KR20180112916A

KR20180112916A - c-Myc에 특이적인 단클론 항체 및 그 용도

Info

Publication number: KR20180112916A
Application number: KR1020170043728A
Authority: KR
Inventors: 권형주; 박병권
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-04
Filing date: 2017-04-04
Publication date: 2018-10-15
Also published as: KR101994977B1

Abstract

본 발명은 c-Myc 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편에 있어서, 상기 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편:서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단클론 항체에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 여러 암에서 Myc-활성을 감소시키는 안타고니스트로 작용할 수 있어서, 암에 대한 치료용 항체 후보물질로 채택될 수 있다.

Description

c-Myc에 특이적인 단클론 항체 및 그 용도{An anti-c-Myc monoclonal antibody and use of the same}

본 발명은 c-Myc에 특이적인 단클론 항체 및 그 용도에 관한 것이다.

암의 발생은 원-발암유전자 c-myc를 포함하는 세포 원-발암유전자의 발현 수 준의 변화에 연결된 복잡한 다단계 과정이다(Denhardt, DT, 1999; Pendergast GC, 1999). c-myc는 세포 성장, 분화, 및 아폽토시스를 조절하며, 그것의 이상 발현은 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병, 폐암 등을 포함하는 많은 사람 암에 관련된다(Dang 등, 1999).

다수 암들에서의 염기성-나선-루프-나선 핵 c-myc의 조절되지 않은 발현이나 이상 발현을 내포하는 보고서들이 많은 접근법을 사용하여 c-myc 저해 효과를 평가하는 전-임상 및 임상 연구를 이끌고 있다.

Myc 유전자는 전사 인자(transcription factor)의 코딩에 영향을 미치는 조절 유전자(regulator gene)이다. 이는 DNA결합단백질을 코딩하는　암유전자이기도 하며, v-Myc 및 c-Myc의 두 종류가 있다. v-Myc(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog)는 조류에서 골수세포종증을 일으키는 것으로서 조류의 암유전자이다.

한편, c-Myc는 염기성 영역-나선-루프-나선-류신지퍼영역(bHLH-LZ)의 구조를 이루고 있으며,각종　암세포에서 유전자의 발현을 증폭시키며, 인간의 8번 염색체　장완 24영역에 위치하고 있다. c-Myc에 의해 발현된 단백질은 세포의 주기, 사멸, 및 형질 전환에 중요한 역할을 인산단백질(phosphoprotein) 이며, 유전자는 세포 증식과 형질전환을 촉진시키는 역할을 한다. 즉, 히스톤을 아세틸화 시켜서 DNA와의 접촉이 느슨하게 함으로써　유전자의 전사억제상태를 완화시키며, 이를 통해 Oct3/4와 Sox2가 특정한　유전자　위치에 잘 결합하여 전사를 유도할 수 있도록 한다.

c-Myc에 돌연변이가 발생하여 과잉활성화되면, 세포가 분열하여 종양을 형성하게 되는데, 이러한 c-Myc-의존성 암세포는 c-Myc가 제거되면 사멸하게 된다. 따라서, 연구자들은 암세포의 이러한 취약성에 착안하여 항암제를 개발하려고 노력해 왔으나, Myc 단백질에 특이적 또는 효과적으로 결합하는 항체를 개발하지 못하는 실정이며,이는 c-Myc에 상기 항체가 효과적으로 결합하는 영역이 없기 때문이다.

[선행 특허문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020160133368호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로 본 발명의 목적은 c-Myc에 특이적인 단클론 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체의 암 관련된 용도를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 c-Myc 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편에 있어서, 상기 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편:서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단클론 항체.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 기능적 단편은 단일 측쇄 항체(scFv)인 것이 바람직하고,

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 기능적 단편은 항원결합 분절(Fab)인 것 바람직하며,상기 기능적 단편은 상기 본 발명의 CDR부위를 포함하는 경쇄 또는 중쇄인 것이 바람직하며, 상기 본 발명의 CDR부위를 포함하는 가변 도메인(Variable domain)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단클론 항체는 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄인 것이 바람직하며,

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 c-Myc 단백질의 일부는 서열번호 9로 기재되는 펩티드 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 c-Myc에 대한 단클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 c-Myc에 대한 단클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 샘플과 상기 본 발명의 단클론 항체를 접촉시키는 단계; 및 2) 상기 단클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는 대상체의 암 발생 여부에 대한 정보제공방법을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 단클론 항체; 및 2) 용기를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 암 진단용 조성물; 및 2) 용기를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 진단용 조성물은 본 발명의 단클론 항체 및 면역학적 분석에 사용되는 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 공지의 모든 정량분석방법에 사용되는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 상기 정량분석방법의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 면역블롯팅, 면역침전법, 효소면역분석법, 단백질 칩, 래피트 어세이 및 마이크로 어레이 방법 등이 있다.

상기에서 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지로는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 효소로는 과산화효소(peroxidase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase), β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을사용할 수 있으며, 형광물질로는 플루오르신 이소티옥시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌린(phycobilin) 단백질, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin) 및 오르토프탈릭 알데히드(orthophthalic aldehyde)등을 사용할 수 있다. 발광물질로는 이소루미놀(isolumino), 루시게닌(lucigenin) 등을 사용할 수 있으며, 방사성 물질로는 131I, 14C, 3H 등을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따라, 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 시료내 암 발생 여부를 진단하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

(1) 인간 c-Myc 단백질에 특이적인 제 1 항체를 고상체에 고정시키는 단계,

(2) 상기 고상체에 검사하고자 하는 시료 용액을 가하여 시료내 c-Myc이 상기 항체에 결합하도록 반응시키는 단계,

(3) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,

(4) 발색 효소에 결합된, c-Myc 단백질에 특이적인 제 2 항체를 상기 고상체에 가하여 단계 (2)에서 결합된 제 1 항체와 c-Myc의 복합체에 결합하도록 반응시키는 단계,

(5) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,

(6) 세척한 고상체에 효소 기질 용액을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 하는 단계, 및

(7) 반응 결과 나타나는 발색 정도를 측정하여 시료내 c-Myc의 농도를 측정하는 단계.

또한, 상기한 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 c-Myc을 측정하기 위한 본 발명의 키트는 고상체에 고정된 항-c-Myc 제 1 항체, 효소에 결합된 항-c-Myc 제 2 항체, 시료 희석 용액, 효소 기질 용액, 세척액 및 c-Myc 표준 용액을 포함한다.

발색 반응에 의해 c-Myc의 농도를 정량적으로 측정하기 위한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 사용하는 것이 바람직하고, 이 경우에 있어 효소의 기질 용액으로는 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액을 사용한다.

또는 정량적 분석을 위하여 본 발명의 항체에 형광물질 (예, Alexa488)을 접하여 직접적으로 측정하는 방법도 있다.

또한 고상체로는 일반적으로 마이크로플레이트의 웰을 사용한다.

전술한 효소 면역 측정법외에, 본 발명에 따른 항-c-Myc 단클론 항체를 이용한 면역 측정법으로서, 면역 크로마토그래피법을 이용하여 시료내 c-Myc 여부를 측정할 수도 있다.

상기 면역 크로마토그래피에 의한 측정 방법은 착색 미립자에 결합된 항-c-Myc 항체와 시료를 면역 반응시키고,모세관 현상에 의해 착색 미립자-항체-c-Myc 복합체가 연속 이동하는 과정을 통해 멤브레인상에 미리 고정시킨 별도의 항-c-Myc 항체 밴드와 상기 복합체가 결합하도록 함으로써, 밴드 위치의 착색 여부에 의해 시료내 c-Myc 존재 여부를 검출하는 방법이다.

상기한 방법은 샘플 부재, 착색 미립자에 결합된 항-c-Myc 제 1 항체가 일시적으로 고정되어 있는 면역 반응 부재, 항-c-Myc 제 2 항체 밴드(판정 라인)와 대조용 항체 밴드(대조 라인)를 함유하는 결과 표시 부재 및 흡수부재를 포함하는 면역 크로마토그래피 킷트를 사용하여 실시할 수 있다.

상기 각 부재들은 모세관 현상에 의해 시료 용액이 연속적으로 이동하도록 부분적으로 겹쳐지게 순서대로 일렬 배치되며, 상기 대조 라인은 판정 라인과 일정 간격을 두고 떨어져 위치하도록 한다.

면역 반응 부재에는 착색 미립자에 결합된 항-c-Myc 제 1 항체가 멤브레인상에 일시적으로 고정되어 있어, 샘플 부재에 의해 흡수된 시료 용액내 c-Myc와 면역 반응에 의해 복합체를 형성한 후, 모세관 현상에 의해 결과 표시 부재상으로 연속 이동하게 된다.

또한, 결과 표시 부재에는 항-c-Myc 제 2 항체 밴드와 대조용 항체 밴드로 이루어지는, 총 2개의 항체 밴드가 일정 간격을 두고 표면상에 고착되어 있다.

상기 항-c-Myc 제 2 항체 밴드는 시료내 c-Myc의 존재를 나타내는 결과 판정 라인으로, 상기 면역 반응부재에서 형성된 착색 미립자-항체-c-Myc 복합체가 이동중에 이 밴드 지점을 통과하면서 항-c-Myc 제 2항체와 특이적으로 반응하여 결합체를 형성하게 되고, 이에 따라 밴드 위치에 착색이 일어나게 된다.

반면, 통상 제 2 항체 밴드로부터 시료 이동 방향으로 하단 0.5 내지 2㎝ 정도의 지점에 위치하는 대조용 항체 밴드는 염소 항-마우스 IgG와 같은 일반적인 항체를 포함하고 있어, 상기 판정 라인을 통과한 미결합 시료 성분들과 면역 반응함으로써, 본 검사가 정상적으로 시행되었는지를 확인해 주는 역할을 한다.

이후, 나머지 시료 성분들은 모세관 현상에 의해 계속 이동되어 흡수 부재에 의해 흡수된다.

본 발명의 면역 크로마토그래피 키트에 사용된 항-c-Myc 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 클론으로부터 생산된, c-Myc에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 항암 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면,하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제,바람직하게는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이러한 목적에 적합한 제형으로는 정제, 환제, 당제 (dragee), 산제, 캡슐제, 시럽제, 용액제, 겔제, 현탁제,에멀젼, 마이크로에멀젼 등의 다양한 경구투여용 제제; 및 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입제 및 하이포스프레이 (hypospray)와 같은 분무제 등과 같은 비경구투여용 제제가 바람직하다. 주사 또는 주입용 제제의 경우에는 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체 분자는 사용 전에 적절한 무균 액체롤 재조정하여 사용할 수 있는 건조된 형태로 제제화될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 위장관 내에서 분해되기 쉬운 항체 분자를 포함하므로, 상기 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의하여 투여되어야 하는 경우에는 분해로부터 항체를 보호하고, 항체를 방출한 후에는 위장관으로 흡수되는 약제를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 또한 본 발명의 항체를 상기에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 동물, 바람직하게는 포유동물,더욱 바람직하게는 사람에게 투여되는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물 또는 약학적 제제의 유효성분으로서 상기 항체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.001 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별, 약제조합, 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 기능적 항체 단편으로는 경쇄, 중쇄, 가변 영역, Fab, Fab', F(ab') 2 , scFv, Diabody, Tribody, dsFv, CDR을 함유하는 펩타이드 등을 들 수 있다.

Fab는 IgG를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단된다),H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합된 분자량 약 5만의 항원결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 당해 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.

F(ab')2 는 IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단된다), Fab가 힌지영역의 S-S 결합을 개재하여 결합된 것보다 약간 큰 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 F(ab') 2 는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 S-S 결합시켜 작제할 수 있다.Fab'는 상기 F(ab') 2 의 힌지영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

scFv는 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(P)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 scFv는 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

Diabody는 항원 결합 특이성이 동일하거나 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Diabody는 예를 들면, 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, 3 내지 15 잔기의 폴리펩타이드 링커를 갖는 scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 Diabody를 발현시켜 제조할 수 있다.

또한, linker P 길이가 3-10 일 때는 tribody가 형성되어, tribody로 포함할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL 중 각각 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를 당해 시스테인 잔기 간의 S-S 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 기재된 방법[참조: Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체구조 예측에 근거하여 선택할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

에피토프 선택 및 2E2F12 단클론 항체의 생산

B-세포 에피토프 펩타이드 Myc362 및 Myc387을 c-Myc 및 Max의 단백질-단백질 상호작용 및 항원성을 고려하여 선택하였다(도 1A). BALB/c 마우스를 각 에피토프 펩타이드 및 Lipoplex(O)의 복합체로 면역화하였다. ELISA 분석은 Myc362 면역화된 군 유래 혈청이 Myc387의 것과 비교된 항체의 현저한 생성을 가진다고 나타내었다(도 1B 및 C). 다음, Myc362-면역화된 마우스 지라세포를 추출하여서 하이브리도마 세포 생산을 위하여 SP2/0 세포와 융합하였다. HAT (도 2A) 및 HT 배지로 Myc362 클론의 추가적인 선택은 2E2A8, 2E2F12, 2E2G12, 및 2E2H11의 네 클론을 야기하였다(도 2B). 이들 클론들의 효율을 조사하기 위하여, HEK293 세포들을 empty 벡터 또는 c-Myc 및 Max 발현 벡터로 트랜스팩션하였다. 세포 파쇄액을 각 클론의 배양 상등액으로 면역침전하고 토끼 anti-c-Myc 항체로 면역블럿하였다(도 2C). 모든 항체 클론들은 재조합 c-Myc를 면역침전하였다. 본 발명자들은 복수액 유래 효과적인 항체 생성 및 클론의 더 큰 안정성 때문에 추가적인 연구를 위하여 2E2F12 클론을 선택하였다.

2E2F12 단클론 항체의 정제 및 특성

anti-c-Myc 항체를 내는 명백한 단클론 항체를 개발하기 위하여, 2E2F12 하이브리도마 세포를 pristine-primed 마우스에 주사하여 복수를 생산하고, anti-c-Myc 항체의 강력한 생성을 확인하였다(도 3A). 다음으로, 정제를 protein A agarose 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 추가적인 확인은 SDS-PAGE에 정제된 항체를 런닝하고 Coomassie brilliant blue로 염색하여 수행하였다(도 3B). IgG isotype의 결정을 위해서, 단클론 항체를 ELISA로 어세이하였다. 그 결과는 2E2F12 단클론 항체가 IgG2a이다라는 것을 나타내었다(도 3C). 2E2F12 항체의 Myc362 펩타이드에 대한 결합 친화도는 ~ 37 nM의 Kd로 평가되었다(도 3D). 그것에 의해, 본 발명자들은 2E2F12 단클론 항체를 성공적으로 생산하고 특성을 규명하였다.

anti- Myc362 펩타이드 -특이적인 단클론 항체의 가변 도메인의 클로닝

중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(V_H 및 V_L)을 코딩하는 cDNA 서열들을 통상적인 중쇄 및 경쇄 프라이머를 사용하여 anti-Myc362 펩타이드-특이적인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(2E2F12)로부터 클로닝하였다. 서열들을 도 4에 나타낸 것과 같이 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 서열들을 protein BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 의해서 공지 서열들과 호모로지에 대해 분석하였다. 2E2F12 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 cDNA는 각각 보고된 면역글로부린 가변 중쇄 및 경쇄 도메인과 약 80 ~ 95% 및 93 ~ 98% 호모로지를 나타내었다.

웨스턴 블럿과 2E2F12 단클론 항체로 면역침전 분석

2E2F12 단클론 항체의 특이성을 분석하기 위하여, 웨스턴 블럿 분석을 2E2F12 단클론 항체를 통상의 토끼 및 마우스 anti-c-Myc 항체를 사용하여 수행하였다. 그 데이터들은 통상 anti-c-Myc 항체들은 HEK293 세포에서 과발현된 c-Myc 단백질을 검출한 반면, 본 발명의 항체는 c-Myc를 검출할 수 없었다(데이터 도시 안함). 본 발명의 항체가 그것의 천연 형태에서 c-Myc를 동정할 수 있는지를 조사하기 위하여, 토끼 anti-c-Myc 항체 및 2E2F12 단클론 항체를 사용한 면역침전을 수행하였다(도 5A). 이 실험은 2E2F12 단클론 항체는 c-Myc 단백질을 적절하게 면역침전할 수 있었고, 2E2F12 단클론 항체가 천연 상태에서 c-Myc 단백질을 효과적으로 동정할 수 있다는 것을 시사한다. 다음으로, 본 발명자들은 anti-Max 항체를 사용하여 면역침전된 복합체를 분석하였고, 2E2F12 단클론 항체가 Jurkat 및 LoVo 세포에서 내생적으로 발현된 c-Myc-Max 복합체를 검출하고 동시 면역침전할 수 있다는 것을 발견하였다(도 5B).

2E2F12 단클론 항체에 의한 promoter-c- Myc -Max 다이머 상호작용의 저해

c-Myc은 특정 DNA 서열에 결합하기 전에 Max와 헤테로다이머를 형성하고 여러 정상적인 세포 작용에 관련된다(Nair SK and Burley SK: Cell 2003;112(2):193-205;Blackwood EM and Eisenman RN: Science 1991;251(4998):1211-1217). 또한, c-Myc은 암세포 생존 및 대사의 중요한 면에서 관련된다(Hsieh AL, Walton ZE, Altman BJ, Stine ZE and Dang CV: Semin Cell Dev Biol 2015;43:11-21).따라서, 2E2F12 항체가 DNA에 c-Myc 결합을 억제할 수 있는지를 결정하기 위하여, ELISA 기반 DNA-단백질 상호작용 어세이를 수행하였다. 그 결과는 효과가 없었던 isotype IgG-처리 샘플 또는 비처리 군과 비교하여 2E2F12 단클론 항체의 존재에서 감소된 DNA 결합을 나타낸다(도 6). 따라서, 이들 결과들은 anti-c-Myc 항체가 다이머화 또는 모두에서 DNA에 헤테로 다이머의 결합 또는 c-Myc 및 Max의 다이머화를 현저하게 저해한다는 것을 시사한다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 여러 암에서 Myc-활성을 감소시키는 안타고니스트로 개발될 수 있는 c-Myc에 대한 단클론 항체를 성공적으로 개발되었고, 이러한 항체는 암에 대한 치료용 항체 후보물질로 채택될 수 있다.

도 1은 c-Myc의 B 세포 에피토프에 대한 단클론 항체의 생산을 나타낸 그림. (A) Myc 및 Max 상호작용 및 Myc 에피토프의 위치를 나타낸 모델. (B 및 C) 마우스를 Lipoplex(O)에서 Myc362 및 Myc387의 B-세포 에피토프 펩타이드로 면역화하고, 혈청을 anti-c-Myc 항체의 검출을 위하여 ELISA로 분석하였다.
도 2는 anti-Myc362 펩타이드-특이적인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 스크리닝을 나타낸 그림. (A) 세 BALB/c 마우스를 10일 간격으로 4회 DOPE:CHEMS 복합체에 코캡슐화된 Myc362 펩타이드 및 MB-ODN 4531(O)로 복강내 면역화하였다. Myc362 펩타이드 면역화된 마우스의 지라세포를 사용하여 세포 융합 실험의 초기 스크리닝(HAT 배지)로부터 얻은 ELISA 결과. (B) 하이브리도마 클론을 단클론 항체의 생산을 위해 선택하고 HT 배지에서 리미팅 희석 방법으로 서브클로닝함. (C) HEK293 세포를 empty vector (E) 또는 c-Myc 및 Max 발현 벡터(M)로 트랜스팩션하였다. 세포 파쇄액을 Myc362 클론들, 2E2A8, 2E2F12, 2E2G12, 및 2E2H11의 세포 배양 상등액을 사용하여 면역침전하고 토끼 anti-c-Myc 항체로 면역블럿하였다. 전체 세포 파쇄액을 시작하는 단백질 양을 나타내기 위해 마우스 anti-c-Myc 항체 및 anti-베타-Actin으로 면역블럿하였다.
도 3은 2E2F12 단클론 항체의 정제 및 특성을 나타낸 그림. (A) 복수의 적정 곡선을 ELISA로 조사하였다. 2E2F12 클론을 복수의 생성을 위해서 pristane-primed 마우스에 주사하였다. (B) 2E2F12 단클론 항체를 protein-A agarose 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 복수로부터 정제하고, SDS-PAGE로 분석하고, Coomassie Blue를 사용하여 염색하였다. R, 환원 조건. NR, 비-환원 조건. (C) 정제된 2E2F12 단클론 항체를 에피토프 특이적인 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3의 결정을 위해서 isotype IgG ELISA를 수행하였다. (D) Myc362로 2E2F12 단클론 항체의 결합 친화도를 ELISA로 평가하였다.
도 4는 하이브리도마 세포 클론 2E2F12으로부터 분리된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인의 cDNA 서열을 나타낸 그림. (A) 중쇄 가변 도메인의 서열. (B) 경쇄 가변 도메인의 서열. 예측된 아미노산 서열을 cDNA 서열 하단에 기재하였다.
도 5는 웨스턴 블럿 및 면역침전 분석에 의한 2E2F12 단클론 항체의 특성을 나타낸 그림. (A) HEK293 세포들을 empty vector (E) 또는 c-Myc 및 Max 발현 벡터(M)로 트랜스팩션하였다. 세포 파쇄액을 토끼 anti-c-Myc 항체 또는 2E2F12 단클론 항체로 면역침전하고 웨스턴 블럿을 통상 토끼 및 마우스 anti-c-Myc 항체로 수행하였다. (B) 2E2F12 단클론 항체 및 마우스 anti-c-Myc 항체를 사용하여 얻어진 면역침전된 샘플을 통상 토끼 anti-c-Myc 항체 및 염소 anti-Max 항체로웨스턴 블럿팅으로 분석하였다. J, Jurkat 세포 파쇄액. L, LoVo 세포 파쇄액.
도 6은 2E2F12 단클론 항체에 의한 promoter-c-Myc-Max 다이머 상호작용의 저해를 나타낸 그림. Avidin를 포함한 카보네이트 버퍼를 96-well immunoplates에 코팅하고, E box 서열을 코딩하는 바이오틴화된 올리고뉴크레오타이드를 그 플레이트 상에 배양하였다. c-Myc 및 Max 코-트랜스팩션된 세포의 전체 추출물을 2E2F12 단클론 항체 또는 isotype 대조군 항체로 배양한 후 세포 파쇄액을 플레이트 상에 배양하였다. 그 플레이트들을 토끼 anti-c-Myc 항체로 배양한 후 peroxidase 부착된 염소 anti-rabbit IgG로 배양하였다. promoter-c-Myc-Max 다이머 상호작용의 수준을 peroxidase 활성의 현상에 의하여 결정되었다.

이하, 비한정적인 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1:세포 배양

HEK293 (human embryonic kidney cell)는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 인간 대장암 세포주인 LoVo는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)에서 확보하였다. 불멸화된(Immortalized) 인간 T-lymphocyte 세포주인 Jurkat는 한림대 이근욱 교수님으로부터 얻었다. HEK293 세포를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 유지시켰다. LoVo 및 Jurkat 세포들은 RPMI1640 (Life Technologies) 배지에서 유지시켰다. 모든 배지는 10% 우태아 혈청(FBS, Life Technologies), 25 mM HEPES, 100 U/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin으로 보충되었다. 모든 세포주들은 37°C에서 95% 공기 및 5% CO₂. 조건에서 배양하였다.

실시예 2: 재조합 c- Myc 및 Max 단백질 발현

c-Myc 및 Max를 myc-histidine (His)-tagged 및 FLAG-tagged 단백질로 각각 발현하였다. 요약하면, 전체 mRNA를 Huh-7 및 PANC1 세포로부터 각각 c-Myc 및 Max에 대하여 얻었다. c-Myc cDNA를 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응으로 증폭하였다: sense 5'- GGA TCC ATG GAT TTT TTT CGG GTA GTG G(서열번호 10) - 3' 및 anti-sense 5'- CTC GAG CGC ACA AGA GTT CCG TAG C - 3'(서열번호 11). Max cDNA는 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다: sense 5'- GAA CAT ATG GCC GAC GAA AAG CCC A - 3'(서열번호 12) 및 anti-sense 5'- GAA CTC GAG GTA GAC ACC TCC CGT CTG C - 3'(서열번호 13). 그 증폭된 cDNA 절편들을 각각 c-Myc에 대한 발현벡터 pcDNA 3.1-Myc-His (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA) 및 Max에 대한 발현벡터 pDream 2.1-FLAG (GeneScript, Piscataway, NJ, USA)로 클로닝하였다. 그 c-Myc 및 Max 발현 플라즈미드를 HEK293 세포주에 Fugene 6 트랜스팩션 시약(Promega, Madison, USA)으로 코-트랜스팩션하였다. 트랜스팩션 후, 그 세포 파쇄액을 원심분리하고 웨스턴 블럿 분석을 위하여 SDS-PAGE 상에 로딩하였다.

실시예 3: B 세포 에피토브 펩타이드의 제조

c-Myc 특이적인 항체 제조를 위한 B 세포 에피토프 펩타이드를 선택하기 위하여, 본 발명자들은 각각 펩타이드 Myc362 및 Myc387에 대한 펩타이드 서열은 선택하였고, 그들은 각각 다음과 같다:³⁶²SSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELK³⁸⁶(서열번호 9) 및 ³⁸⁷RSFFALRDQIPELENNEKAPKVVIL⁴¹¹(서열번호 14). 각 펩타이들은 자동화된 펩타이드 합성기(Peptron III-R24, Peptron, Daejeon, Korea)를 사용하여 합성하였다. 그 펩타이드들을 역상 HPLC (Prominence HPLC, Shimadzu Corp., Tokyo, Japan)로 정제하여 90% 이상의 순도로 정제하였다.

실시예 4: 마우스 및 면역화

4 주령 암컷 BALB/c (H-2^b) 마우스를 Nara-Biotec (Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 본 동물 실험은 한림대 동물 실험 관련 위원회의 승인을 받았다(Hallym2015-56). DOPE:CHEMS에 동시캡슐화된 CpG-DNA 및 B-세포 에피토프 펩타이드의 리포좀 복합체 (Lipoplex(O))는 기존에 기재된 방법(Kim D, Kwon S, Ahn CS, Lee Y, Choi SY, Park J, Kwon HY and Kwon HJ: BMB Rep 2011;44(11):758-763;Kim D, Kwon HJ and Lee Y: BMB Rep 2011;44(9):607-612)과 같이 제조하였다. 그 마우스를 Kim D, Lee Y and Kwon HJ: Methods Mol Biol 2015;1348:127-135와 같이, 리포좀에 캡슐화된 50 ug의 CpG-DNA와 혼합된 50 ug의 펩타이드 에피토프를 복강내 주사하였다. 모든 마우스를 10일 간격으로 3회 주사하였다.

실시예 5: 항원-특이적인 Ig ELISA 어세이

마우스 혈청을 orbital bleeding으로 모아서 항원 특이적 항체 생산을 분석하였다. 5 ug/ml의 펩타이드를 96-well immunoplates (Thermo Fisher Scientific)상에 코팅하고 1% BSA를 포함한 0.05% of Tween-20 in PBS로 블럭킹하였다. 항체 생산 수준은 Park BK, Choi SH, Kim YE, Park S, Lee Y, Lee KW and Kwon HJ: Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 2015;34(2):101-109에서와 같이 측정하였다.

실시예 6: anti-c- Myc 단클론 항체의 제조

표준 하이브리도마 기술에 따라, 하이브리도마 세포를 anti-Myc362 펩타이드-특이적인 단클론 항체(2E2F12)를 생산하기 위하여 선택하였다(Kwon S, Choi KC, Kim YE, Ha YW, Kim D, Park BK, Wu G, Kim DS, Lee Y and Kwon HJ: Cancer Res 2014;74(14):3844-3856;Yokoyama WM, Christensen M, Santos GD and Miller D: Curr Protoc Immunol 2006;Chapter 2:Unit 2 5). 10일 간격으로 3회, BALB/c 마우스에 DOPE:CHEMS 복합체에 캡슐화된 Myc362 펩타이드 (50 ug) 및 MB-ODN 4531(O) (50 ug)를 복강내 주사하였다. 면역화된 마우스 유래 비장을 표준 하이브리도마 기술에 따라 융합에 사용하였다. HAT 배지 및 HT 배지에서 하이브리도마 클론을 클론 세포군을 얻기 위해서 표준 리미팅 희석 프로토콜로 선택하였다. 복수(ascite)를 얻기 위해서, 그 선택된 하이브리도마 클론을 BALB/c 마우스의 복강내에 주사하였다. Anti-Myc362 펩타이드-특이적인 단클론 항체를 protein-A 컬럼 크로마토그래피로 복강액으로부터 정제하였다. anti- Myc362 펩타이드- 특이적인 단클론 항체의 아이소타입을 결정하기 위해서, isotyping 키트(Southern Biotechnology Associates Inc, Birmingham, USA)를 사용하였다.

실시예 7: 결합 친화도 측정

2E2F12 단클론 항체의 결합 친화도를 확인하기 위해서, 5 ug/ml의 Myc362 펩타이드를 96-웰 면역플레이트 상에 코팅한 후 1% BSA를 포함한 PBST로 처리하였다. 항체를 1 nM로 시작해서, 각 플레이트의 상단 열에 첨가하고, PBST 내에서 1:5로 연속 희석한 후 그 다음 열에 위치시켰다. 그 플레이트들을 상온에서 2시간 배양하고, PBST로 세척 후, horseradish peroxidase로 부착된 anti-IgG 항체로 1사간 배양하였다. 그 플레이트들을 TMB(tetramethylbenzidine) peroxidase 기질(KPL, Gaithersburg, MD, USA)로 디벨로프하고, 그 반응을 TMB-stop 용액(KPL, Gaithersburg, MD, USA)으로 정지시키고, 흡광도를 Spectra Max 250 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.

실시예 8: anti- relaxin -2 단클론 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 클로닝

anti-Myc362 펩타이드-특이적인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(2E2F12)를 배양하고 마우스 단클론 항체 isotyping 키트(Dipstick format, Bibco BRL or Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 아이소타이핑을 하였다. 전체RNAs를 하이브리도마 세포(2E2F12)로부터 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하여, cDNAs를 제조하였다. anti-Myc362 펩타이드-특이적인 단클론 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 (V_H 및 V_L)에 대한 서열을 클로닝하기 위해서 생산된 cDNAs를 Vent polymerase (NEB)를 사용하여 하기 프라이머 세트로 증폭하였다. 중쇄 프라이머로, IGG2A (5'- GGA AGA TCT CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT CA-3')(서열번호 15) 및 5'MH2 (5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3')(서열번호 16)를 사용하였다. kappa 체인 프라이머로, 3'Kc (5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3')(서열번호 17) 및 5'Mk (5'-GG GAG CTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3')(서열번호 18)를 사용하였다. 표준 PCR 반응을 25 주기 동안 수행하였다. PCR 산물들을 the pGEM-T easy vector (Promega)에 라이게이션하였다. 클로닝된 마우스 Ig 삽입체들을 DNA 시퀀싱으로 분석하였다.

실시예 9: 웨스턴 블럿팅 및 면역침전

c-Myc-Max 복합체를 동정하기 위해, 파쇄액을 c-Myc 및 Max 과발현 세포로부터 제조하였다. 세포 파쇄액을 2E2F12, 토끼 anti-c-Myc 항체 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 또는 마우스 anti-c-Myc 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)로 4시간 동안 4℃로 배양한 후, protein A 비드로 풀다운하였다. 그 샘플들을 SDS-PAGE 상에 로딩하고, 2E2F12, 토끼 anti-c-Myc 항체, 마우스 anti-c-Myc 항체 또는 염소 anti-Max 항체 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)로 검출하였다. Jurkat 및 LoVo 세포 파쇄액을 과발현 세포의 비교를 위해 사용하였다.

실시예 10:ELISA 기반 DNA-단백질 상호작용 측정 어세이

ELISA 기반 DNA-단백질 상호작용 측정 어세이를 Sohn WJ, Kim D, Lee KW, Kim MS, Kwon S, Lee Y, Kim DS and Kwon HJ: Mol Immunol 2007;44(13):3273-3282에 기재된 방법을 일부 변경하여 수행하였다. 요약하면, c-Myc-Max 복합체의 결합을 위한 올리고뉴크레오타이드인, sense: 5-GCG CAA CGA GCA CGT GGC CTG GGG CGC CAA GTG CGC-3(서열번호 19), antisense: 5-GCG CAC TTG GCG CCC CAG GCC ACG TGC TCG TTG CGC-3(서열번호 20)를 이중 가닥(sense strand를 바이오틴으로 태그) 형태로 열 충격(95℃에서 5분)으로 교잡하고 상온에서 냉각하였다. Avidin을 포함하는 카보에트 버퍼(10 ug/ml)를 96-well immunoplates (Thermo Fisher scientific) 상에 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트들을 PBST로 3회 세척한 후 1% BSA를 포함한 PBS로 1시간 동안 상온에서 블럭킹하였다. 10 pmol의 바이오틴화된 올리고뉴크레오타이드를 포함하는 50 ul의 PBS를 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. c-Myc 및 Max 코-트랜스팩션된 세포를 파쇄하고 20 ul의 전체 추출물(2 ug/ml)을 2E2F12 단클론 항체 또는 isotype 대조군 항체로 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 전체 샘플들을 버퍼 A (2 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCL, 8% glycerol, 5 mM DTT, 0.2% BSA 및 0.016% 연어 정자 DNA)로 상온에서 1시간 동안 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 그 플레이트들을 버퍼 B (10 mM phosphate buffer, pH 7.4, 20 mM NaCl 및 1% 탈지분유)내 토끼 anti-c-Myc 항체 (1:1000)로 상온에서 1시간 동안 배양하고 PBST로 세척하였다. 버퍼 B 내 peroxidase 부착된 염소 anti-rabbit IgG (1:5000)를 웰에 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양한 후 현상하였다.

<110> INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION HALLYM UNIVERSITY <120> An anti-c-Myc monoclonal antibody and use of the same <130> P17-0046HS <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 2 Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Arg 1 5 10 15 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 3 Thr Ile His Arg Ser Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 5 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 6 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 7 Leu Pro Glu Phe Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Thr Glu Leu Val 1 5 10 15 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 20 25 30 Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly 35 40 45 Phe Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Asn Phe Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Thr Ile His Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Arg Ser Ser 130 <210> 8 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kappa chain <400> 8 Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr 1 5 10 15 Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly 35 40 45 Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Phe Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp 85 90 95 Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ala Cys Thr 115 120 125 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc362 <400> 9 Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu 1 5 10 15 Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys 20 25 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggatccatgg atttttttcg ggtagtgg 28 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctcgagcgca caagagttcc gtagc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gaacatatgg ccgacgaaaa gccca 25 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaactcgagg tagacacctc ccgtctgc 28 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 14 Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn 1 5 10 15 Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 20 25 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggaagatctc ttgaccaggc atcctagagt ca 32 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggtgcatgcg gatacagttg gtgcagcatc 30 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gggagctcga yattgtgmts acmcarwctm ca 32 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcgcaacgag cacgtggcct ggggcgccaa gtgcgc 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcgcacttgg cgccccaggc cacgtgctcg ttgcgc 36

Claims

c-Myc 단백질 또는 그 단백질의 일부를 특이적으로 인지하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편에 있어서,
상기 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편:
서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 단일 측쇄 항체(scFv)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 항원결합 분절(Fab)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 제1항의 CDR부위를 포함하는 경쇄 또는 중쇄인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 제1항의 CDR부위를 포함하는 가변 도메인(Variable domain)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 단클론 항체는 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 8로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 c-Myc 단백질의 일부는 서열번호 9로 기재되는 펩티드 서열인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제1항의 c-Myc에 대한 단클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물.
제1항의 c-Myc에 대한 단클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 암 진단용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
1) 샘플과 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 단클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
대상체의 암 발생 여부에 대한 정보제공방법.
1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론 항체; 및
2) 용기
를 포함하는 암 진단용 키트.
1) 제9항의 암 진단용 조성물; 및
2) 용기
를 포함하는 암 진단용 키트.