BG105294A

BG105294A - Високоафинитетни антитела

Info

Publication number: BG105294A
Application number: BG105294A
Authority: BG
Inventors: Peter Harrison
Original assignee: Ks Biomedix Ltd
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2001-12-29
Also published as: EA200100287A1; JP2002525082A; TR200100643T2; KR20010089174A; ID28905A; NO20011006D0; MXPA01002248A; HUP0103233A2; BR9913303A; AU5435099A; CA2340865A1; HRP20010149A2; NO20011006L; WO2000012556A1; EP1107990A1; YU15401A; IL141523A0; ZA200101573B; HUP0103233A3; CN1315966A

Abstract

Изобретението се отнася до високоафинитетни моноклонални антитела, чийто афинитет се характеризира,като се инкубират първа и втора проба от антитялото в покрити с антиген кладенчета на микротитърна паничка в концентрация, избрана в рамките на линеарната част от стандартна крива при рН 7,2 за 1 h ипри температура 370С. Отстранява се несвързаното антитяло от двете проби. Инкубира се първата пробас РВS при рН 7,2 при 370С и рН се редуцира на втората проба до рН 3 или по-ниско и пробата се инкубира за 1 h при 370С. Несвързаното антитяло се отстранява от двете проби, които се инкубират с антиантитяло алкално-фосфатазен конюгат за 1 h при 370С. Несвързаният конюгат се отстранява от двете проби и се добавя РNPP субстрат към тях. Измерва се абсорбцията на пробите при 405 nm и се определя количеството на антитялото, свързано към антигена, като количеството, свързано във втората проба, е > 50% в сравнение с това на първата проба.

Description

ВИСОКО АФИНИТЕТНИ АНТИТЕЛА

Област на изобретението

Настоящето изобретение се отнася до антитела и тяхното приложение като терапевтици.

Ниво на изобретението

Антителата отнавна са отнасяни като потенциални силни средства за лечение на рак и други заболявания. Обаче, макар да има известни забележими отклонения, този потенциал все още не е напълно реализиран.

Тази относителна липса на успех може би се дължи, поне отчасти, на използването на моноклонални антитела, получени от гризачи, които рядко имат афинитет по- висок от 10'⁹ М. Антитела, притежаващи това ниво на афинитет са с ограничена терапевтична приложимост, доколкото е доказано трудно да се достави достатъчно антитяло до целта, за да се предизвика полезна биологична активност. Свързването на едно антитяло се към даден антиген е обратимо, и в концентрациите на антитялото поспециално за in vivo приложение, дисоциацията ще преобладава над асоциацията. По принцип, възможно е изброяването на дисоциацията на антигена чрез повишаване концентрацията на антитялото. Обаче, това може да доведе до неприемливи клинични странични ефекти и би повишило също стоимостта на терапията.

Общо за изобретението

Настоящето изобретение се основава на това, че могат да бъдат продуцирани антитела или техни фрагменти, които са “киселинно- устойчиви” и това свойство се свързва с високия афинитет на свързване на дадено антитяло с неговия антиген.

Съгласно настоящето изобретение, високо- афинитетно антитяло има афинитет, характеризиращ се с:

(i) инкубиране на първа и втора проби от антитялото в покрити с антиген кладенчета на микротитърна паничка в концентрация, избрана в рамките на линеарната част от стандартна крива при pH 7.2 за 1 час при 37°С;

(ii) отстраняване на несвързаното антитяло от двете проби;

(iii) инкубиране на първата проба с PBS при pH 7.2 при 37°С° и редуциране на pH на втората проба до pH 3 или по- ниско и инкубиране за 1 час при 37°С;

(iv) отстраняване на несвързаното антитяло от двете проби;

(ν) инкубиране на двете проби с анти-антитяло алкалнофосфатазен конюгат за 1 час при 37°С;

(vi) отстраняване на несвързаният конюгат от двете проби; и (vii) добавяне на PNPP субстрат към пробите, измерване на абсорбцията на пробите при 405 nm, и определяне на количеството на антитялото свързано към антигена, където количеството свързано във втората проба е > 50% от това на първата проба.

За предпочитане, максималното pH в етап (iii) е 2.5, поспециално 2.0.

Антитела или антитяло фрагменти с “киселинно- устойчиви” свойства се очаква да подпомагат асоциацията вместо дисоциацията и поради това имат по- дълго време на локализация в целените сайтове, което води до по- висока концентрация на антитела, локализирани в тези места.

По- специално, изобретението се отнася до получаването на високо- афинитетен фрагмент на едноверижно Fv антитяло. Този ScFv притежава определени преимущества с факта, че позволява по- добро насочване към даден сайт in vivo.

Описание на Чертежа

Фигура 1 илюстрира резултатите, постигнати за киселинна устойчивост на овчи и миши моноклонални антитела и едноверижни Fvs с афинитет към карциноембрионален антиген при различни стойности на pH.

Описание на изобретението

Киселинно- устойчивите моноклонални антитела съгласно настоящето изобретение могат да бъдат получени с помощта на различни техники. Например, може да бъде приложена класическа хибридомна техника, която включва сливането на В-лимфоцити от имунизирани животни, секретиращи високо- афинитетни антитела с подходящ фузионен партньор. Алтернативен метод е пречистването на тРНК от подбрани лимфоцити и използването им в PCR техника за амплифициране на необходимите гени за антитела. Фаговата и други техники за демонстрирането на антитяло фрагменти може също да бъде използвана за получаване на антитяло гените от естествени или имунизирани библиотеки след подходящи селекционни процедури.

Антитяло генът може да бъде също така ко- експресиран със или по друг начин присъединен към токсини, радиоизотопи или ензими или каквито и да са други желани молекули за осигуряване на фузионен протеин със строго определени характеристики на свързване. В друга алтернатива, антителата може да бъдат продуцирани чрез трансгенни животни както е описано в US-A5770429.

Антитялото може да бъде цяло антитяло, включващо тежки и леки вериги, и постоянни и вариабилни участъци. Обратно, антитялото е антитяло фрагмент, нар. F(ab’)₂> Fab, Fv или едноверижни Fv фрагменти, осигуряващ присъствието на наймалко част от вариабилния участък, който осигурява свойството “киселинна устойчивост”. Антитялото може да бъде също животинско, химерно или хуманизирано антитяло. Подходящ метод за продуциране на хуманизирани антитела е описан в WO-A92/15699.

В предпочитан вариант на изпълнение на изобретението, антитялото е едноверижен Fv фрагмент. Едноверижния Fv фрагмент включва едновременно и тежко верижи и леко верижни вариабилни участъци, свързани с подходящ пептид.

Антителата от настоящето изобретение може да бъдат определени чрез техните киселинно устойчиви свойства, които могат да бъдат охарактеризирани чрез промита с киселина ензимно- свързана имуносорбентна проба (EIA), както е описано по- горе. Обикновено стойността на А450 , получена чрез EIA, ще представлява антитяло свързването на >50% за проба при pH 3 или по- ниско, сравнено със стойността за пробата при pH 7.2. За предпочитане, стойността А4₅₀ на проба при pH 2 ще представлява антитяло свързването на >60% и особено 70% от тази, получена при pH 7.2.

Животното, подложено на имунизация не е гризач, но е избрано така, че да даде по- високо афинитетни антитела. Всеки голям бозайник може да бъде използван и подходящите животни включват зайци, кози, крави и овце.

Антитяло от изобретението може да бъде използвано за лечение и може да бъде включено в който и да е подходящ състав с физиологично-подходящ ексципиент, разтворител или носител.

Изобретението се илюстрира със следните примери:

Пример 1.

Имунизира се овца с карциноембрионен антиген (СЕА) в пълен аджувант на Фройнд, след което се реимунизира трикратно с антиген в непълен аджувант на Фройнд. Животните се умъртвяват след финалната имунизация и лимфните жлези се отстраняват.

Клетките от лимфните жлези след това се промиват и се сливат с овчи хетеромиеломен фузионен партньор SFP3.2. Слятите клетки се посяват при обща плътност от приблизително 10⁶ за ml в среда, съдържаща HAT (Life Technologies). Тези проби след това се скринират за хибридоми, секретиращи високо афинитетни антитела спрямо специфичният антиген с помощта както на нормална EIA, така и на промита с киселина EIA.

Стандартните EIA изследвания се осъществяват както следва:

Изследователски панички Maxisorb (NUNC) се покриват с СЕА (0.4 gg/ml във фосфатно буферен разтвор при pH 7.2), 100 μΙ за кладенче и се оставят за една нощ при 4°С. Паничките след това се промиват трикратно с 0.01% детергент Tween 20. Всички останали реактивни сайтове върху паничките се блокират чрез добавяне на 200 μΙ за кладенче от 0.2% свободен на мазнина млечен протеин в PBS при pH 7.2 при 37°С за % часа. Паничките след това се промиват в PBS каакто е описано по- горе и 45 μΙ от антитяло пробите се добавят към кладенчетата на паничките. Пробите се инкубират за един час при 37°С и след това се промиват както е описано по- рано. Свързаното антитяло след това се открива с помощта на конюгат на алкална фосфатаза с магарешко анти-овче антитяло (Sigma D5187, разредено с 1/5000 в PBS при pH 7.2 с 1% PBS). Паничките след това се промиват и се добавят 100 μΙ за кладенче от разтвор на PNPP (Sigma N2770). Абсорбцията се измерва с помощта на спектрофотометър при 405 nm с фосфатно буферен разтвор като контрола.

Промити с киселина EIA изследвания се провеждат както следва:

Покриването и свързването на антитяло пробите се провежда както еописано за стандартната EIA по- горе. Обаче, след инкубация с антитяло пробите, паничките се промиват и се добавят 200 μΙ за кладенче HCI (10 тМ разтвор на Stock) при pH 2 за един час при 37°С. След три промивания, антитялото останало свързано към антигена се установява чрез конюгат на алкална фосфатаза с магарешко анти- овче антитяло и PNPP, както е описано по- горе. За осигуряване на това, че е направено действително сравнение между антителата при различни концентрации, всяка проба се избира такава, че да дава стойност на А405 от приблизително 1.0 в нормалната EIA (т.е. в линеарната част на EIA кривата на отговора).

Три хибридоми (1D2, 6G11 и 6Н9) секретират антитела, които дават по-вече от 50% ретенция на свързване в промитата с киселина EIA, в сравнение със свързването в не- киселинно промитата EIA.

Ί

Пример 2.

Едноверижен Fv фрагмент се продуцира от хибридомата 6Н9 по- горе, както следва:

МРНК се пречиства от култивираните хибридомни клетки с помощта на олиго- dT целулоза. Едноверижна ДНК, комплементарна на тРНК (сДНК) се синтезира чрез обратна транскрибция. Универсални праймери, създадени от константните участъци на гени на овчи тежко и леко верижни антитела, се използват в отделни обратно транскрибционни реакции за синтезиране на сДНК за антитяло вариабилните участъци.

СДНК след това се амплифицира чрез полимеразната верижна реакция за получаване на двойно- верижна ДНК с помощта на праймери, създадени от тежко и леко верижните вариабилни рамкови последователности. Отделни полимеразни верижни реакции са използвани за амплифициране на тежко и леко верижните участъци. Продуктите след това се анализират чрез агарозна гел електрофореза и ДНК ивиците, еквивалентни на леко и тежко верижните гени се изрязват от гела и се пречистват.

Еквимоларни количества от вариабилни тежко и леко верижни ДНк се смесват заедно с олигонуклеотидна линкерна ДНК. Линкерната ДНК кодира амино киселинната последователност (Gly₄Ser)₃ с допълнителни нуклеотиди, комплементарни на 3’ края от тежко верижния вариабилен участък и 5’ края на леко верижния вариабилен участък. Трите ДНК молекули се денатурират, деспирализират и разширяват в първия етап (без праймери) от двустадийната PCR реакция, така че фрагментите се съединяват, като по този начин се оформя едноверижното Fv.

Едноверижната Fv ДНК се амплифицира във втория етап от

PCR с помощта на двойка праймери, получени от края на тежко и леко верижният вариабилен участъци с добавянето на местата за разпознаване от рестрикционните ензими AIW441 и Notl. Едноверижният Fv генен продукт се анализира чрез гел електрофореза и се пречиства. Едноверижният Fv след това се разгражда с рестрикционните ензими AIW441 и Notl и се клонира във вектор на експресия. Векторът след това се използва за трансформиране на Е. coli НВ 2151, и се оставя експресията на протеина да протече. Веторът е конструиран така, че да включва хекса- хистидинова опашка в СООН края на SFv. Едноверижният Fv се пречиства с помощта на никел- хелатна афинитетна хроматография и се анализира чрез SDS- PAGE. Амино киселинната последователност за тежко верижният вариабилен участък и леко верижният вариабилен участък са описани в SEQ ID NOs: 2 и 4, съответно. Провежда се също киселинно- промита EIA за определяне на свойството устойчивост на киселина за едноверижния Fv.

Киселинно промитата EIA се провежда както следва:

Покрити с карциноембрионален антиген (СЕА) микротитърни пластинки се изготвят както е описано по- рано. Едноверижни Fv проби (6Н9) се разреждат до обхват на концентрацията от 1 ng/ml до 100 ng/ml в PBS при pH 7.2, съдържащ 1% телешки серумен албумин (BSA). Добавят се 100 μΙ от пробата към кладенчетата на микротитърната пластинка и се инкубира за 1 час при 37°С. Паничките след това се промиват, добавят се 200 μΙ цитрат за кладенче и паничките се инкубират за 1 час при 37°С. В този случай, киселите препарати се получават с помощта на щок разтвор от 100 тМ цитрат, разреден до pH стойности 4.0, 3.5, 3.0,

2.5 и 2.0 в реакционната смес. PBS при pH 7.2 се използва като контрола. Паничките след това се промиват и се добавят 100 μΙ за кладенче от миши анти- тетра- хистидиново антитяло (Qiagen) (100 ng/ml, разреден в PBS при pH 7.2 с 1% BSA) и се инкубират за 1 час при 37°С. След промиването на паничките, пробите се инкубират за 1 час при 37°С със 100 μΙ за кладенче конюгат на козя антимиша алкална фосфатаза. (Sigma А3688, разреден 1/1000 в PBS с BSA при pH 7.2). Паничките след това се промиват, обработват се с PNPP както е описано по- рано и абсорбцията се измерва с помощта на спектрометър при 405 nm.

Като контрола за киселинна устойчивост, sFv проби се инкубират с PBS при pH 7.2 за генериране на EIA кривата на отговора за sFv пробите. В линеарния участъкконцентрация от 10ΣΟ ng/ml от sFv дава абсорбция (Aws) от 1-0- 1.5 и поради това се използва за определяне количеството на антитялото, свързано в • киселинно промитите проби като процент от количеството, свързано в референтната проба.

Свойствата устойчивост на киселина на 6Н9 пълното антитяло и 6Н9 едноверижното Fv се сравнява с това за полученото от мишия анти- карциномембрионен антиген пълно антитяло, А5В7 и едноверижното Fv MFE. Резултатите са показани на Фигура 1, със свързването с антиген на получените от мишка антитела, които са съществено редуцирани при pH 3.5 и по- малко от 5% при pH 2.5. В противовест на това, 6Н9 антителата обладават >70% антиген при pH 3.5, >60% при pH 2.5 и > 50% при © pH 2.0.

Claims

1. Високо афинитетно моноклонално антитяло, където афинитета се характеризира с:

(iii) инкубиране на първата проба с PBS при pH 7.2 за един час при 37°С и редуциране на pH на втората проба до pH 3 или по- ниско и инкубиране за 1 час при 37°С;

(v) инкубиране на двете проби с анти-антитяло алкално- фосфатазен конюгат за 1 час при 37°С;

2. Антитяло съгласно претенция 1, където количеството на антитялото, свързано във втората проба е >60% от това, свързано към първата проба.

3. Антитяло съгласно претенция 1 или претенция 2, където pH в етап (iii) е редуцирано до pH 2.5 - pH 2.0.

4. Антитяло съгласно която и да е от предходните претенции, което не произходжа от гризач.

5. Антитяло съгласно която и да е от предходните претенции, което притежава афинитет към асоцииран с тумор антиген.

6. Антитяло съгласно претенция 5, където антигенът е карциноембрионен антиген.

7. Антитяло съгласно която и да е от предходните претенции, което е едноверижно Fv, F(ab’)2, Fv или fab.

8. Антитяло съгласно претенция 7, притежаващо тежко • верижен вариабилен участък, включващ амино киселинната последователност, дефинирана в SEQ ID No. 2 и леко верижен вариабилен участък, включващ амино киселинната последователност, дефинирана в SEQ ID No. 4, или техни варианти.

! 9. Полинуклеотидна молекула, кодираща антитяло ί съгласно претенция 8, където полинуклеотида включва нуклеотидната последователност, дефинирана в SEQ ID Nos. 1 и 3 или техни варианти.

j

10. Среда за клониране, включваща полинуклеотидната

Ф молекула съгласно претенция 9.