CN104784153A

CN104784153A - 一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用

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Publication number: CN104784153A
Application number: CN201510211769.2A
Authority: CN
Inventors: 刘芬菊; 华松; 俞家华; 华道本; 周媛; 张昊文
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104784153B

Abstract

本发明公开了一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用。具体而言，本发明的纳米颗粒通过包括如下步骤的方法制得：1）包含叶酸、脱水缩合剂和缩合促进剂的混合溶液的制备；2）叶酸在磺酸甜菜碱-壳聚糖上的接枝；以及3）纳米颗粒的透析和冻干。本发明提供的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒具有良好的生物相容性和生物可降解性以及较强的抗蛋白吸附性能。另外，由于叶酸接枝的引入，本发明的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒可以使其中包裹的化疗药物靶向于叶酸受体高表达的肿瘤细胞，提高了治疗效率。

Description

一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于具有肿瘤靶向作用的纳米颗粒制剂领域，具体涉及一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

化学治疗（chemotherapy）作为癌症治疗的重要手段之一，长期以来一直受到高度关注。从1946年氮芥的临床应用至今，肿瘤的化疗应用得到了近70年的发展。然而，到目前为止，仅有少部分恶性肿瘤如恶性淋巴瘤、绒毛膜上皮癌等有可能通过化疗得到治愈，90%以上的恶性肿瘤仍未能达到满意的疗效。许多抗肿瘤药物所存在的临床疗效低下、特异性差、毒副作用大等问题已经成为癌症化疗中的瓶颈。由于无法控制抗肿瘤药物集中于肿瘤部位，病人的正常组织和器官通常会受到不必要的伤害，甚至威胁到患者的生命。

近年来，利用纳米载体负载抗肿瘤药物的方法，不仅可以提高药物溶解度、增加药物稳定性以及实现药物缓释，还能够借助其特殊的尺寸范围和表面性质大幅度地改变药物在体内的分布和代谢状况，增强药物对肿瘤血管壁的渗透并在肿瘤部位富集（EPR效应），延长药物在肿瘤部位的作用时间。此外，经靶向分子修饰的纳米颗粒可以通过主动靶向提高肿瘤细胞对药物的摄取，实现药物特异性输送到肿瘤部位，在提高治疗效果的同时减轻对其他脏器的伤害，已成为研究的热点与重点。

叶酸（Folic Acid，FA）是一种小分子水溶性维生素，肿瘤细胞会通过主动运输来摄取微环境中的叶酸，以便维持过度活跃的新陈代谢作用，因此在大部分肿瘤细胞表面均存在过量表达的叶酸受体，而正常细胞表面上的叶酸受体表达量很少。研究表明，将叶酸分子连接在纳米载体表面，可以提高叶酸受体高表达的肿瘤细胞对纳米载药体系的吞噬，实现纳米载体所负载的抗肿瘤药物对肿瘤细胞的靶向输送。

通过查阅相关文献可以发现，虽然目前已有多项专利公开了以叶酸为靶向分子的靶向纳米药物载体，但是合成叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒作为药物载体用于抗肿瘤药物输送与肿瘤靶向治疗的研究尚未见报道。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的在于提供一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明利用某些肿瘤细胞表面叶酸受体高表达这一特点，将其配体叶酸嫁接在磺酸甜菜碱-壳聚糖上面，合成出一种两亲性纳米颗粒。在水溶液中，上述两亲性纳米颗粒可以包裹一些疏水性小分子化疗药物如紫杉醇、依托泊苷、他莫昔芬等。相对于单纯的化疗药物，本发明的载药纳米颗粒具有良好的药物缓释效果以及较高的药物溶解度和稳定性，可以在血液里发挥长循环作用，而且对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑制效果，可用于癌细胞的靶向治疗。

为了实现上述目的，本发明提供了一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒的制备方法。首先，在大剂量γ射线的照射下，通过自由基间的聚合反应把一个含有两性离子的小分子亲水性化合物——磺酸甜菜碱（SBMA）嫁接在壳聚糖表面，这样就会形成一个两亲性的纳米颗粒；然后，在脱水缩合剂（EDC、DCC或DIC）和缩合促进剂（NHS、DMAP或HoBt）的参与下，采用酰胺化反应把叶酸（FA）接枝到磺酸甜菜碱-壳聚糖（Cs-g-PSBMA）骨架上，最终得到用于负载活性药物的叶酸-磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒（Cs-g-PSBMA-FA），其结构如图1所示。

具体而言，该制备方法包括如下步骤：

1）混合溶液的制备：按照叶酸:脱水缩合剂:缩合促进剂=1:1~1.2:1~1.2的摩尔比，将上述反应物加入到无水溶剂中，在室温条件下搅拌至溶解，得到混合溶液；

2）叶酸的接枝：按照叶酸中的羧基:壳聚糖中的氨基=1:1的摩尔比，将步骤1）中得到的混合溶液缓慢加入到磺酸甜菜碱-壳聚糖水溶液中，在室温、避光条件下搅拌16~24h，得到叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒水溶液；

3）透析和冻干：将步骤2）中得到的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒水溶液置于透析袋中，首先用碱液透析12~18h，再用去离子水透析24~48h，将得到的透析液在12000~14000rpm下离心40~60min，最后将上清液冷冻干燥，得到叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒。

优选的，步骤1）中所述叶酸、脱水缩合剂、缩合促进剂之间的摩尔比为1:1:1。

优选的，步骤1）中所述脱水缩合剂为碳二亚胺类化合物，用于活化羧基，促使酰胺的生成，其选自N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）中的任意一种，优选N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐。

优选的，步骤1）中所述缩合促进剂为N-羟基类化合物，可以提高酰胺化反应的产率，减少副反应的发生，其选自N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-羟基苯并三氮唑（HOBT）、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）中的任意一种，优选N-羟基琥珀酰亚胺。

优选的，步骤1）中所述溶剂选自二甲基亚砜（DMSO）、乙醇、甲醇中的任意一种，优选二甲基亚砜。

优选的，步骤2）中所述磺酸甜菜碱-壳聚糖通过下法制得：首先，按照1:1:5~6的重量比，将壳聚糖、磺酸甜菜碱和RAFT试剂溶解在含有1%盐酸和丙酮的混合溶液中，惰性气体除氧后密封，暴露在辐射剂量为10Gy/min的⁶⁰Co源下反应15~20h；其次，将反应物置于截留分子量为25000Da的透析袋中，用去离子水透析48~72h，得到留在透析袋中的磺酸甜菜碱-壳聚糖水溶液；最后，将得到的水溶液于-20℃预冻6~8h，然后冷冻干燥36~48h，得到两亲性纳米颗粒磺酸甜菜碱-壳聚糖；

其中：

所述壳聚糖的脱乙酰度为95.2%，平均分子量为50000g/mol；

所述磺酸甜菜碱为3-[N,N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基)乙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐，CAS号为3637-26-1，结构式如下所示：

；

所述RAFT试剂为S,S’-二(R,R’-二甲基-R’’-乙酸)三硫代碳酸酯（BDACT）；

所述含有1%盐酸和丙酮的混合溶液中1%盐酸和丙酮的体积比为7:3；

所述惰性气体选自氮气、氦气、氩气中的任意一种，优选氩气。

优选的，步骤3）中所述透析袋的截留分子量为3500Da。

优选的，步骤3）中所述碱液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的任意一种的水溶液，其摩尔浓度为0.01mM。

另一方面，本发明提供了根据上述制备方法制备的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒。

另一方面，本发明提供了上述叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒的医药应用，特别是在制备肿瘤靶向药物中的应用。本发明的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒可以通过包裹的性质与疏水性小分子药物进行组装，以便实现缓释效果并提高药物的溶解度和稳定性。

具体而言，本发明提供了一种包裹抗肿瘤药物的肿瘤靶向纳米颗粒的制备方法，其包括如下步骤：

A）纳米颗粒预混液的制备：按照1mg叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒:0.5~2ml水的比例，将叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒溶解于水中，搅拌均匀后，得到纳米颗粒预混液；

B）抗肿瘤药物预混液的制备：按照1mg抗肿瘤药物:0.2~1ml有机溶剂的比例，将抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中，超声处理后，得到抗肿瘤药物预混液；

C）混合包裹及冻干：将两种预混液混合并振荡，向混合液中通入惰性气体后，将混合液离心，并将离心后的残留固体冷冻干燥，得到包裹抗肿瘤药物的肿瘤靶向纳米颗粒。

优选的，在步骤A）中，按照1mg叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒:0.5ml水的比例，将叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒溶解于水中；所述水选自蒸馏水、去离子水中的任意一种，优选去离子水。

优选的，在步骤B）中，按照1mg抗肿瘤药物:0.2ml有机溶剂的比例，将抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中；所述抗肿瘤药物为疏水性小分子抗肿瘤药物，其包括（但不限于）紫杉醇、依托泊苷、他莫昔芬等；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、DMSO中的任意一种，优选甲醇；所述超声处理使用的频率为40~80kHz，优选53kHz，处理的时间为20~30min，优选30min。

优选的，在步骤C）中，所述振荡的功率为400~700W，优选500W，振荡的时间为1~2h，优选2h；所述振荡完毕后，向混合液中通入惰性气体36~48h，优选48h，所述惰性气体选自氮气、氦气、氩气、氖气中的任意一种，优选氮气；所述离心的转速为12000~14000rpm，优选14000rpm，离心的时间为30~40min，优选40min。

与现有技术相比，采用上述技术方案的本发明具有如下优点：

（1）用辐照的方法合成了两亲性的纳米颗粒，不但过程简单，而且不会产生有害的中间产物，而且保护了壳聚糖上的氨基；

（2）引入的两性离子官能团不但能够改善壳聚糖的水溶性，而且也创造了纳米颗粒表面的无污染性质，具有较强的抗蛋白吸附性质，为实现纳米颗粒在血液里面的长循环创造了条件；

（3）壳聚糖表面被保护的氨基可以进一步和具有肿瘤细胞靶向功能的小分子化合物叶酸，通过酰胺反应连在一起，为纳米颗粒里面包裹的化疗药物主动靶向于肿瘤细胞提供了可能。

附图说明

图1为Cs-g-PSBMA-FA的分子结构示意图。

图2为Cs-g-PSBMA-FA的¹H-NMR谱图。

图3中A为扫描电子显微镜（SEM）下观察到的Cs-g-PSBMA-FA纳米颗粒；B为纳米粒度分析仪下检测到的Cs-g-PSBMA-FA纳米颗粒的直径分布曲线图，其中平均直径大小为163.9nm，另外测得的Zeta电位为-7.20±2.31mv。

图4中 A为扫描电子显微镜（SEM）下观察到的Cs(VP-16)-g-PSBMA纳米颗粒；B为纳米粒度分析仪下检测到的Cs(VP-16)-g-PSBMA纳米颗粒的直径分布曲线图，其中平均直径大小为200.5nm，另外测得的Zeta电位为-9.12±1.80mv。

图5为Cs(VP-16)-g-PSBMA纳米颗粒中包裹的药物VP-16在不同pH环境下的体外释放情况曲线图。

图6为不同浓度的Cs-g-PSBMA-FA、Cs(VP-16)-g-PSBMA-FA、VP-16对人星形胶质细胞瘤（U251）细胞活力的影响示意图。

图7为流式细胞仪下检测到的单纯药物VP-16和包裹VP-16的纳米颗粒对人星形胶质细胞瘤（U251）凋亡形成的影响效果图。

图8为U251胶质瘤细胞对经过叶酸修饰（下方）以及未经叶酸修饰（上方）的两种含药纳米颗粒的摄取能力的对比测试图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明做出进一步的解释和说明。

实施例1、Cs-g-PSBMA-FA的合成和表征。

按照1:1:1的摩尔比，将6.97g（15.78mmol）FA（上海江莱生物，纯度≥97%）、3.02g（15.78mmol）EDC（美国Sigma公司，纯度98.5%）、1.82g（15.78mmol）NHS（美国Sigma公司纯度98%）加入到15ml无水DMSO（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，纯度≥99.0%）中，在室温条件下搅拌，直至溶质完全溶解，得到混合溶液。

将上述混合溶液缓慢加入到30ml 0.37%（W/V）的Cs-g-PSBMA水溶液（其制备方法如下：准确称取0.12g壳聚糖（脱乙酰度为95.2%，平均分子量为50000g/mol）、0.0212g S,S’-二(R,R’-二甲基-R’’-乙酸)三硫代碳酸酯（BDACT）和0.12g磺酸甜菜碱（SBMA），溶于8ml含有1%的盐酸和丙酮的混合溶液（两者的体积之比为7:3）中，然后将此混合溶液置于10ml安瓿瓶中，氩气吹扫除氧20~40min后密封；将密封好的安瓿瓶暴露在⁶⁰Co源的照射下，10Gy/min照射16.7h，然后将反应物置于透析袋中（MWCO=25000Da），用去离子水透析48~72h，以除去未参加反应的SBMA、PSBMA均聚物以及HCl和丙酮，留在透析带里面的即是Cs-g-PSBMA水溶液）中，在室温、避光条件下搅拌16h，得到Cs-g-PSBMA-FA水溶液。

将上述Cs-g-PSBMA-FA溶液置于透析袋（上海基星生物，MWCO=3500Da）中，首先用0.01mM稀氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，含量≥96%）溶液透析18h，再用去离子水透析48h，将得到的透析液置于高速离心机（美国贝克曼公司，Avanti J-26 xp型）中，在14000rpm下离心40min，弃去上清液，将残留固体冷冻干燥，得到15g Cs-g-PSBMA-FA，其¹H-NMR谱图如图2所示，Cs-g-PSBMA-FA的表征如图3所示。

实施例2、药物组装和含药纳米颗粒的表征。

以疏水性小分子化疗药物依托泊苷（VP-16）（Sigma-Aldrich）作为模型，进行Cs-g-PSBMA-FA材料和药物的组装，具体步骤如下所述：准确称取60mg实施例1中得到的Cs-g-PSBMA-FA，溶解于30ml去离子水中，得到Cs-g-PSBMA-FA预混液；准确称取20mg VP-16，溶解于4ml无水甲醇中，置于超声仪（科颉工业股份有限公司）中超声30min，得到VP-16预混液；将两种预混液混合，并在振荡器（培英实验设备有限公司）上振荡2h，以便使Cs-g-PSBMA-FA与VP-16充分混合；振荡完毕后，向混合液中通入氮气48h，以便除去其中的有机溶剂甲醇；通气完毕后，将混合液置于离心机中，在14000rpm下离心40min，以便除去未结合的VP-16；将离心后的上清液冷冻干燥，即可得到66.14mg包裹VP-16的纳米颗粒（Cs(VP-16)-g-PSBMA-FA），其表征如图4所示。

实施例3、药物的载药量和包封率考察。

称取2mg实施例2中得到的包裹VP-16的纳米颗粒，溶解于4ml甲醇中，超声2h（超声仪中预先加入冰块，以保证水温不会过高，否则将会影响VP-16的紫外吸收，不利于检测结果的获取）。将得到的溶液用孔径为150nm的滤膜进行真空抽滤，除去未溶解在甲醇内的空载体，得到的超滤液用紫外-可见光分光光度计（岛津公司）测出其在284nm下的吸光度，通过绘制VP-16的标准曲线，即可计算出超滤液中VP-16的浓度，并依照下式计算含药纳米颗粒的载药量和包封率。

紫外测定结果如下：载药量为27%，包封率为90%，其载药量结果高于现有技术中纳米颗粒的平均载药量（大约20%），90%的包封率也保证药物不会造成过多的浪费。

实施例4、药物的体外释放实验。

由于单纯的壳聚糖只溶于弱酸性溶液，不溶于水和有机溶剂，因此本发明在体外模拟了两种不同的pH环境，观察在此条件下纳米颗粒内包裹的VP-16的释放能力。具体步骤如下：配制含有0.6%（W/V）的十二烷基磺酸钠（SDS）（国药集团化学试剂有限公司，纯度≥97%）的两种PBS（pH值分别为6.0和7.4）；准确称取12mg含有VP-16的纳米颗粒，溶解于6ml去离子水中，振荡器振荡2h；充分溶解后，采用透析法进行药物体外释放实验，释放介质为上述两种PBS，在固定的时间点吸取4ml外槽中的释放介质，再加入4ml新鲜的释放介质，然后在紫外-可见分光光度计上测出对应时间点的药物浓度，并计算药物的累计释放度（%），其结果如图5所示。

实验结果表明，在两种不同pH环境下，药物均表现了缓释的特点。在酸性环境（pH=6.0）下，药物能够更快地达到释放平衡状态，并且药物在酸性环境下的释放总量要高于中性环境。众所周知，肿瘤的微环境偏酸性，这也为药物被动靶向于肿瘤组织创造了有利条件。

实施例5、药物的细胞学实验。

1、药物对胶质瘤细胞U251生长的影响（MTT法）。

将处于对数生长期的U251细胞用0.25%胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，按照200μL/孔的剂量接种于96孔板中，待细胞贴壁后，吸出培养基，并换成含有不同药物（单纯的Cs-g-PSBMA-FA、包裹VP-16的Cs-g-PSBMA-FA、单纯的VP-16）的培养基，每组均设置5个平行孔。在37℃，5% CO₂培养箱中培养48h后，每孔加入30μL MTT（质量浓度为5mg/mL），于37℃继续培养4h后，每孔再加入150μL DMSO，于37℃充分溶解后，在酶标仪中于570nm下测定吸光值（OD值），并计算相对细胞活力（%），其结果如图6所示。

实验结果表明，包裹在纳米颗粒中的依托泊苷和单纯的依托泊苷的作用效果几乎相同，均可以抑制U251肿瘤细胞的生长，而且随着浓度的升高，抑制效率也会随之上升。然而，单纯的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒（Cs-g-PSBMA-FA）对正常细胞及肿瘤细胞均未产生细胞毒作用，侧面印证了该材料的生物相容性。

2、药物对胶质瘤细胞U251的杀伤能力测试。

取处于对数生长期的U521细胞制成单细胞悬液，共设置3组（分别为空白对照组、VP-16组、包裹VP-16的Cs-g-PSBMA-FA组），每组设置三个平行样，6孔板（康宁生命科学有限公司）中培养过夜。隔日吸弃VP-16组和包裹VP-16的Cs-g-PSBMA-FA组中的培养基，并相应换成含有VP-16和包裹VP-16的Cs-g-PSBMA-FA的培养基（其中VP-16的浓度均为10μg/mL），继续培养24h或48h后，用0.25%胰酶消化并收集，制备单细胞悬液。将单细胞悬液在1000rpm下离心5min后，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤2次，重悬细胞于1×Binding Buffer（含Ca²⁺的缓冲液）中，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。取100μL细胞悬液，分别加入5μL Annexin V-FITC（美国生命技术公司）和 1μL碘化丙啶（Propidium Iodide，简称PI）（美国生命技术公司），室温、避光作用15min，加入400μL 1×Binding Buffer（含Ca²⁺的缓冲液），1h内通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，其结果如图7所示。

从流式细胞仪结果中可以看出，在24h后，包裹VP-16的纳米颗粒对U521肿瘤细胞的凋亡率要低于单纯的VP-16；然而，在48h后，包裹VP-16的纳米颗粒对U251肿瘤细胞的凋亡率要高于单纯的VP-16，证明了包裹在纳米颗粒内的VP-16具有缓释的特点，这也就减轻了细胞毒类化疗药物对正常组织造成的损伤。

3、细胞摄取含药纳米颗粒能力测试。

选取经过叶酸修饰和未经叶酸修饰的两种包裹VP-16的纳米颗粒，观察并对比两种纳米颗粒进入U251胶质瘤细胞的差异。具体步骤如下：首先，用异硫氰酸荧光素（FITC）（西格玛公司，HPLC级，纯度≥90%）标记两种含药纳米颗粒。然后，将得到的样品溶解于培养基中，浓度均为10μg/ml。取处于对数生长期的U251细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。将高压灭菌过的厚度为0.7mm的盖玻片放入6孔板中，然后将细胞接种于6孔板中，每孔2ml，培养过夜。隔日待细胞爬片后，弃掉培养基，换为含有荧光纳米颗粒的培养基，继续培养2h。弃掉培养基，用冷PBS反复冲洗盖玻片3次，加入0.4%多聚甲醛固定10min，弃掉固定液，再用冷PBS洗涤三次。往盖玻片上滴加100μl DAPI，避光条件下染色15min，用PBS洗掉残留的DAPI。在干净的载玻片上滴加20μl抗淬灭剂，将盖玻片反扣在含有抗淬灭剂的载玻片上，盖玻片的四周涂上封片液，避光保存，待封片液干燥后上机检查，共聚焦拍到的图像如图8所示。

实验结果表明，U251肿瘤细胞表面的叶酸受体呈高表达状态，而实验结果也证明了表面修饰有叶酸的含药纳米颗粒进入细胞的量更多，这也有助于包裹在纳米颗粒中的化疗药物主动靶向于肿瘤细胞。

Claims

1.一种叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述叶酸、脱水缩合剂、缩合促进剂之间的摩尔比为1:1:1。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述脱水缩合剂选自N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺中的任意一种；所述缩合促进剂选自N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三氮唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑中的任意一种；所述溶剂选自二甲基亚砜、乙醇、甲醇中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述磺酸甜菜碱-壳聚糖通过下法制得：首先，按照1:1:5~6的重量比，将壳聚糖、磺酸甜菜碱和RAFT试剂溶解在含有1%盐酸和丙酮的混合溶液中，惰性气体除氧后密封，暴露在辐射剂量为10Gy/min的⁶⁰Co源下反应15~20h；其次，将反应物置于截留分子量为25000Da的透析袋中，用去离子水透析48~72h，得到留在透析袋中的磺酸甜菜碱-壳聚糖水溶液；最后，将得到的水溶液于-20℃预冻6~8h，然后冷冻干燥36~48h，得到两亲性纳米颗粒磺酸甜菜碱-壳聚糖；

其中：所述壳聚糖的脱乙酰度为95.2%，平均分子量为50000g/mol；所述磺酸甜菜碱为3-[N,N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基)乙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐；所述RAFT试剂为S,S’-二(R,R’-二甲基-R’’-乙酸)三硫代碳酸酯；所述含有1%盐酸和丙酮的混合溶液中1%盐酸和丙酮的体积比为7:3；所述惰性气体选自氮气、氦气、氩气中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述透析袋的截留分子量为3500Da；所述碱液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的任意一种的水溶液，其摩尔浓度为0.01mM。

6.根据上述权利要求中任一项所述的制备方法制备的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒。

7.根据权利要求6所述的叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒在制备肿瘤靶向药物中的应用，所述应用为一种包裹抗肿瘤药物的肿瘤靶向纳米颗粒的制备方法，其包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤A）中，按照1mg叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒:0.5ml水的比例，将叶酸修饰的磺酸甜菜碱-壳聚糖纳米颗粒溶解于水中；所述水选自蒸馏水、去离子水中的任意一种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤B）中，按照1mg抗肿瘤药物:0.2ml有机溶剂的比例，将抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中；所述抗肿瘤药物选自紫杉醇、依托泊苷、他莫昔芬中的任意一种；所述有机溶剂为甲醇；所述超声处理使用的频率为40~80kHz，处理的时间为20~30min。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤C）中，所述振荡的功率为400~700W，振荡的时间为1~2h；所述振荡完毕后，向混合液中通入惰性气体36~48h，所述惰性气体选自氮气、氦气、氩气、氖气中的任意一种；所述离心的转速为12000~14000rpm，离心的时间为30~40min。