具体实施方式
实施例1小分子抗体的筛选和纯化
1.抗体筛选
采用PCR方法扩增人、羊和鼠的抗体片段,进行序列重组,获得抗体片段库。将获得的抗体片段库连接到C端含有HIS标签和半胱氨酸的表达载体中,将表达载体转入大肠杆菌表达菌株,获得表达菌克隆。
使用膜菌落筛选方法对表达菌克隆进行筛选,获得对CEA有高亲和力的小分子抗体表达菌,经测序,小分子抗体一条链的氨基酸序列(SEQ ID NO.1,N端->C端)如下:
划线部分为接头(SEQ ID NO.2)。接头序列位于N端一侧的序列(SEQ ID NO.3)为重链可变区(VH),位于接头序列C端一侧的序列(SEQ ID NO.4)为轻链可变区(VL)。
2.抗体表达纯化
(1)将表达抗体片段的基因插入pET22表达质粒构建表达质粒pET22-96ScFv。将含有表达质粒的表达菌接种到含有0.5-1.0%(w/v)葡萄糖、30-100mg/L氨苄青霉素YT培养基中,37℃培养10-20h。
表达抗体片段的基因序列(SEQ ID NO.5)如下:
(2)按照0.5-1.5%(v/v)的接种量,将步骤(1)所得菌液接种至含有30-100mg/L氨苄青霉素的YT培养基中,37℃培养至OD600=0.6-1.0。
(3)加入IPTG至终浓度为0.05-0.15mmol/L,在25℃的条件下,诱导培养5-10小时;收集培养物。
(4)使用超声波或均质机破碎收集到的菌体细胞。0.5-2.0g菌体重悬于3-10ml平衡缓冲液,超声5-10S,间隔3-8S,运行50-100次或700-900Pa均质2次。
(5)采用Ni亲和填料分离纯化破碎后的上清液,即得CEA小分子抗体。
3.抗体SDS-PAGE检测
本发明的小分子抗体有两种形式:单体(单链抗体)和二倍体(单体即序列如SEQID NO.1所述蛋白,二倍体是通过2个序列如SEQ ID NO.1所述蛋白末端半胱氨酸通过二硫键相连形成的蛋白,为二倍体抗体)。
纯化小分子抗体样品分别用含还原剂的电泳加样缓冲液和不含还原剂的电泳加样缓冲液处理,然后使用12%分离胶,4.5%浓缩胶进行电泳。考马斯亮蓝染色过夜后脱色、拍照。结果如图1所示,右侧泳道(二倍体)为未经还原剂处理的纯化样品,包含单体和二倍体两种形式。
4.亲和性检测
第一步,100μl浓度为1ug/μl的CEA抗原包被ELISA检测孔,37℃孵育2小时;
第二步,PBST缓冲液洗板3次;
第三步,用含1%BSA的PBS溶液200ul/孔封闭,37℃孵育2h;
第四步,PBST缓冲液洗板3次;
第五步,抗原包被孔中加入100μl纯化样品,起始浓度25600ng/ml,抗体按4倍稀释法稀释,稀释至6.25ng/ml,做2个复孔(n=2),取平均,37℃孵育1h;
第六步;用含PBST洗涤缓冲液洗板3次,然后加入100μl含0.5%BSA的PBS稀释的抗His-HRP抗体偶联物(1∶2000),37℃孵育1h;
第七步,用PBST洗涤缓冲液洗涤孔板5次,向孔内加入100μL TMB试剂,37℃显色5分钟,加入50μl 1N HCl终止显色反应;
第八步,ELISA酶标仪于450nm波长读数,用吸光值作纵坐标,抗体浓度对数作横坐标,绘制亲和曲线图。
ELISA结果(见图2)表明,本发明抗体片段的EC50值为183.6ng/ml,该小分子抗体与CEA抗原有特异性结合。
实施例2同位素标记的小分子抗体用于CEA阳性细胞、组织的检测
将小分子抗体连接可检测的原子或原子团,能进行CEA阳性细胞、组织的检测,临床上可用于CEA阳性肿瘤的显影。
本实施例将实施例1的小分子抗体进行放射性同位素标记,进行CEA阳性细胞、组织的特异性检测。
一、125I标记
1.同位素标记小分子抗体的制备
50μg Iodogen的小瓶,加入200μL PB涡旋震荡后弃去瓶中缓冲液,顺次加入96ScFv,2mg/mL,0.20mg和100μL PB缓冲液(pH 7.4,0.2M),再小心加入125I-NaI溶液(高比活度9.5mCi/mg,低比活度4.5mCi/mg),控制反应体系pH值7.4,室温反应5min,结束反应。使用G-25凝胶填料进行分离,即得纯化125I同位素标记的CEA小分子抗体,记作[125I]96ScFV。用Whatman No.1滤纸作为支持体,85%甲醇作为展开剂,在滤纸上点上样品,展开时间约40min,样品展开约10em,取出滤纸自然风干,测定标记同位素样品和游离同位素的Rf值,计算样品放化纯,结果(见图3)表明,[125I]96ScFV纯化后放化纯度>99%。
2.对LS174T细胞特异性反应
消化LS174T(特异性组,CEA阳性的肿瘤细胞)、A549(非特异性组,CEA阴性的肿瘤细胞)、BMSCs(阴性对照组,CEA阴性的正常细胞)细胞,分别以800rpm,离心5min后用PBS洗1遍,重悬于培养基中。将三种细胞悬液1mL(9×105个细胞)分别加入反应管中,分别设立3个平行样品。反应管中分别加入1μCi的[125I]96ScFv。在37℃水浴中震荡孵育1.5h。用PBS洗去未结合的[125I]96ScFv(离心法,1000rpm,洗2次)。γ计数仪测定三种细胞结合的[125I]96ScFv放射性计数以及总放射性计数。
结果如表1所示,[125I]96ScFv和LS174T肿瘤细胞有特异性结合。
表1不同细胞表现出放射性的比例
二、18F标记
1.同位素标记小分子抗体的制备
回旋加速器生产出的18F-水溶液在氦气正压作用下,传到氟离子收集瓶中。在氮气压力下,18F-水溶液流经QMA,并被QMA捕获。用适量K222溶液淋洗QMA,将QMA上的18F-淋洗进反应管中,并升温至110-120℃进行第一次除水。干燥后继续加入2mL无水乙腈进行第二次除水。干燥结束加入SFB前体的乙腈溶液,加热密闭反应。反应10min冷却至室温后加入一定量的NaOH溶液,加热反应20min后加入HCl中和。混合液通过C-18柱转移至第二个反应管,加入一定量的TSTU,反应5min后加压通过预先活化好的C-18柱。用20mL超纯水分两次洗涤C-18柱,再用1.2mL乙醇洗脱C-18得18F-SFB粗品。取一定量前体96ScFV与西林瓶中,加入一定量18F-SFB粗品后,加入碱调节pH到9左右,37℃反应20min后,加入预先活化好的PD-10柱,纯化除去小分子化合物,得到纯品[18F]96ScFV。通过TLC分析,检测放射性化学纯度。
结果(见图4)表明,[18F]96ScFV纯化后放化纯度>95%。
2.结直肠癌荷瘤鼠体内显影实验
选用LS174T结直肠癌荷瘤鼠,放射性药物经生理盐水稀释后达到给药剂量要求(0.1mL,200μCi),每只荷瘤鼠经尾静脉注射[18F]96ScFv 0.1mL,约200μCi。给药后经动态扫描1h,然后在2h、4h、6h三个时间点分别进行静态扫描10min。
结果如图5所示,荷瘤小鼠的肿瘤部位表现出明显的放射性信号,表面本发明的抗体可以特异性结合CEA,用于肿瘤显影。注射[18F]96ScFv后扫描结果显示荷瘤小鼠肾脏和膀胱有放射信号,6小时后膀胱仍有微弱信号,是因为该单链抗体通过肾脏经由尿液排出体外。
本实施例的结果说明:将本发明的小分子抗体连接可检测的原子或原子团后,可以用于检测CEA阳性的细胞或组织。
实施例3小分子抗体用于CAR-T治疗
CAR-T是嵌合抗原受体T细胞的简称,通常是将嵌合抗原受体表达于T细胞中得到的细胞,所述嵌合抗原受体分为三段,位于细胞膜外侧的是单链抗体和免疫球蛋白铰链区,位于细胞膜中的是跨膜区,位于细胞膜内侧的是激活结构域,当抗体结构域与抗原蛋白结合后,会使激活结构域激活,促进T细胞的活化和增殖,发挥T细胞的杀伤作用。
本实施例使用实施例1所得的单链抗体(96ScFv)序列构建CAR-T细胞,其嵌合抗原受体由如下几个结构域组成:抗CEA的单链抗体(96ScFv),IgG4铰链区,CD28跨膜区,免疫共刺激信号分子CD28及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
用CEA阳性的LOVO细胞作为靶细胞,取3个CAR-T克隆419、422、425用于体外细胞杀伤评价,经未插入96ScFv的T细胞(CT)处理和培养基(Medium)处理的LOVO细胞作为对照。效靶比5∶1,作用时间24h。
结果显示,克隆419、422、425均达到较高的细胞杀伤作用,杀伤率(裂解率)接近或超过60%,而CT组杀伤率不到10%(图6)。
本实施例的结果表明:本发明的抗体靶向CEA能力强,且CEA用于CAR-T时能起到优良的抗肿瘤作用。
综上,本发明的小分子抗体可特异性结合癌胚抗原,可用于CEA阳性的肿瘤组织检测以及CAR-T的制备,在肿瘤诊断和治疗中具有良好的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都金昆生物科技有限公司
<120> 靶向癌胚抗原的小分子抗体
<130> GYKH1769-2020P0111796CC
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Gln Val Arg Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
Lys Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Gly Val Ser Ser Gly Ala Leu Thr Ala Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Gln Ser Arg Leu Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Ser Val Asn Gly Asp Ser Val Pro Tyr Gly Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Ser Pro Gly Leu Leu Ile Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Val Gly Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Ala Thr Thr
180 185 190
Asp Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Phe Gly Ser Arg Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Gln Ser Thr Tyr Ser Gly Val Phe Gly
225 230 235 240
Ser Gly Thr Met Leu Ala Val Leu Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
245 250 255
Phe His His His His His His His Leu Gly Gly Cys
260 265
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Gln Val Arg Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
Lys Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Gly Val Ser Ser Gly Ala Leu Thr Ala Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Gln Ser Arg Leu Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Ser Val Asn Gly Asp Ser Val Pro Tyr Gly Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Ser Pro Gly Leu Leu Ile Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Ala Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Ala Thr Thr Asp Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Phe Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Gln Ser Thr
85 90 95
Tyr Ser Gly Val Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Ala Val Leu Gly Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe His His His His His His His Leu Gly
115 120 125
Gly Cys
130
<210> 5
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgggtcagg ttcgtctgcg tgaatctggt ccgtctctgg ttaaaccgtc tcagaccctg 60
tctctgacct gcaccgtttc tggtttctct ctgaccaaat acggtgtttc ttgggttcgt 120
caggcgccgg gtaaagcgct ggaatggctg ggtggtgttt cttctggtgc gctgaccgcg 180
tacaacaccg cgctgcagtc tcgtctgtct gttacccgtg acacctctaa atctcagttc 240
tctctgtctc tgtcttctgt taccaccgaa gacaccgcga tctactactg cgcgaaatct 300
gttaacggtg actctgttcc gtacggtctg gactactggt ctccgggtct gctgatcacc 360
gtttcttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctcaggcg 420
gttctgaccc agccgtcttc tgtttctggt tctctgggtc agcgtgtttc tatcacctgc 480
tctggttctt cttctaacat cggtggtaac gcgtacgttg gttggtacca gcaggttccg 540
ggttctgcgc cgcgtctgct gatctctgcg accaccgacc gtgcgtctgg tatcccggac 600
cgtttcttcg gttctcgttc tggtaacacc gcgaccctga ccatctcttc tctgcaggcg 660
gaagacgaag cggactacta ctgcgcgtct taccagtcta cctactctgg tgttttcggt 720
tctggtacca tgctggcggt tctgggtacc gttgcggcgc cgtctgtttt ccaccaccac 780
caccaccacc acctgggtgg ttgc 804