KR20210116113A - c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 및 이의 용도 - Google Patents

c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체를 이용한 융합단백질 검출 또는 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 인간 세포에서 발현되는 모든 단백질과 상동 관계(homology)가 낮은 시퀀스인 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)와 결합하는 항체를 스크리닝하여 신규한 항체를 확립하고, 상기 신규한 항체가 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으므로, c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질의 검출 또는 정제등 다양한 분야에 유용하게 적용할 수 있다.

Description

c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 및 이의 용도{c-Myc peptide specific antibody and uses thereof}
본 발명은 c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체를 이용한 융합단백질 검출 또는 정제 방법에 관한 것이다.
단백질을 신속하게 분리하거나, 생물학적 활성을 특성화하거나, 이와 상호 작용하는 단백질을 식별하려면 태그가 있는 재조합 유전자 산물을 생산하는 효율적인 절차가 중요하며, 태깅된 재조합 단백질(융합 단백질)을 생성함에 있어서, 태그는 표적단백질의 C-말단, N-말단 또는 내부 부위에 융합시켜 사용하게 된다.
태그로 사용되는 짧은 펩타이드는 구조 유전체학 및 단백질체 연구에서 재조합 단백질과의 융합에 실질적으로 유용한 도구로, 이는 한 단계의 높은 친화성 정제를 제공하고 목적 단백질의 3차 구조 또는 기능에 최소한의 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
가장 일반적으로 사용되는 짧은 펩타이드(아미노산 8개 내지 15개) 태그는 특정 단클론 항체(monoclonal antibody; 모노클론항체)에 의해 인식되는 에피토프 펩타이드로 구성된다. 에피토프 펩타이드 태그의 종류에는 FLAG-태그(DYKDDDDK), HA-태그(YPYDVPDYA), c-Myc-태그(CEQKLISEEDL), V5-태그(GKPIPNPLLGLDST) 및 S-태그 (KETAAAKFERQHMDS) 등이 있다.
그 중, 인간의 c-Myc 단백질에서 유래한 펩타이드(CEQKLISEEDL)를 다양한 단백질의 말단에 연결하여 표적 단백질의 발현과 세포 내에서 양태를 추적하는데 활용되고 있으며, 이에 결합하는 항체는 9E10으로 명명되는 마우스에서 유래한 항체가 가장 보편적으로 활용되고 있다.
하지만, 일반적으로 사용되는 c-Myc 태그와 같은 짧은 펩타이드 태그는, 태그 자체에서 아미노산의 번역 후 변형으로 인해 융합된 단백질의 구조 및 생물학적 활성과의 간섭 또는 동족 항체와의 상호 작용 상실과 같은 단점이 있다. 이를 극복하기 위해, 특정 실험 용도에 적합한 특성을 갖는 신규 펩타이드 태그와 이에 결합하는 단클론 항체가 지속적으로 연구되고 있다.
이에, 본 발명에서는 인간 세포에서 발현되는 모든 단백질과 상동 관계(homology)가 낮은 시퀀스인 새로운 c-Myc 단백질에서 유래한 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)와 결합하는 항체를 스크리닝하여 신규한 항체(anti-c-Myc-tag 1D1)를 확립하였으며, 상기 신규한 항체가 c-Myc 태그(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 이용한 융합 단백질 검출 또는 정제 방법을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 단클론 항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항체는 scFv(single chain variable fragment)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질을 상기 항체에 접촉시키는 단계를 포함하는 융합 단백질 정제 방법 또는 융합 단백질 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예 있어서, 상기 항체는 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 표지 물질이 컨쥬게이션되어 있을 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출 또는 정제용 키트를 제공한다.
본 발명에서는 인간 세포에서 발현되는 모든 단백질과 상동 관계(homology)가 낮은 시퀀스인 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)와 결합하는 항체를 스크리닝하여 신규한 항체를 확립하고, 상기 신규한 항체가 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으므로, c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질의 검출 또는 정제등 다양한 분야에 유용하게 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 항체의 아미노산 서열 및 CDR 부분을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
c- Myc 펩타이드 특이적 항체
본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열(MPLNVSFTSRNYDLD)을 포함하는 c-Myc 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 단클론 항체에 관한 것이다.
상기 c-Myc 펩타이드는 목적 단백질의 C-말단, N-말단 또는 내부 부위에 융합시킬 수 있는 짧은 길이의 펩타이드로, 펩타이드 태그, 단백질 태그 또는 에피토프 태그로 표시될 수 있다. 본 발명에서는 c-Myc 펩타이드 또는 c-Myc 태그로 표기하였다.
본 발명의 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 모노클로날 항체 또는 단일클론항체라고도 불리며, 단일 항체 형성세포가 생성하는 항체로, 1차 구조(아미노산 배열)가 균일한 특징이 있다. 오직 하나의 항원 결정기만을 인식하며, 일반적으로 암세포와 항체생산세포를 융합한 하이브리도마(hybridoma cell)을 배양하여 생산되지만, 확보된 항체 유전자 서열을 이용하여 다른 재조합 단백질 발현 숙주세포를 이용하여 생산할 수도 있다.
상기 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 펩타이드 태그(에피토프) 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 단일 사슬(single-chain) Fv(scFv), Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다). 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 c-Myc 펩타이드에 대해서 특이적 결합성을 가지는 단클론 항체는 상기 c-Myc 펩타이드를 면역원(또는 항원)으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 상기 c-Myc 펩타이드, 상기 c-Myc 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 또는 상기 c-Myc 펩타이드를 포함하는 캐리어(carrier)를 필요에 따라서 면역증강제인 아주반트(adjuvant)(예, Freund adjuvant)와 함께 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역감작(immunization)을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다.)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1~21일 마다 1~4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작 된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다. 상기 포유동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 닭, 토끼 또는 인간일 수 있고, 바람직하게는 마우스, 래트, 닭 또는 인간일 수 있다.
세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 생산 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 우선, 상기한 바와 같이 획득한 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA(radioactive substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다.
본 발명의 단클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는, 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 통상의 방법이 이용되며, 배양물 등으로부터 단클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 통상의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
또한, 본 발명의 단클론 항체는, 중쇄(重鎖) 및 경쇄(輕鎖) 가변영역을 코딩하는 DNA를 각각, 중쇄 및 경쇄의 정상영역을 코딩하는 기지의 DNA(예를 들면, 일본 2007-252372호 공보 참조)와 각각 연결한 유전자를, PCR법, 또는, 화학 합성에 의해 합성하고, 그 유전자의 발현을 가능하게 하는 공지의 발현 벡터(pcDNA 3.1(Invitrogen 사 판매) 등에 이식하여 형질 전환체를 제조하고, CHO 세포나 대장균 등의 숙주 중에서 발현시킴으로써 항체를 생산하고, 이러한 배양액으로부터, 프로테인 A 또는 G(Protein A 또는 G) 컬럼 등을 이용해서 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, c-Myc 펩타이드와 특이적으로 결합하는 scFv(single chain variable fragment)를 제조 및 스크리닝하여 신규한 항체(scFv, anti-c-Myc-tag 1D1)를 확립하였으며, 이를 clone 1D1로 명명하였다. 또한, 표 2에 나타난 바와 같이 clone 1D1은 c-Myc 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
나아가, 상기 clone 1D1 항체(scFv)는 서열번호 1(G G S N S A Y G)로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2(Y D N T N)로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3(G S A G S S Y V)으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4(S Y Q M N)로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5(A I N R F G N R)로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6(K A A Y G Y C G S G G W R D V A G T D A)으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되며, 좀 더 구체적으로 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 것을 확인하였다 (도 1).
c- Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출 또는 정제
본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질을 상기 항체에 접촉시키는 단계를 포함하는 융합 단백질 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 "융합 단백질" 또는 "융합 펩타이드"는 각각의 부분이 별개의 기능을 포함하는 적어도 2개의 부분을 포함하는 아미노산(펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질)의 중합체를 의미한다. 융합 단백질의 적어도 하나의 제1 부분은 적어도 하나의 c-Myc 펩타이드를 포함하고, 융합 단백질의 적어도 하나의 제2 부분은 적어도 하나의 목적 단백질(또는 목적 펩타이드)를 포함한다.
상기 융합 단백질은 c-Myc 펩타이드에 특이적인 항체를 유리 또는 실리콘 기질 상에 고정시킨 단백질 마이크로 어레이를 이용하여 대규모로 분석될 수 있다.
본 발명의 항체는 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 표지 물질이 컨쥬게이션되어 있을 수 있다.
c-Myc 펩타이드/clone 1D1 항체 시스템은 웨스턴블랏, 면역 침전 또는 유세포 분석 방법으로, 동물 세포, 효모 및 식물에서 c-Myc 펩타이드-태그된 융합 단백질을 효율적으로 검출하는데 사용할 수 있으며, 세포 내 단백질의 위치를 조사하는 면역 형광 분석(immunofluorescence localization)에 본 발명의 c-Myc 펩타이드/clone 1D1 항체 시스템을 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질을 상기 항체에 접촉시키는 단계를 포함하는 융합 단백질 정제 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 정제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 정제 방법은 c-Myc 펩타이드를 포함하는 융합 단백질과 c-Myc 펩타이드에 특이적인 항체를 연결시키는 것을 포함하는 것으로, 상기 항체는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 멤브레인 또는 컬럼일 수 있다.
상기 방법은 융합 단백질을 포함하는 샘플을 항체가 고정된 지지체에 접촉(contact)시키는 것을 포함하고, 상기 융합 단백질은 c-Myc 펩타이드에 공유결합 또는 비공유 결합으로 연결된 단백질이고, c-Myc 펩타이드는 항체에 대한 특이적 결합 활성을 가지며, 상기 접촉은 항체가 c-Myc 펩타이드에 결합하는 조건하에서 이루어지고, 결합되지 않은 성분들은 제거하는 것 및 지지체로부터 단백질을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 지지체 및 항체를 포함하는 면역 친화성 크로마토그래피 매질 및 상기 친화성 크로마토그래피 매질로 팩킹(packing)된 컬럼을 포함하는 면역 친화성 크로마토그래피 컬럼을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출 또는 정제용 키트에 관한 것이다.
상기 항체는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인 일 수 있다. 상기 융합 단백질 검출용 키트를 구성하는 본 발명의 c-Myc 펩타이드에 대한 항체는 효소, 방사성 물질, 형광물질과 같은 표지 물질로 표지될 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 키트는 설명서, 제한 효소, 리가제, 버퍼 용액 등을 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
c- Myc 펩타이드 특이적인 항체 제조 및 선별
c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 선별은 당업계에 공지된 바이오패닝 방법을 이용하여 수행하였다.
먼저, c-Myc 단백질에서 유래한 펩타이드인 MPLNVSFTSRNYDLD가 결합된 항원을 96-웰 플레이트에 부착시키고, M13 파아지의 표면에 발현하는 scFv의 항체 라이브러리(M13 phage antibody library)를 바이오 패닝(bio-panning)하여 MPLNVSFTSRNYDLD 에 결합하는 scFv를 수거하였다.
확보한 M13 표면에 발현하는 scFv의 DNA 서열(서열번호 8)와 단백질 서열(서열번호 7)을 분석하였으며, 이를 clone 1D1 항체로 명명하였다.
clone 1D1 항체의 c- Myc 펩타이드 특이성 확인
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 clone 1D1 항체의 c-Myc 펩타이드에 대한 특이성을 확인하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, c-Myc 펩타이드를 코딩하기 위해, c-Myc 펩타이드 2 ㎍/㎖(buffer pH 9.6)이 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 3% BSA가 포함된 1 X PBST를 처리한 후, 상온에서 30분 동안 블로킹시켰다.
clone 1D1 항체(scFv)가 0.5, 1, 2, 4 ㎍/㎖가 되도록 각웰에 처리한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-HA peroxides 1:2,000)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척한 다음, 발색을 위해 TMB를 처리하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1N H2SO4의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 종료시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 실험 조건
Immobilization Corning (Cat#. 3690)
Antigen c-Myc tag (MPLNVSFTSRNYDLD), 2 ㎍/㎖
Secondary Ab-HRP 1:2000
TMB substrate incubation 5 min
Measurement filter 450nm
Plate reader Epoch , BIOTEK
ELISA 실험 결과
anti- c-Myc -tag 1D1 antigen(peptide) coating background control delta
scFv concentration c-Myc tag
(2 ㎍/㎖)
4 μg/ml 2.151 0.05 2.101
2.165 0.052 2.113
2 μg/ml 1.31 0.05 1.26
1.3 0.05 1.25
1 μg/ml 0.808 0.052 0.756
0.788 0.053 0.735
0.5 μg/ml 0.415 0.052 0.363
0.431 0.052 0.379
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 clone 1D1 항체가 c-Myc 펩타이드(MPLNVSFTSRNYDLD)에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> c-Myc peptide specific antibody and uses thereof <130> 1066938 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH_CDR1 <400> 1 Gly Gly Ser Asn Ser Ala Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH_CDR2 <400> 2 Tyr Asp Asn Thr Asn 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH_CDR3 <400> 3 Gly Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Val 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_CDR1 <400> 4 Ser Tyr Gln Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_CDR2 <400> 5 Ala Ile Asn Arg Phe Gly Asn Arg Thr 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_CDR3 <400> 6 Lys Ala Ala Tyr Gly Tyr Cys Gly Ser Gly Gly Trp Arg Asp Val Ala 1 5 10 15 Gly Thr Asp Ala 20 <210> 7 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-c-Myc tag <400> 7 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Gln Asp 1 5 10 15 His Cys Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ala Tyr Gly Trp Phe Gln Gln 20 25 30 Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn Thr Asn 35 40 45 Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gly Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ile Phe Gly Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys 130 135 140 Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gln Met Asn Trp Ile Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg Phe Gly 165 170 175 Asn Arg Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser 180 185 190 Arg Gly Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg 195 200 205 Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Ala Tyr Gly Tyr 210 215 220 Cys Gly Ser Gly Gly Trp Arg Asp Val Ala Gly Thr Asp Ala Trp Gly 225 230 235 240 His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser 245 250 <210> 8 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-c-Myc tag <400> 8 ctcactcagc catcctccgt atcggccaac ctaggcgaga cccaggacca ctgttctggt 60 ggtggatcaa attccgcgta cggctggttc cagcagaagt cgcctggtag tgcgccggtc 120 accctcatct acgacaacac gaacaggccc agcaacatcc cgtccagatt ttcaggctcc 180 aagtccggtt ccacggccac tcttaccatc accggcgtgc aggccgatga cgaggccgtg 240 tactactgcg ggtccgccgg ctcctcttac gtgggcatct tcggtgctgg caccacactg 300 accgtgctgg gacagagctc tcgcagctcg tctggcgggg gctcctctgg aggcggcggc 360 tcggctgtca ctctggacga gagcggcggc ggtttgcaga ctcccggggg tggtctttct 420 ctggtgtgca aaggctccgg ctttacgttc tccagctatc agatgaactg gatccgccag 480 gcccccggca agggactgga gttcgtcgcg gcgattaacc gcttcggaaa tcggactggc 540 tatggcgcag cggtgaaggg ccgtgctacc atctctcgcg gtgatggcca atccaccgtg 600 cgcctgcagc tgaacaacct gcgcgccgaa gacaccgcca cctactactg tgccaaggca 660 gcctacggct actgcgggag tggggggtgg cgtgatgtgg ctgggaccga cgcttggggc 720 catggaacag aggtgattgt cagctcgacc agc 753 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc peptide <400> 9 Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Ser Arg Asn Tyr Asp Leu Asp 1 5 10 15

Claims (6)

  1. 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 있어서,
    서열번호 1로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단클론 항체는 scFv(single chain variable fragment)인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
  4. 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체에 접촉시키는 단계를 포함하는 융합 단백질 정제 방법 또는 융합 단백질 검출방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출 또는 정제용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 c-Myc 펩타이드가 포함된 융합 단백질 검출 또는 정제용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20180112916A (ko) * 2017-04-04 2018-10-15 한림대학교 산학협력단 c-Myc에 특이적인 단클론 항체 및 그 용도
KR20210094895A (ko) * 2020-01-22 2021-07-30 전북대학교산학협력단 신규 펩타이드 태그, 이에 결합하는 항체 및 이들의 용도

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