DE69938612T2

DE69938612T2 - Funktionelle chitosanderivate

Info

Publication number: DE69938612T2
Application number: DE69938612T
Authority: DE
Inventors: Hirofumi Kawasaki-shi Yura; Yoshio Yokohama-shi Saito; Masayuki Tachikawa-shi ISHIHARA; Katsuaki Ono; Shiro Saeki
Original assignee: NETECH Inc KAWASAKI; NeTech Inc
Current assignee: NETECH Inc KAWASAKI; NeTech Inc
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2019-11-09
Also published as: US7125968B2; US20040192646A1; EP1152013A4; JP4606586B2; ATE393171T1; EP1152013B1; AU755683B2; AU1078600A; EP1152013A1; WO2000027889A1; US6806260B1; CA2351177C; DE69938612D1; CA2351177A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues funktionelles Chitin/Chitosan-Derivat, und spezifischer betrifft sie ein Chitosan-Derivat mit verbesserter Löslichkeit, gelbildender Fähigkeit und hydrogelbildender Fähigkeit aufgrund des Einbaus einer photoreaktiven funktionellen Gruppe und, zusätzlich, eines Kohlenhydrats mit einem reduzierten Ende und/oder einer amphipathischen Gruppe.
Stand der Technik
Die Verwendung von natürlichen Materialien wurde in medizinischen und kosmetischen Gebieten im Hinblick auf ihre Biokompatibilität, wie ihre Histokompatibilität und Bioabbaubarkeit in großem Umfang erforscht. Insbesondere können verschiedene Verwendungen durch Verfestigung oder Bildung von nichtlöslichen Hydrogelen durch Chelatbildung mit Salzen oder Vernetzungsreaktionen konzipiert werden.
Beispielsweise wurde in den letzten Jahren die Forschung, welche die Funktion von Kohlenhydratketten betrifft, aktiver, wodurch es klar wurde, dass sie eine beachtliche Rolle in der Zelladhäsion und viralen Infektion spielen. Die Kohlenhydrate in Säugetieren existieren meistens als Verbundwerkstoffe, wie Glykoproteine und Glykolipide, wobei einige dieser Kohlenhydratketten zu bestimmten funktionellen Ausprägungen beitragen. Aus diesem Grund sind diese Arten von Substanzen, welche Kohlenhydratketten enthalten, häufig biologisch aktiv, aber in der Praxis weisen sie Probleme in Bezug auf ihre Handhabung und Kosten auf.
Auf der anderen Seite existieren Kohlenhydratketten in Pflanzen und maritimen Organismen als makromolekulare Substanzen für die Skelettstrukturen der Organismen. Cellulose, Pektin, Gummi arabicum, Polygalaktomannan, Argininsäure und ähnliches sind in Pflanzen und Algen enthalten und sind makromolekulare Substanzen mit hoher Viskosität, die auf günstige Weise in Massen eingesammelt werden können. Zusätzlich sind Chitin/Chitosane in den Exoskeletten von Insekten und in den Schalen von Krustentieren, wie Krabben und Hummer, weit verbreitet, Glukosamin, welches der Kohlenhydratbestandteil darin ist, hat die Funktion eines Auslösers zum Schutz gegen Infektionen und Zersetzung.
Da diese Kohlenhydrate als Polysaccharide mit extrem hohen Molekulargewichten existieren und weiterhin hohe Viskosität haben, ist ihre Verwendung in der Medizin, wie in Wundverbandsmaterial, künstlicher Haut, Implantaten, die in der Mundchirurgie oder plastischen Chirurgie verwendet werden, blutstillenden Mitteln und Haftmitteln oder in Kosmetika, wie Befeuchtungsmitteln, in Betracht gezogen worden, aber ihr Verwendungsbereich ist aufgrund der Schwierigkeit limitiert, sie chemisch im Hinblick auf ihre Löslichkeit in Lösungsmitteln und ähnlichem zu modifizieren im Vergleich zu proteinartigen Bestandteilen.
Chitin/Chitosan, welche unter Polysacchariden einzigartig sind, enthalten Aminogruppen als aufbauende Kohlenhydrateinheiten, so dass ihre Verwendung zusammen mit chemischen Vernetzungsmitteln, wie Isocyanaten, Aldehyden und Carbodiimiden, in Wundverbänden, Antihaftmaterialien und zersetzenden Absorbierungsmitteln studiert worden ist.
Chitine sind jedoch in Wasser aufgrund ihrer Kristallinität, welche auf Wasserstoffbrückenbindungen basiert, nicht löslich und müssen durch Hydrolyse zu Substanzen mit niedrigen Molekulargewicht zersetzt werden oder teilweise deacetyliert werden, um sie für die Verwendung in einem großen Bereich von gewerblichen Gebieten, beinhaltend die Medizin, geeignet zu machen. Chitosane mit vermehrt Kohlenhydrateinheiten mit Aminogruppen, die durch aktive Deacetylierung zum Zwecke der Verbesserung der physikalischen Eigenschaften der Chitine exponiert wurden, sind zusätzlich in sauren Lösungsmitteln, beinhaltend verdünnte organische Säuren, löslich, aber weiterhin äußerst dick, welches es schwierig macht, sie in Wundverbänden und biologischer Haftung zu handhaben, welche erforderlich sind, um im Gebiet der medizinischen Behandlung leicht verarbeitet zu werden. Zusätzlich ist es schwierig, frei physiologisch aktive Reagenzien, die für therapeutische Zwecke verwendet werden, zuzufügen, da die dicke Chitosan-Lösung keinen physiologischen pH beibehält, und es gibt das Problem der Toxizität, wenn sie mit freien chemischen Vernetzungsmitteln verwendet wird, wodurch die Möglichkeiten der Verwendung im Gebiet des Gesundheitswesen, beinhaltend Medizin, eingeschränkt werden.
Der Artikel von Aiba et al., 1987 (Biomaterials, Band 8, Seiten 481–8) offenbart die Reaktion von Chitosan mit Methyl-4-azidobenzimidat, um 4-Azidobenzoyl-funktionelles Chitosan zu ergeben, welches photoreaktiv ist. Dieser Artikel lehrt weiterhin, das photoreaktive Chitosan auf Heparin zu graften, um einen Polyelektrolytkomplex zu bilden.
Offenbarung der Erfindung
Bei der Durchführung einer sorgfältigen Recherche haben die gegenwärtigen Erfinder gefunden, dass die oben genannten Probleme durch Binden einer photoreaktiven funktionellen Gruppe und, zusätzlich, eines Kohlenhydrats mit einem reduzierten Ende und/oder einer amphipathischen Gruppe, wie einem Polyoxyalkylenalkylether oder ähnlichem und/oder einem Glykosaminoglykan an mindestens einen Teil der Aminogruppen oder Hydroxygruppen in den Glukosamineinheiten, welche die Chitin/Chitosane bilden mit Strukturen mit wenigstens teilweise deacetyliertem Poly-N-acetylglukosamin, überwunden werden können, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Daher bietet die vorliegende Erfindung ein funktionelles Chitosan-Derivat an, beinhaltend in mindestens einem Teil der Aminogruppen in 2-Position in den Glukosamineinheiten, welche ein wenigstens teilweise deacetyliertes Chitin/Chitosan bilden, eine photoreaktive funktionelle Gruppe als eine erste Funktionalisierung und, zusätzlich, ein Kohlenhydrat mit einem reduzierten Ende als eine zweite Funktionalisierung und/oder eine amphipathischen Gruppe als eine dritte Funktionalisierung und einer Glukosaminglykan als eine vierte Funktionalisierung. Hier kann die amphipathische Gruppe als die dritte Funktionalisierung in wenigstens einen Teil der Hydroxygruppen an den 3- und 6-Positionen der Glukosamineinheiten oder Acetylglukosamineinheiten, welche das Chitin/Chitosan bilden, eingebaut werden. Das funktionelle Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung ändert die pH-abhängige Wasserlöslichkeit, welche ursprünglich durch Chitosan aufgewiesen wird, durch den Einbau von Kohlenhydratketten mit reduziertem Ende, wodurch es in Wasser im Bereich von physiologischem pH löslich gemacht wird, es macht möglich, dass Chitine/Chitosane durch selbstvernetzende Körper unlöslich werden, indem photoreaktive funktionelle Gruppen eingebaut werden, es erlaubt, dass eine vorteilhafte gelbildende Fähigkeit und einer hohen Wassergehalt durch Einbauder amphipathischen Gruppen erreicht wird und es ruft eine Antihaftfähigkeit durch Einbau der Glukosaminglykane hervor.
Durch Binden von photoreaktiven vernetzenden Gruppen und, zusätzlich, Kohlenhydraten und/oder amphipathischen Gruppen an Chitin/Chitosane, welche dafür bekannt sind, dass sie eine Gewebekompatibilität und wundheilende Wirkungen aufweisen, wird dem erfin dungsgemäßen Chitosan-Derivat Wasserlöslichkeit im physiologischen pH-Bereich gegeben, sowie Selbstvernetzung durch kovalente Bindungen (Härten) durch eine Photoreaktion oder eine Fähigkeit zur Bildung eines unlöslichen Gels basierend auf intermolekularen Wechselwirkungen, wodurch es nicht nur sicherheitstechnisch kompatibel mit biologischen Geweben im physiologischen pH-Bereich wird, sondern ebenso die Bildung eines Hydrogels mit einem zweckmäßigen Stärke und Wassergehalt erlaubt. Weiterhin verwendet das Hydrogel, das unter Verwendung von erfindungsgemäßen Chitosan-Derivaten gebildet wird, keine freien chemischen Vernetzungsmittel und ist daher sicher und es ist in der Lage, verschiedene physiologisch aktive Substanzen zu binden aufgrund seines hohen Wassergehalts und Wasserrückhaltevermögens, mit einem breiten Bereich von Anwendungen als ein Gesundheitswesenmaterial im medizinischen Gebiet, wie Wundverbänden, Antihaftungsmaterialien, blutstillenden Materialien, Dichtungsmassen für Körperflüssigkeiten oder Gase, Clathrate zur Wirkstofflieferung und verkapselnden Mitteln für Zellen und ebenfalls im kosmetischen Gebiet als Schutzmaterial für Haut und Haar.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein IR-Spektrum der Verbindung 1-A1-a. Absorption aufgrund der Azidgruppen (-N₃) kann bei 2250 cm^–1 gesehen werden.
2 ist ein ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung a-A1-a. Peaks für die Benzolringe können bei 7,2 und 7,6 ppm gesehen werden.
3 ist ein UV-Spektrum der Verbindung 1-A1-a. Ein Peak kann bei 271 nm gesehen werden.
4 ist ein UV-Spektrum der Verbindung 1-b. Ein Peak kann bei 278 nm gesehen werden.
5 ist ein UV-Spektrum der Verbindung 1-c. Ein Peak kann bei 262 nm gesehen werden.
6 ist ein IR-Spektrum der Verbindung 1-A1-I. Die Schaukelabsorption (rocking absorption) der Methylengruppe in den langkettigen Alkylgruppen kann bei 840 cm^–1 beobachtet werden.
7 ist ein IR-Spektrum der Verbindung 1-A1-a-I. Absorption durch die Azidgruppen kann bei 2250 cm^–1 beobachtet werden und die Schaukelabsorption der Methylengruppen der langkettigen Alkylgruppen kann bei 840 cm^–1 beobachtet werden.
Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung
Im Folgenden werden die funktionellen Chitosan-Derivate der vorliegenden Erfindung näher erläutert.
Normalerweise sind Chitin/Chitosane deacetylierte, säurelösliche Fraktionen, die durch alkalische Verarbeitung von Chitin (Poly-N-acetylglukosamine), welches aus Krabbenschalen stammt, erhalten werden und haben im Allgemeinen die Aufbaueinheiten, die durch die folgende Formeln (1) und (2) ausgedrückt werden (worin Q NHCOCH₃) ist.
Unter den Chitin/Chitosanen benennen einige Leute diejenigen mit einem niedrigen Grad an Deacetylierung (normalerweise weniger als 40%) als "Chitine", diejenigen mit einem hohen Grad an Deacetylierung (normalerweise 40% oder mehr) als "Chitosane", aber hier in der vorliegenden Beschreibung sollen alle Chitin/Chitosane, welche wenigstens teilweise deacetyliert sind, gemeinsam als "Chitosane" bezeichnet werden. Zusätzlich sind in der vorliegenden Erfindung Chitosane nicht auf diejenigen natürlichen Ursprungs eingeschränkt und können chemisch modifizierte Kohlenhydratketten mit ähnlichen Strukturen sein, welche chemisch synthetisiert worden sind oder durch Gentechnik.
Hierin bezeichnet "Grad der Deacetylierung" den Anteil an Acetylaminogruppen in der 2-Position der Kohlenhydrateinheiten, welche das Chitosan aufbauen (oder Poly-N-acetylglukosamin), welche zu freien Aminogruppen durch Deacetylierung umgewandelt worden sind. In der vorliegenden Beschreibung wird der Grad der Deacetylierung durch die "kolloide Titrationsmethode die in "Health Foods Standard and Criterion (Nr. 4)", Japan Health Food and Nutrition Food Association (1996), S. 55 beschrieben wird, gemessen.
Das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat wurde durch weitere chemische Modifizierung des Chitosans funktionalisiert und das als Rohmaterial verwendete Chitosan sollte vorzugsweise ein Grad an Deacetylierung von mindestens 40%, bevorzugt 60–100%, noch bevorzugter 65–95% aufweisen. Ein Chitosan mit einem 100%igen Grad an Acetylierung besteht ausschließlich aus den aufbauenden Einheiten der oben gegebenen Formel (1) und beinhaltet keine aufbauenden Einheiten der Formel (2).
Zusätzlich bestehen keine besonderen Einschränkungen in Bezug auf das Molekulargewicht des Chitosans und dieses kann in einem weiten Bereich in Abhängigkeit von der vorhergesehenen Verwendung des Chitosan-Derivats geändert werden, aber im Allgemeinen sollte das zahlenmittlere Molekulargewicht im Bereich von 5.000 bis 2.000.000, bevorzugt 10.000 bis 1.800.00, noch bevorzugter 40.000 bis 1.500.000, liegen.
Das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung hat eine photoreaktive funktionelle Gruppe und, zusätzlich, ein Kohlenhydrat mit einem reduziertem Ende und/oder eine amphipathische Gruppe in mindestens einem Teil der Aminogruppen in der 2-Position der Glukosamineinheit der Formel (1) und/oder der Hydroxygruppen in der 3-Position oder 6-Position der Acetylglukosamineinheit der Formel (2) eingebaut und beinhaltet die aufbauenden Einheiten, die durch die folgenden Formeln (3) und (1') und/oder (2') gekennzeichnet sind (worin R1 eine Kohlenhydratrestegruppe mit einem reduzierten Ende oder eine photoreaktive funktionelle Gruppe oder eine amphipathische Gruppe bedeutet, R2 eine Hydroxygruppe oder eine amphipathische Gruppe ist und Q wie oben definiert ist).
In anderen Worten, das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine photoreaktive funktionelle Gruppe und mindestens eines von einem Kohlenhydrat mit einem reduzierten Ende, einer amphipathischen Gruppe oder einem Glukosaminglykan und umfasst diejenigen die aus den Aufbaueinheiten von (1') und (3) gebildet sind, diejenigen die aus den Aufbaueinheiten von (2') und (3) gebildet sind und diejenigen, die aus den aufbauenden Einheiten von allen (1'), (2') und (3) gebildet sind. Zusätzlich können Fälle auftreten, in welchen die aufbauenden Einheiten der Formeln (2') nicht beinhaltet sind, in Abhängigkeit vom Grad der Deacetylierung des Chitosan, das als Rohmaterial verwendet wird, und es können Fälle auftreten, in welchen die aufbauenden Einheiten der Formel (1') nicht beinhaltet sind, in Abhängigkeit vom Grad der chemischen Modifizierung. Das heißt, dass die Chitosan-Derivate der vorliegenden Erfindung diejenigen umfassen, welche nur aus aufbauenden Einheiten der Formel (3) bestehen. Zusätzlich kann das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung in einem einzelnen Molekül 2, 3 oder 4 von jeder der Kohlenhydratrestegruppen mit einem reduzierten Ende, einer photoreaktiven funktionellen Gruppe, einer amphipathischen Gruppe und einem Glukosaminoglykan enthalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten Kohlenhydrate mit reduzierten Enden, die zur chemischen Modifizierung von Chitosan als eine zweite Funktionalisierung verwendet werden, Aldosen und Ketosen, unter welchen diejenigen mit 20 oder weniger aufbauenden Kohlenhydrateinheiten, insbesondere diejenigen mit 1 bis 7 Einheiten, bevorzugt verwendet werden. Spezifische Beispiele beinhalten Pentosen und Hexosen, wie Glukose, Fruktose, Gallaktose, Fukose, Mannose, Arabinose, Xylose, Erythrose, Hepturose und Hexylose, Aminokohlenhydrate, wie Glukosamin, N-Acetylglukosamin und Galactosamin; Kohlenhydrat-Derivate, wie Uronsäure und Deoxysaccharide; Di- und Trisaccharide, wie Maltose, Isomaltose, Laktose, Melibiose und Maltotriose zusammengesetzt aus Kohlenhydratketten, welche die oben erwähnten Monosaccharide kombinieren; und die verschiedenen Oligosaccharide, unter welchen die neutralen Disaccharide, wie Maltose, Laktose und Melibiose bevorzugt sind.
Während es ebenso möglich ist, Chitosane aus organischen Verbindungen, wie Polyether und mehrwertigen Alkoholen anstelle der oben erwähnten Kohlenhydrate abzuleiten, ist es bevorzugt, unter Berücksichtigung der Biokompatibilität natürliche Kohlenhydratketten zu verwenden.
Der Einbau der oben erwähnten Kohlenhydrate in die Aminogruppen in 2-Position der Glukosamineinheiten des Chitosan der oben angegebenen Formel (1) kann unter Verwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise, Verfahren, in welchen das reduzierende Ende eines Kohlenhydrats carboxyliert wird, anschließend an die 2-Position Aminogruppe durch eine Amidbindung gebunden wird (siehe beispielsweise Japanische Patentanmeldung, erste Veröffentlichung Nr. H10-120705 ), oder in welchen das reduzierende Ende eines Kohlenhydrats als Aldehyd oder Carbonyl umgeformt wird, anschließend an die 2-Position Aminogruppe einer Glukosamineinheit durch ein reduzierendes Alkylierungsverfahren mittels einer Schiffschen Base gebunden wird (siehe beispielsweise "Applications of Chitins and Chitosans", herausgegeben durch Chitin/Chitosan Workshop, Seiten 53–56, 20. Feb. 1990, veröffentlicht durch Gihodo Shuppan KK).
Das erfindungsgemäße in Chitosan eingebaute Kohlenhydrat ist nicht auf eine Art beschränkt und es möglich, eine Kombination von zwei oder mehreren zu verwenden.
Spezielle Beispiele einer Kohlenhydratseitenkette, die in R1 der aufbauenden Einheit der oben gegebenen Formel (3), welche das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung aufbaut, enthalten ist, beinhalten die folgenden, aber es besteht keine Einschränkung auf diese.
Von den Kohlenhydratseitenketten, die in den obigen Formeln (i) bis (vii) gegeben sind, stellen diejenigen auf der linken Seite Restegruppen dar, die durch Kondensation zwischen einer Carboxylgruppe auf dem Kohlenhydrat und einer Aminogruppe in 2-Position auf dem Chitosan eingebaut wurden, während diejenigen auf der rechten Seite Restegruppen darstellen, die durch eine Schiffsche Base gebunden sind.
Während der Grad der Substitution der Aminogruppen in 2-Position in den Glykosamineinheiten des Chitosan durch Kohlenhydratseitenketten gemäß den physikalischen Eigenschaften, die im endgültigen Chitosan-Derivat gewünscht sind, geändert werden kann, sollte der Grad der Substitution im Allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 80%, bevorzugt 0,5 bis 60%, bevorzugter 1 bis 40% liegen. Hier bedeutet „Grad der Substitution" der Kohlenhydratseitenkette den Level, bis zu welchem die Aminogruppen in der 2-Position der Kohlenhydrat-Einheiten, welche das Chitosan aufbauen, durch Kohlenhydratseitenketten substituiert sind und es bezeichnet den Anteil von substituierten Aminogruppen in Bezug auf die Gesamtzahl an freien Aminogruppen und substituierten Aminogruppen an der 2-Position der Kohlenhydrateinheiten, welche das Chitosan aufbauen. In der vorliegenden Beschreibung wird der Grad der Substitution der Kohlenhydratseitenketten durch die "Phenol-Schwefel-säure-Methode" gemessen, worin die charakteristische Farbemission aufgrund einer Reaktion zwischen Kohlenhydratketten und Phenol in Schwefelsäure durch Lichtabsorption bei 490 nm detektiert wird (siehe J. E. Hodge, B. T. Hofreiter, "Methods in Carbo hydrate Chemistry"), herausgegeben durch R. L. Whistler, M. L. Wolfrom, Band 1, Seite 388, Academic Press, New York (1962)).
Zusätzlich weist das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat als seine erste Funktionalisierung eine Selbstvernetzungseigenschaft durch Photobestrahlung auf aufgrund des Einbaus von photoreaktiven funktionellen Gruppen in die Aminogruppen in 2-Position in den Glukosamineinheiten der oben genannten Formel (1), welche das Chitosan aufbaut.
Die photoreaktiven funktionellen Gruppen, die für die chemische Modifizierung der erfindungsgemäßen Chitosane verwendet werden, sind Gruppen, welche miteinander reagieren, und/oder Aminogruppen oder Hydroxygruppen, die in Chitosan vorhanden sind nach Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, beinhaltend die Nahultraviolettregion von 200 bis 380 nm, um vernetzende Bindungen zu bilden, beinhaltend, beispielsweise, diejenigen die von cyclischen ungesättigten Verbindungen, wie Benzophenonen, Zimtsäuren, Aziden, Diolefinen und bis-Anthracen ableitbar sind, insbesondere bevorzugt diejenigen, welche Carbonylazidgruppen, Sulfonylazidgruppen und aromatische Azidgruppen haben.
Der Einbau von photoreaktiven funktionellen Gruppen in die Aminogruppen in der 2-Position in den Glukosamineinheiten des Chitosan kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch ein Verfahren zum Anbinden einer Azidverbindung mit einer Carboxygruppe an die Aminogruppe in 2-Position in der Gegenwart eines Kondensationsmittels (siehe Japanische Patentanmeldung, erste Publikation Nr. H10-120705 ); oder ein Verfahren zum Reagieren der Azidverbindung mit der Aminogruppe in 2-Position durch eine Säurechloridgruppe, einer Aldehydgruppe, einer N-Hydroxysuccinsäureimidestergruppe oder einer Epoxygruppe (siehe "Applications of Chitins and Chitosans", verlegt durch Chitin/Chitosan Workshop, Seiten 53–5645–65, 20. Feb. 1990, veröffentlicht durch Gihodo Shuppan KK).
In Vernetzungsreaktionen von Azidgruppen wurde es für gewöhnlich als wirksam angesehen, polyfunktionelle Verbindungen, wie bis-Azide oder die oben genannten zu verwenden (siehe Japanische Patentanmeldung, erste Veröffentlichung Nr. H9-103481 ), dies ist in der vorliegenden Erfindung nicht notwendig, so dass ein Chitosan-Derivat mit einer adäquaten Fähigkeit zum Selbstvernetzen durch Einbau von Monoazidverbindungen erhalten werden kann.
Spezielle Beispiele einer photoreaktiven funktionellen Gruppe R1, die an die Aminogruppen in 2-Position der aufbauenden Einheit der Formel (3), welche das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung bildet, gebunden sind, beinhalten, beispielsweise, diejenigen die durch die folgenden Formeln (A) bis (D) dargestellt werden. Die Gruppe der Formel (A) ist abgeleitet von p-Azidobenzoesäure, die Gruppe der Formel (B) ist abgeleitet von p-Azidobenzaldehyd, die Gruppe der Formel (C) ist abgeleitet von p-Benzoylbenzoesäure und die Gruppe der Formel (D) ist abgeleitet von Zimtsäure.
Während der Grad der Substitution dieser photoreaktiven funktionellen Gruppen gemäß dem Grad der Gelierung (Unlöslichkeit) aufgrund der Vernetzungsreaktion wie im endgültigen Chitosan-Derivat gewünscht geändert werden kann, ist es bevorzugt, für den Grad der Substitution der photoreaktiven funktionellen Gruppen innerhalb des Bereichs von 0,1 bis 80%, bevorzugt 0,5 bis 50%, bevorzugter 1 bis 30% zu sein. Hier ist der "Grad der Substitution" der photoreaktiven funktionellen Gruppen der Grad der Substitution der Aminogruppen in 2-Position der Kohlenhydrateinheiten, die das Chitosan bilden, mit photoreaktiven funktionellen Gruppen und ist der Anteil der substituierten Aminogruppen mit Bezug auf die Gesamtanzahl der freien Aminogruppen und der substituierten Aminogruppen an den 2-Positionen der Kohlenhydrateinheiten, die das Chitosan bilden. In der vorliegenden Beschreibung kann der Grad der Substitution der photoreaktiven funktionellen Gruppen, wie Azidgruppen, auf der Basis von Kalibrationskurven bestimmt werden, die durch die charakteristische Absorption bei 270 nm für 4-Azidobenzoesäure erhalten werden.
Der Grad der Substitution der Gesamtzahl an Kohlenhydratseitenketten und photoreaktiven funktionellen Gruppen in den Chitosan-Derivaten der vorliegenden Erfindung ist nicht be sonders eingeschränkt und kann über einen beträchtlichen Bereich variieren, aber er ist für gewöhnlich im Bereich von 0,2 bis 80%, bevorzugt 1,5 bis 65%, bevorzugter 3 bis 50%.
Zusätzlich kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein unlösliches Hydrogel mit einer beträchtlich verbesserten Fähigkeit zur Wasserzurückhaltung erhalten werden durch Einbau einer amphipathischen Gruppe in mindestens einen Teil der Hydroxygruppen in 3- oder 6-Position in den Kohlenhydrateinheiten der Formel (1') und (2') und der Aminogruppen in der 2-Position der Kohlenhydrateinheiten der Formel (3), welche das Chitosan aufbauen. Diese amphipathischen Gruppen sind Gruppen mit einem hydrophoben Block, umfassend eine hydrophobe Gruppe, und einen hydrophilen Block, umfassend eine hydrophile Gruppe, und haben häufig eine oberflächenaktive Funktion. Unter diesen werden diejenigen, in welchen das Molekulargewichtsverhältnis zwischen den hydrophoben Blöcken (X) und den hydrophilen Blöcken (Y) X:Y = 1:5 bis 5:1 ist, bevorzugt verwendet und nichtionische Gruppen ohne dissoziierte ionischen Gruppen werden noch bevorzugter verwendet. Insbesondere sind diejenigen, die sich aus einem hydrophoben Alkylblock und einem hydrophilen Polyoxyalkylenblock mit einem Molekulargewicht von mindestens 90 zusammensetzen, bevorzugt, ein Polyoxyalkylenalkylether von 500 bis 10.000 ist noch bevorzugter. Während ein Polyether ohne einen hydrophoben Block verwendet werden kann, ist ein Polyoxyalkylenalkylether bevorzugt, da es sowohl einen hydrophoben Block und einen hydrophilen Block enthält mit Berücksichtigung der Verbesserung der Wasserrückhaltungsfähigkeit.
Der Einbau dieser amphipathischen Gruppen in das Chitosan kann beispielsweise durch ein Verfahren zum Einbau einer Verbindung mit Gruppen, die in der Lage sind mit Aminogruppen zur Bildung von kovalenten Bindungen zu reagieren, wie Aldehydgruppen oder Epoxygruppen an einen terminalen Teil von entweder dem hydrophilen Block oder hydrophoben Block der amphipathischen Gruppe durchgeführt werden, anschließend reagieren mit den Aminogruppen in 2-Position des Glukosamins des Chitosans, durch ein Verfahren zum Veranlassen einer Reaktion zwischen einem Polyoxyalkylenalkylether-Derivat mit einer Carboxylgruppe mit dem Chitosan in der Gegenwart eines Kondensationsmittels, oder durch ein Verfahren zum Veranlassen einer Reaktion zwischen einem Polyoxyalkylenalkylether-Derivat enthaltend eine Säurechloridgruppe mit einer Hydroxygruppe oder einer Aminogruppe im Chitosan.
Beispielsweise, wenn eine Polyoxyalkylenalkylethergruppe mit einer Epoxygruppe an ihrem terminalen Ende in eine Aminogruppe in dem Chitosan eingebaut werden soll, wird die amphipathische Gruppe R2 in der oben gegebenen Formel (4) ausgedrückt durch die folgenden Formel (a), und wenn eine Polyoxyalkylenalkylethergruppe mit einer Aldehydgruppe an ihrem terminalen Ende in eine Aminogruppe des Chitosan eingebaut werden soll, wird die amphipathische Gruppe R2 der Formel (4) durch die folgende Formel (b) ausgedrückt. Zusätzlich, wenn das Anbinden einer Polyoxyalkylenalkylethergruppe mit einer Säurechloridgruppe an ihrem terminalen Ende an die Hydroxygruppe in 3- oder 6-Position des Chitosan gebunden werden soll, werden die amphipathischen Gruppen R2' oder R2'' in den obigen Formeln (1) bis (4) durch die folgende Formel (c) ausgedrückt. In den unten gezeigten Formeln (a) bis (c) sind n und m Wiederholungseinheiten mit den Zahlen 1 oder mehr.
Der Grad des Einbaus von amphipathischen Gruppen in die Chitosan-Derivate der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt, aber er sollte innerhalb des Bereiches von normalerweise 5 bis 70%, bevorzugt 15 bis 55% basierend auf dem Wechsel im Gewicht des Chitosan-Derivats nach dem Einbau liegen.
Weiterhin ist es in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, zu dem Chitosan-Derivat, welches eine Kohlenhydratseitenkette und eine photoreaktive funktionelle Gruppe eingebaut hat, als eine vierte Funktionalisierung eine Funktion zum Fördern der Heilung zuzufügen, welches eine zusätzliche Funktion ist, die in Wundverbänden, heftig gewünscht wird, durch Einbau von Glykosaminoglykanen.
Die heilungfördernde Wirkung, zusätzlich zur Wundreparatur, optimiert den Tumover von Keratinozyten im Hautpflegegebiet, wodurch zur Vermeidung von Falten beigetragen wird.
Während es vorgeschlagen wurde, dass Chitosane natürlicherweise eine heilungfördernde Wirkung haben, gibt es auch Berichte, dass weitere Heilungförderung durch die ionische Komplexierung von Glykosaminglykanen, welche natürlich vorkommende saure Mukopolysaccharide sind, mit den basischen Gruppen des Chitosans erwartet werden kann (siehe Krats et al., Sc and J Plat Reconstr Hand Surg, 31, 119–123 (1997)). Das kommt daher, dass die Zellwachstumfaktoren zum Stimulieren der Proliferation von Fibroblasten und glatter Muskelzellen, welches während dem Heilungsprozess auftritt, durch Binden an sulfonierte Kohlenhydrate in den Glukosaminglykanen aktiviert werden.
Der Einbau von Glukosaminoglykanen in die erfindungsgemäßen Chitosane geschieht nicht durch konventionelle ionische Komplexationsverfahren und sie werden eingebaut an die Aminogruppen in 2-Position der Glukosamineinheit der Formel (1) durch kovalente Bindungen. Die Verknüpfungsmethode kann beispielsweise dieselbe Methode wie die Einbaumethode für Kohlenhydrate, wie bereits erläutert, sein, aber um die sulfonierten Kohlenhydrate, welche Zellwachstumsfaktoren binden können, zu konservieren, ist es möglich, eine Verknüpfungsmethode unter Verwendung von Aldehydgruppen, in welchen Glykosaminglykane durch Periodsäure- oder Salpetersäurezersetzung hergestellt werden, zu verwenden.
Abgesehen davon kann das Verknüpfen durch Binden durch die oben genannte chemische Reaktion an einen unlöslichen selbstvernetzten Chitosanfilm aufgrund von Photobestrahlung oder durch Bindung durch ionische Komplexierung durchgeführt werden.
Spezielle Beispiele der Glukosaminglykane, die auf diese Weise eingebaut werden, sind diejenigen, die durch die folgenden Formeln ausgedrückt werden, aber es besteht keine Einschränkung auf diese.
Der Grad der Substitution der Glukosaminglykane in den Chitosan-Derivaten der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt, aber sollte normalerweise innerhalb des Bereiches von 1 bis 40%, bevorzugt 10 bis 30% liegen.
Im erfindungsgemäßen Chitosan-Derivat, welches eine photoreaktive Gruppe (erste Funktion) darstellt, kann mindestens eine Substituentengruppe zum Einbau geeigneterweise gewählt werden aus einem Kohlenhydrat mit einem reduzierenden terminalen Ende (zweite Funktion), einer amphipathischen Gruppe (dritte Funktion) und einem Glukosaminoglykan (vierte Funktion) gemäß der beabsichtigten Verwendung.
Beispielsweise ist es möglich, durch Bereitstellen sowohl einer photoreaktiven funktionellen Gruppe und einer amphipathischen Gruppe ein Chitosan-Derivat zu erhalten, welches ein Hydrogel bildet mit sowohl größerer Stärke als auch Wasserzurückhaltungsfähigkeit. Ein derartiges Chitosan-Derivat würde ein neues funktionelles Material sein, welches fähig ist, ein Chitosan zu bilden mit einem bestimmten Grad an Wundheilung, Vermeidung von Adhäsion, Befeuchtungs- und antibakterieller Wirkungen in ein unlösliches Gel mit einer gewünschten Starke innerhalb einer kurzen Zeitspanne, welches in weitem Rahmen auf dem Gebiet des Gesundheitswesen, wie in der Medizin und im kosmetischen Bereich, angewandt werden könnte. Insbesondere stechen Chitosan-Derivate, welche Kohlenhydrate eingebaut haben, bezüglich der Löslichkeit im neutralen Bereich hervor, so dass sie in Lösungen in biologische Pufferlösungen oder Kulturen eingebracht werden können. Weiterhin bilden Chitosan-Derivate mit photoreaktiven funktionellen Gruppen dicke wässrige Lösungen bei einer Konzentration von 0,1 Gew.-% oder mehr und nach Aufbringung auf Gewebe können sie veranlasst werden, ein unlösliches Gel zu bilden, weiches fest mit dem Gewebe innerhalb weniger Minuten verbunden ist, durch Bestrahlung mittels ultravioletten Strahlen einer vorgegebenen Intensität. Als ein Ergebnis kann es frei beschichtet werden auf oder in Verbrennungen, gewebearmen Gebieten, chirurgischen Öffnungen, Löchern, die durch den Verlust von Zähnen entstanden sind, knochenarme Gebiete oder ähnlichem implantiert werden, anschließend für eine kurze Zeitspanne bestrahlt werden, um sofort ein unlösliches und klebriges Gel zu bilden, um Körperflüssigkeiten und Gase fernzuhalten. Zusätzlich können Chitosan-Derivate, welche amphipathische Gruppen und Glukosaminglykane mit hoher Wasserrückhaltungsfähigkeit und heilungsfördernder Wirkung beinhalten, geeigneterweise die Ausscheidungen von Verbrennungen und Hautgeschwüren kontrollieren und sie gegen Infektionen schützen, wodurch die Zeit im Krankenhaus verkürzt wird und die Arbeitsbelastung für medizinisches Personal erleichtert wird.
Zusätzlich, da die gefriergetrockneten Flocken des Chitosan-Derivats beinhaltend amphipathische Gruppen, wie Polyoxyalkylenalkylether, eine Wasserückhaltungsfähigkeit haben, die hoch genug ist, um in der Lage zu sein, schnell ungefähr das 100-fache ihres eigenen Gewichtes in Wasser zu absorbieren und unlösliche Gele zu bilden, können sie verwendet werden, um Blut infolge von Ausbluten aus erkrankten Organen oder nachoperativen Blutungen zu absorbieren sowie die Aktivität von Tumorzellen durch intravaskuläre Hämostase zu inhibieren. Die erfindungsgemäßen Chitosan-Derivate mit amphipathischen Gruppen, wie diejenigen, die dafür gemacht wurden eine wässrige Lösung enthaltend bioaktive Substanzen oder Wirkstoffe zu absorbieren und ein unlösliches Gel zu bilden, können in Wirkstoffverabreichungssystemen aufgebracht werden, wo sie in einer ortsspezifischen Art und Weise agieren, welche nicht im Magen Wirkstoff freisetzend, sondern im Darm Wirkstoff freisetzend ist, aufgrund der teilweise Zersetzung der Polyglykosaminskelettstruktur durch Bakterien oder Enzyme im Darm.
Wenn eine photoreaktive Gruppe eingebaut wird, kann das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung einfach auf Faserprodukte oder Harzfolien beschichtet werden, anschließend durch Photobestrahlung unlöslich gemacht werden, wodurch seine Verwendung als ein industriell günstiges und funktionelles oberflächenreformierendes Material möglich ist. Beispielsweise ist es möglich durch den weiteren Einbau von Glykosaminglykan, eine Gaze oder Binde mit einer die Anklebung verhindernden Funktion aufgrund dieser Weise der Herstellung zu machen, so dass besonders im Falle von Verbrennungen das Auftreten von sekundären Wunden beim Wechseln von wundschützendern Material wirksam verhindert werden kann.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat in einem weiten Bereich von Anwendungen auf dem Gebiet des Gesundheitswesen verwendet werden, wie das Ermöglichen von nicht oder wenig invasiven Verfahren durch Verwendung von Kathetern oder das Ermöglichen von Kosmetika für die Haut oder Haar, weiche ultraviolette Strahlen absorbieren oder eine befeuchtende Wirkung haben.
Im Folgenden soll die vorliegende Erfindung durch Beispiele genauer beschrieben werden, aber diese sind nicht dazu gedacht, um den Schutzumfang der Erfindung in irgend einer Weise einzuschränken.
Beispiel 1: Herstellung des Chitosan-Derivats
(1) Herstellung eines Chitosan-Derivats, welches ein Kohlenhydrat mit reduziertem Ende (zweite Funktionalisierung) eingebaut hat (Vergleichs-Chitosan-Derivat).
125 g Chitosan, welches durch Deacetylierung von Chitin aus Krabben durch ein alkalisches Verfahren erhalten worden ist (Grad der Deacetylierung 80%, Molekulargewicht 1.000.000, hergestellt durch Yaizu Suisan Kagaku Industry Co., Ltd. (im Folgenden als "Verbindung 1" bezeichnet)) wurden in 10 l einer 50 mM wässrigen Lösung Tetramethylethylendiamin (TEMED) dispergiert, woraufhin 56,25 ml Salzsäure zugefügt und gelöst wurden. 32,5 g lösliches Carbodiimid (EDC) und 20,25 g iodierte Laktose wurden zu dieser Chitosan-Lösung zugefügt und das Ergebnis ließ man für 24 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Nicht abreagierte Substanzen mit einem Molekulargewicht von 10.000 und darunter in der Reaktionslösung wurden durch Ultrafiltration entfernt, um ein Chitosan-Derivat zu erhalten, worin die Aminogruppe in 2-Position in den Glykosamineinheiten, welche das Chitosan bilden, mit Laktose substituiert waren (im Folgenden als "Verbindung 1-A1" bezeichnet; Grad der Laktose-Substitution 2%). Zusätzlich kann unter Verwendung desselben Verfahren wie oben beschrieben, ein weiteres Laktose substituierte Chitosan-Derivat erhalten werden (im Folgenden als "Verbindung 1-A2" bezeichnet; Grad der Lactosesubstitution 40%), indem die Mengen der iodierten Laktose und EDC jeweils 607,5 g und 997,7 g betrugen.
Ein Maltose substituiertes Chitosan-Derivat wurde durch dasselbe Verfahren wie oben beschrieben erhalten, abgesehen davon dass 20,25 g der iodierten Laktose mit 20,25 g Maltose ersetzt wurden (im Folgenden als "Verbindung 1-B1" bezeichnet; Grad der Laktose- Substitution 0,5%). Zusätzlich wurden die Mengen der iodierten Maltose und EDC geändert, jeweils zu 620,0 g und 978,0 g, um ein weiteres Maltose substituiertes Chitosan-Derivat zu erhalten (im Folgenden als "Verbindung 1-B2" bezeichnet; Grad der Maltosesubstitution 24%).
Ein Melibiose substituiertes Chitosan-Derivat wurde durch dasselbe Verfahren wie oben beschrieben erhalten, außer dass die 20,25 g der iodierten Laktose mit 20,0 g Melibiose ersetzt wurden (im Folgenden als "Verbindung 1-C1" bezeichnet; Grad der Laktose-Substitution 0,5%). Zusätzlich, unter Verwendung derselben Methode wie oben, wurde ein weiteres Laktose substituiertes Chitosan-Derivat erhalten (im Folgenden als "Verbindung 1-C2" bezeichnet; Grad der Melibiose-Substitution 37%), abgesehen davon, dass die Mengen der iodierten Melibiose und EDC jeweils 620,0 g und 978,0 g betrugen.
(2) Herstellung eines Chitosan-Derivats, welches eine photoreaktive funktionelle Gruppe eingebaut hat (erste Funktionalisierung)
1 g des Chitosans (Verbindung 1), welches in Beispiel 1 (1) verwendet wurde, wurde in 100 ml einer 50 mM wässrigen TEMED-Lösung gelöst. 0,7 g EDC und 0,2 g p-Azidobenzoesäure wurden dieser Chitosan-Lösung zugefügt, dann ließ man das für 72 Stunden reagieren. Nicht abreagierte Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1.000 und darunter in der Reaktionslösung wurden durch Ultrafiltration entfernt, um ein Chitosan-Derivat zu erhalten, worin die Aminogruppe in 2-Positon in den Glukosamineinheiten, welche das Chitosan bilden, mit Azidverbindungen substituiert waren (im Folgenden als "Verbindung 1-a" bezeichnet; Grad der p-Azidobenzoesäuresubstitution 2,5%; Vergleichsderivat).
0,7 g eines wasserlöslichen Carbodiimid (EDC), 0,27 g Parabenzoylbenzoesäure oder 0,09 g Zimtsäure wurden zu einer Lösung zugefügt, welche durch Auflösen von 1 g des Chitosans (Verbindung 1) in 100 ml einer 50 mM wässrigen TEMED-Lösung erhalten wurde, und man ließ es für 72 Stunden reagieren. Nicht abreagierte Substanzen mit einem Molekulargewicht von 10.000 und darunter in der Reaktionslösung wurden durch Ultrafiltration entfernt, um Chitosan-Derivate zu erhalten, welche Parabenzoylbenzoesäure und Zimtsäure als photoreaktive funktionelle Gruppen eingebaut haben (im Folgenden als "Verbindung 1-b" (Grad der Substitution 1,3%) und "Verbindung 1-c" bezeichnet (Grad der Substitution 0,5%), Vergleichsderivate).
Als nächstes wurden 1 g von den Verbindungen 1-A1 (2% Lactose-substituiertes Chitosan-Derivat) und Verbindung 1-B1 (0,5% Maltose-substituiertes Chitosan-Derivat), welche in Beispiel 1(1) hergestellt worden sind, separat in 100 ml einer 50 mM wässrigen TEMED-Lösung gelöst. 0,35 g EDC und 0,2 g Azidobenzoesäure wurden zu jeder Chitosan-Derivat-Lösung zugefügt und für 72 Stunden reagieren gelassen. Nicht abreagierte Substanzen mit einem Molekulargewicht von 10.000 und weniger in der Reaktionslösung wurden durch Ultrafiltration entfernt, um Chitosan-Derivate zu erhalten, welche Kohlenhydrate und photoreaktive funktionelle Gruppen (erste und zweite Funktionalisierung) eingebaut haben (im Folgenden jeweils als "Verbindung 1-A1-a" und "Verbindung 1-B1-a" bezeichnet; Grad der Substituierung durch Azidobenzoesäure, beides mal 2,5%).
(3) Herstellung eines Chitosan-Derivats, welches amphipathische Gruppen eingebaut hat (dritte Funktionalisierung)
1 g eines Hydrochlorids des Chitosans (Verbindung 1), das in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde in 40 ml aufgereinigtem Wasser und 7,76 g Laurylalkoholpolyethylenglykol(15 Wiederholungseinheiten)glycydylether (EX-171; Nagase Kasei Kogyo) gelöst. Nachdem man die Reaktion für 24 Stunden bei 80 Grad laufen ließ, wurde Methanol im Überschuss zugefügt, um die Chitosan-Bestandteile wieder auszufällen. Nach einer Dialyse wurde das Ergebnis gefriergetrocknet, um ein Chitosan-Derivat zu erhalten, in welches eine amphipathische Gruppe eingebaut worden ist (im Folgenden als "Verbindung 1-I" bezeichnet; Vergleichsderivat).
In derselben Weise wie oben beschrieben, wurde ein Chitosan-Derivat mit einer Kohlenhydrat- und einer amplipathischen Gruppe (zweite und dritte Funktionalisierungen) erhalten (im Folgenden als "Verbindung 1-A1-I" bezeichnet, Vergleichsderivat), abgesehen davon, dass Verbindung 1-A1 (Laktose-substituiertes Chitosan-Derivat), das in Beispiel 1(1) hergestellt worden ist, anstelle von Chitosan (Verbindung 1) verwendet wurde.
In derselben Weise wie oben beschrieben, wurde ein Chitosan-Derivat mit einer photoreaktiven funktionellen Gruppe und einer amphipathischen Gruppe (erste und dritte Funktionalisierungen) erhalten (im Folgenden als "Verbindung 1-A1-I" bezeichnet), abgesehen davon, dass die Verbindung 1-a (Azidobenzoesäure substituiertes Chitosan-Derivat) hergestellt in Beispiel 1(2) anstelle des Chitosans (Verbindung 1) verwendet wurde.
In derselben Weise wie oben beschrieben, wurde ein Chitosan-Derivat mit einer Kohlenhydrat- und einer amphipathischen Gruppe (erste, zweite und dritte Funktionalisierungen erhalten (im Folgenden als "Verbindung 1-A1-a-I" bezeichnet), abgesehen davon, dass die Verbindung 1-A1-a (Laktose- und Azidobenzoesäure substituiertes Chitosan-Derivat) hergestellt in Beispiel 1(2) anstelle von Chitosan (Verbindung 1) verwendet wurde.
Beispiel 2: pH-Löslichkeit des Chitosan-Derivats

Die Bereiche der Löslichkeit einer 0,1%igen wässrigen Lösung der Kohlenhydrat-substituierten Chitosan-Derivate, dargestellt in Beispiel 1(1), sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Löslicher ph-Bereich

Verbindung	pH-Bereich
1	pH 4,0 oder weniger
1-A1	pH 7,5 oder weniger
1-A2	pH 13,0 oder weniger
1-B1	pH 6,8 oder weniger
1-B2	pH 13,0 oder weniger
1-C1	pH 6,8 oder weniger
1-A2	pH 13,0 oder weniger

Wie in Tabelle 1 gezeigt, moderiert der Einbau von Disacchariden in das Chitosan die säureabhängige Wasserlöslichkeit des Chitosans, wie durch das nicht behandelte Chitosan (Verbindung 1) verdeutlicht wird, wodurch eine Löslichkeit im neutralen Bereich möglich ist.
Beispiel 3: Bewertung der Fähigkeit zur Bildung von unlöslichen selbstvernetzten Strukturen
Jeweils 10 μg der Verbindung 1-A (Azidobenzoesäure-substituiertes Chitosan-Derivat), dargestellt in Beispiel 1(2), und Verbindungen 1-A1-a und 1-B1-a (Laktose- oder Maltose-, und Azidobenzoesäure-substituierte Chitosan-Derivate) wurden in destilliertem Wasser gelöst, um 1 Gew.-%ige wässrige Lösungen zu bilden, welche anschließend auf eine Glasplatte platziert wurden. Sofort danach wurden sie mit ultravioletten Strahlen (200–380 nm, 5,5 mW/cm²) für 10–90 Sekunden bestrahlt. Anschließend wurde das unlösliche Chitosan-Derivat-Gel in 100 ml destilliertem Wasser für 24 Stunden eingetaucht, um die wasserlöslichen Chitosane herauszulösen, und das Resultat getrocknet.

Die Änderung in Gewicht vor und nach der ultravioletten Bestrahlung wurde gemessen und die Gelbildungsrate bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Unlösliche Gelbildungsrate von photogehärtetem Chitosan

Bestrahlungszeit	Verbleibendes Gew	icht nach Wasserspüle	n/Originalgewicht
Bestrahlungszeit	1-a	1-A1-a	1-B1-a
10 Sekunden	0,61	0,61	0,58
30 Sekunden	1,01	0,99	1,01
60 Sekunden	1,00	1,00	0,98
90 Sekunden	0,99	0,99	1,00

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat mit photoreaktiven funktionellen Gruppen (zweite Funktionalisierung) nahezu vollständig durch Ultraviolettbestrahlung bei einer extrem kurzen Zeit von 30 Sekunden vernetzt, um ein wasserunlösliches Chitosan-Hydrogel zu bilden. Zusätzlich, da das Chitosan-Derivat, welches ein Kohlenhydrat (erste und zweite Funktionalisierungen) eingebaut hat, in der Neutralregion löslich ist, war es möglich, eine Lösung bei einem physiologischen pH zu formulieren. Diese erst- und zweitfunktionalisierte Chitosan-Derivate zeigen die Ausbildung eines unlöslichen Gels, d. h. Selbstvernetzung, unter denselben Bedingungen, ohne vom Typ des eingebauten Disaccharids abhängig zu sein. Weiterhin ist es von dieser selbststrukturierenden Eigenschaft klar, dass die unlösliche Gelbildungszeit auf eine Sekunde oder weniger verkürzt werden kann durch Verwendung stärkerer ultravioletter Bestrahlung.
Beispiel 4: Bewertung der Stärke des wasserunlöslichen Hydrogels
Unter Verwendung des Chitosan-Derivats 1-a mit der zweiten Funktionalisierung und des Chitosan-Derivats 1-A1-a mit den ersten und zweiten Funktionalisierungen wurden 1, 3 und 5 Gew.-%ige wässrige Lösungen hergestellt. Als nächstes wurden zwei 2 mm dicke Schinkenscheiben in 2 × 3 cm Portionen geschnitten und ausgelegt, um ein Stück von 2 × 6 cm zu bilden, und die oben beschriebenen Lösungen wurden in einer Dicke von 2 mm in einem Bereich von 2 × 2 cm mittig an der Grenze zwischen den beiden Scheiben aufgebracht.
Unmittelbar danach wurden die aufgebrachten 1-a und 1-A1-a mit ultravioletter Strahlung für 30 Sekunden bestrahlt, um die beiden Schinkenscheiben zusammenzukleben. Eine der beiden Schinkenscheiben wurde verankert, um mittels eines Probenhalters zu stehen, und ein allmählich anwachsendes Gewicht wurde an das Ende des anderen Schinkenstückes angebracht, um das Gewicht zu messen, bei welchem 1-a und 1-A1-a auseinandergerissen wurden.
Als ein Vergleichsbeispiel wird dasselbe Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Fibrinklebstoffes durchgeführt (Veriplast, Produkt von Hoechst Marion Roussel).
Zusätzlich wurde Schinken an ein Ende eines Schlauches mit einem Durchmesser von 6 mm angeklebt und abgedichtet, ein Schnitt von 6 mm wurde gemacht und eine Dichtung von 2 mm von 1-a oder 1-A1-a wurde aufgebracht, anschließend mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Luft wurde vom anderen Ende des Schlauches zugeführt und der Druck, bei welchem die Luft durch den Schlitz durchzusickem begann, wurde gemessen.
Das Gewicht pro Schnittfläche, wenn das Gel im ersteren Experiment durchbrach und der Druck, bei welchem die Luft im letzteren Experiment durchzusickern begann, sind in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Hier sind das Gewicht und der Druck in Tabelle 3 wie folgt definiert.

* Gewicht: das Gewicht (10² kg/m²) pro Einheit der Schnittfläche auf dem Gel, wenn das den Schinken verbindende Gel brach.
** Druck: der Druck (Pa) pro Flächeneinheit, wenn die komprimierte Luft die Luft veranlasste, durch das Gel, welches den Schnitt im Schinken bedeckte, durchzusickern.

Materialkonzentration	1-a		1-A1-a		Veriplast
Materialkonzentration	Gewicht	Druck	Gewicht	Druck	Gewicht	Druck
1%	1,8	3,2	1,4	4,7	4,0 (Konz. 4%)	- (Konz. 4%)
3%	3,1	3,7	2,8	3,7
5%	4,2	4,6	4,3	4,3

Wie von den in der obigen Tabelle 3 gezeigten Ergebnissen klar ist, bilden die Chitosan-Derivate, welche Azidverbindungen eingebaut haben, ein extrem starkes wasserunlösliches Chitosan-Hydrogel mit ultravioletter Bestrahlung von nur einer kurzen Zeit. Zu dieser Zeit war ein Ablösen des Chitosan-Gels vom Schinken unter allen Bedingungen nicht beobachtet worden. Im Gegensatz dazu, das als Kontrolle verwendete Veriplast, zeigte eine Trennung, gefolgt von einem Ablösen von dem Schinken. 1-A1-a mit der ersten Funktionalisierung war in der Lage, in eine wässrige Lösung im neutralen Bereich eingearbeitet zu werden.
Zusätzlich konnte die Starke des unlöslichen Chitosan-Gels leicht kontrolliert werden durch die Konzentration der wässrigen Lösung vor dem Aushärten. Diese Starke war annäherungsweise dieselbe wie beim kommerziell erhältlichen Fibrinklebstoff.
Beispiel 5: Bewertung der Haarschutzfunktion
Eine 1:1:1-Mischung (im Folgenden als "1-abc" bezeichnet) der Chitosan-Derivate 1-a (Azidobenzoesäure), 1-b (Parabenzoylbenzoesäure) und 1-c (Zimtsäure) mit photoreaktiven funktionellen Gruppen, die in Beispiel 1(2) dargestellt wurden, wurde hergestellt.
0,25 g menschliches Haar wurde mit einem kommerziell erhältlichen Shampoo gewaschen und mit destilliertem Wasser gespült. Nach dem Trocknen wurde es für 1 Stunde bei einer Luftfeuchtigkeit von 95% und 37°C stehen gelassen, dann für 10 Minuten in eine 0,1 Gew.-%ige wässrige Lösung von 1-abc getaucht. Das behandelte Haar wurde auf einem Filterpapier offen hingelegt, um die überschüssige wässrige Lösung zu absorbieren, anschließend mit ultravioletten Strahlen für 5 Minuten bestrahlt. Daraufhin wurde das mit ultravioletten Strahlen bestrahlte Haar eingetaucht und gespült in destilliertem Wasser für 30 Minuten, nach welchem das Haargewicht vor und nach der 1-abc-Behandlung gemessen und verglichen wurde. Als eine Kontrolle wurde dieselbe Bewertung auf nicht behandeltem Chitosan (Verbindung 1) und 1-A1, welches nur Laktose eingebaut hat, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Haarbehandlungsverbindung Erhöhtes Gewicht pro Gramm Haar

1 0,09 g

1-A1 0,11 g

1-abc 0,15 g
Wie in der obigen Tabelle 4 gezeigt ist, war das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung, in welches photoreaktive funktionelle Gruppen eingebaut wurden, effektiv unlöslich gemacht und an der Haaroberfläche durch ultraviolette Absorption verankert, wodurch eine hohe Wasserrückhaltefähigkeit erreicht wurde. Dies legt nahe, dass das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat eine wasserrückhaltende Wirkung und ultraviolette Strahlung abschirmende Wirkung hat, wodurch eine lang anhaltende Beschichtung beibehalten und dem Haar Glanz verliehen werden kann. Im Gegensatz dazu ist das Chitosan-Derivat 1-A1, welches nur ein Kohlenhydrat eingebaut hat, in Wasser löslich, so dass keine bedeutungsvolle Ergebnisse im Vergleich zu dem unbehandelten Chitosan 1 gesehen werden konnten.
Beispiel 6: Bewertung der Hämostasewirkung
1, 3 und 5 Gew.-%ige wässrige Lösungen des Chitosan-Derivats 1-a, welches eine photoreaktive Gruppe (Azidobenzoesäure) eingebaut hat, und des Chitosan-Derivats 1-A1-a, welches weiterhin ein Kohlenhydrat (Laktose) eingebaut hat, wurden hergestellt. Eine Westar-Ratte (weiblich, 4 Wochen alt) wurde mit Pentobarbital am Bauch aufgeschnitten (ventrotomized) und ein Schnitt von 2 mm Tiefe und 2 mm Länge wurde in jeden Lappen der Lunge gemacht. Die Pfortader wurde sofort geklammert, das Blut abgewischt und die vorbereitete wässrige Lösung aufgebracht. Nach Ultraviolettbestrahlung für 30 Sekunden mit einer nadelspitzartigen Ultraviolettstrahlungsvorrichtung (SpotCure, Ushio Electric) wurde die Klammer entfernt und man ließ dem Blutfluss seinen Lauf. Diese Serie von hämostatischen Verfahren wurde innerhalb 1 Minute vollendet. Als ein Ergebnis wurde ein gutes unlösliches Gel durch die ultraviolette Bestrahlung mit Chitosan-Lösungen von jeder Konzentration gebildet, welche vollständig den Blutfluss von der geschnittenen Oberfläche stillten.
Als nächstes wurde eine Kanüle in die Pfortader eingeführt und PBS mit dazugefügten 0,5 mM EDTA wurde mit einer peristaltischen Pumpe injiziert. Das Blut in der Leber wurde sofort mit PBS ersetzt durch Abtrennen der subabdominalen Vene. Zu diesem Zeitpunkt nimmt die Leber eine bräunliche Farbe an aufgrund der Ersetzung mit PBS, aber eine PBS-Ersetzung tritt nicht an den Teilen auf, in welchen Hindernisse gegenüber dem Blutfluss bestehen und das Blut blockiert ist und die charakteristische rötlich-braune Farbe wird dort beibehalten.
Im vorliegenden Test wurde einige rötliche Blutblockaden in den Teilen beobachtet, in welchen das Blut am Schnitt durch das Chitosan-Derivat der vorliegenden Erfindung gestoppt worden ist, aber insgesamt wurde ein Blutersatz ähnlich zu dem anderer Lebergewebe, in welchen kein Schnitt gemacht wurde, beobachtet.
Beispiel 7: Bewertung der Zellantwort
0,1 Gew.-%ige wässrige Lösungen, jeweils aus dem Chitosan-Derivat 1-a mit der zweiten Funktionalisierung und den Chitosan-Derivaten 1-A1-a und 1-B1-a mit den ersten und zweiten Funktionalisierungen, wurden hergestellt. 1 ml der Chitosan-Derivat-Lösungen wurde in Polystyrolkulturschalen mit einem Durchmesser von 35 mm hergestellt, anschließend für zwei Stunden stehen gelassen. Danach wurde die Lösung weggeschüttet und das Ergebnis mit ultravioletten Strahlen für 5 Minuten bestrahlt, anschließend dreimal mit PBS gespült.
Als eine Kontrolle wurde eine Kulturschale, die unter Verwendung von Fibronectin (F) und Gelatine (G) von 0,025 Gew.-% adsorbiert und beschichtet war, verwendet. Zusätzlich wurde eine nicht behandelte Kulturschale (N) ebenso hergestellt.
Diese Kulturschalen wurden mit 10⁶ menschlichen vaskulären Endotheizellen (VEC) aus dem menschlichen Nabelschnur, Fibroblasten (FIB) von Haut von Neugeborenen, glatten Muskelzellen (SMC) aus den koronaren Arterien von Ratten und Keratinozyten von Neugeborenen (KER) (alle von Chronetics) besät und diese wurden für 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Die Zelladsorptionsrate dieser Zeit ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Anteil von ausgesäten Zellen, adsorbiert auf der Kulturschale (%)

Behandlungssubstanz VEC FIB SMC KER

N (unbehandelt) 10 23 21 26

F (Fibronectin) 48 48 47 48

G (Gelatine) 46 44 47 48

1-a 8 10 11 34

1-A1-a 8 5 7 31

1-B1-a 8 4 21 37
Wie in Tabelle 5 gezeigt, während die Endothelzellen, wie vaskuläre Endothelzellen, Fibroblasten und glatte Muskelzellen, eine Tendenz in Richtung einer extrem unterdrückten Adhäsion in Bezug auf die Chitosan-Derivate der vorliegenden Erfindung aufweisen, zeigen die Epithel-Keratinozyten eine Tendenz zur Adhäsion ähnlich der von Fibronectin und Gelatine, welche bekannte Zelladhäsionsproteine sind. Die höchste Zelladhäsionsunterdrückungstendenz wurde in dem Chitosan-Derivat 1-A1-a, welches Laktose eingebaut hat, beobachtet.
Weiterhin wurde eine zylindrische Trennwand mit einem Durchmesser von 15 mm in die Mitte der Kulturschale gestellt, wobei die Außenseite der Trennwand mit Fibronectin behandelt ist und die Innenseite mit Chitosan-Derivaten 1-a, 1-A1-a und 1-B1-a. Nach dem Besäen der äußeren Fibronectin-Phase mit den oben beschriebenen Zellen und Befestigen der Zellen, wurde die Trennwand entfernt und eine Langzeitkultur durchgeführt, aus welcher abgesehen von den Keratinozyten keine der Zellen zur Chitosan-Derivat behandelten Phase innerhalb der Abteilungswand transferierte und kein Zeltwachstum konnte beobachtet, selbst nach zwei Wochen. Zu diesem Zeitpunkt war die Zellüberlebensrate extrem gut in allen Kulturschalen.
Die obigen Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass nach der Unlöslichkeitsbehandlung bei einer Wunde das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat das Eindringen von wild wucherndem Gewebe, das im Behandlungsprozess erzeugt wird, behindert, wodurch die Adhäsion effektiv verhindert wird. Von dieser Art des Aushärtens wird erwartet, beträchtlich zum sicheren Austausch von Verbänden auf Wunden insbesondere Verbrennungen beizu tragen, und nach einer Stent-Behandlung zur Vermeidung des Wiederverschlusses von koronaren Arterien, zur Vorbeugung von Wiederverschluss aufgrund von Proliferation von glatten Muskelzellen und Ähnlichem.
Außerdem erreicht es in der Hautregion Adhäsion und freie Bewegung von Epithel-Keratinozyten und es kann daher erwartet werden, dass es die Hautregeneration anregt und einen hautverschönernden Effekt durch Glätten von Falten aufweist. Auf der anderen Seite absorbieren und reagieren die photoreaktiven funktionellen Gruppen, wie Azidgruppen, Benzophenongruppen und Zimtsäure, welche in die vorliegende Erfindung eingebaut werden können, mit ultravioletten Strahlen und es kann daher erwartet werden, dass sie als ein Rohmaterial für kosmetische Produkte mit einem Weißungseffekt aufgrund der Abschirmung von ultravioletten Strahlen verwendet werden können.
Beispiel 8: Bewertung der Wasserrückhaltungsrate
Die folgenden Experimente wurden unter Verwendung des Chitosan-Derivats 1-I durchgeführt, in welches nur eine amphipathische Gruppe (dritte Funktionalisierung), dargestellt in Beispiel 1(3), eingebaut wurde, des Chitosan-Derivats 1-A1-I, welches nur die erste und dritte Funktionalisierungen eingebaut hatte, des Chitosan-Derivats 1-a-I, welches die zweite und dritte Funktionalisierung eingebaut hatte, des Chitosan-Derivats 1-A1-a-I, welches die erste, zweite und dritte Funktionalisierung eingebaut hatte und für Vergleichszwecke des unbehandelten Chitosans (Verbindung 1) und eines Derivats (1-AI), welches nur ein Kohlenhydrat eingebaut hatte.

Diese wurden gefriergetrocknet, dann wurde 1 g der gefriergetrockneten Flocken in einen Kolben mit einer Kapazität von 100 cm³ gegeben und 100 ml destilliertes Wasser wurden zugefügt. Nach 5 Stunden war die Feuchtigkeit absorbiert worden, um ein gelatineartiges transparentes Gel zu bilden, und nach Beseitigen der Feuchtigkeit, welche nicht absorbiert worden war, wurde das gelatineartigen Gels gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6: Wasserabsorptionsgewicht (g) des Chitosan-Derivats

Material	Gewicht
Chitosan (unbehandelt)	Nicht messbar aufgrund vollständiger Auflösung nach 5 Stunden
1-A1 (Laktose)	Nicht messbar aufgrund vollständiger Auflösung nach 5 Stunden
1-I	72
1-A1-I	75
1-a-I	70
1-A1-a-I	68

Wie in Tabelle 6 gezeigt, hat das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat, welches eine amphipathische Gruppe (Polyoxyalkylenalkylethergruppe) eingebaut hat, klar eine höhere wasserrückhaltende Fähigkeit, wodurch es in der Lage ist, ungefähr das 70-fache seines eigenen Gewichtes an Wasser zu absorbieren. Zusätzlich war die Hydrogelbildung innerhalb von 10 Sekunden vervollständigt, aber es behielt seine Gelform sogar 5 Stunden nach der Messung bei. Zusätzlich, die Verbindung 1-a-I mit einer photoreaktiven funktionellen Gruppe und einer amphipathischen Gruppe wurde ein Gel mit noch höherer Stärke aufgrund der Ultraviolettbestrahlung.
Beispiel 9: Blutverfestigungstest
0,1 g gefriergetrockneter Flocken der Chitosan-Derivate 1-I und 1-a-I, die durch die vorliegende Erfindung erhalten wurden, wurden zu 3 ml frischen menschlichen Blutes, gesammelt mit der Zugabe von Citrat-Phosphat-Dextrose (CPD) gegeben. 1-I und 1-a-I absorbierten unmittelbar den Wassergehalt im Blut, um ein unlösliches Hydrogel zu bilden, und wenn (I)-1-A mit ultravioletten Strahlen bestrahlt wurde, erhöhte sich die Adhäsion zwischen der Gewebeoberfläche und dem Gel. Diese Chitosan-Derivate mit hoher Wasserrückhaltungsfähigkeit quellen mit Wasser, wenn sie in Blutgefäße unter Verwendung von Kathetern oder Spritzen injiziert werden und können effektiv den Blutfluss in Blutgefäßen stoppen. Dies bedeutet, dass die Anwendung zur lokalisierten Krebsbehandlung, worin ein Blutgefäß, welches zu tumorhaltigem Gewebe führt, verschlossen wird, um das Tumorwachstum zu behindern, vorgeschlagen wird.
Beispiel 10: Einkapselung von Substanzen
50 ml einer wässrigen Chlorophyll-Lösung, die bei Standardtemperatur gesättigt wurde, wurden zu 1 g der Chitosan-Derivate 1-I und 1-a-I, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, zugefügt. Die jeweiligen Chitosan-Derivate absorbierten sofort die Chlorophyll-Lösung, um ein grünes Hydrogel zu bilden. Diese Gele waren nicht in der Lage, in 0,1 M Essigsäurepuffer-Lösung (pH 4,0), 1 N Salzsäure-Lösung (pH 1) noch in IN Natriumhydroxid-Lösung (pH 13) zersetzt zu werden.
Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass das Chitosan-Derivat mit hoher Wasserrückhaltefähigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, wasserlösliche Verbindungen schnell zu absorbieren und einzukapseln und sogar unter einem bestimmten Grad an nicht physiologischen Bedingungen ein unlösliches Gel beizubehalten, so dass ein weiter Bereich von Anwendungen in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie als ein Wirkstoffverabreichungssystem oder als Mittel zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung erwartet werden kann.
Beispiel 11: Oberflächenbehandlungen durch Chitosan-Derivate (Funktionalisierung von verfestigten Chitosan-Derivaten)
(1) Oberflächenschmierbehandlung durch amphipathische Gruppen
Eine 0,1 Gew.-%ige wässrige Lösung des Chitosan-Derivats 1-A1-a mit den ersten und zweiten Funktionalisierungen aufgrund der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt und ein Polyurethan-beschichteter Draht (Durchmesser 2 mm, Länge 5 cm, Kawasumi Laboratories) wurde in die wässrige Lösung eingetaucht. Danach wurde es sofort mit ultravioletten Strahlen für 5 Minuten bestrahlt und mit Ethanol und Wasser gespült. Der Urethandraht, der mit 1-A1-a behandelt war, wurde in eine Kohlensäurepufferlösung (pH 10), enthaltend 5 Gew.-% Laurylalkoholpolyethylenglykol(15)glycydylether (EX-171; Nagase Kasei Kogyo) eingetaucht, dann ließ man ihn für 20 Stunden bei 80°C reagieren. Nach der Reaktion wurde das Ergebnis gespült mit Ethanol und destilliertem Wasser, um einen Polyurethandraht (als "1-A1-a-(I)" bezeichnet) mit einer Schmierungsoberflächenbehandlung aufgrund der amphipathischen Gruppen zu erhalten.
Nach Eintauchen des resultierenden oberflächenbehandelten Polyurethandrahtes 1-A1-a-(i) für 30 Sekunden in eine physiologische Salzlösung wurden 2 cm der oberflächenbehandelten Teile des Polyurethandrahtes durch eine 1 mm dicke Silikonfolie mit Hilfe einer Luftklemme, eingestellt auf 2 kg/cm², durchgesteckt, anschließend mit einer Rate von 200 mm/Minuten gezogen, wobei die maximal aufgebrachte Ladung zu dem Zeitpunkt, wo der Polyurethandraht aus der Silikonfolie gezogen wurde gemessen wurde. Diese maximale Beladung wurde verwendet, um die Schmierfähigkeit der Oberfläche zu bewerten. Als eine Kontrolle wurden dieselben Messungen an einem unbehandelten Polyurethandraht (N) und einem Polyurethandraht, welcher nicht mit EX-171 (behandelt mit 1-A1-a) behandelt worden ist, durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Wie in Tabelle 7 gezeigt, die Oberfläche behandelt mit EX-171, welches eine amphipathische Gruppe hat, zeigte eine erhöhte Schmierfähigkeit und war leichter wegzuziehen. Das heißt, das erfindungsgemäße funktionalisierte Chitosan-Derivat ist in der Lage, schnell einen dünnen Film auf der Oberfläche eines Harzes zu bilden aufgrund des Einbaus einer photoreaktiven funktionellen Gruppe (zweite Funktionalisierung) und weiteren Funktionalisierungen, wie beispielsweise den amphipathischen Gruppen, können gemacht werden, nachdem der Film sich gebildet hat. Aufgrund der Fähigkeit zur Oberflächenmodifizierung, wobei weitere Funktionen, wie Schmierfähigkeit und Ähnliches, nach der Filmbildung zugefügt werden können, kann das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat geeigneterweise in der Oberflächenbehandlung von Kathetern sowie Führungsdrähten verwendet werden. Tabelle 7: Maximale Beladung, um Polyurethandrähte zu ziehen

Oberflächenbehandlung Maximale Herausziehbeladung (kgf)

N (unbehandelt) 2,00

1-A1-a 0,96

1-A1-a(I) 0,18
(2) Oberflächenbehandlung aufgrund von Glykosaminoglykan (Heparin) (vierte Funktionalisierung)
Das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat 1-A1-a wurde in destilliertem Wasser gelöst, ein Dimethylsulfoxid wurde zugefügt bis zu einer Endkonzentration von 1 Gew.-%, um eine gemischte Lösung mit einer Konzentration des Chitosan-Derivats von 1 Gew.-% zu formulieren. Das Innere eines Vinylchloridschlauches mit einem inneren Durchmesser von 5 mm und einer Länge von 5 cm wurde mit dieser gemischten Lösung gefüllt und nach Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen für 24 Stunden von der Außenseite des Schlauches wurde die nicht abreagierte Lösung entfernt und das Ergebnis mit destilliertem Wasser gewaschen. Auf diese Weise wurde die innere Oberfläche des Vinylchloridschlauches mit einem 1-A1-a-Film beschichtet.
Getrennt vom Obigen wurden Heparinfragmente mit niedrigem Molekulargewicht und mit einer Aldehydgruppe, die in den reduzierenden Enden mit Hilfe eines bekannten Salpetersäure-Zersetzungsverfahren eingebaut worden sind, durch Gelfiltration erhalten. Eine wässrige Lösung, die durch Zugabe von 10 mg des Heparins mit niedrigem Molekulargewicht erhalten worden ist, wurde mit 50 mg Cyanonatriumboronhydrat in 1 ml destilliertem Wasser hergestellt und in den oben erwähnten mit Chitosan-Derivat behandelten Schlauch eingefüllt, welcher gewaschen worden ist. Nachdem man für 24 Stunden bei 50°C reagieren ließ, wurde das Innere des Schlauches mit 0,01% TWEEN 20-Lösung ersetzt, anschließend mit Ethanol und destilliertem Wasser gespült, um einen mit Heparin versehenen (vierte Funktionalisierung) Vinylchloridschlauch zu erhalten (1-A1-a-(H)).
Als nächstes wurde eine 0,0008%ige wässrige Toluidin-Blue-Lösung, welche an Heparin bindet, um einen Komplex zu bilden, in den oben beschriebenen mit Heparin modifizierten Schlauch 1-A1-a-(H) gefüllt und der Wechsel in der Lichtabsorption des Toluidin-Blue, welches an Heparin gebunden war, wurde bei 640 nm gemessen. Als Kontrollen wurden dieselben Messungen unter Verwendung eines unbehandelten Vinylchloridschlauches und eines Schlauches, welcher mit Heparin mit niedrigem Molekulargewicht ohne der Verwendung von Cyanonatriumboronhydrat behandelt worden ist (d. h., worin das Heparin mit niedrigem Molekulargewicht eine kovalente Bindungsform und lediglich an die Oberfläche absorbiert, bezeichnet als "1-A1-a/(H)) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8: Wechsel in der Lichtabsorption von Toluidin-Blue

Oberflächenbehandlung Lichtabsorption

Keine 0,19

1-A1-a/(H) 0,16

1-A1-a-(H) 0,06
Wie in Tabelle 8 gezeigt, mit dem erfindungsgemäßen funktionalisierten Heparin-Derivat, welches Heparin, welches ein Glykosaminoglykan ist, durch Hilfe von kovalenten Bindungen eingebaut hat, war eine Oberflächenbehandlung durch Heparin mit einer höheren Effizienz möglich als in dem Falle von einfacher Adsorption. Daher ist das erfindungsgemäße Chitosan-Derivat geeignet zur Verwendung in der Oberflächenbehandlung von medizinischen Geräten, wie Kathetern, Führungsdrähten und extrakorporalen Zirkulationswegen, welche Blut kontaktieren. Zusätzlich, da die Aktivierung von Zellwachstumsfaktoren, wie FGF aufgrund von Heparin in Wundverbänden erreicht werden kann, kann ein wundheilungsfördernder Effekt erwartet werden.
In dem vorliegenden Beispiel wurden Glykosaminoglykane in die Oberfläche von dem photogehärteten Film, geformt auf einer Harzoberfläche oder Ähnlichem, eingebaut, wie oben erwähnt, es kann auch nach dem Einbau von Glykosaminoglykan in die Chitosan-Moleküle vor der Filmbildung verwendet werden.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäßen funktionalen Chitosan-Derivate ermöglichen Löslichkeit bei physiologischen pH-Leveln aufgrund des Einbaus von Kohlenhydraten mit reduzierten Enden (erste Funktionalisierung), es ist mit der Fähigkeit versehen zur Selbstvernetzung durch Photobestrahlung aufgrund des Einbaus von photoreaktiven funktionellen Gruppen (zweite Funktionalisierung), ist in der Lage, ein unlösliches Hydrogel mit deutlich verbesserter Wasserrückhaltekraft (Wasserabsorption) zu bilden aufgrund des Einbaus von amphipathischen Gruppen (dritte Funktionalisierung) und kann das Heilen von Wunden fördern oder als ein antithrombotisches Material arbeiten aufgrund des Einbaus von Glykosaminoglykanen (vierte Funktionalisierung). Daher können die erfindungsgemäßen funktionellen Chitosan-Derivate weithin in verschiedenen Materialien des Gesundheitswesens angewendet werden, beispielsweise in dem Gebiet der Medizin, zum Binden von Körpergeweben, Abdichten von Flüssigkeit und Gasen, Verhinderung der Adhäsion, gegen Embolismen, als Implantate, Schmiermittel und zur kontrollierten Freisetzung von pharmazeutischen Bestandteilen, und im Feld der Kosmetik für Hautpflege und Haarschutz.

Claims

Ein funktionelles Chitosanderivat, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine photoreaktive funktionelle Gruppe auf einem Teil der Aminogruppen in 2-Position in den Glukosamineinheiten, weiche ein mindestens teilweise deacetylierte Chitin/Chitosan bilden, umfasst, und dass es weiterhin mindestens ein Kohlenhydrat mit reduzierten Enden an anderer Stelle der Aminogruppen in 2-Position in den Glukosamineinheiten und/oder mindestens eine Glukosaminglukangruppe an anderer Stelle der Aminogruppen in 2-Position in den Glukosamineinheiten und/oder mindestens eine amphiphatische Gruppe mit einem hydrophoben Block umfassend eine hydrophobe Gruppe und einen hydrophilen Block mit einer hydrophilen Gruppe an anderer Stelle der Aminogruppen in 2-Position in den Glukosamineinheiten und/oder an einer Stelle der Hydroxylgruppen in der 3-Position und/oder 6-Position in den Glukosamineinheiten oder Acetylglukosamineinheiten umfasst.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Deacetylierung des Chitin/Chitosan mindestens 40% beträgt.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kohlenhydrat mit reduzierten Enden ein Kohlenhydrat mit 20 oder weniger konstituierenden Kohlenhydrateinheiten ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Kohlenhydrat mit reduzierten Enden ein neutrales Disaccharid ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Substitution der Kohlenhydrate mit reduzierten Enden 0,1 bis 80% ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die photoreaktive funktionelle Gruppe ausgewählt wird unter Carbonylazidgruppen, Sulfonylazidgruppen und aromatischen Azidgruppen.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Substitution der photoreaktiven funktionellen Gruppen 0,1 bis 80% ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die amphipathische Gruppe eine nicht-ionische Gruppe ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die amphipathische Gruppe eine Polyoxyalkylenalkylethergruppe ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Substitution der amphipathischen Gruppe 5 bis 70% ist.
Ein funktionelles Chitosanderivat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykosaminoglykan ein Heparinderivat ist.
Ein Material für die Gesundheitsvorsorge enthaltend ein funktionelles Chitosanderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.