JP2002508020A - ポリエチレングリコールとキトサンの複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 キトサンと、結合一体化されるポリエチレングリコール部分又はその誘導体を含むＰＥＧ-キトサン複合体、及び薬剤におけるその使用が記載される。一つの実施態様において、その複合体は、キトサン部分又はその誘導体と、活性化したキトサン種の使用によってキトサン上のアミノ官能基を経て一緒に結合されるポリエチレングリコール部分又はその誘導体とを含む。別な実施態様において、該複合体はキトサン部分又はその誘導体と、１０キロダルトンから１０００キロダルトンまでの範囲内の分子量の複合体のキトサン部分と一緒に結合されるポリエチレングリコール部分とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリエチレングリコールとキトサンの複合体 本発明は、生物医学的な用途において、特に、アンチセンス及び遺伝子治療、 薬剤吸収強化およびおよび粒子状担体を用いたターゲッティングの分野において 使用され得るキトサンおよびポリエチレングリコールの間の新規な複合体（ＰＥ Ｇキトサン複合体）に関する。 キトサンはキチンに由来する生体高分子物質である。化学的には、キトサンは ポリグルコサミンであり、β（１→４）結合の２−アミノ−２−デオキシ−Ｄグ ルコピラノースの直鎖状ポリマーである。キトサンは、脱アセチル化方法によっ てキチンから誘導することができる。キチンは不溶性であるが、塩の形態のキト サンはｐＨ７．０未満において許容溶解度を示す。キトサンは非毒性と考えられ ており、粘膜表面への投与することが可能である。 創傷治癒での利用を含む先行技術に記載されたキトサンの多様な用途は、生物 接着剤として、また、不十分な可溶性化合物の溶解度を改良することを目的とし て、薬物送達を調整している。さらに最近では、キトサンはその陽電荷により細 胞間の密着結合に効果があり得ることが発見され、薬剤の傍細胞の輸送、特に特 性として極性があるものの改良に有効であることがわかった。キトサンの医学的 用途の詳細な記事は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ中の多糖類の 項（編集、Ｄｕｍｉｔｒｕ，Ｓ.、Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９９６年、 ６３１〜６４９ページ）のＨｏｎによる論文に確認することができる。また、Ｐ ＣＴ／ＧＢ９０／００２９１、Ａｒｔｕｒｓｓｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１ １ １３５８，１９９４、およびＩｌｌｕｍら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１ １ １８６，１９９４に、キトサンについての医学用途の具体的な例を確認すること ができる。 キトサンは、数単位のグルコサミンを含むオリゴマー物質から２００，０００ ダルトンを越える高分子量物質までの分子量範囲で得ることができる。医薬用途 においては、通常、５０，０００〜５００，０００ダルトンの高分子量が好まし い。また、キトサンは異なる脱アセチル化の程度により得ることができるが、通 常６０〜９０％の脱アセチル化が行われた物質が好ましい。キトサンは、甲殻類 、真菌類および他の物質を含む多様な供給源から得ることができ、製薬等級のキ トサンはノルウェーのＰｒｏｎｏｖａ Ｌｉｍｉｔｅｄから入手可能である。 キトサンは陽電荷を保持するので、薬剤を含む他の負電荷の物質並びに負電荷 の表面と相互作用を起こすために使用することができる。さらに、担体粒子の表 面を修飾するのにキトサンを使用することができる。例えば、表面にキトサンを 結合させたリポソームの記述がある(Ｔａｋｅｕｃｈｉｕら、(１９９４)、Ｃｈ ｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４２ １９５４〜１９５６)。 キトサンは、ミクロ球体の粉末物質として溶液中で使用するか、皮膜剤として 使用することができる。 また、化学的に修飾されたキトサンは、新しい特性を有する誘導体を生成する ことが知られている。例えば、Ｎ−アシルキトサン、Ｎ−カルボキシアルキルキ トサン、Ｎ−カルボキシアシルキトサン、およびＯ−カルボキシアルキルキトサ ンがある。 キトサンとポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の簡単な混合物が知られている。 例えば、キトサン／ポリ（エチレンオキシド）ポリマーネットワークが、Ｐａｔ ｅｌおよびＡｍｉｊｉによって報告されている(Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉ ｎｔｓ，ＡＣＳ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍ．１９９ ４，３５２，４０３、および ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，６ ２７，Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ａｎｄ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍ ｅｒｓ ｆｏｒ ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅ ２０９)。酢酸 にキトサンを溶解してヒドロゲルを調製し、溶液を生成した。１メガダルトン（ ｍＤ）に対し１０キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有するポリエチレングリコー ルを酢酸に溶解し、得られた溶液をキトサン溶液に添加して物理的混合物を調製 した。その後、その混合物はグリオキサールと架橋してゲルシステムを形成した 。しかし、ＰａｔｅｌおよびＡｍｉｊｉの研究においては、ＰＥＧキトサン複合 体を形成するために、ポリエチレンオキシドとしてまた公知であるポリエチレン グリコールをキトサンに直接的に結合することについては示唆されて いない。 また、Ｐｅｎｇらは、キトサン／ポリエーテルヒドロゲルについて記述してい る(Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｔ Ａ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，５９１−５９６，１９９４)。この文献ではさらに、 キトサンとポリエーテル（ポリオキシプロピレングリコール）を酸性ｐＨ下で混 合し、その後、グルタルアルデヒドで架橋している。 タンパク質、炭水化物およびリン脂質を含む高分子材料へのポリエチレングリ コールの結合が知られている。例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙによる論文（Ａｄｖａ ｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，１５ ７−１８２(１９９５)）を参照のこと。この方法はしばしばＰＥＧ化と呼ばれて おり、本明細書においてもこの用語を使用する。その様々な化学的方法には、関 係する方法の複雑性、選択される分子のＰＥＧ化を調節する能力、ポリエチレン グリコールポリマー結合の可逆性または分解性、高価な溶媒または有毒な溶媒の 使用等を含む欠点および長所がある。 ＰＣＴ／ＧＢ９５／００６８６は、実質的に水溶性高分子からなる外部の表面 および非水溶性高分子の実質的に球状のコア粒子を含んでいる生物医学的な用途 を目的とするミクロ球体について記述している。その水溶性高分子はポリエチレ ングリコールに接合し、また、その非水溶性コア粒子はポリエチレングリコール （ＰＥＧ）成分によってその水溶性高分子に結合する。その特許出願は、ＰＥＧ デキストラン複合体を使用して詳細な実施例を記述している。さらに、キトサン はそのようなミクロ球体の調製において水溶性高分子として説明されているが、 実際にはＰＥＧキトサン複合体は調製されていなかった。なおまた、ＰＥＧ成分 かぺンダントされ、外部環境に露出された粒子の開示はなかった。 Ｏｕｃｈｉらは、カルボン酸塩としてＰＥＧのモノメチル・エーテルで多糖類 上のアミノ基をアシル化し、次いで、この化合物を５−フルオロウラシル（５− Ｆｕ）へ共有結合で結合させることによってＰＥＧキトサンを調製し、癌化学療 法用の物質を生成することについて記述している(Ｏｕｃｈｉら、Ｊ．Ｍａｃｒ ｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．，Ａ２８，９５９，１９９１)。活性エステル方 法を用いてＯｕｃｈｉらの研究におけるＰＥＧキトサン生成物を調 製した。そのキトサンは、キトサンの酸処理によって生成された重合度が３０の 低分子量物質だった。さらに、ＰＥＧキトサン複合体中のＰＥＧ鎖の末端へ５− Ｆｕを結合させ、得られた可溶性複合体を注射によって投与した。 Ｏｕｃｈｉらは、アンチセンスのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ（核酸）の ような陰イオン性高分子薬剤の送達に未修飾のＰＥＧキトサン複合体を使用する こと、並びに、負電荷の表面および負電荷のコロイド粒子と陽電荷のキトサンの 相互作用を介した、コロイド状の薬物送達分野におけるコーティング剤として末 修飾の複合体が使用できるということについては考慮しなかった。その上、Ｏｕ ｃｈｉら論文には、上皮細胞の負電荷の表面または負電荷の粘液と陽電荷のＰＥ Ｇキトサン複合体の相互作用を介した粘膜表面を越えての薬剤吸収を増強するた めに、そのような陽電荷のＰＥＧキトサン複合体を使用することができるという ことについて示唆していない。 遺伝子治療の分野において、改良投薬にあたって、核酸からなるプラスミド物 質を小粒子へ縮合することができるということは多くの場合重要である。先行技 術には、陽イオン性脂質並びにポリリシンのような陽イオン性ポリマーを使用し てこれを達成する方法が説明されている。（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎおよび Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．３９ ３５７−３７２(１９９ ５)、および、Ｍｕｍｐｅｒら、 Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３ ７０１−７０９ （１９９６）を参照。）また、同時係属中の特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９７／０００ ２２には、ポリエチレングリコールが結合したポリアミドアミンを使用した場合 、どのようにそのような縮合を達成することができるかについて説明している。 しかしなから、ＰＥＧキトサンをプラスミドＤＮＡの改良した縮合に用いるこ とについては、いかなる例も報告されていない。 我々は、アミノ官能基を介したキトサン分子へのポリエチレングリコールの共 有結合によるキトサンの修飾（ＰＥＧ化）が有用な薬剤の特性を示し得るポリマ ー複合体物質を生じ、医薬品、ワクチン、診断薬の送達の改良に、並びに遺伝子 治療の分野における核酸に対する可能性を提供することを発見した。特に、ＰＥ Ｇキトサン複合体は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ（核酸） のような陰イオン性物質と相互に作用すると考えられるので、医薬品吸収を増強 するために、あるいは微粒子状担体を用いたターゲティングに用いることができ る。 本発明の第１の態様は、活性化されたキトサンの種類を用いることによってキ トサン上のアミノ官能基を介して互いに結合された、キトサン部分またはその誘 導体、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分またはその誘導体からなる ポリマー複合体を提供する。 本発明の第２の態様は、互いに結合した、キトサン部分またはその誘導体、お よびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分またはその誘導体からなるポリマー 複合体であって、複合体のキトサン部分が１０キロダルトンから１０００キロダ ルトンの範囲の分子量を持つ複合体を提供する。 本発明の第３の態様は、オリゴヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択し た治療薬とＰＥＧキトサン複合体との間に形成された複合体からなる組成物を提 供する。ＰＥＧキトサン複合体は、互いに結合した、キトサン部分またはその誘 導体、およびポリエチレングリコール成分またはその誘導体からなる。 また、本発明の別の態様では、薬物送達において使用し得るポリエチレングリ コールに共有結合されたキトサンの形態のポリマー複合体からなる特定の組成物 を提供する。 キトサンは次式を有する反復モノマー単位からなる高分子材料である。 式中、ｐは整数であり、キトサン鎖中のモノマー単位の数（すなわち、重合度） を表わす。 上述のモノマー単位に加えて、キトサンは、通常、キチンで発見された一定割 合のモノマー単位を含んでいる。この割合は、脱アセチル化の程度による。一般 的に、脱アセチル化の程度は、９９％から１０％までの範囲、好ましくは９０％ から２０％までの範囲、さらに好ましくは８５％から４０％までの範囲にある。 複合体を形成するために使用される化学反応を制御することによって、ＰＥＧ 化形態へのキトサンの変換程度を変えることは可能であり、また、異なった薬剤 用途に対して一連のＰＥＧキトサン複合体を有することも可能である。ポリエチ レングリコール成分はＰＥＧキトサン複合体の溶解度を十分に増大し得る。また 、医薬品または核酸のような治療薬と混合したＰＥＧキトサン複合体の溶解度を 申し分無く増加することは重要である。 キトサン内のアミノ（ＮＨ₂）官能基のＰＥＧ化された形態への変換は１％か ら９９％までの範囲内で生じ得る。しかしながら、変換は１０〜９０％の範囲が 好ましく、さらに１０〜５０％の範囲が好ましい。 医薬品または生物学的膜と相互作用を行うため、または粘膜表面の密着結合を 修飾するため、または負電荷の微小粒子をコーティングするためにＰＥＧキトサ ン複合体を使用することを所望する場合、その時のＰＥＧキトサン複合体は残留 性の陽電荷を保持していなければならない。 １つの実施例では、ＰＥＧキトサン複合体は、オリゴヌクレオチドまたは核酸 （ＤＮＡ）のような負電荷の（陰イオン）物質と相互に作用し、かつ陰イオン種 の縮合に提供し得る十分な陽電荷を保持しているはずである。縮合に関しては、 原子力顕微鏡検査法または光子相関分光法等の方法により測定されるような粒度 の縮小を意味する。 別の実施例では、ＰＥＧキトサン複合体は、１００ミクロン未満の大きさの負 電荷の医薬品粒子、並びに、エマルジョン、リポソーム、ミクロ球体およびマイ クロカプセルのような薬剤送達に用いる予定の負電荷のコロイド状担体と相互に 作用し得るのに十分な陽電荷を有しているはずである。 さらに別の実施例では、ＰＥＧキトサン複合体は、ムチンまたは上皮細胞と相 互に作用するのに十分な陽電荷を有しているはずである。 高分子電解質錯体を形成するよう負電荷のポリマーとその複合体の相互作用を 検討することにより、ＰＥＧキトサン複合体上の陽電荷を求めることができるが 、このことはＴｅｒａｙａｍａによってＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ８ ２４３（１９５２）に記述されている。あるいは、約１ミクロンの大きさの ポリスチレン-ミクロ球体のようなポリマー粒子上にＰＥＧキトサン複合体を吸 収し、そしてＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒのような器具を使用した粒 子微量電気泳動法によって系統上の電荷を求めることができる。上述の陰イオン 種と相互に作用するのに十分な陽電荷に関しては、一般的に、１ｍＭのＨＥＰＥ Ｓ緩衝液中、ｐＨ７．４で、少なくとも１ｍＶ、好ましくは１〜２００ｍＶの範 囲でのゼータ電位として測定された電荷を示す。ＰＥＧキトサン複合体が十分な 陽電荷を保持するためには、キトサン中のアミン基の９０％以内をＰＥＧ化すべ きである。 当業者は、要求される薬剤用途を満たすのに必要な変換の程度を確認すること ができる。 ＰＥＧキトサン複合体の調製に使用されるキトサンは、１０ｋＤから１０００ ｋＤの範囲の分子量、より好ましくは１０ｋＤから５００ｋＤ、例えば、２０ｋ Ｄから５００ｋＤの範囲の分子量、特に好ましくは、３０ｋＤから３００ｋＤ、 例えば、１００ｋＤから３００ｋＤの範囲の分子量を有することができる。 ＰＥＧキトサン複合体の調製に使用されるキトサンのポリマー化の程度は一般 に５０〜６０００の範囲であるが、好ましくは１００〜３０００の範囲、特に好 ましくは１５０〜２０００の範囲である。 ＰＥＧキトサン複合体のポリエチレングリコール含有量は一般に１〜５０重量 ％、好ましくは５〜２０重量％である。 また、ヒドロキシル官能基の修飾によって誘導されたキトサンを使用すること ができる。 そのような誘導体には、Ｏ−ベンゾイルキトサンおよびＯ−硫酸化キトサン等の Ｏ−アシル化物質およびアルキル化物質があり、Ｃｈｉｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，Ａ Ｆ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，１９９２，ｐ．１６６に 記載されている。従って、本発明では、ＰＥＧキトサン複合体中のキトサン部分 はキトサン誘導体であってもよく、また、用語キトサンにはその誘導体を含んで いることを意図する。しかしながら、好ましくは、キトサンは未修飾である。 負電荷の表面を修飾するため、あるいはＤＮＡ、ＤＮＡプラス逆ドまたは核酸 のような負電荷の分子と複合体を形成するか相互に作用するために、ＰＥＧキト サン複合体を用いることができる。陽電荷のキトサンはそのような負の表面へ強 く結合することができ、その際に外部環境にＰＥＧ基を露出する。そのような露 出したポリエチレングリコール基は、立体化学的安定化を提供するのに役立つ。 これは、安定性の改良、例えばコロイド分散に役立つが、例えば、血流へ粒子を 注射したり、身体区分へ投与する場合、粒子表面へのタンパク質の取込みを最小 限にする点においてまた重要な生物学的関係を有する。 ＰＥＧキトサン複合体または付加物は、先行技術で公知の方法を用いて、高分 子材料へＰＥＧ成分が結合するよう調製することができる。 １つの実施例においては、次の工程からなる方法によりＰＥＧキトサン複合体 を調製する。 （１）ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体にアクリル酸エステル、アクリルチオエステ ルまたはアクリルアミド基を結合することによって活性化ＰＥＧまたは活性化Ｐ ＥＧ誘導体を調製し、 （２）活性化ＰＥＧまたは活性化ＰＥＧ誘導体とキトサンを反応させ、 （３）ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体とキトサンの複合体を回収する。 この方法は、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体とキトサンの間の反応を制御すること が可能である。 ＰＥＧ誘導体に関しては、修飾されたポリエチレングリコール、例えば、末端 の水酸基の一つまたは両方が予め修飾されたポリエチレングリコールを意味する 。適当なＰＥＧ誘導体としては、末端の水酸基がアルコキシ基、すなわち、式、 ＲＯ−（式中、Ｒはアルキルである）を有する基に変換されたアルコキシルＰＥ Ｇがある。好ましいＰＥＧ誘導体は、単一のアルコキシ末端基からなる誘導体で ある。好ましいアルコキシ基はメトキシのようなＣ_1-4アルコキシである。 アクリル酸エステル基を有するＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体の調製は、ヒドロキ シル官能基を含んでいるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体をアクリロイル塩化物と反応 させることによって行なうことができる。 アクリルチオエステル基を有するＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体の調製は、スルフ ィドリル基を含んでいるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体をアクリロイル塩化物と反応 させることによって行なうことができる。アクリルアミド基を有するＰＥＧまた はＰＥＧ誘導体の調製は、第一級アミン官能基または第二級アミン官能基の一つ を含んでいるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体をアクリロイル塩化物と反応させること によって実施することができる。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体は、ゲル透過クロマ トグラフィー(ＧＰＣ)、ＦＴ−ＩＲおよび紫外分光法により特性を決定すること ができる。Ｎ−アクリロイルモルフォリンまたはテトラエチレングリコールジア クリレートのような標準アクリルアミドまたはアクリル酸エステルを用いて２３ ３ｎｍで実施した検量の後で、過剰の２−メルカプトエタノールを添加し、調整 されたＫＩ／Ｉ₂溶液で過剰チオールを滴定することからなる末端基滴定、また は紫外分光法を行うことによって、活性化の程度を決定することができる。 活性化ＰＥＧまたは活性化ＰＥＧ誘導体は、乾燥剤の存在下に、Ｔ≦４℃で数 か月間保管することが可能である。さらに、４−メトキシフェノールのようなラ ジカル阻害剤を添加してラジカル重合を防止することができる。 活性化されたＰＥＧまたは活性化されたＰＥＧ誘導体のキトサンとの反応は、 好ましくは水溶性媒体において実施する。また、アルコールまたはアルコール／ 水混合物も用いることができる。反応媒体のｐＨは、好ましくは少なくとも８、 一般的には８〜９の範囲である。好ましい反応温度は２０〜３０℃の間であり、 一般的な反応時間は１２〜４８時間である。暗所で、４−メトキシフェノールの ようなラジカル阻害剤の存在する状態で、不活性雰囲気下に反応を導くことによ って、ビニルラジカル重合の発生を抑制する。ＰＥＧの分子量、またはＰＥＧ誘 導体の場合のＰＥＧ部分の分子量は、一般的に１〜３０ｋＤであり、好ましくは ２〜２０ｋＤであり、さらに好ましくは２〜１０ｋＤである。 ＰＥＧキトサン複合体または付加物の回収は、通常、水中での限外ろ過法によ って、または反応溶媒を蒸発させて新しい溶媒で粗製物質を抽出することによっ て実施する。 ゲル透過クロマトグラフィー(ＧＰＣ)、ＦＴ−ＩＲ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）お よび紫外分光法によって、付加物の純度を評価することができる。残留性の活 性化ＰＥＧまたは活性化ＰＥＧ誘導体に対するチェックは、通常、２３３ｎｍで 分光測光法により実施する。 その方法は、下記の理由により、先行技術で公知の他のＰＥＧ化方法に優る効 果を保持し得る。 （ａ）ｐＨ増加につれて、すなわち、遊離塩基の濃度の増加につれて反応速度が 増加するように、遊離塩基は二重結合と反応する種である。 （ｂ）反応中に副産物を生成しない。 （ｃ）グラフト反応の結果として、キトサン上のアミノ基のアミンの特徴を変化 させない。 別の実施例では、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体ではなくキトサンを活性化するこ とによる方法でＰＥＧキトサン複合体を調製している。キトサンの活性化は、キ トサンに対して大過剰のビス（アクリルアミド）を添加することによって達成す るのが好ましい。キトサンをビス（アクリルアミド）と反応させた後、好ましく は、過剰のビス（アクリルアミド）を除去し、その後、活性化されたキトサンを ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体、好ましくはヒドロキシル、スルフィドリルまたは第 １または第２アミノ基を保持する一官能価ＰＥＧと反応させた。 従って、本発明のさらなる態様では、次の工程からなるＰＥＧキトサン複合体 を調製する方法を提供する。 （１）ビス（アクリルアミド）とキトサンを反応させて活性化キトサンを調製す る。 （２）任意に過剰のビス（アクリルアミド）を除去する。 （３）活性化キトサンをＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、好ましくは、ヒドロキシ ル、スルフィドリルあるいは第１または第２アミノ基を保持する一官能価ＰＥＧ と反応させる。 （４）一官能価ＰＥＧおよびキトサンの複合体を回収する。 キトサンへのビス（アクリルアミド）のグラフトにより、キトサンがより可溶 性となるか、あるいは、少なくともｐＨ≧８でより増大する可能性がある。なお また、主要なポリマー鎖に接しているオリジナルのＮＨ₂基よりさらに反応しや すい反応性官能基を提供することが可能である。 さらに、ビス（アクリルアミド）を用いたキトサンの活性化により、より大量 のＰＥＧがキトサンにグラフトまたは結合することができる。 上述の方法によって調製されたＰＥＧキトサン複合体は、連結基または、式− ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ（０）−Ｒ²−Ｘ−を有するカップリング成分を介して互いに連結 されるキトサン部分およびＰＥＧ部分からなる。連結基は−Ｃ₂ＣＨ₂−基を介し てキトサン部分上のアミノ窒素に結合し、また、Ｘ基を介してＰＥＧ部分に結合 する。連結基のうち、Ｒ²は結合基または二価の有機基であり、Ｘは酸素、硫黄 、または−ＮＲ³−であり、Ｒ³はＨまたは例えばＣ_1-10アルキルのようなアルキ ル等の有機基である。 従って、本発明のさらなる態様では、次式を有するＰＥＧキトサン複合体を提 供する： −[Ｃｍ−ＮＲ¹ ₂]_p− Ｉ 式中： Ｃｍはキトサン部分を構成するモノマー単位の残余またはそのようなモノマー 単位の誘導体であり、 ｐは整数であり、キトサン部分の式−Ｃｍ−ＮＲ¹ ₂−のモノマー単位の数を表 わし、 各Ｒ¹は、少なくともＲ¹基の一部分が−ＡＰＥＧである条件で、互いに独立し てＨまたは−Ａ−ＰＥＧ基であり、 各ＰＥＧは互いに独立してポリエチレングリコール成分またはその誘導体であ り、 各Ａは、互いに独立して、−ＣＨ₂ＣＨ₂−基を介してキトサン部分上のアミノ 窒素に結合し、またＸ基を介してＰＥＧ部分結合する式−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ） −Ｒ²−Ｘ−を有する連結基であり、 Ｒ²は結合しているか又は二価の有機基であり、 Ｘは酸素、硫黄または−ＮＲ³−であり、 Ｒ³はＨまたは有機基であり、 あるいはそれらの生理学上許容し得る誘導体である。 上記の式Ｉに関して。 不正確を回避するため、Ｃｍをキトサン部分を構成するモノマー単位の残余と して言及する場合、我々は−ＮＨ₂基とともにキトサンで確認された十分なモノ マー単位を構成する基を言及している。従って、完全なモノマー単位それ自体は 式Ｃｍ−ＮＨ₂を有している。そのようなモノマー単位の誘導体に関して言えば 、我々は、水酸基が修飾された生理学上許容し得る誘導体を言及している。適当 な誘導体としては、Ｃｈｉｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｆ Ｒｏｂｅｒｔ ｓ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，１９９２，ｐ．１６６に記載されているようなＯ−ベ ンゾイルキトサンおよびＯ−硫酸化キトサン等のＯ−アシル化物質およびアルキ ル化物質がある。 Ｃｍは好ましくはキトサンを構成するモノマー単位の残余である。 ｐは、好ましくは５０〜６０００の範囲、さらに好ましくは１００〜３０００ の範囲、特に好ましくは１５０〜２０００の範囲の整数である。 ＰＥＧは、好ましくは、式、Ｒ⁴−（−ＯＣＨ₂Ｈ₂−）_n−を有する修飾された ポリエチレングリコール成分であり、式中、Ｒ⁴はアルキル、シクロアルキル、 アリールまたはアルアルキル基のような脂肪族、脂環式または芳香族の炭化水素 基で、ｎは整数である。好ましくは、Ｒ⁴はアルキルであり、さらに好ましくは Ｃ_1-10アルキル、例えば、Ｃ_1-4アルキルであり、特に好ましくはメチルである 。ｎは１０〜１０００の範囲が適当であり、更に好ましくは１０〜１００の範囲 が適当である。 Ｒ²は、好ましくは、次式を有する結合基または二価の有機基である。 式中、Ｒ⁵は連結基Ａのカルボニル（Ｃ(Ｏ)）基に結合する二価の有機基である 。Ｒ⁵は上述の式ＩＩのカルボニル基に結合し、また窒素原子を介して連結基Ａ のカルボニル基に結合するのが好ましい。さらに好ましくは、Ｒ⁵は次式を有す る基である。または 式中、各Ｒ⁶は互いに独立して直鎖または分枝したＣ_1-4アルキル鎖であり、Ｒ⁷ は二価の有機基、特に直鎖または分枝したＣ_1-4アルキレン鎖であり、Ｒ⁸、Ｒ⁹ 、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は互いに独立してＨあるいは直鎖または分枝したＣ_1-3アルキ ル鎖である。 Ｘは、好ましくは酸素または−ＮＲ³−である。 Ｒ³の適当な有機基としては、アルキル、例えばＣ_1-10アルキルのような炭化 水素基がある。好ましくは、Ｒ³はＨである。 上述の２つの方法によって得られたＰＥＧキトサン複合体の構造は多少異なる 。例えば、次の構造を有するアミノ化モノメトキシ−ＰＥＧを使用する場合、Ｃ Ｈ₃-(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_n-ＯＣＨ₂ＣＨ₂-ＮＨ₂ Ｖ および、次式で表されるキトサンを使用する場合、 の第一アミン基を表わす。）アクリルアミド基でアミノ化されたモノメトキシ− ＰＥＧを活性化し、その活性化された化合物を次の構造を有するキトサンと反応 させることによって複合体を作製する。 対照的に、次の構造を有するビス（アクリルアミド）と反応させることによっ て活性化されたキトサンを代替方法として使用する場合、 （式中、Ｒ５は次式を有する基である。） または、 対応する複合体は次の構造を有している： 式中、Ｒは水素または同一方法でキトサンに結合した別のＰＥＧ鎖であり、それ はアクリルアミド（方法１）またはビス（アクリルアミド）(方怯２)を介して結 合しており、Ｒ⁶は直鎖又は分枝したＣ_1-4アルキル鎖であり、Ｒ⁷は直鎖又は分 枝したＣ_1-4アルキレン鎖であり、また、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は互いに独 立してＨまたは直鎖又は分枝したＣ_1-3アルキル鎖である。医薬品ターゲッティ ングおよび薬物送達において、並びに画像診断およびワクチン・システムの投薬 において、乳濁液、リポソーム、ミクロ球体、マイクロカプセルおよびナノ粒子 の形態の分散粒子を使用する。そのような粒子はしばしば有効負電荷を保持する 。多くの場合、表面修飾の方法によってこの負電荷を修飾し得ることは重要であ る。例えば、上述のように、キトサンの吸着によってリポソームの特性を変更す ることが可能である。粒子が陽電荷だけでなくポリエチレングリコール基も保持 するようにＰＥＧキトサン系を用いてそのような粒子を修飾することが本発明に よりまさに可能となり、それは立体化学的安定化および有用な生物学的製剤およ び物理的性質を提供する。 遺伝子治療の分野において、改良投薬のための小粒子へ核酸からなるプラスミ ド物質を縮合することができるということは多くの場合重要である。我々は、Ｐ ＥＧキトサン複合体が縮合プラスミドＤＮＡに利用できることを発見した。生成 された縮合物は、細胞と遺伝産物のその後の発現の相互作用において溶解度およ び有用な特性を増強するはずである。 本明細書に記述したＰＥＧキトサン物質は、さらに、部位特異的ターゲッティ ングを達成するヒドロキシルおよび未修飾のアミノ官能基へのターゲッティング リガンドの結合によって修飾することができる。そのようなリガンドは、糖類お よびタンパク質の形態をとり得る。後者にはモノクローナル抗体およびその断片 を含むことができる。糖にはマンノース、フコースおよびガラクトースが含まれ る。糖の選択は、標的部位として同定される組織または細胞の性質によって決定 する。例えば、ＤＮＡとＰＥＧキトサンの複合体は、３つのアンテナ状（ｔｒｉ ａｎｔｅｎｎａｒｙ）ガラクトース成分との共有結合により肝臓を目標とするこ とができる。 図１は、キトサンまたはＰＥＧキトサンでコーティングされたポリスチレン粒 子（１９０ｍｎ）の特性に対して硫酸ナトリウムの添加の作用を示すグラフであ る。 図２は、キトサンおよびＰＥＧキトサンとＤＮＡの間に形成された複合体のサ イズに対してキトサンおよびＰＥＧキトサン濃度の増加の作用を示すグラフであ る。 図３は、ＤＮＡ／エチジウムブロマイド複合体の蛍光に対しキトサンおよびＰ ＥＧキトサンの添加の作用を示すグラフである。 以下の実施例を参照しながら本発明をここに説明するが、これに制限されるも のではない。 実施例１ 活性化ＰＦＧを用いたＰＥＧキトサンの調製 （Ａ） モノメトキシ−ＰＥＧピペラニジルギ酸塩（ＭＰＥＧ−ＰＦ）の調製 "アルコールフリー"のＣＨＣｌ₃（６０ｍｌ）にモノメトキシ−ＰＥＧ １９０ ０（１２．２６ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を溶解した。その溶液を水素化カルシウ ム上で一晩乾燥し、濾過によってそれを除去した。その後、９７％の純度の１， １’−カルボニルジイミダゾール（２．１６ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を添加し、 得られた溶液は、冷水（１０ｍｌ）を添加し、１０分間その混合物を撹拌した後 、３０分間、３０℃で静置した。相分離後、有機相に無水ピペラジン（０．５６ ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で２０時間反応させた。その後、その 溶液をＣＨＣｌ₃（１００ｍｌ）で希釈し、水で抽出し(５×３０ｍｌ)、硫酸ナ トリウムで乾燥し、ろ過し、６０ｍｌまで真空内で濃縮し、約１０℃でジエチル エーテルへ最終的に注いだ。沈殿した粉末を濾によって収集し、０．１トールで 恒量まで乾燥した。収量は１０．６４ｇだった。ＧＰＣクロマトグラムは、保持 時間１０３０秒で１つのピークを示した。ＦＴ−ＩＲスペクトルは、１７０３ｃ ｍ^-1のウレタン領域でバンドを示した。０．１ＭのＨＣｌを用いた電位差滴定に よって決定された分子量は２１９０であった。 （Ｂ） モノメトキシ−ＰＥＧアクリルアミド（ＭＰＥＧ−ＡＡ）の調製 無水の"アルコールフリー"のＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）にＭＰＥＧ−ＰＦ（７． ０７ｇ、３．２３ｍｍｏｌ）を溶解し、蒸留水（２ｍｌ）を添加した。その後、 ＣＨＣｌ₃（４．８ｍｍｏｌ）に溶解したアクリロイル塩化物の２Ｍ溶液２．４ ｍｌ、および２ＭのＮａＯＨ水溶液（４．８ｍｍｏｌ）２．４ｍ１を、約５℃に 温度を維持しながら激しい撹拌のもとに、ともに滴下して添加した。添加が完了 したならば、その反応液を２５℃の暗所にて１時間撹拌しながら置いた。５％Ｋ ＮＯ₃（２×３０ｍｌ）および水（１×３０ｍｌ）を用いて分液漏斗中で洗浄し た。硫酸ナトリウムで乾燥し濾過した後、真空内でほとんどのＣＨＣｌ₃を蒸発 させることによって容量を約５０ｍｌまで減らした。その後、ジエチルエーテル （２００ｍｌ）で溶液を希釈した。沈殿した生成物を濾過によって収集し、０． １トールで恒量まで乾燥させた。収量は６．０５ｇであった。ＧＰＣクロマトグ ラムは、保持時間１０２０秒で１つのピークを示した。ＦＴ−ＩＲスペクトルは 出発物のＭＰＥＧ−ＰＦに非常に類似していたが、１６４９ｃｍ^-1でアミドのバ ンドを示した。Ｎ−アクリロイルモルフォリンの検量線を用いて、水中で２３３ ｎｍにおける分光測光法で検出した分子量は２３００であった。 （Ｃ） キトサンのＰＥＧ化 その混合物のｐＨを、３：１のＨ₂Ｏ／ＣＨ₃ＯＨ混合物に溶解したトリエチル アミンを激しく撹拌した状態で滴下することによってｐＨ８まで上げた。ｐＨ＞ ７で沈澱物が形成された。１０日間、暗所で、窒素雰囲気下において２５℃でそ の反応液を撹拌した。希釈された塩酸の添加によってｐＨを３〜４にし、得られ た溶液を凍結乾燥した。その粉末を収集し、ソックスレー器具にて３：１のジエ チルエーテル／ＣＨ₂Ｃｌ₂混合物を用いて抽出し、恒量まで真空にて乾燥した。 収量は１．２０ｇであった。 水中で記録されたＵＶスペクトルは２３３ｎｍにいかなるピークも示さず、こ れは残留性ＭＰＥＧ−ＡＡが存在しなかったことを表している。ＦＴ−ＩＲスペ クトルでは、約１７００ｃｍ^-1にショルダー部を検出したが、それは天然キトサ ンに対するスペクトルが消失したもんどえあり、グラフトされたＰＥＧの存在を 示している。生成物(Ｃ：３７．６９％、Ｈ：７．１７％、Ｎ：５．７８％、Ｃ １：１４．０９％)、開始時のキトサン(Ｃ：３４．９１％、Ｈ：６．４２％、Ｎ −６．５６％、Ｃｌ：１７．０４％)、およびＭＰＥＧ−ＡＡ（Ｃ：５４．４９ ％、Ｈ：８．８７％、Ｎ：１．２５％）で実施された元素分析は、ＰＥＧ容量が 重量で１４％であることを確証した。生成物および天然キトサンの両方で実施し た塩化物イオンのモール滴定法によりこの値を確認した。 １０，０００〜５００，０００ダルトンの範囲の分子量を有しているキトサン および７５０〜１０，０００ダルトンの分子量を有しているポリエチレングリコ ール物質からＰＥＧキトサン複合体を調製するため、上述の同一方法を用いた。 ＰＥＧ化された形態へキトサンを変換する程度は、化学反応によって制御するこ とができる。 ＰＥＧキトサン複合体を調製する上記の方法では、ｐＨ＞７でキトサンの溶解 度を増加させることが有効であり、また、塩酸と比較した場合、ｐＨ約７でイソ 酪酸がより可溶性を有するキトサン塩を生じ得ることがわかった。 実施例２ 活性化キトサンを用いたＰＥＧキトサンの調製 （Ａ） モノメトキシ−ＰＥＧピペラニジルギ酸塩（ＭＰＥＧ−ＰＦ）の調製 モノメトキシ−ＰＥＧ１９００の代わりにモノメトキシ−ＰＥＧ５５０（３． ５５ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を使用する以外、上記の実施例１（部分Ａ）に記述 したのと全く同一の方法を用いて、モノメトキシ−ＰＥＧピペラニジルギ酸塩（ ＭＰＥＧ−ＰＦ）を調製した。収量は５．１８ｇであった。 （Ｂ） キトサンのＰＥＧ化 イソ酪酸（０．２２ｇ、２．５ｍｅｑ）を含む蒸留水（３０ｍｌ）にキトサン （Ｆｌｕｋａ；ＭＷ＝７００００）(０．４０ｇ、２．５ｍｅｑ)を溶解した。そ の後、キトサン溶液に１，４−ビス（アクリロイルピペラジン）(２．４３ｇ、 １２．５ｍｍｏｌ)を加え、窒素雰囲気下に、暗所にて２５℃で２４時間反応さ せた。クロロホルムを用いて抽出することによって(８×５ｍｌ)、未反応の１， ４−ビス（アクリロイルピペラジン）を除去した。その後、水相にＭＰ ＥＧ−ＰＦを添加し(３．２５ｇ、５．０ｍｅｑ)、イソ酪酸の添加によってｐＨ ７に調節し、窒素雰囲気下で、暗所にて、２５℃で１０日間反応させた。その溶 液を凍結乾燥し、ソックスレー器具で３：１のジエチルエーテル／ＣＨ₂Ｃｌ₂混 合物を用いて抽出し、恒量まで真空内で乾燥した。収量は０．３８ｇであった。 １７００ｃｍ^-1で確認されたピークを伴ったＦＴ−ＩＲ分光法によってキトサ ン上へのＰＥＧのグラフトを確認したが、これはＰＥＧピペラニジルギ酸塩に特 有の結果であり、また、天然キトサンが存在しないことを示している。キトサン に特有である１６３０ｃｍ^-1でのそのピークに対するこのピークのエリアの比率 から、ＰＥＧ容量が重量で約２０％であると計算した。 実施例３ コロイド粒子へのＰＥＧキトサンの物理吸着 粒子へのＰＥＧキトサンの物理吸着を説明するために、モデル系としてポリス チレン・ナノ粒子を使用した。ポリスチレン粒子をＩＤＣ Ｓｐｈｅｒｅｓ、Ｉ ｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｃｏｒｐ．ＵＳＡから購入した。負 の硫酸基で粒子を安定させた。未修飾の格子の粒度をフオトン相関分光法（ＰＣ Ｓ）(Ｍａｌｖｅｒｎ Ｓ４７００，ＵＫ)によって測定したところ、１９０ｎｍ であった。 キトサン（ＳｅａＣｕｒｅ ＣＬ １１３）またはＰＥＧキトサン複合体のい ずれかでポリスチレン粒子の試料をコーティングした。ＰＥＧキトサン複合体は 、Ｐｒｏｎｏｖａ Ｌｔｄ.，Ｎｏｒｗａｙから入手したキトサンＳｅａＣｕｒ ｅ ＣＬ １１３から実施例１のようにして調製した。キトサンは、約５０ｋＤ の平均分子量、および１５３ｍｌ／ｇの固有粘度を有していた。アミノ官能基の 約１２％をアセチル化した(８８％を脱アセチル化した)。結合しているＰＥＧの 平均分子量は２１００で、ＰＥＧ化の程度は１５％であった。 １０ｍｌガラス試験管（０〜１００μｇ）に、純水１．５ｍｌとともに、異な る量のキトサンおよびＰＥＧキトサン複合体を添加した。激しく２時間撹拌しな がら、ポリスチレン粒子の０．１％懸濁液０．５ｍｌを滴下して添加した(５０ ０μｇの粒子を示す)。１ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中、ｐＨ７．４で、Ｍａｌｖ ｅｒｎ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ(Ｍａｒｋ ＩＶ)、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫを使用して、粒子のゼータ電位に対する吸着されたキ トサンおよびＰＥＧキトサンの効果を測定した。 コーティングしていないポリスチレン粒子は、−５０ｍＶのネット負電荷を保 持していた。キトサンまたはＰＥＧキトサンの添加は、Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒを 使用して測定した場合、迅速な電荷逆転を生じ、ポリスチレン粒子は、水溶性緩 衝液２ｍｌに懸濁されたポリスチレン粒子５００μｇへのキトサンまたはＰＥＧ キトサン１００μｇの添加により＋２０ｍＶのネット陽電荷を生じた。従って、 キトサンおよびＰＥＧキトサンはともに強く負電荷のコロイド粒子に吸着する性 能を有しており、電荷を逆転する。ゼロ電荷点へは、その系へのキトサンの１２ μｇの添加、およびその系へのＰＥＧキトサンの１８μｇの添加後に到達したが 、ＰＥＧ化された物質とＰＥＧ化されなかった物質の間の差を示している。系へ のキトサンまたはＰＥＧキトサンの同一量の添加について、類似した差を見い出 すことができた。例えば、陽イオン性ポリマーに２０のμｇを添加した場合、キ トサン系に対してゼータ電位は＋１３ｍＶであり、ＰＥＧキトサン系に対しては ＋５ｍＶであった。 １９０ｎｍのポリスチレン粒子のような負電荷コロイドに陽電荷ポリマーを添 加すると凝集が生じる。測定の前に分散媒で５０：５０に希釈の後、６００ｎｍ で系の光学密度（ＯＤ）を測定することによりこの過程を調査した。キトサンの 添加については、０．６８の最大ＯＤを得るのに必要な陽イオン性ポリマーの濃 度は５μｇであった(４ｍｌにポリスチレン粒子５００μｇに添加)。ＰＥＧキト サン系については、４ｍｌに懸濁された５００μｇポリスチレン粒子にＰＥＧキ トサン１０μｇを加えた場合、０．６６の最大ＯＤを得た。従って、キトサンお よびＰＥＧキトサンはともに負電荷のモデルコロイド粒子の凝集を引き起こすが 、要求される量はＰＥＧキトサンとキトサンの間の差が示されたように異なって いた。 コーティングした粒子が凝集に抵抗性を示す性能について、硫酸ナトリウムの 添加による作用を検討して測定した。１：５の粒子に対するキトサンまたはＰＥ Ｇキトサンの重量比率を使用して、コーティングしたポリスチレン粒子（１９０ ｎｍ）の硫酸ナトリウム誘発性凝集について測定した。コーティングした粒子の 特性を評価するため、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ）を使用した。 図１は、キトサンおよびＰＥＧキトサンでコーティングされたポリスチレン粒 子（１９０ｎｍ）の特性に対する添加硫酸ナトリウムの作用をそれぞれ示す。（ ０〜１．６Ｍの硫酸ナトリウム溶液中、ポリマー０．２ｍｌで粒子をコーティン グ(１０μｇキトサンまたはＰＥＧキトサン／５０μｇポリスチレン)）低濃度の 硫酸ナトリウムは、キトサンおよびＰＥＧキトサンコーティング粒子の両方に影 響した(未コーティング粒子では、ＯＤの変化が開始されるのに少なくとも０． ２５Ｍの硫酸ナトリウムが必要であった)。キトサンコーティング粒子のＯＤは ０．８Ｍ以上の硫酸ナトリウム濃度で定数を維持していたが、ＰＥＧキトサンコ ーティング粒子はＯＤに変化を示した。これらの結果は、コーティング物質とし てのキトサンとＰＥＧキトサンの間の差を改めて示している。 実施例４ キトサンおよびＰＥＧキトサンの凝集 ２つの陽イオン性ポリマーの溶液の凝集を誘発する硫酸ナトリウムによって、 キトサンおよびＰＥＧキトサンの異なる特性を測定することができる。実施例３ に記述した２つの異なる量のキトサンおよびＰＥＧキトサン、０．１ｍｇおよび １ｍｇを水０．４ｍｌに懸濁した。その後、硫酸ナトリウムを添加して凝集を引 き起こした。凝集の程度を６００ｎｍのＯＤとして前述のように測定した。０． ２Ｍの硫酸ナトリウム濃度で、以下のＯＤ値を得た。 ＰＥＧキトサン（０．１ｍｇ） ＯＤ＝０．００５ キトサン（０．１ｍｇ） ＯＤ＝０．０２ ＰＥＧキトサン（１ｍｇ） ＯＤ＝０．０４５ キトサン（１ｍｇ） ＯＤ＝０．１３ 結果は陽イオン性ポリマーの同一濃度に対する値を示しているが、ＰＥＧキト サン系はキトサンより硫酸ナトリウム誘発性凝集に対し安定性がある。 実施例５ ＰＥＧキトサンを用いたＤＮＡの縮合−物理化学的試験 キトサンを用いたＤＮＡの縮合およびＰＥＧキトサン複合体を用いたＤＮＡの 縮合の間の違いを示すために、モデルプラスミド物質を使用した。これは、クロ ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、いわゆるリポーター遺 伝子系をコードするプラスミドＣＭＶ−ＣＡＴの形態をしてい名。ｐ−ＣＡＴ物 質は、Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｃ.，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＵＳＡから入 手した。 プラスミドと陽イオン性ポリマーの間の相互作用については、以下の工程を含 む種々の方法によって実施可能である。 （１） 光量子相関分光法を用いた複合体上の粒度測定。 （２） 粒子微量電気泳動法を用いたプラスミド錯化剤複合体のゼータ電位の測 定。 （３） 臭化エチジウム存在下でのプラスミドＤＮＡ物質の蛍光の研究によるプ ラスミドの縮合状態の測定。 （４） 陽電荷のポリマー複合体と負電荷のＤＮＡ物質の間の相互作用における 熱を検出する滴定マイクロ熱量計測。 この実施例および次の実施例６において、キトサンを用いた縮合とＰＥＧキト サン系を用いた縮合の間の違いを示すため、上述の技術のいくつかを使用した。 ＳｅａＣｕｒｅ ＣＬ １１３の試料からＰＥＧキトサンを調製し、アミノ官能 基の約１２％をアセチル化した。方法は実施例１に記述した方法を使用した。キ トサンへ結合したＰＥＧの平均分子量は２１００であった。対照として未修飾の キトサンＳｅａＣｕｒｅ ＣＬ １１３を使用した。 光量子相関分光法およびゼータ電位測定について。 ｐＣＡＴ−ＤＮＡ／キトサンまたはｐＣＡＴ−ＤＮＡ／ＰＥＧキトサン複合体 は、異なるｐＣＡＴ−ＤＮＡ／ポリマー比率を生じるように以下の方法で調製し た。 超純水２ｍｌに溶解した８１．１μｇ（１００μｌ）のｐＣＡＴ−ＤＮＡを、 撹拌下に５２５μｇのキトサンまたはＰＥＧキトサン（０．１５％溶液の０．３ ５ｍｌ）とゆっくり混合し、１：６．５のｐＣＡＴ−ＤＮＡ：ポリマー重量比率 を得た。 超純水２ｍｌに溶解した８１．１μｇ（１００μｌ）のｐＣＡＴ−ＤＮＡを、 撹拌下に８１０μｇのキトサンまたはＰＥＧキトサン（０．１％溶液の０．８１ ｍｌ）とゆっくり混合し、１：１０のｐＣＡＴ−ＤＮＡ：ポリマー重量比率を得 た。 Ｍａｌｖｅｒｎ Ｓ４７００ ＰＣＳおよびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ Ｓｉ ｚｅｒ（Ｍａｒｋ ＩＶ）をそれぞれ使用して、キトサンおよびＰＥＧキトサン 複合体の大きさ、並びに水中およびｐＨ７．４における１ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝 液中のそれらのゼータ電位を検出した。表１から、キトサンＤＮＡ複合体の表面 の特性が本発明の対象である複合体から生成されたＤＮＡ複合体の特性とは異な ることが確認できる。この複合体の改良された溶解度および粒子電荷の違いが、 生物学的反応に有効であると思われる。面白いことに、ＤＮＡとキトサンおよび ＰＥＧキトサンによって形成された複合体は、ＰＣＳにより測定されるような約 １４０ｎｍの小さい大きさのナノ粒子を生成した。 当業者は、プラスミドＤＮＡおよび成形ポリマーの間で得られた複合体の大き さは、相互作用する構成部分の比率および処理条件（すなわち混合速度）の影響 を受けることを理解するであろう。 表１ キトサン（ＰＥＧキトサン）／ＤＮＡ複合体の粒度およびゼータ電位 実施例６ この実施例では、選択されたプラスミドＤＮＡ物質（ＣＭＶ−ＣＡＴ）および ＰＥＧキトサンの間の相互作用について、さらなる研究を実施した。プラスミド の濃度は１ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧキトサンの濃度は５００μｇ／ｍｌであった。Ｐ ＥＧキトサンを１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、その溶液からいず れの微粒子も除去した。水１ｍｌに溶解したＤＮＡ５０μｇの溶液に、１：０． ２５のＤＮＡ：ＰＥＧキトサン電荷比までＰＥＧキトサン溶液同等物の試料を添 加した。その溶液を５分間撹拌し、その後１０分間、複合体まで放置した。 光量子相関分光法を使用して、複合体の大きさを検出した。その後、さらにＰ ＥＧキトサンの部分試料を添加した。 図２は、反応生成物複合体の大きさに対する増加するキトサンおよびＰＥＧキ トサン濃度の作用を示す。低濃度のキトサンまたはＰＥＧキトサンでは、プラス ミドＤＮＡを縮合する十分なポリマーとはならない。しかしながら、ＤＮＡ：Ｐ ＥＧキトサンまたはＤＮＡキトサンが０．７５〜１．５の間の比率では、１：１ に近い電荷比で１９０ｎｍ末満まで大きさが低減した複合体を形成する。さらに ポリマー濃度が増加するにつれて、複合体の大きさも大きくなる。その結果、ポ リマーとＤＮＡの複合体生成については、添加するＰＥＧキトサンの量が重要性 であることが明らかである。また、さらにその結果は、ＰＥＧ官能基の存在はキ トサンの縮合特性にほとんど影響しないことを示している。キトサン複合体と比 較してＰＥＧキトサン複合体がより大きな大きさであるのは、立体化学的バリア を提供するＰＥＧ基によるものと考えられる。 蛍光試験について。 標識物質として臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を用いた蛍光定量方法により、キ トサンおよびＰＥＧキトサンとのＤＮＡ複合体の相互作用を調査した。プラスミ ドＤＮＡは臭化エチジウムと強く相互に作用し(挿入)、強い蛍光を示す。しかし 、プラスミドが縮合した場合には蛍光は著しく減少し、置換されたことを示す。 蛍光の減少について以下のように測定した。 プラスミドＤＮＡ８．１１μｇを臭化エチジウム２μｇと混合した。この複合 体の蛍光は、蛍光分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ３０００，ＵＫ）を使用 して、５９１ｎｍでの発光および３６６ｎｍでの励振を検出した。複合体にキト サンまたはＰＥＧキトサンの１μｇ部分試料を漸増的に添加し、複合体の減少し た蛍光を測定した。キトサン（ＣＬ １１３）およびＰＥＧキトサンを使用して 、臭化エチジウム置換の有効性を比較した。 置換反応を図３に示す。図３から明らかなように、キトサンを用いた選択され たプラスミドＤＮＡ物質の縮合は、ＰＥＧキトサンを用いた縮合と異なった性質 を表している。 キトサン（ＣＴＳ）については、図３から計算したキトサンの添加が７．４７ μｇとなった場合、置換反応が終了している。ＰＥＧキトサン（ＰＥＧ−ＣＴＳ ）については、この値が１０．６６μｇであった。この点でのＤＮＡ：キトサン の重量比率は１：０．９２、ＤＮＡ：ＰＥＧキトサンの重量比率は１：３１であ った。 キトサンより多くのＰＥＧキトサンを添加して重量方式における置換反応を終 了するようにしたところ、２つのポリマーのモル濃度は非常に近づいた。すなわ ち、キトサンは０．０３３μｍｏｌ、ＰＥＧキトサンは０．０３９μｍｏｌであ った。 この実施例は、キトサンのＰＥＧ化が、キトサンがプラスミドＤＮＡと強く相 互に作用する機能に実質的に影響しないことを説明している。 マイクロ熱量計測について。 恒温滴定マイクロ熱量計測として公知の方法を用いた反応の間に生じた熱交換 によって、キトサンおよびＰＥＧキトサンと負電荷のプラスミドの間の相互作用 を評価した。熱変化をモニターするため、スウェーデンの温度測定のモデル２２ ７７から利用可能な熱活性モニターを使用した。 その方法では、指定された時間的間隔で、２つのＤＮＡ溶液へ精密注射器から キトサンまたはＰＥＧキトサンの溶液を注入した。８１．１μｇのｐＤＮＡを含 むＤＮＡ溶液２．０ｍｌを各実験に対し使用し、キトサンおよびＰＥＧキトサン の溶液０．３５ｍｌを３５回の１０μｌ注入により添加した。２つの注入間の時 間的間隔は約１０分であった。 キトサンまたはＰＥＧキトサンの各注入は熱の展開(発熱過程)または吸収(吸 熱過程)を生じ、それを熱活性モニターによってピックアップして一連のピーク として記録し、その値を算出した。熱変化は各添加後に測定した。 また、０．３５ｍｌのキトサンおよびＰＥＧキトサンの溶液を３５回の１０μ ｌ注入により２．０ｍｌの蒸留水に添加し希釈熱を検出し、その後、キトサンお よびＰＥＧキトサンとＤＮＡ溶液の間の相互作用から生じた測定された熱交換値 から減算した。 最初、ＤＮＡとキトサンおよびＰＥＧキトサン両方の間の相互作用は、多量の キトサンおよびＰＥＧキトサン溶液を添加した時それほど発熱しない発熱過程を 示したが、やがて吸熱過程になった。 その相互作用は、吸熱反応を提供するのに必要とされるキトサンまたはＰＥＧ キトサンの量の測定結果に対応する。その後、この時点でのキトサンまたはＰＥ Ｇキトサンに対するＤＮＡの比率を計算した(表２)。 表２ キトサンまたはＰＥＧキトサンとプラスミドＤＮＡの間の相互作用 相互作用の化学量論は計算することが可能である。 リン酸基当たりのプラスミドＤＮＡの平均分子量は３０８．８ダルトンとして 計算した。アミノ基当たりのキトサン（８７％の脱アセチル化）の平均の分子量 は２２７．９ダルトンとして計算した。アミノ基当たりのＰＥＧキトサン(１５ ％ｗ／ｗのＰＥＧ ２１００、８７％の脱アセチル化)の平均の分子量は２７３ ．９ダルトンとして計算した。 反対荷電単位（あるいはモル比率）の比率が１：１である場合、重量によるＤ ＮＡ対キトサンの比率は１：０．７４であり、また、重量によるＤＮＡ対ＰＥＧ キトサンの比率は１：０．８９である。これらの理論値は、マクロ熱量測定法試 験から得られた実験結果に非常に近い。これらの結果は、ＰＥＧキトサンがＤＮ Ａと相互に作用し、複合体を形成し得ることを示している。 本発明は、薬物送達におけるＰＥＧキトサン物質の利用を提供する。ＰＥＧ部 分は有利な特性、特にキトサン物質の物理化学的特性、および陽量荷（ＰＥＧ化 されなかったキトサンのそのＮＨ₂基からの）とＰＥＧ−修飾アミノ基の結合を 提供することが可能な表面、粒子およびＤＮＡとキトサンとの相互作用に関する 特性を与えることができる。さらに、ＰＥＧキトサンは、キトサン自体について すでに記述したように医薬品の傍細胞送達を改良することができる。なおまた、 胃腸管、膣腔、鼻および口腔への投薬に対して、ＰＥＧキトサン複合体はミクロ 球体、微小粒子およびマトリックスの形態の徐放物質として用いることができる 。 また、その複合体は、キトサンが好ましくは粘液に結合するような眼に対する 医薬品の投与に用いることが可能である。さらにドライアイ症候群の治療にその ような薬剤を使用してもよく、その場合、ＰＥＧ部分は立体化学的安定化および 潤滑作用を提供する。先行技術で公知の点眼薬系を用いて、眼にこれらの生成物 を提供することが可能である。 アルギン酸塩、キサンタン、デキストラン硫酸およびゲル化剤のような炭水化 物とのＰＥＧキトサン複合体は、薬物送達用途においてゲルとして有用なものと なりうる。さらに、ＰＥＧキトサンは、ヘパリンおよびその他の負電荷の高分子 医薬品と相互に作用して複合体を形成することが可能である。ＰＥＧキトサンを 基剤とした液体または粉末等の鼻腔および膣用生成物は、噴霧ポンプ、粉末注入 器または注射器のような従来の器具によって送達することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年７月１６日（１９９９．７．１６） 【補正内容】 請求の範囲 １． キトサン部分又はその誘導体と、活性化したキトサン種の使用によってキ トサン上のアミノ官能基を経て一緒に結合されるポリエチレングリコール部分又 はその誘導体とを含むポリマー複合体。 ２． 活性化したキトサン種がビス(アクリルアミド)を用いて調製される請求項 １記載の複合体。 ３． 複合体のキトサン部分が１０キロダルトンから１０００キロダルトンまで の範囲内の分子量を有し、且つ複合体のポリエチレングリコール部分が少なくと も１キロダルトンの分子量を有する請求項１記載のポリマー複合体。 ４．式： −[Ｃｍ−ＮＲ¹ ₂]_p− Ｉ 式中： Ｃｍはキトサン部分を作るモノマー単位又はそのようなモノマー単位の誘導体 の残部である； ｐは、キトサン部分において式−Ｃｍ−ＮＲ¹ ₂−のモノマー単位の数を表す、 それぞれのＲ¹は独立して、Ｈ又はＲ¹基の１から９９％までが−Ａ−ＰＥＧで あるという条件で基−Ａ−ＰＥＧである； それぞれのＰＥＧは、独立してポリエチレングリコール部分又はその誘導体で ある； それぞれのＡは独立して−ＣＨ₂ＣＨ₂−基を経てキトサン部分上のアミノ窒素 に、及びＸ基を経てＰＥＧ部分に結合される、式−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ(Ｏ)−Ｒ²− Ｘ−を有する連結基である； Ｒ²は結合又は二価有機基である； Ｘは酸素、硫黄又は−ＮＲ³−であり；及び Ｒ³はＨ又は有機基である、 を有するＰＥＧ-キトサン複合体、又は生理学的に許容されるその誘導体。 ５． Ｃｍがキトサンを作るモノマー単位の残部である請求項４記載の複合体。 ６． ｐが５０から６０００までの範囲内の整数である請求項４又は５記載の複 合体。 ７． ｐが１５０から２０００までの範囲内の整数である請求項６記載の複合体 。 ８． ＰＥＧが、式Ｒ⁴−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_n−(式中Ｒ⁴は脂肪族、環式脂肪族又は 芳香族炭化水素基であり且つｎは整数である)を有する修飾したポリエチレング リコール部分である請求項４から７のいずれか１項記載の複合体。 ９． Ｒ⁴がアルキルである請求項８記載の複合体。 １０． Ｒ⁴がメチルである請求項９記載の複合体。 １１． Ｒ²が、結合した、又は式： ［式中Ｒ⁵は、連結基Ａのカルボニル(Ｃ(Ｏ))基に結合される二価の有機基であ る］を有する二価の有機基である請求項４から１０のいずれか１項記載の複合体 。 １２． Ｒ⁵が式ＩＩ中のカルボニル基及び窒素原子を経て連結基Ａのカルボニ ル基に結合される請求項１１記載の複合体。 １３． Ｒ⁵が、式： 又は ［式中、それぞれのＲ⁶は、独立して直鎖又は分枝したＣ_1-4アルキル鎖であり、 Ｒ⁷は二価の有機基であり、Ｒ⁸，Ｒ⁹，Ｒ¹⁰とＲ¹¹は、それぞれ独立してＨ又は 直鎖又は分枝したＣ_1-3アルキル鎖である］ を有する基である請求項１２記載の複合体。 １４． Ｒ⁷が直鎖又は分枝したＣ_1-4アルキル鎖である請求項１３記載の複合体 。 １５． Ｘが酸素又は−ＮＲ³−である請求項４から１４のいずれか１項記載の 複合体。 １６． Ｒ³がアルキル又はＨである請求項４から１５のいずれか１項記載の複 合体。 １７． 複合体のキトサン部分が１００キロダルトンと３００キロダルトンの間 の分子量を有する請求項１から１６のいずれか１項記載の複合体。 １８． 複合体のポリエチレングリコール含量が重量ベースで１から５０％まで である請求項１から１７のいずれか１項記載の複合体。 １９． ポリエチレングリコール含量が重量ベースで５から２０％までである請 求項１８記載の複合体。 ２０． 複合体のキトサン部分が１０から９９％までの範囲内の脱アセチル化度 を有する請求項１から１９のいずれか１項記載の複合体。 ２１． キトサン部分が４０から８５％までの範囲内の脱アセチル化度を有する 請求項２０記載の複合体。 ２２． ポリエチレングリコール部分が１キロダルトンと３０キロダルトンの間 の分子量を有する請求項１から２１のいずれか１項記載の複合体。 ２３． ポリエチレングリコール部分が２キロダルトンと１０キロダルトンの間 の分子量を有する請求項２２記載の複合体。 ２４． 請求項１から２３のいずれか１項記載の複合体を含む製薬組成物。 ２５． 薬剤における使用のための請求項１から２３のいずれか１項記載の複合 体を含む組成物。 ２６． 薬剤における使用のための薬の製造における請求項１から２３のいずれ か１項記載の複合体の使用。 ２７． ＰＥＧ-キトサン複合体と、オリゴヌクレオチド及び核酸からなる群か ら選択される治療剤との間で形成される複合体を含む組成物。 ２８． キトサンと、オリゴヌクレオチド及び核酸からなる群から選択される治 療剤との間で形成される複合体、ここで該キトサンはポリエチレングリコール部 分に接合される、を含む組成物。 ２９． キトサンとＤＮＡとの間で形成される複合体、ここで該キトサンはポリ エチレングリコール部分に接合される、を含む組成物。 ３０． 治療剤が薬剤物質としての使用を意図した請求項２７又は２８記載の組 成物。 ３１． 治療剤が予防用又は治療用ワクチンとしての使用を意図した請求項２７ 又は２８記載の組成物。 ３２． ＰＥＧ-キトサン複合体が請求項１から２３のいずれか１項記載の複合 体である請求項２７から３１のいずれか１項記載の組成物。 ３３． 医薬的適用を意図した粒状担体系の表面を変性するためのＰＥＧ-キト サン複合体の使用。 ３４． リポソーム、エマルジョン、マイクロカプセル、ミクロ球体又はナノ粒 子の表面を変性するための又は薬剤粒子の表面を変性するためのＰＥＧ-キトサ ン複合体の使用。 ３５． 粒子の表面がＰＥＧ-キトサン複合体によって変性されている、医薬適 用のための粒状担体系。 ３６． 表面がＰＥＧ-キトサン複合体によって変性されているリポソーム、エ マルション、マイクロカプセル、ミクロ球体、ナノ粒子又は薬剤粒子。 ３７． 薬剤の送達のための請求項３５又は３６記載の組成物の使用。 ３８． 抗原とアレルゲンの送達のための請求項３５又は３６記載の組成物の使 用。 ３９． オリゴヌクレオチドと核酸の送達のための請求項３５又は３６記載の組 成物の使用。 ４０． 診断剤の送達のための請求項３５又は３６記載の組成物の使用。 ４１． 粘膜表面を横切る薬剤の全身的取込みを増加するためのＰＥＧ-キトサ ン複合体の使用。 ４２． 水又は生物学的流体中の薬剤の可溶性を増加するためのＰＥＧ-キトサ ン複合体の使用。 ４３． 哺乳動物の身体の粘膜と局所表面の限局治療のためのＰＥＧ-キトサン 複合体の使用。 ４４． 抗菌剤、抗真菌剤及び抗ウイルス剤としてのＰＥＧ-キトサン複合体の 使用。 ４５． ＰＥＧ-キトサンと補足の治療又は診断剤を含むミクロ球体とマイクロ カプセル。 ４６． ＰＥＧ-キトサンと治療剤との混合物から作製した薬剤の制御放出製剤 。 ４７． 圧縮により作製し且つ消化管への送達を意図した請求項４６記載の制御 放出製剤。 ４８． 鼻腔、口腔及び膣腔に投与するための請求項４６記載の制御放出製剤。 ４９． 目への薬剤の投与のためのＰＥＧ-キトサンに基づく組成物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 Ｃ０８Ｂ 37/08 Ｃ０８Ｂ 37/08 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スタンリー・ステュワート・デイビス イギリス・ノッティンガム・ＮＧ７・１Ｂ Ａ・ザ・パーク・キャヴェンディッシュ・ クレッセント・ノース・19 (72)発明者 ウー・リン イギリス・ノッテインガム・ＮＧ７・２Ｅ Ｑ・レントン・トリニティ・アベニュ・９ (72)発明者 ファビオ・ビノッティ イタリア・Ｉ―25081・ベデイッツォル・ 78・ヴィアレ・リベルタ (72)発明者 パオロ・フェルティ イタリア・Ｉ―2015・ミラノ・ヴィア・プ ルタルコ・13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． キトサン部分又はその誘導体と、活性化したキトサン種の使用によってキ トサン上のアミノ官能基を経て一緒に結合されるポリエチレングリコール部分又 はその誘導体とを含むポリマー複合体。 ２． 活性化したキトサン種がビス(アクリルアミド)を用いて調製される請求項 １記載の複合体。 ３． キトサン部分又はその誘導体と、１０キロダルトンから１０００キロダル トンまでの範囲内の分子量の複合体のキトサン部分と一緒に結合されるポリエチ レングリコール部分とを含むポリマー複合体。 ４．式： −[Ｃｍ−ＮＲ¹ ₂]_p− Ｉ 式中： Ｃｍはキトサン部分を作るモノマー単位又はそのようなモノマー単位の誘導体 の残部である； ｐは、キトサン部分において式−Ｃｍ−ＮＲ¹ ₂−のモノマー単位の数を表す、 それぞれのＲ¹は独立して、Ｈ又はＲ¹基の少なくとも部分が−Ａ−ＰＥＧとい う条件で基−Ａ−ＰＥＧである； それぞれのＰＥＧは、独立してポリエチレングリコール部分又はその誘導体で ある； それぞれのＡは独立して−ＣＨ₂ＣＨ₂−基を経てキトサン部分上のアミノ窒素 に、及びＸ基を経てＰＥＧ部分に結合される、式−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ(Ｏ)−Ｒ²− Ｘ−を有する連結基である； Ｒ²は結合又は二価有機基である； Ｘは酸素、硫黄又は−ＮＲ³−であり；及び Ｒ³はＨ又は有機基である、 を有するＰＥＧ-キトサン複合体、又は生理学的に許容されるその誘導体。 ５． Ｃｍがキトサンを作るモノマー単位の残部である請求項４記載の複合体。 ６． ｐが５０から６０００までの範囲内の整数である請求項４又は５記載の複 合体。 ７． ｐが１５０から２０００までの範囲内の整数である請求項６記載の複合体 。 ８． ＰＥＧが、式Ｒ⁴−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_n−(式中Ｒ⁴は脂肪族、環式脂肪族又は 芳香族炭化水素基であり且つｎは整数である)を有する修飾したポリエチレング リコール部分である請求項４から７のいずれか１項記載の複合体。 ９． Ｒ⁴がアルキルである請求項８記載の複合体。 １０． Ｒ⁴がメチルである請求項９記載の複合体。 １１． Ｒ²が、結合した、又は式： ［式中Ｒ⁵は、連結基Ａのカルボニル(Ｃ(Ｏ))基に結合される二価の有機基であ る］を有する二価の有機基である請求項４から１０のいずれか１項記載の複合体 。 １２． Ｒ⁵が式ＩＩ中のカルボニル基及び窒素原子を経て連結基Ａのカルボニ ル基に結合される請求項１１記載の複合体。 １３． Ｒ⁵が、式： 又は ［式中、それぞれのＲ⁶は、独立して直鎖又は分枝したＣ_1-4アルキル鎖であり、 Ｒ⁷は二価の有機基であり、Ｒ⁸，Ｒ⁹，Ｒ¹⁰とＲ¹¹は、それぞれ独立してＨ又は 直鎖又は分枝したＣ_1-3アルキル鎖である］ を有する基である請求項１２記載の複合体。 １４． Ｒ⁷が直鎖又は分枝したＣ_1-4アルキル鎖である請求項１３記載の複合体 。 １５． Ｘが酸素又は−ＮＲ³−である請求項４から１４のいずれか１項記載の 複合体。 １６． Ｒ³がアルキル又はＨである請求項４から１５のいずれか１項記載の複 合体。 １７． 複合体のキトサン部分が１００キロダルトンと３００キロダルトンの間 の分子量を有する請求項１から１６のいずれか１項記載の複合体。 １８． 複合体のポリエチレングリコール含量が重量ベースで１から５０％まで である請求項１から１７のいずれか１項記載の複合体。 １９． ポリエチレングリコール含量が重量ベースで５から２０％までである請 求項１８記載の複合体。 ２０． 複合体のキトサン部分が１０から９９％までの範囲内の脱アセチル化度 を有する請求項１から１９のいずれか１項記載の複合体。 ２１． キトサン部分が４０から８５％までの範囲内の脱アセチル化度を有する 請求項２０記載の複合体。 ２２． ポリエチレングリコール部分が１キロダルトンと３０キロダルトンの間 の分子量を有する請求項１から２１のいずれか１項記載の複合体。 ２３． ポリエチレングリコール部分が２キロダルトンと１０キロダルトンの間 の分子量を有する請求項２２記載の複合体。 ２４． 請求項１から２３のいずれか１項記載の複合体を含む製薬組成物。 ２５． 薬剤における使用のための請求項１から２３のいずれか１項記載の複合 体を含む組成物。 ２６． 薬剤における使用のための薬の製造における請求項１から２３のいずれ か１項記載の複合体の使用。 ２７． ＰＥＧ-キトサン複合体と、オリゴヌクレオチド及び核酸からなる群か ら選択される治療剤との間で形成される複合体を含む組成物。 ２８． キトサンと、オリゴヌクレオチド及び核酸からなる群から選択される治 療剤との間で形成される複合体、ここで該キトサンはポリエチレングリコール部 分に接合される、を含む組成物。 ２９． キトサンとＤＮＡとの間で形成される複合体、ここで該キトサンはポリ エチレングリコール部分に接合される、を含む組成物。 ３０． 治療剤が薬剤物質としての使用を意図した請求項２７又は２８記載の組 成物。 ３１． 治療剤が予防用又は治療用ワクチンとしての使用を意図した請求項２７ 又は２８記載の組成物。 ３２． ＰＥＧ-キトサン複合体が請求項１から２３のいずれか１項記載の複合 体である請求項２７から３１のいずれか１項記載の組成物。 ３３． 医薬的適用を意図した粒状担体系の表面を変性するためのＰＥＧ-キト サン複合体の使用。 ３４． リポソーム、エマルジョン、マイクロカプセル、ミクロ球体又はナノ粒 子の表面を変性するための又は薬剤粒子の表面を変性するためのＰＥＧ-キトサ ン複合体の使用。 ３５． 粒子の表面がＰＥＧ-キトサン複合体によって変性されている、医薬適 用のための粒状担体系。 ３６． 表面がＰＥＧ-キトサン複合体によって変性されているリポソーム、エ マルション、マイクロカプセル、ミクロ球体、ナノ粒子又は薬剤粒子。 ３７． 薬剤の送達のための請求項３５又は３６記載の組成物の使用。 ３８． 抗原とアレルゲンの送達のための請求項３５又は３６記載の組成物の使 用。 ３９． オリゴヌクレオチドと核酸の送達のための請求項３５又は３６記載の組 成物の使用。 ４０． 診断剤の送達のための請求項３５又は３６記載の組成物の使用。 ４１． 粘膜表面を横切る薬剤の全身的取込みを増加するためのＰＥＧ-キトサ ン複合体の使用。 ４２． 水又は生物学的流体中の薬剤の可溶性を増加するためのＰＥＧ-キトサ ン複合体の使用。 ４３． 哺乳動物の身体の粘膜と局所表面の限局治療のためのＰＥＧ-キトサン 複合体の使用。 ４４． 抗菌剤、抗真菌剤及び抗ウイルス剤としてのＰＥＧ-キトサン複合体の 使用。 ４５． ＰＥＧ-キトサンと補足の治療又は診断剤を含むミクロ球体とマイクロ カプセル。 ４６． ＰＥＧ-キトサンと治療剤との混合物から作製した薬剤の制御放出製剤 。 ４７． 圧縮により作製し且つ消化管への送達を意図した請求項４６記載の制御 放出製剤。 ４８． 鼻腔、口腔及び膣腔に投与するための請求項４６記載の制御放出製剤。 ４９． 目への薬剤の投与のためのＰＥＧ-キトサンに基づく組成物の使用。