판독하여, 검사가 타호흡기바이러스와 얼마나 교차성이 없는지를 확인할 수 있다.

효소면역항체법을 이용한 키트의 경우, 본 발명의 단클론 항체가 코팅된 플레이트의 각 웰에 인간 코로나바이러스 OC43 의심환자로부터 채취된 검체를 반응시키고, HRP(Horseradish peroxidase)-축합 인간 코로나바이러스 OC43 N 항원 특이 단클론항체를 첨가한 후, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 기질용액을 각 웰에 처리하여 발색반응을 흡광도로 측정하는 것으로 구성된다 바람직하게는,

본 발명에 따른 상기 진단용 조성물은 본 발명의 단클론 항체 및 면역학적 분석에 사용되는 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 공지의 모든 정량분석방법에 사용되는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 상기 정량분석방법의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 면역블롯팅, 면역침전법, 효소면역분석법, 단백질 칩, 래피트 어세이 및 마이크로 어레이 방법 등이 있다.

상기에서 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지로는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 효소로는 과산화효소(peroxidase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase), β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을사용할 수 있으며, 형광물질로는 플루오르신 이소티옥시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌린(phycobilin) 단백질, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin) 및 오르토프탈릭 알데히드(orthophthalic aldehyde)등을 사용할 수 있다. 발광물질로는 이소루미놀(isolumino), 루시게닌(lucigenin) 등을 사용할 수 있으며, 방사성 물질로는 ¹³¹I, ¹⁴C, ³H 등을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

본 발명의 기능적 항체 단편으로는 경쇄, 중쇄, 가변 영역, Fab, Fab', F(ab')₂ , scFv, Diabody, Tribody, dsFv, CDR을 함유하는 펩타이드 등을 들 수 있다.

Fab는 IgG를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단된다),H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합된 분자량 약 5만의 항원결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 당해 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.

F(ab')₂는 IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단된다), Fab가 힌지영역의 S-S 결합을 개재하여 결합된 것보다 약간 큰 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 F(ab') 2 는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 S-S 결합시켜 작제할 수 있다.Fab'는 상기 F(ab') 2 의 힌지영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

scFv는 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(P)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 scFv는 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

Diabody는 항원 결합 특이성이 동일하거나 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Diabody는 예를 들면, 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, 3 내지 15 잔기의 폴리펩타이드 링커를 갖는 scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 Diabody를 발현시켜 제조할 수 있다.

또한, linker P 길이가 3-10 일 때는 tribody가 형성되어, tribody로 포함할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL 중 각각 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를 당해 시스테인 잔기 간의 S-S 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 기재된 방법[참조: Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체구조 예측에 근거하여 선택할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서,락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스,메틸히드록시벤조에이트,프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제,보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0001-10,000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 포스파티딜-β-올레오일-γ-팔미토일 에탄올아민(DOPE): 콜레스테롤 헤미숙시네이트(CHEMS)에서 CpG-DNA로 공동 캡슐화된 복합물을 HCoV-OC43 N 단백질 복합체로 마우스를 면역화시켜 HCoV-OC43의 N 단백질에 대한 단클론 항체를 생산했다.

본 발명자들은 또한 HCoV-OC43의 N 단백질을 인식하는 HCoV-OC43Spike CD 및 Fc 도메인(HCoV-OC43 Spike CD-Fc)으로 구성된 융합 단백질의 능력을 평가했다. 마지막으로, 본 발명자들은 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 융합 단백질과 항-HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체를 결합한 신속한 HCoV-OC43 검출 방법을 제안하였다.

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 및 SARS-CoV-2 N-Bio-His6 재조합 단백질을 발현하고 ELISA 시스템을 사용하여 시험관 내에서 이들 단백질 간의 특이적이고 직접적인 상호 작용을 확인했다. 또한, 항-HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체를 사용하여 HCoV-OC43을 검출할 수 있음을 확인했다.

종합하면, 본 발명자들은 Spike CD-N 단백질 상호작용이 다양한 코로나바이러스 사이에서 일반적일 수 있으며 각 코로나바이러스에 대한 이러한 특정 상호작용이 우리의 미끼 및 먹이 ELISA 시스템을 사용하여 각 바이러스 입자의 정량적 측정에 적용될 수 있다고 결론지었다. 본 발명의 ELISA 시스템이 Spike CD-N 단백질 상호작용을 억제하여 코로나바이러스 복제를 차단하는 잠재적 약물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.

도 1은 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 융합 단백질과 HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His₆ 재조합 단백질 간의 상호작용을 나타낸 그림으로,
(A) 비오틴 펩타이드-6xHis-tagged HCoV-OC43 N 단백질(HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His6)의 발현. 비오틴화된 HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His₆ 재조합 단백질은 ExpiCHO 세포에서 발현되었고 Ni-NTA 아가로스 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 정제되었다. 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE(좌측) 및 peroxidase-conjugated streptavidin(우측)을 이용한 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. R, 환원 조건; NR, 비환원 조건.
(B) HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc의 발현. 재조합 Fc 도메인 단백질 및 HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc 융합 단백질을 ExpiCHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색으로 분석하였다.
(C) 미끼와 먹이 분석 시스템의 개략도.
(D) 96-웰 면역판을 스트렙타비딘으로 코팅한 다음, HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His₆ 단백질을 각 웰에 첨가하였다. 웰을 PBST로 세척한 다음, 표시된 농도에서 HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc 또는 Fc 도메인 단백질을 첨가하였다. 웰에서 HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His6 재조합 단백질에 결합된 HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc의 양은 ELISA에 의해 결정되었다.
도 2는 항HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론항체(1C7D7)를 생산하는 하이브리도마 클론의 스크리닝을 나타낸 그림으로,
(A) 재조합 HCoV-OC43 N-Bio-His₆ 단백질 및 CpG-DNA를 DOPE:CHEMS 복합체로 제형화하고 그 제형화된 복합체를 BALB/c 마우스(n=4)에 3회 복강내 주사하였다. 혈청으로 ELISA를 수행하여 재조합 HCoV-OC43 N-Bio-His6 단백질 특이적 항체의 존재를 확인했다.
(B) ELISA는 HCoV-OC43 N 단백질-비오틴 펩티드-6xHis 면역화된 마우스의 비장세포를 사용한 세포 융합 실험의 초기 스크리닝(HAT 배지)의 결과.
(C) 하이브리도마 클론은 HT 배지에서 제한 희석 방법에 의한 서브클로닝 후 단클론 항체 생산을 위해 선택되었다.
도 3은 anti-HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론항체의 생산 및 특성 규명을 나타낸 그림으로,
(A) 복제된 하이브리도마 세포(1C7D7)를 주사한 마우스로부터 복수를 수집하였다. ELISA는 재조합 SARS-CoV-2 N-Bio-His₆ 단백질 특이적 항체의 분석을 위해 복수로 수행되었다.
(B) 복수의 단클론항체를 Protein-A 컬럼크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE를 수행하였다. HC, 중쇄. LC, 경쇄.
(C) 정제된 단클론 항체의 서브클래스는 ELISA에 의해 결정되었다.
(D) 재조합 SARS-CoV-2 N-Bio-His6 단백질에 대한 정제된 단클론 항체(클론 1C7D7 mAb)의 결합 능력을 ELISA로 측정하였다.
(F) 모의 감염 또는 HCoV-OC43-, MERS-CoV- 또는 SARS-CoV-2 감염 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분해하고 정제된 단클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 분석했습니다. 항-β-액틴 항체를 대조군으로 사용하였다.
도 4는 HCoV-OC43 입자의 N 단백질과 HCoV-OC43 Spike CD의 상호작용을 나타낸 그림으로, HCoV-OC43을 함유하는 세포 배양 상청액을 세포 용해 완충액으로 용해시키고 Fc 또는 HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc와 함께 인큐베이션하였다. Fc 결합 단백질을 단백질 A 비드로 풀다운하고 항-HCoV-OC43 N 단클론 항체(클론 1C7D7 mAb)(왼쪽) 또는 항-hIgG Fc 항체(가운데)를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행했다. 바이러스 용해물은 대조군(오른쪽)으로 항-HCoV-OC43 N 단클론 항체(클론 1C7D7 mAb)를 사용하여 직접 분석되었다.
도 5는 하이브리도마 세포 클론 1C7D7에서 분리된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인에 대한 cDNA 서열.
(A) 중쇄 가변 도메인의 서열. (B) 경쇄 가변 도메인의 서열. 예상되는 아미노산 서열은 cDNA 서열에서 표시.
도 6은 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체와 재조합 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 단백질을 사용한 세포 배양 배지에서 HCoV-OC43의 검출을 나타낸 그림으로,
(A) ELISA 시스템의 개략도.
(B) 세포 배양 상층액의 HCoV-OC43을 세포 용해 완충액으로 용해하고 PBST에 연속적으로 희석했다. 바이러스 용해물을 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체(클론 1C7D7 mAb)로 코팅된 96웰 면역판에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. PBST로 세척한 후, 재조합 스파이크 CD-Fc 단백질을 첨가한 후, HRP가 결합된 항-인간 IgG Fc 항체를 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 HCoV-OC43 N 단백질의 양은 ELISA에 의해 결정되었다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:세포 배양

아프리카 녹색 원숭이 신장에서 유래한 베로 세포는 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 얻었고, 세포는 10% 소태아혈청(FBS,Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(100μg/ml)을 함유한 둘베코 변형 Eagle's 배지(DMEM, ATCC, Manassas, VA, USA)에서 배양하였다. 세포는 37°C에서 95% 공기와 5% CO2에서 유지되었다.

실시예 2:바이러스 증폭

HCoV-OC43(KBPV-VR-8)은 한국병원성바이러스은행(고려대학교 의과대학, 서울, 한국)에서 제공했다. 바이러스 증폭은 Maharjan S, Kang M, Kim J, Kim D, Park S, Kim M, Baek K, Lee Y, Kwon HJ. Apoptosis Enhances the Replication of Human Coronavirus OC43.　Viruses　2021; 13 :2199. https://doi.org/10.3390/v13112199에서 설명한 대로 수행되었다.

요약하면, 6웰 플레이트(3 × 10⁵ 세포/웰)의 Vero 세포를 0.03의 감염 다중도(MOI)에서 인산 완충 식염수(PBS)에서 HCoV-OC43으로 감염시켰다. 37℃에서 10분마다 흔들어주면서 1시간 동안 배양한 후, 세포를 5% CO2 배양기에서 37℃, 2% FBS를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 감염 후 4일 후, 세포 배양 상청액을 수확하고 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 -70°C에서 보관했다. HCoV-OC43 증폭은 한림대학교 중개연구센터에서 BSL-2(biosafety level 2) 조건에서 수행하였다.

MERS-CoV(MERS-CoV/KOR/KNIH/002_05_2015) 및 SARS-CoV-2 S 계통(BetaCoV/Korea/KCDC03/2020, NCCP43326)은 국립 병원균 수집품(오송, 한국)에서 제공했다. MERS-CoV 및 SARS-CoV-2 증폭 및 세포 배양 절차는 한림대학교 생물안전위원회의 권고에 따라 한림임상중개과학연구소에서 생물안전 3등급(BSL-3) 조건에 따라 수행하였다.

실시예 3:플라크 분석

HCoV-OC43 역가는 Maharjan S, Kang M, Kim J, Kim D, Park S, Kim M, Baek K, Lee Y, Kwon HJ. Apoptosis Enhances the Replication of Human Coronavirus OC43.　Viruses　2021; 13 :2199. https://doi.org/10.3390/v13112199에서 설명한 대로 수행되었다.

요약하면, Vero 세포(7 x 10⁵ cells/well)를 6웰 플레이트(Corning, NY, USA)에서 18시간 동안 배양했다. 세포를 PBS로 세척하고 37℃에서 PBS 중 바이러스-감염 배양 상청액의 10배 연속 희석액으로 접종하였다. 1시간 감염 후, 배지를 웰로부터 흡인하고 2% Oxoid 한천과 혼합된 3 ml DMEM/F12 배지(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하였다. 감염 후 5일 후, 오버레이 배지를 제거하고 플라크 형성을 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 평가했다.

실시예 4:항체

Peroxidase-conjugated streptavidin (Catalog No. S5512) 및 β-actin에 대한 항체는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수하였다. 인간 IgG Fc 도메인에 대한 항체(카탈로그 번호 790-035-098)는 Jackson ImmunoResearch Laboratories(PA, USA)로부터 입수하였다.

실시예 5: 비오틴 펩타이드-6xHis-tagged HCoV-OC43 N 단백질의 구성 및 발현

각각 5' 및 3' 말단에 제한효소 부위(NotI 및 Kpn I)를 포함하는 비오틴 펩타이드-6xHis 태그된(NSGSLHHILDAQKMVWNHR-DRNLPPLAPLGPHHHHHH;서열번호 9) HCoV-OC43 N 단백질(GenBank ID: NC006213.1, 뉴클레오티드 번호 29079-30425, 단백질Y P_0095155245,서열번호 10)을 코딩하는 융합 유전자를 합성하였다. 비오틴 펩타이드 서열은 대장균 비오틴 완전효소 합성효소 BirA에 의해 인식되었다. 합성된 융합 유전자를 포유동물 세포 발현을 위한 IL-2 신호 서열(pcDNA3.4-HCoV-OC43 N 단백질-Biotin-His6)을 함유하는 변형된 pcDNA 3.4 발현 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다.

HCoV-OC43 N 단백질-비오틴-His₆은 대장균 비오틴 리가아제, BirA(pTT3 분비 BirA-8His, 카탈로그 번호 #32408; Addgene, Watertown, MA, USA)를 포함하는 변형된 발현벡터로 ExpiCHO 세포 (catalog No. A29133, Thermo Fisher Scientific) 에서 발현되었다. HCoV-OC43 N protein-Biotin-His₆은 Ni-NTA-agarose(Qiagen) 크로마토그래피를 사용하여 32˚C에서 14일 동안 세포 배양한 후 ExpiCHO 배양 상층액에서 정제되었다. HCoV-OC43 N 단백질-비오틴-His₆의 발현 및 정제는 SDS-PAGE 및 항-His-tag 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

실시예 6: HCoV-OC43 스파이크 CD-인간 Fc 융합 단백질의 구축 및 발현

각각 5' 및 3' 말단에 제한 효소 부위(Not I 및 Kpn I) 포함하는 HCoV-OC43 스파이크 CD(GenBank ID :NC_006213 뉴클레오티드 번호 27600-27701 단백질 YP_009555241.1, 1320-CCTGCGTSCFKKCGGCCDDYTGYQELVIKTSHDD- 1353;서열번호 11) 및 인간 IgG1의 Fc 영역(GenBank ID:AK123800.1. KLEAKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 단백질;서열번호 12)을 코딩하는 융합 유전자를 합성하였다 (Bioneer, Korea), 합성된 융합 유전자를 포유동물 세포 발현을 위한 IL-2 신호 서열(pcDNA3.4-HCoV-OC43 Spike CD-Fc)을 함유하는 변형된 pcDNA 3.4 발현 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다. HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc 융합 단백질은 지침에 설명된 대로 Gibco™ ExpiCHO™ 발현 시스템 키트(카탈로그 번호 A29133, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 발현되었다. HCoV-OC43 Spike CD-Fc 융합 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 32˚C의 세포 배양에서 14일 후 ExpiCHO 배양 상청액에서 정제되었다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 분석으로 평가하였다.

실시예 7:마우스 면역화

HCoV-OC43 N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하기 위해 Nara-Biotec(Seoul, Korea)에서 4주령 BALB/c(암컷, H-2b) 마우스를 제공하였다. 재조합 HCoV-OC43 N-Bio-His6 단백질(50μg)과 MB-ODN 4531(O)(CpG-DNA,(50μg))의 혼합물은 DOPE:CHEMS 복합체(1:1의 몰비)로 캡슐화되었다(Kim, D., Kwon, S., Rhee, J. W., Kim, K. D., Kim, Y. E., Park, C. S., Choi, M. J., Suh, J. G., Kim, D. S., Lee, Y., and Kwon, H. J. (2011). BMC Immunol. 12, 29. doi: 10.1186/1471-2172-12-29).

BALB/c 마우스에 HCoV-OC43 N 단백질 복합체를 14일 간격으로 3회 복강내(ip) 면역화시켰으며, 동물 관리 및 실험 프로토콜은 한림대학교의 동물실험윤리 위원회의 승인을 받았다(한림2021-12).

실시예 8:HCoV-OC43 N 단백질에 대한 마우스 단클론항체 생산

마우스 SP2/0 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜 용액(PEG, Sigma-Aldrich)을 사용하여 HCoV-OC43 N 단백질 면역화된 마우스에서 유래된 비장 세포와 융합시켰다. 하이브리도마 세포는 앞서 설명한 표준 하이브리도마 생산 방법[Kim, D., Kwon, S., Rhee, J. W., Kim, K. D., Kim, Y. E., Park, C. S., Choi, M. J., Suh, J. G., Kim, D. S., Lee, Y., and Kwon, H. J. (2011). BMC Immunol. 12, 29. doi: 10.1186/1471-2172-12-29]에 따라 HAT 배지(Sigma-Aldrich) 및 HT 배지(Sigma-Aldrich)에서 수득하고 클로닝하였다. HCoV-OC43 N 단백질에 대한 마우스 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 BALB/c 마우스의 복강에 주입한 후 복강에서 복수를 수집하였다. HCoV-OC43 N 단백질에 대한 단클론 항체를 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 복수로부터 정제하였다.

실시예 9:항원 특이적 Ig ELISA

ELISA 코팅 완충액(0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.6) 중 Streptavidin(2 μg/well)을 4˚C에서 밤새 96-we1l 면역판(Thermo Fisher Scientific)에 코팅했다. 플레이트를 3% BSA를 함유하는 PBST가 보충된 PBS로 차단하였다. 재조합 HCoV-OC43 N-Bio-His6 단백질(2 μg/well)을 각 웰에 2시간 동안 첨가한 후 마우스 혈청, 하이브리도마 배양 상청액, 복수 또는 정제된 단클론 항체 용액을 각 웰에 첨가하여 이전[Kim, D., Kwon, S., Rhee, J. W., Kim, K. D., Kim, Y. E., Park, C. S., Choi, M. J., Suh, J. G., Kim, D. S., Lee, Y., and Kwon, H. J. (2011). BMC Immunol. 12, 29. doi: 10.1186/1471-2172-12-29]에 설명한 대로 표준 ELISA에 의하여 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 항체 수준을 측정하였다.

단클론 항체의 서브클래스는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-마우스 IgG(각 서브클래스) 항체(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)로 확인되었다.

실시예 10:ELISA에 의한 단클론항체 결합 친화도 측정

정제된 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론항체의 결합 친화도는 앞서 기술한 바와 같이 ELISA로 측정하였다[Park BK, Maharjan S, Lee SI, Kim J, Bae JY, Park MS, Kwon HJ. Generation and characterization of a monoclonal antibody against MERS-CoV targeting the spike protein using a synthetic peptide epitope-CpG-DNA-liposome complex. BMB reports 2019;52: 397-402. https://doi.org/10.5483/BMBRep.2019.52.6.185].

요약하면, 스트렙타비딘(2μg/웰)을 96웰 면역 플레이트에 코팅한 다음 재조합 HCoV-OC43 N-Bio-His6 단백질(3μg/웰)을 각 웰에 첨가한 다음 PBST 중의 연속 희석(1:5) 단일 클론 항체(클론 1C7D7 mAb)를 각 웰에 첨가하였다. HCoV-OC43 N 단백질에 결합하는 단클론 항체는 HRP-접합된 항-마우스 IgG 항체(1:5,000 희석, 카탈로그 번호 715-035-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) 및 테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)로 검출하였다. Spectra Max 250 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 각 웰의 450 nm에서의 흡광도를 측정했다. SigmaPlot은 앞서 설명한 대로 EC50 값을 결정하는 데 사용되었다[Park BK, Maharjan S, Lee SI, Kim J, Bae JY, Park MS, Kwon HJ. Generation and characterization of a monoclonal antibody against MERS-CoV targeting the spike protein using a synthetic peptide epitope-CpG-DNA-liposome complex. BMB reports 2019;52: 397-402. https://doi.org/10.5483/BMBRep.2019.52.6.185]

실시예 11:항-HCoV-OC43 N 단백질 단클론 항체의 가변 헤비 및 라이트 도메인의 클로닝

HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론(1C7D7)을 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 하이브리도마 세포(1C7D7)에서 전체 RNA를 추출하고 cDNA를 생성했다. 항-HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체(1C7D7)의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인(V_H 및 V_L)에 대한 서열을 클로닝하기 위해 생성된 cDNA를 다음 프라이머 세트와 함께 벤트 폴리머라제(NEB)를 사용하여 증폭시켰다.

중쇄 프라이머의 경우 IGG1(5'-GGA AGA TCT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3') 및 5'MH2(5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3')가 사용되었다.

카파 사슬 프라이머의 경우 3'Kc(5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3') 및 5'Mk(5'-GG GAG CTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3')가 사용되었다. 표준 PCR 반응은 25주기 동안 수행되었다. PCR 산물은 pGEM-T easy vector(Promega)에 직접 연결되었다. 복제된 마우스 Ig 삽입물을 DNA 시퀀싱으로 분석했다.

실시예 12:바이러스에 감염된 세포 용해물의 제조

HCoV-OC43 N 단백질에 대해 얻은 단클론 항체(클론 1C7D7 mAb)의 특이성을 조사하기 위해 이전에 설명한 대로 SARS-CoV-2, MERS-CoV 또는 HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포에서 세포 용해물을 준비했다[Maharjan S, Kang M, Kim J, Kim D, Park S, Kim M, Baek K, Lee Y, Kwon HJ. Apoptosis Enhances the Replication of Human Coronavirus OC43.　Viruses　2021; 13 :2199. https://doi.org/10.3390/v13112199].

Vero 세포(3×10⁵ 세포)를 6웰 플레이트에서 18시간 동안 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 후, PBS(0.1 MOI)의 각 바이러스를 각 웰에 접종한 다음 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 15분마다 흔들면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 MERS-CoV용 DMEM/F12 배지 2mL 또는 SARS-CoV-2 및 HCoV-OC43를 위한 2% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 37˚C CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음 10mM HEPES, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 100mM NaF, 2mM Na₃VO₄, 프로테아제 억제제 칵테일 및 1% NP-40을 포함하는 세포 용해 완충액으로 30분 동안 용해시켰다. 세포 용해물을 4°C에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고 상층액을 수집하여 -80°C에서 보관했다.

실시예 13:HCoV-OC43 Spike CD-인간 Fc 융합 단백질과 HCoV-OC43 N 단백질 간의 상호작용 평가

HCoV-OC43 Spike CD와 HCoV-OC43 N 단백질의 상호작용을 분석하기 위해 우리는 이전에 설명한 대로 "미끼와 먹이" ELISA를 설계했다[Kim D, Kim J, Park S, Kim M, Baek K, Kang M, Choi JK, Maharjan S, Akauliya M, Lee Y, Kwon HJ. Production of SARS-CoV-2 N protein-specific monoclonal antibody and its application in an ELISA-based detection system and targeting the interaction between the spike C-terminal domain and N protein. Front Microbiol. 2021; doi: 10.3389/fmicb.2021.726231].

요약하면, 스트렙타비딘(2 ㎍/웰)을 96-웰 면역 플레이트(Thermo Fisher Scientific)에 코팅한 다음 1% BSA를 함유하는 PBST로 차단했다. HCoV-OC43 N 단백질-비오틴-His6(3㎍/웰)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 후 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 융합 단백질을 PBST에 1:3으로 연속 희석하여 각 웰에 첨가한 다음 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. PBST로 세척한 후 양고추냉이 퍼옥시다제(1:5000 희석, 카탈로그 번호 109-035-008, Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 접합된 염소 항-인간 IgG Fc 항체를 각 웰에 첨가하였다. HCoV-OC43 Spike CD-인간 Fc 융합 단백질과 HCoV-OC43 N 단백질 사이의 상호작용은 테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질(KPL, SeraCare, Milford, MA, USA)로 현상하여 측정되었다.

바이러스 입자에서 HCoV-OC43 Spike CD-인간 Fc 융합 단백질과 HCoV-OC43 N 단백질의 상호작용을 분석하기 위해 HCoV-OC43을 포함하는 세포 배양 상청액을 세포 용해 완충액으로 용해시킨 다음 재조합 HCoV-OC43 Spike CD- Fc 단백질. 4°C에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 단백질 A 비드(CaptivA^tm PriMAB 52%(v/v) 슬러리, REPLIGEN)를 첨가한 다음 면역복합체를 수집했다. 면역복합체를 항-HCoV-OC43 N 단클론 Ab(클론 1C7D7 mAb)를 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석에 적용하였다.

실시예 14:ELISA에 의한 세포 배양 상청액에서 HCoV-OC43 검출

바이러스 입자의 HCoV-OC43 Spike CD와 HCoV-OC43 N 단백질의 상호작용은 앞서 설명한 바와 같이 ELISA로 측정하였다[Kim D, Kim J, Park S, Kim M, Baek K, Kang M, Choi JK, Maharjan S, Akauliya M, Lee Y, Kwon HJ. Production of SARS-CoV-2 N protein-specific monoclonal antibody and its application in an ELISA-based detection system and targeting the interaction between the spike C-terminal domain and N protein. Front Microbiol. 2021; doi: 10.3389/fmicb.2021.726231].

요약하면, HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체(클론 1C7D7 mAb, 3μg/well)를 96웰 면역 플레이트(Thermo Fisher Scientific)에서 4°C에서 밤새 코팅한 다음 1% BSA를 포함하는 PBST로 차단했다. 세포 배양 상청액 중 HCoV-OC43 바이러스 입자를 세포 용해 완충액으로 용해시키고 PBST에서 연속 희석(1:3)하고 플레이트의 웰에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 재조합 HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc 융합 단백질을 첨가한 다음 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-인간 IgG Fc 항체를 각 웰에 첨가하였다. TMB 퍼옥시다제 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories)로 현상한 후, Spectra Max 250 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 각 웰의 HCoV-OC43 N 단백질의 양을 결정했다.

상기 실시예의 결과를 하기에서 상술한다.

HCoV-OC43 N 단백질의 정제

HCoV-OC43 N 단백질에 대한 단클론 항체를 생산하기 위해 비오틴 펩타이드-6xHis-tagged HCoV-OC43 N 단백질(HCoV-OC43 N-Bio-His6)을 비오틴화된 형태로 ExpiCHO 세포에서 발현시키고 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 정제했다.

정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE로 검사하고 peroxidase-conjugated streptavidin을 이용한 western blotting으로 확인하였다(Fig. 1A).

재조합 HCoV-OC43 스파이크 CD 융합 단백질과 HCoV-OC43 입자의 N 단백질 간의 상호작용

HCoV-OC43에 대한 시험관 내 상호작용을 확인하기 위해 컨트롤 Fc 도메인과 HCoV-OC43 Spike CD 및 Fc 도메인(HCoV-OC43Spike CD-Fc)으로 구성된 융합 단백질을 생산 및 정제했다(그림 1B).

본 발명에서 본 발명자들은 시험관 내에서 HCoV-OC43 스파이크 CD와 N 단백질 사이의 상호 작용을 확인하기 위해 ELISA 기반 "미끼와 먹이" 시스템을 적용했다. HCoV-OC43의 Spike CD와 N 단백질 간의 상호 작용을 조사하기 위해 재조합 HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His₆ 융합 단백질(그림 1A)과 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 융합 단백질(그림 1B)을 발현 및 정제했다.

본 발명자들은 스트렙타비딘, HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His₆, HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc 및 HRP와 접합된 항-인간 IgG Fc 항체를 사용하는 미끼 및 먹이 분석 시스템을 설계했다(그림 1C). ELISA 결과 HCoV-OC43 Spike CD-Fc가 농도 의존적으로 HCoV-OC43 N protein-Bio-His₆에 결합함을 보여주었다. 고농도에서만 Fc 도메인의 약한 결합이 있었고 PBS 대조군에서는 결합이 없었다(도 1D).

이러한 결과는 HCoV-OC43 스파이크 CD와 HCoV-OC43의 N 단백질이 특이적이고 직접적으로 상호작용한다는 것을 뒷받침하고 우리의 미끼와 먹이 시스템이 시험관 내에서 이 상호작용을 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.

항-HCoV-OC43 N 단백질 단클론 항체의 생산 및 특성화

본 발명자들은 정제된 재조합 HCoV-OC43-2 N 단백질과 CpG-DNA의 복합체를 리포솜(DOPE:CHEMS)에 공동 캡슐화한 다음 BALB/c 마우스에서 면역화했다. 4마리의 면역된 마우스로부터 마우스 혈청을 수집하였고, 재조합 HCoV-OC43 N 단백질에 대한 항체의 생산을 확인하였다(도 2A). HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체의 생성을 위한 재조합 HCoV-OC43 N 단백질 인식 항체를 생산한 마우스로부터 비장세포를 수집한 다음 비장세포를 SP2/0과 융합시켰다. HAT 배지(도 2B) 및 HT 배지(도 2C) 선택을 통해 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 항체를 생산하는 하나의 클론 하이브리도마 세포(1C7D7)를 선택했다.

하이브리도마 세포(1C7D7)를 마우스 복강에 주사하고 수집된 복수에는 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체를 함유하였다(도 3A). HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체는 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다(도 3B). 정제된 단클론 항체의 IgG 서브클래스는 IgG1이었다(도 3C). 재조합 HCoV-OC43 N 단백질-Bio-His6에 대한 단클론 항체의 결합은 ELISA에 의해 측정되었고 EC50 값은 ~ 1.2 nM이었다(도 3D).

정제된 단클론 항체는 HCoV-OC43에 감염된 Vero 세포의 세포 용해물에서 N 단백질을 인식했지만 MERS-CoV- 또는 SARS-CoV-2에 감염된 Vero 세포의 세포 용해물에서는 인식하지 못했다(그림 3E).

다음으로 HCoV-OC43 Spike CD와 HCoV-OC43 입자의 N 단백질 간의 직접적인 상호작용을 확인했다. 정제된 HCoV-OC43 Spike CD-Fc 또는 Fc 도메인 컨트롤을 HCoV-OC43 바이러스의 용해물과 함께 배양하고, Protein A 아가로스 비드로 복합체를 풀다운하고, HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체(1C7D7 mAb)를 사용하여 HCoV-OC43 N 단백질을 검출했다. 결과는 HCoV-OC43의 N 단백질이 HCoV-OC43 Spike CD-Fc와 특이적으로 상호작용하지만 Fc 대조군과는 상호작용하지 않는다는 것을 보여주었다(도 4).

HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체의 가변 도메인 클로닝

중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(V_H 및 V_L)을 암호화하는 cDNA 서열은 공통 중쇄 및 경쇄 프라이머를 사용하여 HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(1C7D7)로부터 클로닝되었다. DNA 염기서열분석으로 확인된 염기서열은 도 5와 같다. 염기서열은 protein BLAST program(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 알려진 염기서열과의 상동성을 분석하였다. 1C7D7 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 cDNA는 보고된 면역글로불린 가변 중쇄 및 경쇄의 서열과 각각 약 93~98% 상동성을 나타내었다.

HCoV-OC43 바이러스 입자의 N 단백질과 재조합 스파이크 CD 간의 상호작용을 기반으로 하는 ELISA 시스템에 의한 HCoV-OC43 검출

본 발명자들은 anti-HCoV-OC43 N 단백질 항체와 HCoV-OC43 Spike CD-Fc를 사용하여 HCoV-OC43 바이러스에 대한 ELISA 기반 탐지 시스템을 설계했다(그림 6A).

HCoV-OC43 N 단백질 특이적 단클론 항체(1C7D7 mAb)는 용해물에서 HCoV-OC43 입자의 N 단백질을 포획하는 데 사용되었으며, N 단백질은 HCoV-OC43 스파이크 CD-Fc와 상호작용할 수 있었다. 이 ELISA 시스템은 농도 의존적으로 HCoV-OC43의 바이러스 입자를 성공적으로 검출했다(그림 6B).

이는 N 단백질과 Spike CD Fc 융합 단백질 간의 상호 작용이 HCoV-OC43의 새로운 검출 방법에 적용될 수 있음을 시사한다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> AN ANTIBODY SPECIFIC FOR N PROTEIN OF HUMAN CORONAVIRUS OC43 AND AN APPLICATION THEREOF <130> P21-0046 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VH <400> 1 Gly Phe Ser Phe Ser Ser His Thr Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VH <400> 2 Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VH <400> 3 Gly Gln Glu Ala Asp Gly Tyr Tyr Val Pro Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VL <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VL <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VL <400> 6 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<210> 12 <211> 234 <212> PRT <213> Human coronavirus <400> 12 Lys Leu Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims (14)

1. 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편에 있어서,
   상기 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편:
   서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및
   서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 단일 측쇄 항체(scFv)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
3. 제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 항원결합 분절(Fab)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
4. 제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 제1항의 CDR부위를 포함하는 경쇄 또는 중쇄인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
5. 제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 제1항의 CDR부위를 포함하는 가변 도메인(Variable domain)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
6. 제1항에 있어서, 상기 단클론 항체는 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
7. 리포좀 내에 동시캡슐화된 인간 코로나바이러스 OC43의 N 단백질 및 CpG-DNA 복합체를 동물에 주사하여 인간 코로나바이러스 OC43을 인식하는 단클론 항체를 제조하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 인간 코로나바이러스 OC43 N 단백질은 서열번호 10에 기재된 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단클론 항체를 제조하는 방법.
9. 제9항의 제조방법에 의하여 제조된 인간 코로나바이러스 OC43을 인식하는 단클론 항체.
10. 제1항의 단클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 인간 코로나바이러스 OC43 진단용 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인간 코로나바이러스 OC43 진단용 조성물.
12. 1) 샘플과 제1항, 또는 제9항의 단클론 항체를 접촉시키는 단계; 및
    2) 상기 단클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는
    대상체의 인간 코로나바이러스 OC43 감염 여부에 대한 정보제공방법.
13. 1) 제1항 또는 제9항의 단클론 항체; 및
    2) 용기를 포함하는 인간 코로나바이러스 OC43 진단용 키트.
14. 제1항의 단클론 항체를 유효성분으로 포함하는 인간 코로나바이러스 OC43 감염 치료용 조성물.

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