CN106146824A - 利用天然糖抗体靶向免疫治疗肿瘤的脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型的磷脂类衍生化合物，得到形如磷脂‑PEG‑叶酸或磷脂‑PEG‑鼠李糖的磷脂类衍生物。本发明还提供了含有所述磷脂类衍生物的脂质体药物组合物及其制备方法，其可用于靶向免疫治疗肿瘤，利用补体依赖毒性免疫靶向杀伤肿瘤细胞。本发明采用鼠李糖和叶酸修饰的磷脂作为原料制备脂质体，靶向性好，充分利用人体天然免疫高效杀伤肿瘤细胞，毒副作用极小，适合临床应用研究和工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种利用天然糖抗体靶向免疫治疗肿瘤的脂质体及其制备方法与应用。
背景技术
鼠李糖(rhamnose,Rha)是一种单糖，存在于许多细菌中，但人体中却不能合成。大量研究已经表明鼠李糖具有免疫原性。而最近的研究发现，在人体血清中具有高滴度的鼠李糖抗体，并且其含量比α-Gal丰富，而改造过的α-Gal已被利用多价效应能有效杀伤肿瘤细胞。而且在野生型小鼠中，anti-Rha比anti-α-Gal数量多很多，anti-α-Gal几乎没有，说明如果做小鼠实验的话，利用anti-α-Gal需要将小鼠体内的半乳糖基转移酶基因进行敲除，而利用anti-Rha则不用；另外，鼠李糖的结构也比α-Gal简单，更容易通过化学方法进行改造。这提示我们，应用鼠李糖作为免疫抗原进行改造，用作抗肿瘤药物研究会有更好的效果。
脂质体是一种很好的运送载体，很多研究都利用脂质体包裹药物。但是脂质体载药普遍面临一大问题，即包封率不高且容易泄露，另外许多药物本身毒副作用大，这些都极大地限制了脂质体包封药物的应用。而且肿瘤细胞有许多分子特征，特别是一些肿瘤细胞表面会过表达许多受体，如表皮生长因子受体(EGFR)、叶酸受体(FR)等；其中叶酸受体在90％的肿瘤细胞表面过表达，如卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等。况且，叶酸分子结构简单，易于进行化学改造。本发明采用鼠李糖和叶酸修饰的磷脂作为原料制备脂质体，无需包裹、靶向性好，充分利用人体天然免疫高效杀伤肿瘤细胞，毒副作用极小。
发明内容
本发明的一个目的提供一种新型磷脂类衍生物，其可用于制备靶向免疫治疗肿瘤的脂质体，利用补体依赖毒性免疫靶向杀伤肿瘤细胞。
本发明提供了一种新型的磷脂类衍生化合物，其具有如式(I)所示的结构：
其中，R1选自如下的基团：
R2选自如下的基团：
其中，式(I)结构中的m为大于零的正整数；优选的，m的范围为1-500的正整数；更优选的，m的范围为1-40、40-50或50-500的正整数；更优选的，m的范围为20-40、40-50或50-150的正整数；最优选的，m为正整数45；
其中，R1基团中的R3选自H，Na，K，更优选为H；
其中，R2基团中的R4为一价阳离子，选自H+，Na+，K+，NH4 +，优选为NH4 +；
其中，R2基团中的n为10-20的正整数；优选的，n为正整数12，14或16；更优选的，n为正整数16；
其中，R2基团中的p和q各自为5-15的正整数；优选的，p和q各自为5-10的正整数；更优选的，p和q分别为正整数7。
优选的,式(I)选自如下结构的化合物：
(1)
(2)
式(I)的化合物是由PEG修饰的磷脂与叶酸或鼠李糖反应生成。其中，磷脂主体结构的如R2所示，优选的磷脂种类为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二-十二酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二-十四酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE),棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)。更优选的磷脂种类为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
修饰磷脂的聚乙二醇分子量优选为1000-200000道尔顿，优选为1000-50000道尔顿，更优选为2000-20000道尔顿。
将聚乙二醇修饰的磷脂与叶酸(Folate)或鼠李糖(Rhamnose)反应生成磷脂-PEG-Folate或磷脂-PEG-Rhamnose,其通式结构如式(I)所示。优选的，当所述的PEG分子量为2000时，通式中的m值为45。更优选的，当所述的磷脂为DSPE时，可以得到两种类型的具体化合物，1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－叶酸(DSPE-PEG-Folate)，1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－鼠李糖(DSPE-PEG-Rhamnose)。其中，优选的分子DSPE-PEG2000-Folate和DSPE-PEG2000-Rhamnose的结构式分别如(1)和(2)所述。
本发明的另一目的是提供一种磷脂-PEG-Folate分子的制备方法，所述方法包括如下的步骤：
(1)将叶酸与聚乙二醇修饰的磷脂在合适的溶剂及催化剂环境下反应；
(2)分离得到磷脂-PEG-Folate分子，该分子结构如式(I)所示：
其中，R1基团的结构如下所示：
R2选自如下的基团：
其中，式(I)结构中的m为大于零的正整数；优选的，m的范围为1-500的正整数；更优选的，m的范围为1-40、40-50或50-500的正整数；更优选的，m的范围为20-40、40-50或50-150的正整数最优选的，m为正整数45；
其中，R1基团中的R3选自H，Na，K，更优选为H；
其中，R2基团中的R4为一价阳离子，选自H+，Na+，K+，NH4 +，优选为NH4 +；
其中，R2基团中的n为10-20的正整数；优选的，n为正整数12，14或16；更优选的，n为整数16；
其中，R2基团中的p和q各自为5-15的正整数；优选的，p和q各自为5-10的正整数；更优选的，p和q分别为正整数7。
上述反应步骤(1)中，优选的PEG修饰的磷脂种类为DOPE-PEG-NH2，DLPE-PEG-NH2,DMPE-PEG-NH2,DSPE-PEG-NH2，POPC-PEG-NH2。更优选的PEG修饰的磷脂种类DOPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-NH2。修饰磷脂的聚乙二醇分子量优选为1000-200000道尔顿，优选为1000-50000道尔顿，更优选为2000-20000道尔顿。一种优选的PEG修饰的磷脂为DSPE-PEG2000-NH2。
上述反应步骤(1)中，所述合适的溶剂选自二甲亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一种或其混合物，优选为二甲亚砜(DMSO)。反应条件为将叶酸(Folate)溶解在DMSO中，再加入PEG修饰的磷脂(例如DSPE-PEG-NH2或DOPE-PEG-NH2)和吡啶。其中叶酸和PEG修饰的磷脂的摩尔比为1:1-20:1，优选为1:1-10:1，更优选为1:1-5:1。反应温度为0℃-45℃，优选为10℃-30℃，优选为室温环境。
上述反应步骤(1)中，所述合适的催化剂为常用缩合剂，如二环己基二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)等，更优选为二环己基碳二亚胺(DCC)。
上述反应步骤(2)中，反应完成后加热蒸发去除溶剂，加入水溶解，离心收取上清，透析后，冻干得到磷脂-PEG-Folate分子。
本发明的另一目的是提供一种磷脂-PEG-Rhamnose分子的制备方法，所述方法包括如下的步骤：
(1)将鼠李糖衍生物(RhaNBuacid)与聚乙二醇修饰的磷脂在合适的溶剂及催化剂环境下反应；其中，鼠李糖衍生物的结构
如下所示：
(2)分离得到磷脂-PEG-Rhamnose分子，其结构如式(I)所示：
其中，R1基团的结构如下所示：
R2选自如下的基团：
其中，式(I)结构中的m为大于零的正整数；优选的，m的范围为1-500的正整数；更优选的，m的范围为1-40、40-50或50-500的正整数；更优选的，m的范围为20-40、40-50或50-150的正整数；最优选的，m为正整数45；
其中，R1基团中的R3选自H，Na，K，更优选为H；
其中，R2基团中的R4为一价阳离子，选自H+，Na+，K+，NH4 +，优选为NH4 +；
其中，R2基团中的n为10-20的正整数；优选的，n为正整数12，14或16；更优选的，n为整数16；
其中，R2基团中的p和q各自为5-15的正整数；优选的，p和q各自为5-10的正整数；更优选的，p和q分别为正整数7。
上述反应步骤(1)中，优选的PEG修饰的磷脂种类为DOPE-PEG-NH2，DLPE-PEG-NH2,DMPE-PEG-NH2,DSPE-PEG-NH2,POPC-PEG-NH2。更优选的PEG修饰的磷脂种类DOPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-NH2。修饰磷脂的聚乙二醇分子量优选为1000-200000道尔顿，优选为1000-50000道尔顿，更优选为2000-20000道尔顿。一种优选的PEG修饰的磷脂为DSPE-PEG2000-NH2。
上述反应步骤(1)中，所述合适的溶剂选自二甲亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一种或其混合物，优选为二甲亚砜(DMSO)。反应条件为将RhaNBuacid溶解在DMSO中，再加入PEG修饰的磷脂(例如DSPE-PEG-NH2或DOPE-PEG-NH2)和吡啶。其中RhaNBuacid和PEG修饰的磷脂的摩尔比为1:1-20:1，优选为5:1-20:1，更优选为10:1-20:1。反应温度为0℃-45℃，优选为10℃-30℃，优选为室温环境。
上述反应步骤(1)中，所述合适的催化剂为常用缩合剂，如二环己基二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)等，更优选为二环己基碳二亚胺(DCC)。
上述反应步骤(2)中，反应完成后加热蒸发去除溶剂，加入水溶解，离心收取上清，透析后，冻干得到磷脂-PEG-Rhamnose分子。
上述反应中步骤(1)中，其中鼠李糖衍生物RhaNBuacid的合成过程如图2-2所示。具体为鼠李糖在酸酐和吡啶环境下使糖分子上的羟基乙酰化，然后在TMSN3和SnCl4环境下反应得到之后该化合物通过两步反应与琥珀酐生成之后在碱环境下脱去保护基团得到鼠李糖衍生物RhaNBuacid。
本发明的另一目的是提供一种含有式(I)所述磷脂类衍生物的脂质体药物组合物，其可用于靶向免疫治疗肿瘤，利用补体依赖毒性免疫靶向杀伤肿瘤细胞。
本发明所述的脂质体药物组合物，包含磷脂，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩尔比为100～1000：0.1～1:1～5000。优选的摩尔比为500～1000：0.5～1：100～5000，更优选的摩尔比为500～1000：1：100～5000，最优选的摩尔比为1000：1：100～3000。
上述药物组合物中，磷脂选自为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二-十二酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二-十四酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE),二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。优选的磷脂为DOPE和DOPC，更优选的磷脂为DOPE。
上述药物组合物中，磷脂-PEG-Folate分子优选为DOPE-PEG-Folate，DLPE-PEG-Folate,DMPE-PEG-Folate,DSPE-PEG-Folate。其中，PEG分子量优选为1000-200000道尔顿，优选为1000-50000道尔顿，更优选为2000-20000道尔顿。一种优选的磷脂-PEG-Folate分子为DSPE-PEG2000-Folate分子。
上述药物组合物中，磷脂-PEG-Rhamnose分子优选为DOPE-PEG-Rhamnose，DLPE-PEG-Rhamnose,DMPE-PEG-Rhamnose,DSPE-PEG-Rhamnose。其中，PEG分子量优选为1000-200000道尔顿，优选为1000-50000道尔顿，更优选为2000-20000道尔顿。一种优选的磷脂-PEG-Rhamnose分子为DSPE-PEG2000-Rhamnose分子。
胆固醇可调节磷脂双分子层膜的流动性，使膜通透性降低，减少药物渗漏。同时可使脂膜维持一定柔韧性，增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力。并对磷脂的氧化有一定保护作用。制备普通载药脂质体，胆固醇是必须的添加物，用量一般为胆固醇:磷脂＝0.3-1(摩尔比)。因磷脂(PC)和药物的不同，存在胆固醇的最佳用量。在一定范围内，脂质体的粒径、氧化稳定性、物理稳定性与胆固醇添加量成正相关，超出范围时，超过膜负荷，会造成部分脂质体破裂。另外，胆固醇的添加会对膜相变温度有一定影响，临界值以内使相变温度降低，临界值以上，使相变温度升高。如果不载药的话，可以选择不添加胆固醇。
作为本发明的一个优选的技术方案，本发明公开了一种脂质体药物组合物，包含磷脂，胆固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩尔比为100～1000：100～1000：0.1～1:1～5000。上述药物组合物中,磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩尔比优选为500～1000：500～1000：0.5～1：100～5000，更优选的摩尔比为500～1000：500～1000：1：100～5000，最优选的摩尔比为1000：1000：1：100～3000。
作为本发明的一个优选的技术方案，本发明公开了一种脂质体药物组合物，包含磷脂，胆固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩尔比为100～1000：100～1000：0.1～1:1～5000；其中所述的磷脂为DOPE，磷脂-PEG-Folate为DSPE-PEG-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose为DSPE-PEG-Rhamnose。
作为本发明的另一个优选的技术方案，本发明公开了一种脂质体药物组合物，包含磷脂，胆固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩尔比为500～1000：500～1000：1：100～3000；其中所述的磷脂为DOPE，磷脂-PEG-Folate为DSPE-PEG-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose为DSPE-PEG-Rhamnose。
作为本发明的另一个优选的技术方案，本发明公开了一种脂质体药物组合物，包含磷脂，胆固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩尔比为1000：1000：1：100～3000；其中所述的磷脂为DOPE，磷脂-PEG-Folate为DSPE-PEG2000-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose为DSPE-PEG2000-Rhamnose。
本发明脂质体组分中，通过优化DSPE-PEG-Rhamnose与DSPE-PEG-Folate的摩尔比，可使补体依赖的毒性达到最佳。例如，当DSPE-PEG2000-Rhamnose与DSPE-PEG2000-Folate的摩尔比为100：1，CDC％为20％；DSPE-PEG2000-Rhamnose与DSPE-PEG2000-Folate的摩尔比为1000：1，CDC％为29％；DSPE-PEG2000-Rhamnose与DSPE-PEG2000-Folate的摩尔比为2500：1，CDC％为58.5％。
优选的，上述的组合物中还可进一步包括附加剂，例如阳离子脂质体DOTMA或DOTAP，优选为DOTAP；其中，磷脂-PEG-Folate相对于阳离子脂质体的摩尔比为1:1-1:10，优选为1:2-1:6，更优选为1:4。
本发明提供的脂质体药物组合物粒径范围在80～200nm之间，Zeta电位值为|zeta电位|>30mV。制备靶向脂质体，作为本发明的重要改进与完善，本发明中所优化的脂质体浓度以叶酸的浓度来计算，并且其最佳工作浓度为10-7M。
本发明的另一目的是提供一种制备上述脂质体药物组合物方法，其包括如下的步骤：
(1)、取按摩尔比为1～5000的磷脂-PEG-Rhamnose，0.1～1的磷脂-PEG-Folate，100～1000的磷脂，加入适量有机溶剂，减压旋转蒸发除去有机溶媒，形成薄的均匀的脂质膜；
(2)加入pH范围6.0-8.5的缓冲液洗涤脂质膜，超声；
(3)将溶液通过薄膜挤压器反复挤压，得到粒径大小均匀的脂质体。
上述方法步骤(1)中，磷脂-PEG-Rhamnose，磷脂-PEG-Folate和磷脂的定义如前所述，其优选的摩尔比范围亦如前所述。
若脂质体组合物含有胆固醇，则步骤(1)为取按摩尔比为1～5000的磷脂-PEG-Rhamnose，0.1～1的磷脂-PEG-Folate，100～1000的磷脂，100～1000的胆固醇，加入适量有机溶剂，减压旋转蒸发除去有机溶媒，形成薄的均匀的脂质膜；
所述方法步骤(1)中，有机溶剂为二甲亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一种或其混合物，优选为氯仿和甲醇的混合液，其体积比氯仿：甲醇为1:1～10:1(V/V)，优选为9：1(V/V)。
所述方法步骤(2)中，缓冲液选自水溶液状态下pH值为6.0-8.5的缓冲液，例如PBS、HEPES、Hanks或者生理盐水，优选为PBS。
所述方法步骤(3)中，薄膜选自孔径大小为80nm～200nm多聚碳酸(PC)膜，优选为Whatman 200nm PC膜。脂质体多次通过挤出膜的过滤使单室脂质体的粒径呈正态分布，优选经过10-20次的反复挤压，最后获得的脂质体粒径大小为80nm～200nm。
作为一种优选的实施方案，本发明中具体的靶向脂质体制备方法如下：三种组分均溶解在氯仿/甲醇＝9：1的混合溶液中。称量配制母液为10-3M的DSPE-PEG2000-Folate，10-2M的DSPE-PEG2000-Rhamnose和10-1M的DOPE.按上述摩尔比，分别加入一定量体积的三种组分稀释在氯仿/甲醇＝9：1的混合溶液中。然后用旋转蒸发仪旋干，形成脂质膜后，通往一股氮气气流，真空避光旋干过液，第二天加入3g直径约2mm的干净玻璃珠和一定量pH 7.4的PBS再次通入一股氮气气流后，旋转洗涤脂质膜30分钟，接着水浴超声2分种，最后用200nm的多聚碳酸(PC)膜，挤出理想粒径大小的脂质体。
本发明的另一目的是提供了式(I)的化合物以及由式(I)的化合物制备得到的脂质体组合物在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。
本发明所制备的脂质体可以利用配体与受体高度特异性的亲和力，将带有叶酸和鼠李糖的脂质体准确地靶向到叶酸受体过表达的肿瘤细胞，相比于叶酸受体低表达的正常细胞，肿瘤细胞会利用高亲和力和多价效应使得细胞表面带上更多数量的鼠李糖抗原，该鼠李糖抗原会招募人体血清里面天然的鼠李糖抗体，从而结合补体系统中的C1q蛋白，进而启动了蛋白酶活性，形成攻膜复合物，最终导致肿瘤细胞的裂解。本发明获得的脂质体制剂能发挥高效的补体依赖毒性，可用于治疗多种实体瘤，例如卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等叶酸受体过表达的肿瘤，在体外实验中杀伤这些肿瘤细胞明显，更为重要的是在体内实验中也能够发挥显著作用，说明本发明所采用的策略制备脂质体，疗效可靠。本发明制备的脂质体制剂可经注射途径给药，如静脉、肌肉或皮下注射给药。
本发明技术与现有技术相比，本发明技术所用脂质体的量的数量级为10-7M，而相比现有技术包裹脂质体用药的数量级10-6M-10-3M，其用药量更少，生产更为廉价，浓度低、无需包封、稳定性更好；除此之外，本发明技术是利用人体天然糖抗体发挥补体毒性作用，因此，毒副作用更低；而且，本发明技术是针对癌细胞表面过表达的受体，要利用多价效应才能发挥作用，不针对正常细胞，所以靶向性更好；能够利用免疫小鼠进行活体实验，更加适用于临床研究和工业化生产。因此，若采用此技术开发新型肿瘤免疫靶向药物将会产生巨大的经济效益。
附图说明
图1：免疫靶向脂质体的设计策略图
图2-1：DSPE-PEG2000-Folate的合成路线图
图2-2：DSPE-PEG2000-Rhamnose的合成路线图
图3：实施例3中所获得的脂质体的粒径分布和zeta电位值
图4：实施例3中所获得的脂质体靶向性测定的激光共聚焦图
图5：体外实验中实施例3所获得的脂质体的补体依赖毒性
图6：实施例3所获得的脂质体在体内小鼠实验中发挥的CDC效应
具体实施方式
下面通过具体实例来详细阐述本发明。应当指出的是，以下所描述的实施例中采用的条件都不是孤立的，而是经过反复实验进行优化组合的。本发明的实施例只是作为一种示范，而不是作为本发明权利要求范围的限制。对于本领域的技术人员而言，基于本发明进行的适当修改或变通仍然属于本发明的保护范围之内。
实施例1：鼠李糖偶联的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺
精确称量40mg RhaNBuacid，溶解于0.78ml二甲基亚砜(DMSO)，再在此溶液当中加入27mg 1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－氨基(DSPE-PEG2000-NH2)和0.39ml吡啶(pyridine),接下来加入81mg二环已基碳二亚胺，室温反应4小时。形成雾状后的混合液通过旋转蒸发法去除吡啶，并加入10ml单蒸水。再通过离心收取上清，该上清用3000分子量的透析膜，50mM 2L盐溶液透析两次，2L去离子水透析三次，最后通过将透析物进行冻干得到白色固体的DSPE-PEG2000-Rhamnose。合成路线如图2-2所示。
实施例2：叶酸偶联的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺
精确称量79mg叶酸，溶解于2ml二甲基亚砜(DMSO)，再在此溶液当中加入50mg 1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－氨基(DSPE-PEG2000-NH2)和1ml吡啶(pyridine)，接下来加入96mg二环已基碳二亚胺，室温反应4小时。形成雾状后的混合液通过旋转蒸发法去除吡啶，并加入10ml单蒸水。再通过离心收取上清，该上清1000分子量的透析膜，50mM 2L盐溶液透析两次，2L去离子水透析三次，最后通过将透析物进行冻干得到黄色固体的DSPE-PEG2000-Folate。合成路线如图2-1所示。
实施例3：免疫靶向脂质体的制备
配制1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，实施例1所得鼠李糖偶联的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Rhamnose)，实施例2所得叶酸偶联的聚乙二醇二硬脂酸磷酸酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Folate)三种成分浓度分别为0.1M,0.01M和0.001M的母液，储存于-80℃。
取20μl DOPE,200μL DSPE-PEG2000-Rhamnose和2μl DSPE-PEG2000-Folate配成摩尔比为1000:1000:1的混合液(稀释于10ml氯仿/甲醇(9/1))中，并置于250ml洁净圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上以60转/分钟的速度进行旋干。旋转蒸发时，圆底烧瓶要浸于40℃水浴中，并且旋干出现均匀脂质膜以后继续旋干。15分钟后，圆底烧瓶离开水面，通入一股氮气气流后，将圆底烧瓶用锡箔纸进行避光，高真空下5转/分钟低速旋转过夜(一般14h)。第二天取下圆底烧瓶加入3g直径为2mm的玻璃珠和2ml PH7.4的PBS，再次通入一股氮气气流后，高真空下室温避光旋转洗涤脂质膜30分钟。接着将圆底烧瓶进行水浴超声2分钟后，吸出大多室脂质体，用mini-extruder(avanti polar lipid)通过200nm多聚碳酸膜(WhatmanPC membrane)来回至少11次，最终得到理想粒径的单室脂质体。其它比例的脂质体，只需改变DSPE-PEG2000-Rhamnose起始旋干时的母液体积(1000:500:1为100μl,1000:2500:1为500μl)。对照脂质体中不加入DSPE-PEG2000-Folate。
实施例4：脂质体的粒径和zeta电位的测定
将实施例3中所制备的脂质体取1μl用PBS稀释1000倍，用马尔文激光粒度仪进行粒径的测定；将实施例3中所制备的脂质体取1μl用去离子水稀释1000倍，用马尔文激光粒度仪进行zeta电位测定(图3)。
实施例5：脂质体靶向性的测定
进行细胞实验，首先将Hela细胞用含10％FBS无Folic acid 1640培养基传代5次得到FR+Hela细胞(叶酸受体过表达Hela细胞)。FR+Hela以40％的汇合度铺于24孔板中，贴壁后，用f-rha-lip,f-rha,f-lip,f-lip+rha四组脂质体孵育6h(脂质体的浓度用叶酸的浓度计算并且其孵育最终尝试为10-7M)。吸出脂质体,PBS洗涤2次，4％多聚甲醛(PFA)室温固定10分钟，PBS洗涤两次，1：200人血清中纯化的鼠李糖抗体和1：200兔源叶酸受体抗体室温孵育1h,再次用PBS洗涤两次，1：500AF488偶联的羊抗人抗体和1：500驴抗兔抗体室温孵育1h，PBS洗涤两次。最后用Hoechst33342室温染色10分钟，PBS洗涤两次后，在激光共聚焦显微镜下观察荧光(图4)带叶酸和鼠李糖的脂质体能够很好地靶向到叶酸受体过表达的肿瘤细胞(如FR+Hela,4T1)表面。
实施例6：免疫靶向脂质体药效的体外测定
首先培养FR+Hela细胞，以1×104cells/well的密度接种于96孔板中培养过夜，第二天每孔中加入脂质体孵育6小时，然后用100μl含20％人血清的无叶酸1640培养基替换旧培养基孵育2h,不加人血清的孔作为对照组，另外加入9％H2O2(用含20％人血清的无叶酸1640培养基进行稀释)的孔作为最大杀伤力(max killing)组，最后在每孔中加入100μlCell Titer Glo(Promega)，每组处理至少进行3次重复.室温振荡2分钟诱导细胞裂解，继续室温静止稳定10分钟，用Synergy H1(Bio Tek)测发光强度(图5)鼠李糖靶向脂质体能够很好地靶向到叶酸受体过表达的肿瘤细胞(如FR+Hela,4T1)并有效杀伤细胞，而且杀伤力会随着鼠李糖浓度的增加而增加。CDC％＝100％-(with human serum-max killing)/(without human serum-max killing)。
实施例7：免疫靶向脂质体药效的体内测定
进行免疫靶向脂质体药效的体内测定首先将五到六周大小的BALB/c小鼠，在两周内每次用30μg Rhamnose-BSA免疫三次。一周后将1×106小鼠乳腺癌4T1细胞接种于裸鼠中成瘤。共养15只小鼠，平均分成三组，分别用实施例3中制备的脂质体f-lip-rha,f-lip和PBS连续处理六周。在第十周对小鼠进行无痛致死处理并取出肿瘤。小鼠肿瘤大小用游标卡尺每两周测一次(图6)。用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长度×宽度2/2。
实施例8：含胆固醇的免疫靶向脂质体的制备
具体制备工艺参照实施例3所述的实验参数。其中，免疫靶向脂质体组合物包含胆固醇，组分中DOPE：胆固醇：DSPE-PEG2000-Rhamnose：DSPE-PEG2000-Folate的摩尔比为1000:1000：1000:1。最后获得的脂质体粒径大小为80nm～200nm。
实施例9：含胆固醇和阳离子脂质体DOTAP的免疫靶向脂质体的制备
具体制备工艺参照实施例3所述的实验参数。其中，免疫靶向脂质体组合物包含胆固醇和阳离子脂质体DOTAP，组分中DOPE：胆固醇：DSPE-PEG2000-Rhamnose：DSPE-PEG2000-Folate:DOTAP的摩尔比为1000:1000：1000:1:4。最后获得的脂质体粒径大小为80nm～200nm。
Claims (10)
1.一种磷脂类衍生化合物，其具有如式(I)所示的结构：
其中，R1选自如下的基团：
R2选自如下的基团：
其中，式(I)结构中的m为大于零的正整数；优选的，m的范围为1-500的正整数；更优选的，m的范围为1-40、40-50或50-500的正整数；更优选的，m的范围为20-40、40-50或50-150的正整数；最优选的，m为正整数45；
其中，R1基团中的R3选自H，Na，K，更优选为H；
其中，R2基团中的R4为一价阳离子，选自H+，Na+，K+，NH4 +，优选为NH4 +；
其中，R2基团中的n为10-20的正整数；优选的，n为正整数12，14或16；更优选的，n为正整数16；
其中，R2基团中的p和q各自为5-15的正整数；优选的，p和q各自为5-10的正整数；更优选的，p和q分别为正整数7。
2.根据权利要求1所述的磷脂类衍生化合物，其选自如(1)或(2)所示结构的化合物：
(1)
(2)
3.一种磷脂-PEG-Folate分子的制备方法，所述方法包括如下的步骤：
(1)将叶酸与聚乙二醇修饰的磷脂在合适的溶剂及催化剂环境下反应；
(2)分离得到磷脂-PEG-Folate分子，该分子结构如式(I)所示：
其中，R1基团的结构如下所示：
R2选自如下的基团：
其中，式(I)结构中的m为大于零的正整数；优选的，m的范围为1-500的正整数；更优选的，m的范围为1-40、40-50或50-500的正整数；更优选的，m的范围为20-40、40-50或50-150的正整数最优选的，m为正整数45；
其中，R1基团中的R3选自H，Na，K，更优选为H；
其中，R2基团中的R4为一价阳离子，选自H+，Na+，K+，NH4 +，优选为NH4 +；
其中，R2基团中的n为10-20的正整数；优选的，n为正整数12，14或16；更优选的，n为整数16；
其中，R2基团中的p和q各自为5-15的正整数；优选的，p和q各自为5-10的正整数；更优选的，p和q分别为正整数7。
4.一种磷脂-PEG-Rhamnose分子的制备方法，所述方法包括如下的步骤：
(1)将鼠李糖衍生物(RhaNBuacid)与聚乙二醇修饰的磷脂在合适的溶剂及催化剂环境下反应；其中，鼠李糖衍生物的结构如下所示：
(2)分离得到磷脂-PEG-Rhamnose分子，其结构如式(I)所示：
其中，R1基团的结构如下所示：
R2选自如下的基团：
其中，式(I)结构中的m为大于零的正整数；优选的，m的范围为1-500的正整数；更优选的，m的范围为1-40、40-50或50-500的正整数；更优选的，m的范围为20-40、40-50或50-150的正整数；最优选的，m为正整数45；
其中，R1基团中的R3选自H，Na，K，更优选为H；
其中，R2基团中的R4为一价阳离子，选自H+，Na+，K+，NH4 +，优选为NH4 +；
其中，R2基团中的n为10-20的正整数；优选的，n为正整数12，14或16；更优选的，n为整数16；
其中，R2基团中的p和q各自为5-15的正整数；优选的，p和q各自为5-10的正整数；更优选的，p和q分别为正整数7。
5.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，PEG修饰的磷脂种类为DOPE-PEG-NH2，DLPE-PEG-NH2,DMPE-PEG-NH2,DSPE-PEG-NH2,POPC-PEG-NH2。
6.一种脂质体药物组合物，包含磷脂，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩尔比为100～1000：0.1～1:1～5000。
7.一种脂质体药物组合物，包含磷脂，胆固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rhamnose的摩尔比为100～1000：100～1000：0.1～1:1～5000。
8.一种脂质体药物组合物，包含磷脂，胆固醇，磷脂-PEG-Folate和磷脂-PEG-Rhamnose，其中磷脂：胆固醇：磷脂-PEG-Folate：磷脂-PEG-Rha的摩尔比为100～1000：100～1000：0.1～1:1～5000；其中所述的磷脂为DOPE，磷脂-PEG-Folate为DSPE-PEG-Folate，磷脂-PEG-Rhamnose为DSPE-PEG-Rhamnose。
9.一种制备如权利要求6所述的脂质体药物组合物的方法，其包括如下的步骤：
(1)取按摩尔比为1～5000的磷脂-PEG-Rhamnose，0.1～1的磷脂-PEG-Folate，100～1000的磷脂，加入适量有机溶剂，减压旋转蒸发除去有机溶媒，形成薄的均匀的脂质膜；
(2)加入pH范围6.0-8.5的缓冲液洗涤脂质膜，超声；
(3)将溶液通过薄膜挤压器反复挤压，得到粒径大小均匀的脂质体。
10.权利要求1所述的式(I)化合物或由式(I)的化合物制备得到的脂质体组合物在用于制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。
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