CN111971060B - 募集抗体并靶向肿瘤细胞的双功能分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了募集抗体并靶向肿瘤细胞的双功能分子，属于生物制药技术领域。本发明的双功能分子包含至少一个能够结合到体内已有的抗体的募集结构和一个选择性结合肿瘤细胞的靶向性部分。根据本发明的化合物选择性结合至癌细胞表面，并通过募集结构招募已有抗体，介导患者中对癌细胞的体液应答和细胞应答反应。根据本发明的化合物的这一生理作用，癌细胞可以被免疫调节，为肿瘤免疫治疗提供了新的策略。

Description

募集抗体并靶向肿瘤细胞的双功能分子
技术领域
本发明涉及募集抗体并靶向肿瘤细胞的双功能分子，属于生物制药技术领域。
背景技术
近年来，癌症的发病率和死亡率都迅速增加，2015年我国新增肿瘤患者400多万，死亡人数280多万。为了解决传统疗法靶向性低、副作用大等问题，增强抗癌药物的靶向性并降低其副作用被认为是有效的改进策略。
目前市面上应用最广的为基于单克隆抗体的靶向药物，例如用于治疗霍杰金淋巴瘤的利妥昔单抗。然而，自身巨大的分子量(150KD)和昂贵的生产的成本所带来的缺陷则限制了单克隆抗体的肿瘤治疗效果和在临床上的应用。虽然之后分子量更小的抗体片段如单链抗体(ScFv)、抗原结合片段(Fab)得以开发，但它们相对完整单克隆抗体亲和力和稳定性都有所欠缺。
因此，开发和利用亲和性和稳定性都不亚于的小分子靶向性抗体/化合物是解决这一问题的关键。在此类小分子中，纳米抗体(VHH)、含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽(RGD)等都已经被广泛证明具有良好的靶向性。
另一方面，为了降低传统药物对正常细胞的毒性，解决肿瘤细胞的耐药性等问题，调动自身免疫系统对靶细胞进行杀伤的免疫疗法广受关注。其中，抗体募集策略在于：(1)利用体内自然存在的高丰度的抗体，如二硝基苯(DNP)，galactose-α-1,3-galactose(αGal)，鼠李糖(Rha)和磷酰胆碱(PC)等抗原对应的抗体；(2)利用ZZ domain此类可以特异性结合免疫球蛋白(IgG)的分子捕捉血清内游离的抗体，介导免疫系统多重途径的免疫活性从而杀伤目的细胞。
此外，通过何种方式，选用何种linker对靶向部分和募集部分进行连接仍不具备完善的理论研究体系和值得借鉴的成熟经验。
发明内容
基于上述肿瘤靶向的分子和抗体募集分子策略，本发明开发了一系列含不同linker的药用化合物，用于肿瘤的免疫治疗。
本发明的第一个目的是提供一系列用于肿瘤免疫治疗的基于nanobody的抗体募集双功能分子，所述双功能分子的结构式如式1所示，
式1：
Figure BDA0002148712530000011
；其中，A为能够招募抗体的结构，包括能够与抗体结合的半抗原、多肽、Z/ZZ domain亲和肽及其类似物；B为能够与细胞表面结合的物质，包括但不限于寡肽、多肽、纳米抗体、具有抗体功能的片段；Linker为连接A和B的连接结构，包括但不限于化学键或分子连接体。
在本发明的一种实施方式中，A为能结合人体内天然存在的抗体半抗原结构。
在本发明的一种实施方式中，所述人体内天然存在的抗体包括但不限于DNP和Rha基团。
在本发明的一种实施方式中，B为RGD及其衍生物，包括但不限于RGD环肽；所述RGD为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
在本发明的一种实施方式中，B为NGR及其衍生物，所述NGR为天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸。
在本发明的一种实施方式中，B为LHRH及其衍生物；所述LHRH是促黄体酮激素释放激素。
在本发明的一种实施方式中，B包括抗肿瘤细胞表皮生长因子受体EGFR的纳米抗体、抗HER2的纳米抗体、抗前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)的纳米抗体，或上述纳米抗体与Z(ZZ)domain的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述双功能分子中A包括两种不同的半抗原或Z/ZZdomain亲和肽。
在本发明的一种实施方式中，所述双功能分子的结构式为：
Figure BDA0002148712530000021
；其中，A1和A2为两种不同的能够结合人体内天然存在的抗体的半抗原结构；B含有靶向肿瘤的纳米抗体；Linker为连接A和B的连接结构，包括但不限于化学键或分子连接体。
在本发明的一种实施方式中，所述人体内天然存在的抗体包括但不限于DNP和Rha基团。
在本发明的一种实施方式中，B包括抗肿瘤细胞表皮生长因子受体EGFR的纳米抗体、抗HER2的纳米抗体、抗前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)的纳米抗体，或上述纳米抗体与Z(ZZ)domain的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，B与linker通过sortase A酶进行连接。
在本发明的一种实施方式中，带有LPXTGn的B和带有Gn的linker通过sortaseA连接
在本发明的一种实施方式中，linker的结构式为
Figure BDA0002148712530000022
Figure BDA0002148712530000031
或-LPXTGn-；所述-LPXTGn-为-亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-n个甘氨酸；其中n为整数1～10；n1为整数1～4；n2为整数2-9；n3为整数2-9；X为O或S或N。
在本发明的一种实施方式中，
Figure BDA0002148712530000032
靠近X端为半抗原结构，另一端为B，B通过SortaseA连接。/>
在本发明的一种实施方式中，
Figure BDA0002148712530000033
靠近X端为相同或不同的半抗原，另一端为B，B通过SortaseA连接。
-LPXTGn-适用于SortaseA将纳米抗体和Z(ZZ)domain直接进行连接，所述纳米抗体连接在Z/ZZ domain的N端或C端。
在本发明的一种实施方式中，所述双功能分子的结构式为：
Figure BDA0002148712530000034
其中，A是抗体结合末端，其具有能结合到病人体内已有抗体的半抗原结构；B含有能够结合细胞的纳米抗体；L1和L2为连接基，含有一个或多个双官能连接体基团CON；MULTICON为双官能或多官能连接体基团，当MCON≥1时，MULTICON通过连接基L1和/或L2将至少一个A与B连接；
MCON为整数0～10；n和n’各自独立地为整数1～15，通常为2～10，通常为2～5，更通常为2～3，或2、3、4、5或6；NL1和NL2各自为整数0～10，且n≥NL1，且n’≥NL2。
在本发明的一种实施方式中，MCON为1、2或3。
在本发明的一种实施方式中，MCON为1。
在本发明的一种实施方式中，n为1、2或3，且n’为1或2。
在本发明的一种实施方式中，NL1为1且NL2为1。
在本发明的一种实施方式中，MCON为0，NL1为1且NL2为1。
在本发明的一种实施方式中，MCON为0，n为1且n’为1。
在本发明的一种实施方式中，NL1为1。
在本发明的一种实施方式中，NL2为1。
在本发明的一种实施方式中，所述B包含一种免疫球蛋白单可变结构域，或纳米抗体，或可以靶向结合细胞表面靶标的多肽及其衍生物；所述多肽及其衍生物可以靶向细胞表面的靶标。
在本发明的一种实施方式中，所述B的多肽可以靶向结合细胞表面靶标；所述细胞是有病细胞，包括但不限于癌细胞。
在本发明的一种实施方式中，B的结构为：
Figure BDA0002148712530000041
其中，X为任一氨基酸及其衍生物，所述-LPXTGn-为-亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-n个甘氨酸；X为O或S或N；n为1-100的整数。
在本发明的一种实施方式中，所述双官能连接体基团CON包括：
Figure BDA0002148712530000042
其中X2为O、S、NR4、S(O)、S(O)2、-S(O)2O、-OS(O)2或OS(O)2O；X3为O、S、NR4；且R4为H、C1-C3烷基或烷醇基，或-C(O)(C1-C3)基团；或其可药用盐。
在本发明的一种实施方式中，所述双官能连接体基团CON为
Figure BDA0002148712530000043
其中CL为
Figure BDA0002148712530000044
m为整数0～12，通常为0、1、2、3、4、5、6；且IL为0或1，通常为1。
在本发明的一种实施方式中，所述连接基L1或L2包括聚乙二醇(PEG)连接基、聚丙二醇连接基或聚乙二醇-共-聚丙烯聚合物，它们的长度为1至100单位。
在本发明的一种实施方式中，所述连接基L1或L2为聚脯氨酸连接基或胶原连接基：其中，聚脯氨酸连接基结构式为
Figure BDA0002148712530000051
胶原连接基结构式为
Figure BDA0002148712530000052
其中n为1至100。
在本发明的一种实施方式中，所述连接基L1或L2为
Figure BDA0002148712530000053
中的任一种；其中，Ra是H、C1-C3烷基或烷醇或与R3形成一环，R3为衍生自氨基酸的侧链；m是从1到100的整数；且m”是从0到25的整数；上述任一基团均可进一步通过酰胺基、酮基、胺基或氨基酸连接。
在本发明的一种实施方式中，所述连接基L1或L2为
Figure BDA0002148712530000054
其中，Ra是H或C1-C3烷基，通常为CH3，最通常为H；m为整数1至12，通常为1、2、3、4、5或6；m”为整数1、2、3、4、5或6，通常为6；t为1、2、3、4、5或6；且iL为0或1，其中所述连接基任选在一端连接至A基团，且在另一端任选连接至B基团。/>
在本发明的一种实施方式中，所述连接基L1或L2为
Figure BDA0002148712530000055
Figure BDA0002148712530000056
其中q为整数0～12；且q’为1～12；iL为0或1；且RL为氨基酸或寡肽；
或根据以下化学结构的连接基琥珀酰亚胺：
Figure BDA0002148712530000057
其中各XS独立地为S、O或N-RS；RS为H或C1-C3烷基；SC为CH2、CH2O或CH2CH2O；i为0或1；且ms为0、1、2、3、4、5或6；
或根据以下化学式的连接基：
Figure BDA0002148712530000061
其中Z和Z’各自独立地为键，包括-(CH2)i-S，-(CH2)i-N-R，
Figure BDA0002148712530000062
-(CH2)m′-；/>
Figure BDA0002148712530000063
Figure BDA0002148712530000064
或任选键合至另一连接基、连接体、A基团或B基团；每个R为H，或烷基或烷醇基；每个R2独立地为H或烷基；每个Y独立地为键、O、S或N-R；每个i独立地为0至100；
D为
Figure BDA0002148712530000065
-(CH2)m′-；/>
Figure BDA0002148712530000066
或键，或
Figure BDA0002148712530000067
或具有1至100个二醇但愿的聚丙二醇或聚丙烯-共-聚乙二醇连接基；其中Z，Z’和D各自不同时为键；每个i独立地为0～100；j为1至100；m为整数1～100；且n为整数1～100；m’为1～100；m”为整数0～25，通常为1～10，通常为1～8；更通常为1、2、3、4、5或6；n’为整数1～100，或1～75，或1～60，或1～5，或1～50，或1～45，或1～40，或2～35，或3～30，或1～15，或1～10，或1～8，或1～6，或1、2、3、4或5；Xi为O，S或N-R；R为H，或烷基或烷醇基；Ra是H、C1-C3烷基或烷醇或与R3形成一环，R3是衍生自氨基酸的侧链；或他们药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物。
在本发明的一种实施方式中，所述双官能或多官能连接体基团MULTICON基团包括：
Figure BDA0002148712530000068
Figure BDA0002148712530000071
其中Y4为C-H或N；且各X”独立地衍生自亲电或亲核基团，包括但不限于(CH2)n”O、(CH2)n”NRCON、(CH2)n”S、(CH2)n”、(CH2)n”C＝O或CON基团；该取代基RCON为H或C1-C3烷基，尤其是H或CH3，且n”为0、1、2或3；r为整数1至12；且所述CON基团，如果存在的话，结构为
Figure BDA0002148712530000072
其中X2为O、S、NR4、S(O)、S(O)2、-S(O)2O、-OS(O)2或OS(O)2O；X3为O、S、NR4；且R4为H、C1-C3烷基或烷醇基，或-C(O)(C1-C3)基团；或其可药用盐。
在本发明的一种实施方式中，L1和/或L2为
Figure BDA0002148712530000073
基团；其中Ra为H或CH3；m为整数1～12；m”为整数1、2、3、4、5或6；t为0、1、2、3、4、5或6；且iL为0或1。
在本发明的一种实施方式中，L1和/或L2为
Figure BDA0002148712530000074
其中Ra为H；m”为整数1、2、3、4、5或6且m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
在本发明的一种实施方式中，所述化合物中L1和/或L2为长度为1～12个二醇单元的聚乙二醇连接基，或通过所述CON基团延伸至第二聚乙二醇连接基的聚乙二醇连接基；所述聚乙二醇连接基的长度为1～12个二醇单元且所述第二聚乙二醇连接基为长度为1～12个二醇单元。
在本发明的一种实施方式中，所述CON基团为
Figure BDA0002148712530000075
在本发明的一种实施方式中，A具有以下结构的部分组成的基团：
Figure BDA0002148712530000081
其中DNP基团任选地通过X基团连接到所述氨基酸部分；X是O、CH2、NR1、SO、SO2、-S(O)2O、-OS(O)2或-OS(O)2O。
在本发明的一种实施方式中，A具有以下化学式的部分：
Figure BDA0002148712530000082
其中，Y’是H或NO2；X是O、CH2、NR1、SO、SO2、-S(O)2O、-OS(O)2或-OS(O)2O；R1是H、C1-C3烷基或-C(O)(C1-C3)基团；Xs是OH或NHAc；XR是O或者S；Xb是一化学键O、CH2、NR1或S；X’是CH2、O、N-R1’(R1’是H或C1-C3烷基)或S；X”是O、CH2、NR1(R1是H、C1-C3烷基或-C(O)(C1-C3)基团)Z是一化学键、单糖、二糖、寡糖、糖蛋白或糖脂。
有益效果：(1)本发明所采用的募集结构均为常规的小分子或易于发酵获得ZZdomain,易于获得，并可以有效募集人体血清内相关的抗体。
(2)本发明所采用的靶向结构均为易于合成的多肽、环肽或者易于发酵获得的抗体蛋白，它们均可以和肿瘤表面相关的抗原实现高亲和、高特异地结合，其结合能力不亚于传统的单克隆抗体。
(3)本发明将募集结构和靶向结构的连接方式并不复杂，产物也易于纯化，如利用SortaseA和点击化学均可以在生理环境下实现对分子的快速修饰。
(4)本发明提供的双功能分子均可以特异性靶向肿瘤细胞细胞，且半结合常数通常低于10nM，并可以有效募集抗DNP、抗Rha等抗体，通过介导CDC或ADCC不同程度地实现对肿瘤细胞的杀伤(20％-90％)。本发明还通过一系列不同的链(包括不同链长、链类型)对募集结构和靶向结构进行连接，评估不同链、不同募集结构(种类、数量)和靶向结构(种类、数量)对终化合物肿瘤杀伤作用的影响，优选出该系列双功能分子，可以为以后相类似肿瘤药物的开发提供宝贵的基础和借鉴。
附图说明
图1目标产物的质谱；(A)GGG-triEGDNP,(B)GGG-hexEGDNP；
图2为流式细胞图；其中纵坐标MFI指平均荧光强度，左图中横坐标表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negative control表示用等体积的PBS对细胞进行孵育；右图中横坐标表示所孵育的细胞种类。
图3为肿瘤杀伤效应；其中，(A)ADCC效果；(B)CDC效果；纵坐标对应为细胞裂解率，横坐标表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negative control表示用等体积的PBS对细胞进行孵育。
图4为目标产物质谱(A)GGG-triEGRha,(B)GGG-hexEGRha；
图5为流式细胞图；其中纵坐标MFI指平均荧光强度，左图中横坐标表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negative control表示用等体积的PBS对细胞进行孵育；右图中横坐标表示所孵育的细胞种类。
图6为肿瘤杀伤效应；(A)ADCC效果；(B)CDC效果；纵坐标对应为细胞裂解率，横坐标表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negative control表示用等体积的PBS对细胞进行孵育。
图7为MCF-7细胞的流式细胞仪、CDC、ADCC实验结果；纵坐标MFI表示荧光强度，lysis％对应为细胞裂解率，横坐标均表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negativecontrol表示用等体积的PBS对细胞进行孵育。
图8为化合物NGR-DNP的质谱结果；
图9为MCF-7细胞的流式细胞仪、CDC、ADCC实验结果；纵坐标MFI表示荧光强度，lysis％对应为细胞裂解率，横坐标均表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negativecontrol表示用等体积的PBS对细胞进行孵育。
图10为RGD-DNP(图A)和RGD-linker-DNP(图B)的质谱数据；
图11为细胞实验结果；其中，(A)为HEK-293细胞的流式细胞仪、CDC、ADCC实验结果；纵坐标MFI表示荧光强度，lysis％对应为细胞裂解率，横坐标均表示用对应的化合物与细胞进行孵育，Negative control表示用等体积的PBS对细胞进行孵育。(B)为HT-29、SKOV-3和HEK-293细胞与RGD-linker-DNP的流式细胞结合实验；纵坐标MFI表示荧光强度，横坐标表示所孵育的细胞种类，其中negative control表示用等体积的PBS对SKOV3细胞进行孵育。
具体实施方式
以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1以anti-EGFR nanobody(7D12)和小分子(GGG-triEGDNP和GGG-hexEGDNP)为例1、GGG-triEGDNP和GGG-hexEGDNP具体的合成路线以及每步相应的条件和产率如下：
Figure BDA0002148712530000101
图1-1
目标产物的高分辨如图1所示。其中GGG-triEGDNP检测到的分子量为487.1792(M+H+)，GGG-hexEGDNP检测到的分子量为619.2580(M+H+)，均和预测一致，表明所合成的产物正确。
2、anti-EGFR nanobody(7D12)的发酵生产：
合成7D12的氨基酸序列(参考NCBI Sequence ID:4KRL_B)：
maqvkleesgggsvqtggslrltcaasgrtsrsygmgwfrqapgkerefvsgiswrgdstgyadsvkgrftisrdnakntvdlqmnslkpedtaiyycaaaagsawygtlyeydywgqgtqvtvssaaaeqkliseedlngaalpetgghhhhhh
发酵具体实施方式为：将编码7D12的基因克隆至pET28a商业载体上并转化至商业宿主E.coli BL21(DE3)。挑取单菌落进行接种，接种培养基为LB，并添加0.1％的卡那霉素，37℃过夜培养；按1-10％的量进行转接，发酵培养基为TB培养基，待OD＝0.6-1.2时进行诱导，IPTG终浓度为0.1-1.0mM,温度转为16-30℃，诱导24h。发酵结束后进行离心，弃置培养基，用缓冲液(10-100mM Tris-Hcl或者PBS，pH 7-8)进行重悬，并用超声进行破壁，破壁后取破壁上清用镍柱进行纯化，并用脱盐柱或者超滤或者透析进行脱盐。纯化脱盐后的7D12通过SDS-PAGE进行验证，结果显示只有一条带，且分子量和预测相符(16.7KD)。
3、7D12-triEGDNP和7D12-hexEGDNP的合成：
在增强型SortaseA(SrtA)的作用下，在Tris-HCl缓冲液当中对7D12进行DNP的修饰，在4-37℃，反应10-120min，反应后未反应的7D12用Ni+磁珠进行去除，多余的小分子则通过透析或者排阻法除去，产物经纯化(可以通过透析、超滤和排阻过滤)后无菌过滤后保存在-20℃备用。
4、细胞实验
(1)细胞的培养：商业化细胞A431(EGFR高表达)，MCF7(EGFR低表达)培养在DMEM完全培养基，4T1(鼠源EGFR高表达)培养在1640完全培养基，所有细胞培养条件均为37℃，5％CO2；
(2)流式细胞实验：实验流程为①用胰酶消化细胞，流式液重悬计数，稀释细胞到1*105个，取400μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为250nM的7D12或DNP修饰的7D12,对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入终浓度为20μg/mL的抗DNP抗体，冰上孵育1h③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用仪器进行检测。
流式结果如图2所示，相对于空白对照，加入未经半抗原修饰的7D12在荧光强度上并没有明显升高，证明未经修饰的7D12不具备募集抗体的能力；此外，经过7D12-triEGDNP或7D12-hexEGDNP处理后，A431荧光明显增加，而MCF7则无明显增加，这说明了了所构建的7D12-triEGDNP和7D12-hexEGDNP可以特异性结合细胞表面的EGFR，值得注意的是，由于4T1组经7D12-triEGDNP或7D12-hexEGDNP处理后，荧光强度也无明显增加，则证明了所合成的7D12-triEGDNP所识别的为人源EGFR，而非鼠源。
(3)ADCC实验：实验流程为：①在96孔板相应孔加入100μL A431细胞悬浮液(10000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入稀释的7D12或7D12-triEGDNP或7D12-hexEGDNP,并立即加入一定浓度的IgG；②孵育一段时间后，按一定的效靶比加入新鲜提取的PBMC细胞，处理一定时间；③离心去上清LDH是方法检测。
结果如图3(A)，相对于其它对照的细胞活性，以7D12-triEGDNP或7D12-hexEGDNP处理后，杀伤率分别为31％和37％，而对照组的细胞损失仅有5％左右，表明合成的两种产物均可以诱导ADCC效应，而且两者的杀伤力度相差无几。
(4)CDC实验：实验流程为①在96孔板相应孔加入100μL A431细胞悬浮液(5000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入稀释的7D12或7D12-triEGDNP或7D12-hexEGDNP,并立即加入一定浓度的IgG②孵育一段时间后，加入一定量的补体，处理一定时间③cck8法检测细胞活性，并转化成相应的细胞毒性。
结果如图3(B)所示，相对于其它对照的细胞活性，以7D12-triEGDNP或7D12-hexEGDNP处理后，杀伤率分别为21％和27％，而对照组的细胞死亡率则低于5％，表明合成的两种产物均可以诱导CDC效应。并且7D12-hexEGDNP所诱导的CDC效果略强于7D12-triEGDNP。
实施例2
以anti-HER2nanobody(C7b)和小分子(GGG-triEGRha和GGG-hexEGRha)为例。
1、GGG-triEGRha和GGG-hexEGRha具体的合成路线以及每步相应的条件和产率如下：
Figure BDA0002148712530000121
产物的高分辨如图4所示。其中GGG-triEGRha检测到的分子量为467.2354(M+H+)，GGG-hexEGRha检测到的分子量为599.3145(M+H+)，均和预测一致，表明所合成的产物正确。
2、anti-HER2nanobody(C7b)的发酵生产：
合成C7b的氨基酸序列(参考NCBI Sequence ID:AFN61318.1)：
mqvqlvqsggglvqaggslrlscaasgrtfssyamawfrqapgkerefvaaiswsganiyvadsvkgrftisrdnakdtvylqmns
lkpedtavyycavklgfapveerqydywgqgtqvtvsslpetgg
发酵具体实施方式为：将编码C7b的基因克隆至pET22b商业载体上并转化至商业宿主E.coli BL21(DE3)。挑取单菌落进行接种，接种培养基为LB，并添加0.1％的氨苄抗生素，37℃过夜培养；按1-10％的量进行转接，发酵培养基为TB培养基，待OD＝0.6-1.2时进行诱导，IPTG终浓度为0.1-1.0mM,温度转为16-30℃，诱导24h。发酵结束后进行离心，弃置培养基，用缓冲液(10-100mM Tris-Hcl或者PBS，pH 7-8)进行重悬，并用超声进行破壁，破壁后取破壁上清用镍柱进行纯化，并用脱盐柱或者超滤或者透析进行脱盐。
3、C7b-triEGRha和C7b-hexEGRha的合成
在增强型SrtA的作用下，在Tris-HCl缓冲液当中对C7b进行Rha修饰，在为4-37℃，反应10-120min，反应后未反应的C7b用Ni+磁珠进行去除，多余的小分子则通过透析或者排阻法除去，产物经纯化(可以通过透析、超滤和排阻过滤)后无菌过滤后保存在-20℃备用。
4、细胞实验
(1)细胞的培养：商业化细胞SKBR3(HER2高表达)MCF7(HER2低表达)培养在DMEM完全培养基，所有细胞培养条件均为37℃，5％CO2.
(2)流式细胞实验：实验流程为①用胰酶消化细胞，流式液重悬计数，稀释细胞到1*10^5个，取400μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为250nM的C7b或Rha修饰C7b,对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入中浓度为20μg/mL的抗鼠李糖(anti-Rha)抗体，冰上孵育1h③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用仪器进行检测。
流式结果(图5)表明所合成的C7b-triEGRha和C7b-hexEGRha可以专一性识别并结合靶细胞表面的HER2，相对于空白对照，加入未经半抗原修饰的C7b在荧光强度上并没有明显升高，证明未经修饰的C7b不具备募集抗体的能力；而经过C7b-triEGRha和C7b-hexEGRha处理后，SKBR3荧光强度增加最多，MCF7则无明显增加，这说明了所构建的C7b-triEGRha和C7b-hexEGRha可以特异性结合细胞表面的HER2。
(3)ADCC实验：实验流程为①在96孔板相应孔加入100μL SKBR3细胞悬浮液(10000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入稀释的C7b或者Rha修饰的C7b,并立即加入一定浓度的anti-Rha IgG②孵育一段时间后，按一定的效靶比加入新鲜提取的PBMC细胞，处理一定时间③离心去上清LDH是方法检测细胞毒性。
结果(图6(A))表明合成的C7b-triEGRha和C7b-hexEGRha均可以诱导ADCC效应，它们对应的杀伤率分别为32％和43％，且C7b-hexEGRha所诱导的ADCC效果强于C7b-triEGRha。
(4)CDC实验：实验流程简单概括为：①在96孔板相应孔加入100μL A431细胞悬浮液(5000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入稀释的C7b或者Rha修饰的C7b,并立即加入终浓度为20％的商业化正常人血清(已检测内有anti-Rha抗体)，处理一定时间③cck8法检测细胞活性，行转化成相应的细胞毒性。
结果如图6(B)所示，相对于其它对照组的细胞活性(杀伤率低于5％)，C7b-triEGRha和C7b-hexEGRha可以诱明显的CDC效应，它们的杀伤率分别达到了36％和47％，且C7b-hexEGRha所诱导的CDC效果强于C7b-triEGRha。
实施例3
将鼠李糖(Rhamnose,Rha)偶联到LHRH多肽上，通过招募体内已有的抗体介导免疫效应来靶向杀死肿瘤细胞。
合成LHRH-鼠李糖偶联物(LHRH-Rhamnose，LHRH-Rha)的实施方式为：
基于LHRH构效关系的研究，在不影响其活性的基础上，在6位甘氨酸的位置进行带叠氮基团(-N3)的D型赖氨酸(D-Lys(N3))的取代，成为[6-D-Lys(N3)]-LHRH多肽分子(其氨基酸序列为：焦谷氨酸-组氨酸-色氨酸-丝氨酸-酪氨酸-D型赖氨酸(侧链带叠氮基团-N3)-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-氨基，Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(N3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，其中，Glp为焦谷氨酸。
选取Rink-amide MBHA树脂作为固相载体，基于Fmoc合成策略，按照Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的序列(其中，Glp为焦谷氨酸，无Fmoc保护)，利用TBTU作为缩合剂，从C端Gly开始到N端Glp逐步缩合。序列合成后，加入切割试剂(TFA:Tis:H2O＝95:2.5:2.5)将多肽从树脂上切割下来。利用冰乙醚沉淀得到粗肽，再通过HPLC进行纯化，获得多肽[D-Lys6]-LHRH，质谱验证,[M+Na+]为1301.6，为正确产物。
其中，带叠氮的D型赖氨酸的合成的实施方式为(质谱数据[M+Na+]417.1，为正确化合物)：
Figure BDA0002148712530000151
合成鼠李糖Rha衍生物的实施方式为：Rha分子进行寡聚聚乙二醇(选用n＝0，2，5)连接臂进行组装，该连接臂的另一端为炔基通过点击反应偶联到上述LHRH多肽衍生物中，合成的化合物为
Figure BDA0002148712530000152
合成路线如下：
Figure BDA0002148712530000153
硫酸铜、维生素C钠催化的条件下，Rha衍生物与LHRH衍生物通过点击反应获得LHRH-Rha偶联产物，质谱验证偶联成功。连接臂linker为寡聚聚乙二醇(选用n＝0，2，5)，分别表示为LHRH-Rha(质谱分子量[M+Na+]为1560.7),LHRH-TEG-Rha(质谱分子量[M+Na+]为1648.8),LHRH-HEG-Rha(质谱分子量[M+Na+]为1780.9)。
细胞实验的实施方案：细胞的培养：商业化细胞MCF-7(LHRH-R高表达)和UCI-107(LHRH不表达)培养在DMEM完全培养基，所有细胞培养条件均为37℃，5％CO2。流式细胞实验：实验流程为①用胰酶消化细胞，流式液重悬计数，稀释细胞到1×105个，取400μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为250nM的LHRH、LHRH-Rha、LHRH-TEG-Rha和LHRH-HEG-Rha化合物，对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入中浓度为20μg/mL的抗鼠李糖(anti-Rha)抗体，冰上孵育1h，随后洗涤细胞后加入带荧光的二抗，冰上孵育0.5h；③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用仪器进行检测。
ADCC实验的实施方案：①在96孔板相应孔加入100μL MCF-7或UCI-107细胞悬浮液(10000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为250nM的LHRH、LHRH-Rha、LHRH-TEG-Rha和LHRH-HEG-Rha化合物，并立即加入一定浓度的anti-Rha抗体②孵育一段时间后，按一定的效靶比加入新鲜提取的PBMC细胞，处理一定时间③离心去上清，用LDH方法检测细胞毒性。
CDC实验的实施方案：①在96孔板相应孔加入100μL MCF-7或UCI-107细胞悬浮液(5000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为250nM的LHRH、LHRH-Rha、LHRH-TEG-Rha和LHRH-HEG-Rha化合物，并同时加入一定浓度的anti-Rha抗体，在37度孵育2小时候，加入终浓度为10％的补体溶液，37度孵育1个小时。孵育结束后，直接用cck8法检测细胞活性。
流式细胞仪、ADCC、CDC实验结果如7所示，实验结果表明，LHRH-Rha,LHRH-TEG-Rha和LHRH-HEG-Rha偶联化合物都能招募抗Rha抗体并靶向LHRH高表达的MCF-7肿瘤细胞，并介导免疫反应CDC和ADCC进一步杀伤MCF-7肿瘤细胞，且这三个化合物所介导的免疫杀伤效果相当(CDC介导的杀伤率均在26％左右，ADCC介导的杀伤率均在33％左右)，在本实施例中，连接臂的长短对活性的影响较小。
实施例4
NGR多肽即含天门冬酰胺酸-精氨酸-甘氨酸序列的多肽。直链状的NGR多肽有CYGGRGNG，CNGRCVSGCAGRC，GNGRGGVRSSSRTPSDKYC等。NGR多肽是一种能与肿瘤新生血管内皮细胞上的CD13受体结合的靶向肽，能够有效地靶向肿瘤细胞。因此，本发明设计合成了基于NGR的抗体募集双功能分子，将DNP的结构偶联到NGR上，通过招募抗DNP的抗体并靶向CD13高表达的肿瘤新生血管内皮细胞，介导免疫反应靶向杀伤肿瘤细胞。
合成NGR-DNP偶联物的实施方式如下：
Figure BDA0002148712530000161
化合物3(DNP-TEG-COOH)的合成：在0℃条件下将化合物2(DNP-TEG-COOEt)0.35g溶于1:1的四氢呋喃/水溶液(15ml/15ml)中，加入碳酸钾0.4g反应过夜。反应结束后抽干四氢呋喃，以20ml二氯甲烷DCM萃取3次，产物呈盐状态溶于水中，以薄层色谱监测是否萃净水中杂质。以1mol/ml的盐酸中和水相，至PH试纸显红色。抽干后用二氯甲烷溶解过滤。若仍有少量杂质可过硅胶柱。产物0.26g，产率80％。
化合物4的合成：先合成肽链GGGCNGRC(G、C、N、R分别代表氨基酸甘氨酸、半胱氨酸、天门冬酰胺、精氨酸)，以Fmoc-Cys(Acm)-Wang resin(0.1mmol)树脂为固相载体将树脂在固相合成管中溶胀过夜，加入20％哌啶/DMF溶液(5ml)在摇床上摇15min脱去Fmoc，然后将Fmoc-Arg-OH(0.25mmol)，HBTU(0.25mmol),Dipea(0.5mmol)溶于5mlDMF溶液，加入树脂中，摇床上摇2h，以茚三酮溶液监测是否连上。再次脱去Fmoc保护基，重复上述步骤直到肽链合成。
然后再将0.25mmol的化合物3，HBTU(0.25mmol),Dipea(0.5mmol)溶于5ml DMF溶液，加入树脂反应2h，监测反应结束。化合物5的合成：将化合物4在95％的三氟乙酸TFA溶液(TFA:Tis:H2O＝95:2.5:2.5)中，反应2h切去树脂，用大量冰乙醚沉淀离心，除去乙醚，冻干。HPLC监测。化合物6的合成：将化合物5溶于乙酸中，加入碘I2氧化，反应2-3h。HPLC监测反应进行，反应结束后用水猝灭，三氯甲烷CHCl3洗涤多次除去大多数碘I2。水相抽干后以半制备柱纯化。图8为化合物NGR-DNP的质谱结果，可见，有预测分子量973的峰出现，表明产物合成成功
细胞实验的实施方案：细胞的培养：商业化细胞HUVEC(CD13高表达)和培养在DMEM完全培养基，所有细胞培养条件均为37℃，5％CO2。流式细胞实验流程为①用胰酶消化细胞，流式液重悬计数，稀释细胞到1×105个，取400μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为250nM的NGR寡肽(NGR peptide，其氨基酸序列：GGGCNGRC)或NGR-DNP，对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入中浓度为20μg/mL的抗DNP(anti-DNP)抗体，冰上孵育1h，随后洗涤细胞后加入带荧光的二抗冰上孵育0.5h；③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用仪器进行检测。
ADCC实验的实施方案：①在96孔板相应孔加入100μL HUVEC细胞悬浮液(10000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为250nM的NGR寡肽(NGR peptide，其氨基酸序列：GGGCNGRC)或NGR-DNP化合物，并立即加入一定浓度的anti-DNP抗体②孵育一段时间后，按一定的效靶比加入新鲜提取的PBMC细胞，处理一定时间③离心去上清，用LDH方法检测细胞毒性。
CDC实验的实施方案：①在96孔板相应孔加入100μL HUVEC细胞悬浮液(5000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为250nM的NGR寡肽(NGR peptide，其氨基酸序列：GGGCNGRC)或NGR-DNP化合物，并同时加入一定浓度的anti-DNP抗体，在37度孵育2小时候，加入终浓度为10％的补体溶液，37度孵育1个小时。孵育结束后，直接用cck8法检测细胞活性。
NGR peptide(氨基酸序列：GGGCNGRC)和化合物NGR-DNP的流式细胞仪、ADCC、CDC实验结果如图9所示，实验结果表明，NGR-DNP化合物能招募抗体并靶向肿瘤细胞，并介导免疫反应CDC和ADCC(细胞裂解率约60％)进一步杀伤肿瘤细胞。
实施例5
整合素在多种肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞中低表达或不表达，且整合素在肿瘤细胞的粘附、迁移、浸润及肿瘤血管新生中起着重要作用，因此，整合素是肿瘤治疗的一个重要的靶点。由于整合素受体特异配体精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)能够特异性结合整合素，RGD及其衍生物被用于开发肿瘤靶向治疗策略。在本发明中，我们设计合成了一系列基于RGD结构的抗体募集双功能分子，将DNP偶联到RGD或其衍生的多肽或环肽上，通过招募抗DNP的抗体，介导免疫杀伤作用并靶向杀死肿瘤细胞。
合成RGD-DNP偶联物的实施方案如下所示：
Figure BDA0002148712530000181
合成RGD-linker-DNP的实施方案如下所示：
Figure BDA0002148712530000191
通过质谱检测确认合成的化合物正确，质谱如图10所示。RGD-DNP的实际分子量为769.78，质谱中中出现的770.38(M+H+)和792.26(M+Na+)均与预测相符；另外RGD-linker-DNP的分子量为882.3，质谱中出现的质何比453.57(M+Na+H+)以及883.44(M+H+)以及905.44(M+Na+)均和预测相符，表明产物合成正确。
化合物RGD-DNP和RGD-linker-DNP的活性检测实施方案如下：包括流式细胞实验、CDC实验和ADCC实验。具体实施方案如下：
细胞实验的实施方案：细胞的培养：商业化细胞HEK-293(整合素αvβ3高表达)SKOV-3(整合素αvβ3和αvβ5都表达)和HT-29(整合素αvβ5高表达)培养在DMEM完全培养基，所有细胞培养条件均为37℃，5％CO2。流式细胞实验：实验流程为①用胰酶消化细胞，流式液重悬计数，稀释细胞到1×105个，取400μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为250nM的RGD类似物、RGD-DNP和RGD-linker-DNP化合物，对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入中浓度为20μg/mL的抗DNP(anti-DNP)抗体，冰上孵育1h，随后洗涤细胞后加入带荧光的二抗，冰上孵育0.5h；③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用仪器进行检测。
ADCC实验的实施方案：①在96孔板相应孔加入100μL HEK-293、SKOV-3和HT-29细胞悬浮液(10000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为250nM的RGD类似物、RGD-DNP和RGD-linker-DNP化合物，并立即加入一定浓度的anti-DNP抗体②孵育一段时间后，按一定的效靶比加入新鲜提取的PBMC细胞，处理一定时间③离心去上清，用LDH方法检测细胞毒性。
CDC实验的实施方案：①在96孔板相应孔加入100μL HEK-293、SKOV-3和HT-29细胞悬浮液(5000个/孔)，待细胞完全贴壁后，加入终浓度为250nM的RGD类似物、RGD-DNP和RGD-linker-DNP化合物，并同时加入一定浓度的anti-DNP抗体，在37度孵育2小时候，加入终浓度为10％的补体溶液，37度孵育1个小时。孵育结束后，直接用cck8法检测细胞活性。
流式细胞仪、ADCC、CDC实验结果如图11所示，实验结果表明，RGD-DNP和RGD-linker-DNP偶联化合物都能结合到HEK-293、SKOV-3和HT-29细胞，但是与细胞的结合能力略有差别，可能是因为每种细胞表达的整合素不一样。RGD-DNP和RGD-linker-DNP偶联化合物都能招募抗DNP抗体并靶向整合素高表达的HEK-293细胞，并介导免疫反应CDC和ADCC进一步杀伤这几款细胞，且这2个化合物所介导的免疫杀伤效果有一定区别，连接臂较长的RGD-linker-DNP化合物所介导的免疫杀伤效果更强(短连接臂对应的CDC和ADCC杀伤率仅为21％和18％，长连接臂对应的CDC和ADCC杀伤率则达到了42％和38％)，与流式细胞实验的结果相一致。这个结果表明，招募DNP的抗体需要将DNP这部分结构裸露在RGD-整合素的复合物外面，如果连接臂太短，将会影响抗DNP的抗体与RGD-整合素复合物的结合。因此，本发明结果优化了一个连接臂的长度。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 募集抗体并靶向肿瘤细胞的双功能分子
<150> PCT/CN2017/119779
<151> 2017-12-29
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His His
145 150 155
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Glu Gly Phe Arg
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Gly Asp Asn Pro
1 5
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Val Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Val Lys Leu Gly Phe Ala Pro Val Glu Glu Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Leu Pro Glu Thr
115 120 125
Gly Gly
130
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Cys Tyr Gly Gly Arg Gly Asn Gly
1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Cys Asn Gly Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys
1 5 10
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Asn Gly Arg Gly Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp
1 5 10 15
Lys Tyr Cys

Claims (4)

1.一种双功能分子，其特征在于，结构式为：
Figure QLYQS_1
；
A为能结合人体内天然存在的抗体半抗原结构，所述能结合人体内天然存在的抗体半抗原结构选自：
Figure QLYQS_2
Figure QLYQS_3
；其中DNP基团任选地通过X基团连接到所述氨基酸部分；X是O、CH2、NR1、SO、SO2、-S(O)2O、-OS(O)2或-OS(O)2O；
或A具有以下化学式的部分：
Figure QLYQS_4
其中，Y’是H或NO2；X是O、CH2、NR1、SO、SO2、-S(O)2O、-OS(O)2或-OS(O)2O；R1是H、C1-C3烷基或-C(O)(C1-C3)基团；
B为RGD；所述RGD为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；
B与linker通过sortase A 酶进行连接；
linker的结构式为
Figure QLYQS_5
、
Figure QLYQS_6
或-LPXTGn-；所述-LPXTGn-为-亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-n个甘氨酸；其中n为整数1~10；n1为整数1~4；n2为整数2-9；n3为整数2-9；X为O或S或N。
2.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，
Figure QLYQS_7
或
Figure QLYQS_8
靠近X端为半抗原结构，或为相同或不同的半抗原，另一端与B通过SortaseA连接。
3.含有权利要求1或2所述双功能分子的药物组合物。
4.权利要求1或2所述的双功能分子在制备用于抑制卵巢癌或结肠癌的药物方面的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110420334A (zh) * 2019-08-19 2019-11-08 江南大学 一种药物缀合物和提高药物分子半衰期的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101856497A (zh) * 2009-04-10 2010-10-13 复旦大学附属华东医院 一种半抗原与含氨基载体的结合物及其制备方法和用途
CN105017340A (zh) * 2015-08-05 2015-11-04 厦门大学 一种抗原连接的唾液酸及其应用
CN106146824A (zh) * 2016-07-19 2016-11-23 浙江大学 利用天然糖抗体靶向免疫治疗肿瘤的脂质体及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8852630B2 (en) * 2008-05-13 2014-10-07 Yale University Chimeric small molecules for the recruitment of antibodies to cancer cells
CN103764665A (zh) * 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
CA2870485A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Sortase-modified vhh domains and uses thereof
EP3046932B1 (en) * 2013-09-20 2020-04-29 President and Fellows of Harvard College Evolved sortases and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101856497A (zh) * 2009-04-10 2010-10-13 复旦大学附属华东医院 一种半抗原与含氨基载体的结合物及其制备方法和用途
CN105017340A (zh) * 2015-08-05 2015-11-04 厦门大学 一种抗原连接的唾液酸及其应用
CN106146824A (zh) * 2016-07-19 2016-11-23 浙江大学 利用天然糖抗体靶向免疫治疗肿瘤的脂质体及其制备方法

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