CN108403662B - 三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备方法 - Google Patents

三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备方法。该方法是将三羟甲基氨基甲烷偶联到经碳二亚胺盐活化的玉米醇溶蛋白上，并以此为载体材料采用反溶剂制备药物输送系统，随后以叶酸、cRGD肽、Her2抗体等功能性分子进行表面修饰，获得出球形度好、载药效率高、粒径分布窄、功能性分子接枝量显著高于未改性玉米醇溶蛋白的功能化载药微球。本发明所制备的载药微球分散性好，粒径为100～300nm，载药效率为81.48～86.01％，其功能性分子的接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球的1.72～1.94倍。本发明制备的功能性载药微球能够适应不同生理环境，在医药领域具有较好的应用前景。

Description

三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球及制备 方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白，三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球，及三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白功能性载药微球的制备方法。
背景技术
制备药物输送系统能够改变药物的药理性质(如溶解度、循环半衰期)、药代动力学及体内生物分布。其中，药物载体材料是决定药物输送载体理化、生化特性的关键因素。玉米醇溶蛋白(全称玉米醇溶贮藏蛋白)作为一种天然疏水性大分子，来源广泛，无毒，非免疫原性，且具有良好的生物相容性及生物可降解性，是少数被FDA允许口服的疏水性生物高分子(Patel A.R.,Velikov K.P.Zein as a source of functional colloidal nano-andmicrostructures.Curr.Opin.Colloid In.,2014,19(5):450-458.)。
玉米醇溶蛋白的氨基酸组成非常特别，非极性氨基酸的比例超过50％。在其组成的影响下，玉米醇溶蛋白能够通过二级结构的转换自组装形成稳定的内“疏”外“亲”的密实结构，包埋各种物质，如多糖、DNA、RNA、蛋白质、金属纳米颗粒、量子点、油滴及疏水性药物等。再者，玉米醇溶蛋白上的氨基酸残基带有一定的极性基团(如-SH、-COOH、-NH3以及-OH)。玉米醇溶蛋白可以这些基团为化学反应位点接枝各种功能性分子，为其适应复杂多变的人体环境提供可能性。因此，无论从来源，成本，安全性，还是从其本身的理化性质、应用拓展性等方面进行考量，玉米醇溶蛋白都是一个优势的药物载体材料。
然而，玉米醇溶蛋白的含硫氨基酸比例仅为2.8％，碱性氨基酸比例仅为2.9％，羟基氨基酸的比例总计为13.4％，限制了功能性分子的选择，及以其改性的效果。例如，在均相环境下，玉米醇溶蛋白的儿茶素没食子酸接枝量为2.17％，玉米醇溶蛋白的儿茶素没食子酸接枝量为2.40％，而玉米醇溶蛋白的绿原酸接枝量则为0.69％(Liu F.,Ma C.,McClements D.J.,Gao Y..A comparative study of covalent and non-covalentinteractions between zein and polyphenols in ethanol-water solution.FoodHydrocolloid.,2017,63:625-634)。
发明内容
本发明的目的是提供一种反应条件温和、设备要求简单的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白及其功能性载药微球及其制备方法，改善玉米醇溶蛋白的理化性质之余，赋予并提高玉米醇溶蛋白的功能特性，制备出适应不同生理环境的功能性载药微球。
本发明利用玉米醇溶蛋白的酸性氨基酸比例较大，占比27.1％；通过活化玉米醇溶蛋白上的羧基，偶联亲水的、富含羟基的三羟甲基氨基甲烷，改善玉米醇溶蛋白的理化性质，并为玉米醇溶蛋白提供更多的反应位点，提高功能性分子的接枝量。
本发明目的通过如下技术方案实现：
三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，包括如下步骤：
1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将玉米醇溶蛋白与氨基保护剂二碳酸二叔丁酯按质量比1:1～1.5:1，溶于特定的二甲基亚砜或者乙醇水溶液中，在25～40℃避光反应12～24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，分别往玉米醇溶蛋白保护液加入碳二亚胺盐、N-羟基琥珀酰亚胺及三羟甲基氨基甲烷，在25～40℃避光反应12～24h，得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液；
2)三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往所述的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液加入浓盐酸，在25～40℃避光反应6～8h；调节pH至5.0～6.0，转移至透析袋中透析，将透析袋中的保留液离心洗涤，冻干，得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白；
3)载药微球的制备：将疏水性药物与冻干的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白按质量比1:1～1:10，溶于乙醇水溶液；磁力搅拌下，注入pH为2.5～4.5的盐酸水溶液中，稳定后离心去上清，得载药微球；
4)载药微球功能化修饰：分别制备溶有不同的功能性分子溶液，将载药微球分散到含功能性分子的溶液，搅拌下反应后，离心去上清，获得功能性载药微球。
为进一步实现本发明目的，优选地，步骤1)中，所述的碳二亚胺盐与玉米醇溶蛋白摩尔比为1:1～1.5:1；所述的N-羟基琥珀酰亚胺与玉米醇溶蛋白摩尔比为1.2:1～1.75:1；所述的三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白质量比为1:10～10:1。
优选地，步骤1)中，所述的碳二亚胺盐为二环己基碳二亚胺(二甲基亚砜)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述的玉米醇溶蛋白的蛋白纯度≥97％；所述的乙醇水溶液体积分数为50～95％。
优选地，步骤2)中，所述的浓盐酸的质量浓度为36.0～38.0％；所述浓盐酸的用量是三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液体积的1/4～1/2；所述透析的时间为1～2天；所述离心洗涤的次数为3次以上。
优选地，步骤2)，步骤3)调pH值，采用浓度为0.1mol/L的HCl溶液或浓度为0.1mol/L的NaOH溶液。
优选地，步骤3)中，所述疏水性药物为苏尼替尼、吉非替尼、羟基喜树碱或白藜芦醇；所述乙醇水溶液的体积分数为70～80％；所述盐酸水溶液的用量为5～20倍，稳定时间为1～2h。
优选地，所述的功能性分子为能够靶向癌细胞的cRGD肽、叶酸、Her2抗体、壳聚糖或具有抗氧化活性的儿茶素没食子酸；cRGD肽、叶酸、Her2抗体和儿茶素没食子酸预先使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺活化；壳聚糖预先在0.4mol/L的NaOH溶液下偶联一氯醋酸的壳聚糖。
优选地，活化的cRGD肽、叶酸、Her2抗体以及儿茶素没食子酸溶于pH值为8～10的碱性溶液，避光反应24～72h；一氯醋酸-壳聚糖溶于90℃的水溶液，避光反应1h。
优选地，碱性溶液为PBS、Tris-HCl、HEPES及硼酸缓冲溶液的一种。
一种三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球，由上述制备方法制得，粒径为100～300nm，载药效率为81.48～86.01％，其功能性分子的接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球1.72～1.94倍。
优选的，所述的溶液皆用去离子水配置。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
1)本发明在反应过程中避免了玉米醇溶蛋白在活化阶段的自聚，避免了玉米醇溶蛋白上极性基团的消耗。
2)本发明成功将三羟甲基氨基甲烷偶联到玉米醇溶蛋白上，显著改善了玉米醇溶蛋白的理化性质，如提高了改性玉米醇溶蛋白在原蛋白等电点下的溶解度等。
3)本发明制备的微球，球形度好，粒径分布均一，粒径分布在100～300nm左右，载药效率在81.48～86.01％，适用于体内输送。
4)本发明的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白基载药微球的功能性分子接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球1.72～1.94倍，使微球的功能特性更加显著。另外，通过调节三羟甲基氨基甲烷用量可调控玉米醇溶蛋白的可改性基团的数量，从而调控载药微球的控缓释特性。因此，本发明拓展了玉米醇溶蛋白在药物输送系统上的应用。
附图说明
图1为实施例1的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的核磁共振氢谱。
图2为实施例1的叶酸修饰三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球SEM图。
图3为实施例1～3的载药微球粒径分布图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但需要说明的是，本发明所要求的保护的范围并不局限于下面实施例所表述的范围。
实施例1
三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将1g纯度为97％的玉米醇溶蛋白与1.55ml氨基保护剂二碳酸二叔丁酯，溶于75ml体积分数为70％的乙醇水溶液中，在37℃恒温振荡器下避光反应24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，往制备的玉米醇溶蛋白保护液分别加入0.3921g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，0.2354g N-羟基琥珀酰亚胺以及0.1g三羟甲基氨基甲烷，在37℃恒温振荡器下避光反应24h；
(2)三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的提纯与提取：在氮气的保护下，往步骤(1)制备的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液中加入25ml质量浓度为36.0～38.0％浓盐酸，在37℃恒温振荡器下避光反应6h；将三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白混合液的pH调节至6.0，随后转移至透析袋中，透析2天，共计换水10次，将透析袋中的保留液以5000转/分的速度离心洗涤3次，冻干，即获得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白；
(3)载药微球的制备：将2mg苏尼替尼与20mg三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶于1ml 80％乙醇水溶液，在50℃下搅拌30min，保证药物与三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白完全溶解；在速度为1000转/分的磁力搅拌下，迅速将其注入19ml pH 4.5的盐酸水溶液中，在氮气氛围下，稳定2h，以12500转/分的速度离心20min，去上清，获得载药微球；
(4)叶酸修饰的载药微球：将1g叶酸、0.6531g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.3946gN-羟基琥珀酰亚胺溶于50ml pH 10.0Tris-HCl溶液中；取1ml活化叶酸加至烧杯中，随后加入步骤(3)获得的载药微球，定容至20ml，在速度为1200转/分的磁力搅拌下24h后，以12500转/分的速度离心20min，去上清，获得叶酸修饰的载药微球。
对实施例1制备的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白进行核磁共振氢谱分析：分别将三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白(Tris-Zein)、玉米醇溶蛋白(Zein)与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于氘代二甲基亚砜后测量其氢谱(见图1)，发现三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白在化学位移3.98处出现了新峰，该峰为酰胺键上的氢，表明三羟甲基氨基甲烷成功偶联玉米醇溶蛋白。
对实施例1得到的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白进行稳定性分析，发现改性蛋白的等电点较玉米醇溶蛋白往酸性方向移动，从pH 6～7偏移到在pH 4～4.5左右。再者，三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白在生理条件下的zeta电位为-35.0mv，能保持稳定。
对实施例1得到的叶酸修饰的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行扫描电子显微镜(SEM)表征，其形貌如图2所示，发现微球的球形度较好，基本不黏连、大小较为均一，平均粒径为168.6±29.67nm，与马尔文粒度仪测定的粒径分布曲线基本重合(图3)，满足体内输送要求。
对实施例1得到的叶酸修饰的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行载药效率的测定：载药效率＝(微球包封的药物量/添加的药物总量)×100％。其测定方法如下：配制药物苏尼替尼浓度为0～30μg/ml等一系列80％乙醇水溶液，采用紫外分光光度计测其在428nm处的最大吸光度，然后经线性拟合后的回归方程为Y＝0.0606X-0.0005(R2＝0.9997，Y是指吸光值，X是指苏尼替尼的浓度，μg/ml)，再将准确称量的实施例1的苏尼替尼微球溶解在80％乙醇水溶液中，超声5min后测量其吸光度，并计算出苏尼替尼的含量，重复3次，取其平均值，计算出实施例1的苏尼替尼载药效率为81.48±2.93％。
对实施例1进行叶酸修饰的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行叶酸接枝量的测定：叶酸接枝量＝(接枝的叶酸质量/三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的质量)×100％。其测定方法如下：配制叶酸浓度为5～100μg/ml等一系列80％乙醇水溶液，采用紫外分光光度计测其在342nm处的最大吸光度，然后经线性拟合后的回归方程为Y＝0.02151X-0.01486(R2＝0.9989，Y是指吸光值，X是指叶酸的浓度，μg/ml)，再将准确称量的实施例1的叶酸修饰微球溶解在80％乙醇水溶液中，超声5min后测量其吸光度，并计算出叶酸的含量，重复3次，取其平均值，计算出实施例1的叶酸的接枝量为7.67％，与之相对的是玉米蛋白载药微球的叶酸接枝量仅有4.49％。
实施例2
三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将1g纯度为97％的玉米醇溶蛋白与1.55ml氨基保护剂二碳酸二叔丁酯，溶于25ml的DMSO溶液中，在40℃恒温振荡器下避光反应12h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，往制备的玉米醇溶蛋白保护液分别加入0.4213g二环己基碳二亚胺，0.2768g N-羟基琥珀酰亚胺，1.50ml三乙胺以及0.2g三羟甲基氨基甲烷，在40℃恒温振荡器下避光反应24h；
(2)三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往步骤(1)制备的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液中加入7ml质量浓度为36.0～38.0％浓盐酸，在40℃恒温振荡器下避光反应6h；将三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白混合液的pH调节至6.0，随后转移至透析袋中，透析1天，共计换水8次，将透析袋中的保留液以5000转/分的速度离心洗涤3次，冻干，即获得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白；
(3)载药微球的制备：将2mg吉非替尼与20mg三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶于2ml 80％乙醇水溶液，超声5min，保证药物与三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白完全溶解；在速度为1000转/分的磁力搅拌下，迅速将其注入18ml pH 4的盐酸水溶液中，在氮气氛围下，稳定1h，以12500转/分的速度离心20min，去上清，获得载药微球；
(4)cRGD肽修饰的载药微球：将载药微球分散至预先溶有20mg cRGD肽，10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，5.76mg N-羟基琥珀酰亚胺的20ml pH 9PBS溶液中，在速度为1200转/分的磁力搅拌下48h后，以12500转/分的速度离心20min，去上清，获得cRGD肽修饰的载药微球。
对实施例2得到cRGD肽修饰三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行马尔文粒度分析仪表征，其粒度分布如图3所示，发现微球大小均一，平均粒径为150.0±46.83nm，满足体内输送要求。
对实施例2得到cRGD肽修饰三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行载药效率的测定。其中吉非替尼的标曲为Y＝0.04296X-0.01286(R2＝0.9997，Y是指吸光值，X是指吉非替尼的浓度，μg/ml)。最终测得实施例2的吉非替尼平均载药效率为83.56±1.52％。
对实施例2得到cRGD肽修饰的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行cRGD肽接枝量的测定：cRGD肽接枝量＝((加入的cRGD肽质量-未接枝的cRGD肽质量)/三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的质量)×100％。其测定方法如下：将cRGD与菲醌在60℃下反应3h，随后稀释获得cRGD肽浓度为0～20μg/ml的一系列水溶液，采用荧光分光光度计(λex＝312nm,λem＝340–570nm)测其在395nm处的最大吸光度，然后经线性拟合后的回归方程为Y＝097184X+14351(R2＝0.9989，Y是指吸光值，X是指cRGD肽的浓度，μg/ml)，再将cRGD肽修饰微球溶液以12500转/分的速度离心40min，测试上清液的cRGD肽的浓度，重复3次，取其平均值，计算出实施例2的cRGD肽接枝量为9.81％，与之相对的是玉米蛋白载药微球的cRGD肽接枝量仅有5.07％。
实施例3
三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将1g纯度为97％的玉米醇溶蛋白与1.55ml氨基保护剂二碳酸二叔丁酯，溶于75ml体积分数为体积分数为80％的乙醇水溶液，加入1.50ml三乙胺,在25℃恒温振荡器下避光反应24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，往制备的玉米醇溶蛋白保护液分别加入0.3142g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，0.1898g N-羟基琥珀酰亚胺以及2g三羟甲基氨基甲烷，在40℃恒温振荡器下避光反应24h；
(2)三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往步骤(1)制备的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液中加入30ml质量浓度为36.0～38.0％浓盐酸，在25℃恒温振荡器下避光反应6h；将三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白混合液的pH调节至6.0，随后转移至透析袋中，透析2天，共计换水10次，将透析袋中的保留液以5000转/分的速度离心洗涤3次，冻干，即获得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白；
(3)载药微球的制备：将4mg白黎芦醇与20mg三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶于1ml 80％乙醇水溶液，在50℃下搅拌30min，保证药物与三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白完全溶解；在速度为1000转/分的磁力搅拌下，迅速将其注入19ml pH 3.5的盐酸水溶液中，在氮气氛围下，稳定1h，以12500转/分的速度离心20min，去上清，获得载药微球。
(4)Her2抗体修饰的载药微球：将载药微球分散至预先溶有20mg Her 2抗体，20mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，20mg N-羟基琥珀酰亚胺的20ml pH 8.0硼酸缓冲溶液溶液中，在速度为1200转/分的磁力搅拌下72h后，以12500转/分的速度离心20min，去上清，获得Her2抗体修饰的载药微球。
对实施例3得到Her2抗体修饰三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行马尔文粒度分析仪表征，其粒度分布如图3所示，发现微球大小均一，平均粒径为307.0±44.40nm，满足体内输送要求。
对实施例3得到Her2抗体修饰三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行载药效率的测定。其中白藜芦醇的标曲为Y＝0.12065X-0.00429(R2＝0.9999，Y是指吸光值，X是指白藜芦醇的浓度，μg/ml)。最终测得实施例3的白藜芦醇平均载药效率为86.01±1.21％。
对实施例3得到Her2抗体修饰的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白载药微球进行Her2抗体接枝量的测定：Her2抗体接枝量＝((加入的Her 2抗体质量-未接枝的Her2抗体质量)/三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的质量)×100％。其测定方法如下：配制Her2抗体为100～1000μg/ml等一系列水溶液，采用紫外分光光度计测其在277nm处的最大吸光度，然后经线性拟合后的回归方程为Y＝0.0005X-0.0351(R2＝0.9983，Y是指吸光值，X是指Her2抗体的浓度，μg/ml)，再将Her2抗体修饰微球溶液以12500转/分的速度离心40min，测试上清液的Her2抗体的浓度，重复3次，取其平均值，计算出实施例2的Her2抗体接枝量为56.14％，与之相对的是玉米蛋白载药微球的Her2抗体接枝量仅有32.44％。
对比例1-3制得的功能化修饰条件严格按照表1中所列操作参数数值执行，得到功能化微球的粒径、载药效率及功能化分子接枝量见表1：
表1
Figure GDA0002402628770000081
各实施例较各自的对比例的载药效率有所提高，特别是在乙醇中溶解度较大的白藜芦醇，说明改性的玉米醇溶蛋白与药物的相容性提高，这可能是因为制备条件与改性玉米醇溶蛋白的等电点附近有关。各实施例的功能性分子接枝量较各自的对比例均有所提高，这说明玉米醇溶蛋白经三羟甲基氨基甲烷改性后确实增加了功能性分子的反应位点。由于所选的功能性分子均是亲水性的分子。接枝量提高后，颗粒表面电荷提高，避免了颗粒在稳定过程中的团聚，提高了颗粒的稳定性，符合实施例1、3的颗粒尺寸明显低于对比例1、3的情况。另外，实施例2颗粒尺寸略大于对比例2，符合改性玉米醇溶蛋白接枝量高于玉米醇溶蛋白的结果。而cRGD是三种功能性分子中在水中溶解度最大的一个分子，较小的cRGD接枝量便可使玉米醇溶蛋白微球稳定分散于水溶液中。

Claims (10)

1.三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白的偶联反应：将玉米醇溶蛋白与氨基保护剂二碳酸二叔丁酯按质量比1:1～1.5:1，溶于特定的二甲基亚砜或者乙醇水溶液中，在25～40℃避光反应12～24h，得到玉米醇溶蛋白保护液；在氮气的保护下，分别往玉米醇溶蛋白保护液加入碳二亚胺盐、N-羟基琥珀酰亚胺及三羟甲基氨基甲烷，在25～40℃避光反应12～24h，得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液；
2)三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白的提取与纯化：在氮气的保护下，往所述的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液加入浓盐酸，在25～40℃避光反应6～8h；调节pH至5.0～6.0，转移至透析袋中透析，将透析袋中的保留液离心洗涤，冻干，得三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白；
3)载药微球的制备：将疏水性药物与冻干的三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白按质量比1:1～1:10，溶于乙醇水溶液；磁力搅拌下，注入pH为2.5～4.5的盐酸水溶液中，稳定后离心去上清，得载药微球；
4)载药微球功能化修饰：分别制备溶有不同的功能性分子溶液，将载药微球分散到含功能性分子的溶液，搅拌下反应后，离心去上清，获得功能性载药微球；所述的功能性分子为能够靶向癌细胞的cRGD肽、叶酸、Her2抗体、壳聚糖或具有抗氧化活性的儿茶素没食子酸。
2.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述的碳二亚胺盐与玉米醇溶蛋白摩尔比为1:1～1.5:1；所述的N-羟基琥珀酰亚胺与玉米醇溶蛋白摩尔比为1.2:1～1.75:1；所述的三羟甲基氨基甲烷与玉米醇溶蛋白质量比为1:10～10:1。
3.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述的碳二亚胺盐为二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述的玉米醇溶蛋白的蛋白纯度≥97％；所述的乙醇水溶液体积分数为50～95％。
4.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述的浓盐酸的质量浓度为36.0～38.0％；所述浓盐酸的用量是三羟甲基氨基甲烷-玉米醇溶蛋白溶液体积的1/4～1/2；所述透析的时间为1～2天；所述离心洗涤的次数为3次以上。
5.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤2)，步骤3)调pH值都采用浓度为0.1mol/L的HCl溶液或浓度为0.1mol/L的NaOH溶液调节。
6.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述疏水性药物为苏尼替尼、吉非替尼、羟基喜树碱或白藜芦醇；所述的乙醇水溶液的体积分数为70～80％；所述盐酸水溶液的用量为5～20倍，稳定时间为1～2h。
7.根据权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于；cRGD肽、叶酸、Her2抗体和儿茶素没食子酸预先使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺活化；壳聚糖预先在0.4mol/L的NaOH溶液下偶联一氯醋酸的壳聚糖。
8.根据权利要求7所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：活化的cRGD肽、叶酸、Her2抗体以及儿茶素没食子酸溶于pH值为8～10的碱性溶液，避光反应24～72h；一氯醋酸-壳聚糖溶于90℃的水溶液，避光反应1h。
9.根据权利要求8所述的三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球的制备方法，其特征在于：碱性溶液为PBS、Tris-HCl、HEPES及硼酸缓冲溶液的一种。
10.一种三羟甲基氨基甲烷改性玉米醇溶蛋白功能载药微球，其特征在于：其由权利要求1-9任一项所述制备方法制得，粒径为100～300nm，载药效率为81.48～86.01％，其功能性分子的接枝量平均为未改性玉米醇溶蛋白微球1.72～1.94倍。
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