CN105191940A

CN105191940A - 一种壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用

Info

Publication number: CN105191940A
Application number: CN201510525992.4A
Authority: CN
Inventors: 吴福安; 杨采风; 周雨; 吴滔; 许晏; 盛晟; 王俊
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2015-08-25
Filing date: 2015-08-25
Publication date: 2015-12-30

Abstract

一种壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用，所述壳聚糖衍生物的结构如式(Ⅰ)所示，其中R为H或脱羧羟基的咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸和绿原酸。本发明提供了利用壳聚糖衍生物抑制桑青枯病病原菌的半致死浓度，这种方法在低浓度壳聚糖衍生物可以有效的抑制青枯菌，是一种防治青枯病的有效方法，且对环境没有污染。

Description

一种壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用

技术领域

本发明属于微生物防控领域，尤其涉及到壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用。

背景技术

青枯病(Ralstoniasolanacearum)是一种破坏性最大的植物细菌性病害之一，其病原菌为茄科劳尔氏菌，根据其致病性差异，可分为马铃薯青枯病病原菌GIM1.74，木麻黄青枯病病原菌GIM1.76，番茄青枯病病原菌GIM1000，生姜青枯病病原菌GIM1.71和桑树青枯病病原菌RS-5，主要分布在热带、亚热带和温带地区，危害五十余科三百余种植物，造成了大面积的植物病害，在一定程度上制约了经济的可持续发展。

自然条件下，茄科劳尔氏菌可从植物根部或茎部的伤口侵入，也可以从未受伤的次生根的根冠部位直接侵入，从而引起发病。主要病状是植株迅速萎蔫、枯死，茎叶仍保持绿色。病茎的褐变部位用手挤压有乳白色菌液排出。在高温高湿、重荏连作、低洼土粘、田间积水、土壤偏酸和偏施氮肥等情况下该病容易发生且发病快，防治困难。青枯病菌在10～41℃下生存，在35～37℃生育最为旺盛。一般从气温达20℃时开始发病，低温超过20℃时十分严重。因此，对青枯病的有效防治十分必要。

目前，青枯病的防治方法主要包括物理防治，化学防治和生物防治。

2013年，丁伟等在专利CN103190222A中通过土壤改良，平衡土壤养分，在烟草种植地中加入改良剂控制烟草青枯病。传统的防治方法还包括及时消毒和更换床土，并有计划地进行轮作，同时采用嫁接栽培方式加以防范，一旦发现病株就立即剔除并烧毁，但是这类防治方法单一，治标不治本，需辅助其他方法进行防治。

化学防治青枯病的方法有：2000年，覃新导等在《热带农业科学》中报道在防治旱地茄子青枯病的田间试验中，用50％青枯灵可湿性粉剂喷药6次，防效达73％左右，残效期长达5个月；2004年，孔玉凡等在《中国烟草科学》中报道用20％青枯灵可湿性粉剂防治烟草青枯病优于72％农用链霉素可湿性粉剂。化学防治效果虽然很好，但对环境影响比较大。

近几年，生物防治青枯病的方法有：2013年，Kiirika等通过壳聚糖和硅的综合应用来防治番茄青枯病；2011年，Li等通过多粘类芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌的生物膜形成能力来研究其对番茄青枯菌的防治作用；2010年，Algam等用类芽孢杆菌和壳聚糖相互结合抑制番茄青枯菌的生长；2008年，姜宁等在《植物保护》中提出紫油厚朴皮提取物对马铃薯青枯菌的最小抑制浓度为0.1g/L。综上可述，青枯病的生物防治是将来该病绿色防控的主要手段。

壳聚糖(Chitosan)是一种天然可再生的大分子多糖，是自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰基后的产物，其化学名称为β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，具有生物可降解性、生物相容性、生物低毒性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。因其低溶解性需要进行酶法修饰合成其衍生物，从而增强其溶解性并保持或增强其抑菌性。壳聚糖来源广泛，属于使用来源于天然或者直接来源于自然的有机材料的绿色防控，而壳聚糖衍生物是首次应用于青枯病的防治。

发明内容

技术问题：本发明针对上述问题，本发明提供一种壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用，找到了利用壳聚糖衍生物抑制桑青枯病病原菌的半致死浓度，这种方法在低浓度壳聚糖衍生物可以有效的抑制青枯菌，是一种防治青枯病的有效方法，且对环境没有污染。

技术方案：一种壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用，所述壳聚糖衍生物的结构如式(Ⅰ)所示：其中R为H或脱羧羟基的咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸和绿原酸化合物。

所述对防治青枯病有效的式(Ⅰ)化合物浓度为0.0125～10g/L。

式(Ⅰ)化合物是在均相反应体系中合成，反应条件为：0.01～0.1g咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸或绿原酸溶于甲醇后再与磷酸缓冲液混合，以0.5～2g壳聚糖为底物，0.1～1mg虫漆酶为催化剂，温度为20～40℃，反应3～5h，20～300W微波条件下辅助合成。

式(Ⅰ)化合物在酸性条件下抑制青枯菌。

应用时以0.0125～10g/L的式(Ⅰ)化合物进行喷洒，每日使用次数为1～5次。

式(Ⅰ)结构的壳聚糖衍生物在制备青枯病防治药物中的应用。

一种青枯病防治药物，有效成分为如式(Ⅰ)结构的壳聚糖衍生物中的至少一种。

所述青枯病病原菌分为五个小种：RalstoniasolanacearumRace1，Race2，Race3，Race4和Race5，即分别为马铃薯青枯病病原菌GIM1.74，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)；木麻黄青枯病病原菌GIM1.76，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)；番茄青枯病病原菌GIM1000，由南京农业大学植物保护学院提供；生姜青枯病病原菌GIM1.71，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)；桑树青枯病病原菌RS-5，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)。

有益效果：利用SPSS软件进行分析，计算壳聚糖衍生物对青枯菌的半抑制浓度，从而对青枯病进行有效防治。本发明提供了利用壳聚糖衍生物抑制桑青枯病病原菌的半致死浓度，这种方法在低浓度壳聚糖衍生物可以有效的抑制青枯菌，是一种防治青枯病的有效方法，且对环境没有污染。

附图说明

图1为壳聚糖衍生物的合成路线图；

图2为壳聚糖及其衍生物的红外谱图。

具体实施方式

面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

壳聚糖衍生物的合成路线如图1所示，以壳聚糖(CTS)和咖啡酸(CA)(阿魏酸(FA)，肉桂酸(CIA)，对香豆酸(COA)或绿原酸(CHA))为底物，漆酶(Laccase)为催化剂合成壳聚糖咖啡酸衍生物(CTS-g-CA)(壳聚糖阿魏酸衍生物(CTS-g-FA)，壳聚糖肉桂酸衍生物(CTS-g-CIA)，壳聚糖对香豆酸衍生物(CTS-g-COA)，壳聚糖绿原酸衍生物(CTS-g-CHA))。壳聚糖分子质量范围为20～50万，CTS-g-CA，CTS-g-FA，CTS-g-CIA，CTS-g-COA和CTS-g-CHA结构式中n为1116～2790；壳聚糖及其衍生物的红外谱图如图2所示，与壳聚糖相比，壳聚糖衍生物在1320cm^-1和1380cm^-1处的N-H键的透射比明显增加，在1700cm^-1和1670cm^-1处出现新的峰，与C＝C键的伸缩振动相符合。结果表明N-H键的含量明显减少，壳聚糖衍生物是通过酰胺键合成。

壳聚糖衍生物溶液的制备方法，包括以下步骤：

称取少量壳聚糖衍生物，溶于稀酸溶液中，配制成母液，其用量和浓度可以根据需要进行稀释。

壳聚糖衍生物的抑菌效果测定采用分光光度法。

分光光度法：采用酶标仪测定加入不同浓度的壳聚糖衍生物的菌液的吸光度，准确测定其对青枯菌的抑制率及半抑制浓度。抑菌率计算公式为式(Ⅱ)：

其中T0样品和TF样品分别为加入壳聚糖衍生物的菌液在培养前与培养后的吸光度；T0空白和TF空白分别为只加培养基在培养前与培养后的吸光度；T0对照和TF对照分别为加入无菌水的菌液在培养前和培养后的吸光度。

实施例1

本实施例采用分光光度法检测最低浓度范围的壳聚糖衍生物对桑青枯病病原菌的抑制作用。

桑青枯病病原菌RS-5在TM液体培养基(蛋白胨10g，葡萄糖5g，干酪素1g，蒸馏水1L)中28℃下震荡培养24h，得到菌悬液。将壳聚糖衍生物溶解在稀酸中，配制成20g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去杂菌的影响。每个试管内加入5mLTM液体培养基，设置不同浓度的壳聚糖衍生物(CTS-g-CA、CTS-g-FA、CTS-g-CIA、CTS-g-COA和CTS-g-CHA)，结构如图1所示。试管内接入桑青枯病病原菌RS-5，做3个重复，培养过夜。最后将试管中的菌悬液200μL加入96孔板，用酶标仪在600nm下读数，根据式(Ⅱ)计算抑菌率。

结果显示，壳聚糖衍生物对桑青枯病病原菌RS-5有抑制效果的最低浓度范围为0.0125～0.1g/L，抑菌率为19.83％～43.35％。

实施例2

本实施例采用分光光度法法检测最高浓度范围的壳聚糖衍生物对桑青枯病病原菌的抑制作用。

桑青枯病病原菌RS-5在TM液体培养基中28℃下震荡培养24h，得到菌悬液。将壳聚糖及其衍生物溶解在稀酸中，配制成20g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去杂菌的影响。每个试管内加入5mLTM液体培养基，设置不同浓度的壳聚糖衍生物(CTS-g-CA、CTS-g-FA、CTS-g-CIA、CTS-g-COA和CTS-g-CHA)，结构如图1所示。试管内接入桑青枯病病原菌RS-5，做3个重复，培养过夜。最后将试管中的菌悬液200μL加入96孔板，用酶标仪在600nm下读数，根据式(Ⅱ)计算抑菌率。

结果显示，壳聚糖衍生物对桑青枯病病原菌RS-5有抑制效果的最高浓度范围为9～10g/L，抑菌率为85.43％～92.26％。

实施例3

本实施例采用分光光度法检测最优浓度范围的壳聚糖衍生物对桑青枯病病原菌的抑制作用。

桑青枯病病原菌RS-5在TM液体培养基中28℃下震荡培养24h，得到菌悬液。将壳聚糖衍生物溶解在稀酸中，配制成20g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去杂菌的影响。每个试管内加入5mLTM液体培养基，设置不同浓度的壳聚糖衍生物(CTS-g-CA、CTS-g-FA、CTS-g-CIA、CTS-g-COA和CTS-g-CHA)，结构如图1所示。试管内接入桑青枯病病原菌RS-5，做3个重复，培养过夜。最后将试管中的菌悬液200μL加入96孔板，用酶标仪在600nm下读数，根据式(Ⅱ)计算抑菌率。

结果显示，壳聚糖衍生物对桑青枯病病原菌RS-5有抑制效果的最优浓度范围为0.15～2g/L，抑菌率为47.34％～81.07％，半抑制浓度范围为0.2～3g/L。

实施例4

本实施例说明壳聚糖衍生物对不同青枯病病原菌的抑制效果。

将五种青枯病病原菌：马铃薯青枯病病原菌GIM1.74，木麻黄青枯病病原菌GIM1.76，番茄青枯病病原菌GIM1000，生姜青枯病病原菌GIM1.71和桑树青枯病病原菌RS-5在TM液体培养基中28℃下震荡培养24h，得到菌悬液。将壳聚糖衍生物(CTS-g-CA、CTS-g-FA、CTS-g-CIA、CTS-g-COA和CTS-g-CHA，结构如图1所示)溶解在稀酸中，配制成20g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去杂菌的影响。将菌悬液涂布在TM固体培养基(蛋白胨10g，葡萄糖5g，干酪素1g，琼脂粉17g，蒸馏水1L)上，然后在培养基上打4个洞，每个孔洞加100μL壳聚糖衍生物，用稀酸做空白对照。平板在28℃的培养箱培养24h，观察是否有抑菌圈的形成，如有抑菌圈则说明有抑制作用；反之则说明无抑制作用。

结果显示，五种壳聚糖衍生物对五种青枯病病原菌都产生抑菌圈，抑菌圈大小在0.1～1.0cm，说明壳聚糖衍生物对五种青枯病病原菌都有明显的抑制作用。

实施例5

本实施例说明壳聚糖衍生物在桑树上进行抑菌试验。

将桑青枯病病原菌RS-5在TM液体培养基中28℃下震荡培养24h，得到菌悬液。将菌悬液每天接种于桑苗，使桑苗发病。

将10％～30％有效浓度的壳聚糖衍生物(CTS-g-CA、CTS-g-FA、CTS-g-CIA、CTS-g-COA和CTS-g-CHA，结构如图1所示)每天用喷雾喷洒致病的桑苗2次。观察壳聚糖衍生物是否对发病的桑苗有效果。

结果显示，经过0.0125～10g/L的有效浓度的壳聚糖及衍生物均对发病桑苗每天用喷雾喷洒1～5次后，发病桑苗病情减轻，说明壳聚糖衍生物对发病桑苗有抑制效果。

Claims

1.一种壳聚糖衍生物在防治青枯病中的应用，所述壳聚糖衍生物的结构如式(Ⅰ)所示：其中R为H或脱羧羟基的咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸和绿原酸化合物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述对防治青枯病有效的式(Ⅰ)化合物浓度为0.0125～10g/L。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于式(Ⅰ)化合物是在均相反应体系中合成，反应条件为：0.01～0.1g咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸或绿原酸溶于甲醇后再与磷酸缓冲液混合，以0.5～2g壳聚糖为底物，0.1～1mg虫漆酶为催化剂，温度为20～40℃，反应3～5h，20～300W微波条件下辅助合成。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于式(Ⅰ)化合物在酸性条件下抑制青枯菌。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以0.0125～10g/L的式(Ⅰ)化合物进行喷洒，每日使用次数为1～5次。

6.权利要求1所述式(Ⅰ)结构的壳聚糖衍生物在制备青枯病防治药物中的应用。

7.一种青枯病防治药物，其特征在于有效成分为如权利要求1所述式(Ⅰ)结构的壳聚糖衍生物中的至少一种。

8.根据权利要求7所述青枯病防治药物，其特征在于所述青枯病病原菌分别为马铃薯青枯病病原菌GIM1.74，木麻黄青枯病病原菌GIM1.76，番茄青枯病病原菌GIM1000，生姜青枯病病原菌GIM1.71和桑树青枯病病原菌RS-5。