CN104193779B - 一种pH敏感磷脂药用材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种pH敏感磷脂药用材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药用材料领域，提供了一种pH敏感磷脂药用材料，该材料的结构式为：上述结构式中，R1＝-CnH2n+1或-CnH2n，n＝11～17，

Description

一种pH敏感磷脂药用材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药用材料领域，特别涉及一种pH敏感磷脂药用材料及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤(简称癌)是危害人类生命健康的常见病、多发病。化疗是目前肿瘤治疗的主要手段之一。然而，传统抗癌药物制剂没有选择性，在杀死肿瘤细胞的同时也会杀死正常细胞，尤其是快速增殖的骨髓细胞，造成严重甚至致命的毒副作用。研究发现，肿瘤组织有异于正常组织的生物学特点，肿瘤细胞生长旺盛、代谢快，会产生大量的酸性产物，然而肿瘤脉管系统异常又无法及时清除酸性产物，导致肿瘤组织的pH值为5.5～6.8，低于正常组织的pH值(7.4)，肿瘤细胞内涵体的pH值为5.0～6.0，溶酶体的pH值为4.5～5.5。
磷脂为两亲性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水的长烃基链。磷脂分子的亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，常与蛋白质、糖脂、胆固醇等其它分子共同构成脂双分子层，即细胞膜的结构。磷脂也是脂质体双分子层的主要组成物质。根据肿瘤组织、正常组织以及细胞内pH值的差异，利用pH敏感磷脂制备的脂质体，可实现肿瘤的靶向治疗。
CN103585106A公开了一种pH敏感脂质体，由治疗药物、磷脂、表面活性剂、聚天冬氨酸和/或脂肪胺接枝的聚天冬氨酸组成。聚天冬氨酸或改性聚天冬氨酸可以响应外界pH值发生构象变化，从而控制治疗药物在不同pH值环境中的释放速度。CN102488658A公开了一种叶酸-羧甲基壳聚糖修饰的pH敏感紫杉醇纳米脂质体，由紫杉醇、卵磷脂、胆固醇、维生素E、叶酸-羧甲基壳聚糖和缓冲液组成，叶酸-羧甲基壳聚糖可响应外界pH值变化产生构象变化，从而控制紫杉醇在不同pH值(5.0～7.4)环境中具有不同的释放速度。虽然上述两种pH敏感脂质体能改变药物在正常组织和肿瘤组织中的释放速度，但无法改变载药脂质体在正常组织和肿瘤组织中的蓄积量，很难有效地改善抗癌药物的靶向性，降低抗癌药物对正常组织的毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种pH敏感磷脂药用材料及其制备方法与应用，所述药用材料具有良好的pH敏感性和电荷反转能力，使用该药用材料制备的载药脂质体能在肿瘤组织中靶向聚集，从而降低药物对正常组织的毒副作用。
本发明所述pH敏感磷脂药用材料的结构式为：
上述结构式中，R1＝-CnH2n+1，n＝11～17，a＝0，1，2，b＝0，1，2。
本发明所述pH敏感磷脂药用材料的结构式优选为，(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸)，(二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二乙基马来酸)，(1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2-甲基-3-乙基马来酸)，(二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-柠康酸)，或者
(二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸)。
本发明所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，步骤如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
以带保护基赖氨酸、缩合剂、有机碱和磷脂酰乙醇胺为原料，带保护基赖氨酸与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(0.1～10):1，缩合剂与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(1～10):1，有机碱与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(0.1～10):1；
将磷脂酰乙醇胺、带保护基赖氨酸、缩合剂和有机碱加入溶剂中形成混合液，在0～30℃、氮气保护下搅拌反应24～48h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入沉淀剂并进行重结晶，重结晶完成后进行固液分离，将所得固态产物进行洗涤除去未反应的原料及副产物后真空干燥即得带保护基赖氨酸修饰磷脂；所述溶剂的量应使混合液中磷脂酰乙醇胺的浓度为1～100mmol/L；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得带保护基赖氨酸修饰磷脂溶解在溶剂中形成溶液，然后向所述溶液中加入脱保护剂，在氮气保护下于室温搅拌反应1～3h，反应时间届满后减压蒸发除去溶剂，将所得固态产物洗涤后真空干燥即得赖氨酸修饰磷脂；所述溶剂的量应使溶液中带保护基赖氨酸修饰磷脂的浓度为5～50mmol/L，脱保护剂与带保护基赖氨酸修饰磷脂的摩尔比为(10～20):1；
或者将步骤(1)所得带保护基赖氨酸修饰磷脂和钯碳加入溶剂中形成混合液，在通入氢气的条件下于室温搅拌反应1～5h，反应时间届满后过滤除去钯碳，将滤液减压蒸发除去溶剂，将所得固态产物洗涤后真空干燥即得赖氨酸修饰磷脂；所述带保护基赖氨酸修饰磷脂与脱保护剂的摩尔比1:(1～10)，所述溶剂的量应使混合液中带保护基赖氨酸修饰磷脂的浓度为1～100mmol/L；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
以酸酐、三乙胺和步骤(2)所得赖氨酸修饰磷脂为原料，酸酐与赖氨酸修饰磷脂的摩尔比为(1～10):1，三乙胺与赖氨酸修饰磷脂的摩尔比为(1～10):1；
在0～30℃、氮气保护下将赖氨酸修饰磷脂、酸酐、三乙胺加入溶剂中形成混合液，搅拌反应24～48h，然后将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入沉淀剂并进行重结晶，重结晶完成后，固液分离，将所得固态产物进行洗涤去除未反应的原料及副产物后真空干燥即得pH敏感磷脂药用材料；所述溶剂的量应使混合液中赖氨酸修饰磷脂的浓度为1～100mmol/L；
所述溶剂为氯仿、二氯甲烷或者N,N-二甲基甲酰胺，所述沉淀剂为丙酮、无水乙醚或者石油醚。
上述方法中，所述磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺中的任意一种。
上述方法中，所述带保护基赖氨酸为双叔丁氧羰基-L-赖氨酸、双芴甲氧羰基-L-赖氨酸、双苄氧羰基-L-赖氨酸中的任意一种。
上述方法中，所述酸酐为2,3-二甲基马来酸酐、2,3-二乙基马来酸酐、2-甲基-3-乙基马来酸酐、2-乙基-3-甲基马来酸酐、柠康酸酐中的任意一种。
上述方法中，所述缩合剂为环己基碳化二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的至少一种。
上述方法中，所述有机碱为4-二甲氨基吡啶或者二异丙基乙胺。
上述方法中，所述脱保护剂为三氟醋酸、哌啶或者吗啉。
上述方法的步骤(1)和步骤(3)中的重结晶操作在0～6℃进行。
本发明还提供了一种上述pH敏感磷脂药用材料在制备载药脂质体中的应用，所载药物主要为抗肿瘤药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种新的pH敏感磷脂药用材料，由于该材料的一端带羧基，在弱碱性介质中显负电荷、稳定性高，在弱酸性或酸性介质中该材料中的酰胺键极易断裂，暴露出氨基而显正电荷，具有良好的pH敏感性和电荷反转能力(见实施例7)。
2.由于本发明所述pH敏感磷脂药用材料在弱碱性的血液中(pH＝7.4)显负电荷，以该材料为主要成分制备的载药脂质体在血液循环系统中也显负电荷，因而所述载药脂质体在血液循环系统中与带负电荷的血浆蛋白会相互排斥而不易被正常组织摄取，在体内的循环时间长；由于肿瘤组织呈弱酸性，载药脂质体在肿瘤组织中显正电荷，因而所述载药脂质体极易与带负电荷的肿瘤细胞膜发生静电吸引而被肿瘤细胞摄取，因此所述载药脂质体具有良好的靶向聚集能力，从而能够降低药物，特别是抗癌药物对正常组织的毒副作用。
3.由于以本发明所述pH敏感磷脂药用材料制备的载药脂质体具有长循环的特点(见实施例9)，又因为肿瘤血管壁上皮细胞间隙比正常血管壁的更大，因此，载药脂质体在体内的循环时间长有利于载药脂质体从肿瘤血管渗出，从而提高其被肿瘤细胞摄取的几率。
4.由于本发明所述pH敏感磷脂药用材料以生物相容性好的磷脂酰乙醇胺和赖氨酸等原料制备而成，因此该药用材料具有良好的生物相容性，无细胞毒性(见实施例6)。
5.本发明还提供了一种pH敏感磷脂药用材料的制备方法，该方法操作简单，工艺条件温和，采用常规设备即可实现。
附图说明
图1是实施例1制备的pH敏感磷脂药用材料的核磁氢谱图；
图2是实施例1制备的pH敏感磷脂药用材料的质谱图；
图3是实施例1～5制备的pH敏感磷脂药用材料的细胞毒性测试结果；
图4是实施例7制备的脂质体在不同pH值条件下的zeta电位测试结果；
图5是实施例8中紫杉醇在不同组织中的分布情况。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明所述pH敏感磷脂药用材料及其制备方法与应用作进一步说明。下述各实施例中，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺购买自上海艾韦特医药科技有限公司。所述双叔丁氧羰基-L-赖氨酸、双芴甲氧羰基-L-赖氨酸、双苄氧羰基-L-赖氨酸购买自吉尔生化(上海)有限公司。
实施例1
本实施例中，所述pH敏感磷脂药用材料为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸，其结构式为：
其制备方法如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
按照双叔丁氧羰基-L-赖氨酸(BOC-Lys-(BOC)-OH)、缩合剂[等摩尔的1-羟基苯并三唑(HOBT)与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)]、二异丙基乙胺(DIPEA)与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)的摩尔比分别为1.5:1、3:1、6:1计量BOC-Lys-(BOC)-OH、HOBT、HBTU、DIPEA和DSPE；
将BOC-Lys-(BOC)-OH、HOBT、HBTU、DIPEA和DSPE加入氯仿中形成混合液，氯仿的量应使混合液中DSPE的浓度为1mmol/L，在常压、0℃、氮气保护下以52rpm的转速搅拌反应24h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入丙酮并静置于4℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后减压抽滤，用4℃的丙酮洗涤滤饼以除去未反应的原料及副产物，将洗涤后的产物真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双叔丁氧羰基赖氨酸；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双叔丁氧羰基赖氨酸溶解在二氯甲烷中形成溶液，使溶液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双叔丁氧羰基赖氨酸的浓度为10mmol/L，然后在冰浴条件下缓慢加入三氟醋酸，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-双叔丁氧羰基赖氨酸与三氟醋酸的摩尔比为1:10，然后在常压、室温、氮气保护下以52rpm的转速搅拌反应1h，减压旋转蒸发除去二氯甲烷，再用无水乙醚洗涤所得固态产物并将其真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
按照2,3-二甲基马来酸酐、三乙胺与步骤(2)所得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的摩尔比分别为10:1、10:1计量2,3-二甲基马来酸酐、三乙胺与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
将上述原料加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的浓度为10mmol/L，在常压、10℃、氮气保护下以52rpm的转速搅拌反应24h，将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入丙酮并静置于4℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后，减压抽滤，用丙酮洗涤滤饼以去除未反应的原料及副产物，真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸，其核磁氢谱图见图1，质谱图见图2。
实施例2
本实施例中，所述pH敏感磷脂药用材料为二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二乙基马来酸，其结构式为：
其制备方法如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
按照双芴甲氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH)、环己基碳化二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的摩尔比分别为0.1:1、1:1、1:1计量Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH、DCC、DMAP和DOPE；
将Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH、DCC、DMAP和DOPE加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中DOPE的浓度为10mmol/L，在常压、20℃、氮气保护下以40rpm的转速搅拌反应36h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入无水乙醚并静置于4℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后减压抽滤，用4℃的无水乙醚洗涤滤饼以除去未反应的原料以及副产物，将洗涤后的产物真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二油酰磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得二油酰磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中形成溶液，使溶液中二油酰磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸的浓度为50mmol/L，然后缓慢加入哌啶，二油酰磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸与哌啶的摩尔比为1:20，然后在常压、室温、氮气保护下以40rpm的转速搅拌反应3h，减压旋转蒸发除去N,N-二甲基甲酰胺，再用无水乙醚洗涤所得固态产物并将其真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
按照2,3-二乙基马来酸酐、三乙胺与步骤(2)所得二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的摩尔比分别为5:1、10:1计量2,3-二乙基马来酸酐、三乙胺与二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
将上述原料加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的浓度为50mmol/L，在常压、0℃、氮气保护下以40rpm的转速搅拌反应48h，然后将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入无水乙醚并静置于0℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后，减压抽滤，用无水乙醚洗涤滤饼以去除未反应的原料及副产物，真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二油酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二乙基马来酸。
实施例3
本实施例中，所述pH敏感磷脂药用材料为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2-甲基-3-乙基马来酸，其结构式为：
其制备方法如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
按照双苄氧羰基-L-赖氨酸(Z-Lys(Z)-OH)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)与1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)的摩尔比分别为10:1、10:1、10:1计量Z-Lys(Z)-OH、DIC、DMAP和POPE；
将Z-Lys(Z)-OH、DIC、DMAP和POPE加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中POPE的浓度为50mmol/L，在常压、0℃、氮气保护下以60rpm的转速搅拌反应48h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入丙酮并静置于0℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后减压抽滤，用0℃的丙酮洗涤滤饼以除去未反应的原料以及副产物，将洗涤后的产物真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-双苄氧羰基赖氨酸；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-双苄氧羰基赖氨酸与钯碳按照1:1的摩尔比加入氯仿中形成混合液，氯仿的量应使混合液中1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-双苄氧羰基赖氨酸的浓度为100mmol/L，然后在在常压、室温、通入氢气的条件下以60rpm的转速搅拌反应5h，过滤除去钯碳，减压旋转蒸发除去氯仿，用无水乙醚洗涤所得固态产物并将其真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温)即得1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
按照2-甲基-3-乙基马来酸酐、三乙胺与步骤(2)所得1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的摩尔比分别为10:1、10:1计量2-甲基-3-乙基马来酸酐、三乙胺与1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
将上述原料加入N,N-二甲基甲酰胺中形成混合液，N,N-二甲基甲酰胺的量应使混合液中1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的浓度为100mmol/L，在常压、30℃、氮气保护下以60rpm的转速搅拌反应24h，然后将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入无水乙醚并在6℃进行重结晶，重结晶完成后，减压抽滤，用无水乙醚洗涤滤饼以去除未反应的原料及副产物，真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2-甲基-3-乙基马来酸。
实施例4
本实施例中，所述pH敏感磷脂药用材料为二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-柠康酸，其结构式为：
其制备方法如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
按照双芴甲氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH)、环己基碳化二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)与二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)的摩尔比分别为0.5:1、5:1、0.2:1计量Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH、DCC、DMAP和DLPE；
将Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH、DCC、DMAP和DLPE加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中DLPE的浓度为100mmol/L，在常压、30℃、氮气保护下以50rpm的转速搅拌反应24h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入丙酮在6℃进行重结晶，重结晶完成后减压抽滤，用4℃的丙酮洗涤滤饼以除去未反应的原料以及副产物，将洗涤后的产物真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二月桂酰磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸溶解在二氯甲烷中形成溶液，使溶液中二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸的浓度为5mmol/L，然后缓慢加入哌啶，二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-双芴甲氧羰基赖氨酸与哌啶的摩尔比为1:15，然后在常压、室温、氮气保护下以50rpm的转速搅拌反应3h，减压旋转蒸发除去二氯甲烷，再用丙酮洗涤所得固态产物并将其真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
按照柠康酸酐、三乙胺与步骤(2)所得二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的摩尔比分别为8:1、8:1计量2-乙基-3-甲基马来酸酐、三乙胺与二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
将上述原料加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的浓度为20mmol/L，在常压、20℃、氮气保护下以50rpm的转速搅拌反应36h，然后将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入石油醚并静置于4℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后，减压抽滤，用石油醚洗涤滤饼以去除未反应的原料及副产物，真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温)即得二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-柠康酸。
实施例5
本实施例中，所述pH敏感磷脂药用材料为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸，其结构式为：
其制备方法如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
按照双苄氧羰基-L-赖氨酸(Z-Lys(Z)-OH)、1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)与二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)的摩尔比分别为2:1、2:1、0.1:1计量Z-Lys(Z)-OH、EDC、DMAP和DMPE；
将Z-Lys(Z)-OH、EDC、DMAP和DMPE加入二氯甲烷中形成混合液，二氯甲烷的量应使混合液中DMPE的浓度为5mmol/L，在常压、0℃、氮气保护下以50rpm的转速搅拌反应24h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入石油醚并静置于4℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后减压抽滤，用4℃的石油醚洗涤滤饼以除去未反应的原料以及副产物，将洗涤后的产物真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温)即得二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-双苄氧羰基赖氨酸；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-双苄氧羰基赖氨酸与钯碳按照1:10的摩尔比加入氯仿中形成混合液，氯仿的量应使混合液中二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-双苄氧羰基赖氨酸的浓度为1mmol/L，然后在在常压、室温、通入氢气的条件下以50rpm的转速搅拌反应1h，过滤除去钯碳，减压旋转蒸发除去氯仿，用无水乙醚洗涤所得固态产物并将其真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
按照2,3-二甲基马来酸酐、三乙胺与步骤(2)所得二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的摩尔比分别为1:1、1:1计量2,3-二甲基马来酸酐、三乙胺与二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸；
将上述原料加入N,N-二甲基甲酰胺中形成混合液，N,N-二甲基甲酰胺的量应使混合液中二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸的浓度为1mmol/L，在常压、0℃、氮气保护下以50rpm的转速搅拌反应24h，然后将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入石油醚并静置于4℃冰箱中进行重结晶，重结晶完成后，减压抽滤，用石油醚洗涤滤饼以去除未反应的原料及副产物，真空干燥(负压0.1MPa，干燥温度为室温，干燥时间为12h)即得二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸。
实施例6
将密度为1×105个/mL的L929细胞(购自中国科学院细胞库)悬液接种于96孔培养板内，每孔接种0.1mL，然后向每孔加入0.1mL完全培养基(DMEM培养基+10％胎牛血清+100mg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。然后分别将实施例1～5所制备的pH敏感磷脂药用材料用完全培养基稀释作为试验组，使pH敏感磷脂药用材料的终浓度分别为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.30mg/mL和0.50mg/mL。以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，于48h弃去上清液，以PBS缓冲液(135mMNaCl,2.7mMKCl,1.5mMKH2PO4,8mMK2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200μLPBS缓冲液，再加入20μL5mg/mL的MTT溶液(MTT溶液的配制方法：将0.5gMTT溶于100mLPBS缓冲液中得到)，继续培养4h，继后吸尽上清液，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定波长为570nm处的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的细胞存活率。细胞毒性试验结果见图3，从图3可以看出，实施例1～5制备的pH敏感磷脂药用材料均无明显细胞毒性。
实施例7
将实施例1制备的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-二甲基马来酸10mg、大豆磷脂10mg以及胆固醇3mg溶于50mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜。然后加入10mL去离子水，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，得到脂质体溶液。取所述脂质体溶液4份，每份1mL，分别用pH值为7.4、6.5的PBS缓冲液，pH值为5.5、4.5的醋酸盐缓冲液稀释至10mL。采用马尔文激光粒度仪，分别于上述脂质体溶液稀释完毕后的第0，1，2，4，8h取上述不同4种用不同pH值缓冲液稀释后的脂质体溶液1mL检测zeta电位。zeta电位测试结果如图4，从图4可知，脂质体在pH值为7.4的条件下，一直显负电荷；在pH值为6.8的条件下，1小时内，电荷由负变为正；在pH值为5.5和pH值为4.5的条件下，始终显正电荷。
实施例8
将实施例1制备的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-二甲基马来酸10mg、大豆磷脂10mg、胆固醇3mg和紫杉醇10mg溶于50mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的紫杉醇，所得上清液即为载紫杉醇的pH敏感脂质体。
将大豆磷脂20mg、胆固醇3mg和紫杉醇10mg溶于50mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的紫杉醇，所得上清液即为普通紫杉醇脂质体。
对12只BALB/c小鼠(购自四川大学动物实验中心,体重18～22g)皮下接种鼠源乳腺癌细胞4T1(购自中国科学院细胞库)，接种量为1×106细胞/只。皮下接种4T1的一周后，将12只BALB/c小鼠随机分为两组，每组6只，命名为第一组和第二组，对第一组BALB/c小鼠尾静脉注射载紫杉醇的pH敏感脂质体，对第二组BALB/c小鼠尾静脉注射普通紫杉醇脂质体，给药剂量均为5mg/kg。尾静脉注射8h后，处死BALB/c小鼠，分别取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，首先进行组织匀浆，然后定量加入甲醇提取其中的紫杉醇，最后采用高效液相方法检测紫杉醇的含量，检测条件为：安捷伦ODS3色谱柱(250×4.6mm,5μm,Agilent,USA)，检测波长为227nm，流动相为甲醇-水(50:50,v/v)，流速为1.5mL/min。紫杉醇在第一组和第二组BALB/c小鼠的不同组织中的分布情况见图5，从图5可知，使用本发明所述pH敏感磷脂药用材料制备的载药脂质体与普通载药脂质体相比，本发明所述pH敏感磷脂药用材料制备的载药脂质体具有更好的肿瘤靶向性，并且，第一组BALB/c小鼠各组织中紫杉醇的含量明显高于第二组，这说明采用本发明的pH敏感磷脂药用材料制备的载药脂质体，可以降低药物的使用剂量，进一步减小药物的毒副作用。
实施例9
将实施例1制备的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-二甲基马来酸10mg、大豆磷脂10mg、胆固醇3mg和紫杉醇10mg溶于50mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的紫杉醇，所得上清液即为载紫杉醇的pH敏感脂质体。
将大豆磷脂20mg、胆固醇3mg和紫杉醇10mg溶于50mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的紫杉醇，所得上清液即为普通紫杉醇脂质体。
将12只Wistar大鼠(购自四川大学动物实验中心)随机分为两组，每组分别尾静脉注射载紫杉醇的pH敏感脂质体和普通载药脂质体，给药剂量为5mg/kg。分别于尾静脉注射给药后的第5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h，通过尾静脉取血，然后采用高效液相法检测药物浓度。采用DAS药动学软件计算药物生物半衰期(t1/2)。载紫杉醇的pH敏感脂质体的t1/2为13.9h，普通紫杉醇脂质体的t1/2为1.2h。由此可见，本发明所述pH敏感磷脂药用材料制备的载药脂质体具有长循环的特点。

Claims (10)

1.一种pH敏感磷脂药用材料，其特征在于该材料的结构式为：
上述结构式中，R1＝-CnH2n+1，n＝11～17，a＝0，1，2，b＝0，1，2。
2.权利要求1所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)磷脂酰乙醇胺与带保护基赖氨酸的酰胺化反应
以带保护基赖氨酸、缩合剂、有机碱和磷脂酰乙醇胺为原料，带保护基赖氨酸与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(0.1～10):1，缩合剂与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(1～10):1，有机碱与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(0.1～10):1；
将磷脂酰乙醇胺、带保护基赖氨酸、缩合剂和有机碱加入溶剂中形成混合液，在0～30℃、氮气保护下搅拌反应24～48h，然后将反应液过滤并浓缩滤液，向浓缩后的滤液中加入沉淀剂并进行重结晶，重结晶完成后进行固液分离，将所得固态产物进行洗涤除去未反应的原料及副产物后真空干燥即得带保护基赖氨酸修饰磷脂；所述溶剂的量应使磷脂酰乙醇胺在混合液中的浓度为1～100mmol/L；
(2)带保护基赖氨酸修饰磷脂脱去保护基反应
将步骤(1)所得带保护基赖氨酸修饰磷脂溶解在溶剂中形成溶液，然后向所述溶液中加入脱保护剂，在氮气保护下于室温搅拌反应1～3h，反应时间届满后减压蒸发除去溶剂，将所得固态产物洗涤后真空干燥即得赖氨酸修饰磷脂；所述溶剂的量应使溶液中带保护基赖氨酸修饰磷脂的浓度为5～50mmol/L，脱保护剂与带保护基赖氨酸修饰磷脂的摩尔比为(10～20):1；
或者将步骤(1)所得带保护基赖氨酸修饰磷脂和钯碳加入溶剂中形成混合液，在通入氢气的条件下于室温搅拌反应1～5h，反应时间届满后过滤除去钯碳，将滤液减压蒸发除去溶剂，将所得固态产物洗涤后真空干燥即得赖氨酸修饰磷脂；所述带保护基赖氨酸修饰磷脂与脱保护剂的摩尔比1:(1～10)，所述溶剂的量应使混合液中带保护基赖氨酸修饰磷脂的浓度为1～100mmol/L；
(3)赖氨酸修饰磷脂与酸酐的酰胺化反应
以酸酐、三乙胺和步骤(2)所得赖氨酸修饰磷脂为原料，酸酐与赖氨酸修饰磷脂的摩尔比为(1～10):1，三乙胺与赖氨酸修饰磷脂的摩尔比为(1～10):1；
将赖氨酸修饰磷脂、酸酐、三乙胺加入溶剂中，在0～30℃、氮气保护下搅拌反应24～48h，然后将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入沉淀剂并进行重结晶，重结晶完成后，固液分离，将所得固态产物进行洗涤去除未反应的原料及副产物后真空干燥即得pH敏感磷脂药用材料；所述溶剂的量应使赖氨酸修饰磷脂的浓度为1～100mmol/L；
所述溶剂为氯仿、二氯甲烷或者N,N-二甲基甲酰胺，所述沉淀剂为丙酮、无水乙醚或者石油醚。
3.根据权利要求2所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺中的任意一种。
4.根据权利要求2或3所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述带保护基赖氨酸为双叔丁氧羰基-L-赖氨酸、双芴甲氧羰基-L-赖氨酸、双苄氧羰基-L-赖氨酸中的任意一种。
5.根据权利要求2或3所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述酸酐为2,3-二甲基马来酸酐、2,3-二乙基马来酸酐、2-甲基-3-乙基马来酸酐、2-乙基-3-甲基马来酸酐、柠康酸酐中的任意一种。
6.根据权利要求2或3所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述缩合剂为环己基碳化二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的至少一种。
7.根据权利要求2或3所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述有机碱为4-二甲氨基吡啶或者二异丙基乙胺。
8.根据权利要求2或3所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述脱保护剂为三氟醋酸、哌啶或者吗啉。
9.根据权利要求2或3所述pH敏感磷脂药用材料的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(3)中的重结晶操作在0～6℃进行。
10.权利要求1所述pH敏感磷脂药用材料在制备载药脂质体中的应用。
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