DE69826684T2

DE69826684T2 - Kovalent gebundenes n,o-carboxymethylchitosan und seine verwendungen

Info

Publication number: DE69826684T2
Application number: DE69826684T
Authority: DE
Inventors: M. Clive ELSON
Original assignee: Chitogenics Inc
Current assignee: Kytogenics Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 1997-05-06
Filing date: 1998-05-04
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2018-05-05
Also published as: DE69826684D1; CA2288983C; JP2001524156A; CA2288983A1; ATE277624T1; EP1003526A4; WO1998050050A1; EP1003526A1; ES2230692T3; EP1003526B1; US5888988A

Description

Hintergrund der Erfindung
Polymere haben sich in den letzten Jahren einer zunehmenden Verwendung in medizinischen Applikationen erfreut. Solche Polymere, bei denen es sich um synthetische Materialien handeln kann oder die sich von natürlichen Quellen herleiten können, wurden für so diverse Applikationen wie die Abgabe von Therapeutika, wie z. B. Arzneimitteln, Formulierungen mit protrahierter Wirkstofffreigabe; Rekonstruktion von Gewebsdefekten (zum Beispiel in der plastischen Chirurgie); Schutz geschädigter Gewebe oder Prävention postoperativer Adhäsionen, eingesetzt.
Postoperative Adhäsionen werden durch eine Kombination von Faktoren, einschließlich manipulativer Traumen und Austrocknen der Gewebe während des chirurgischen Eingriffs selbst verursacht. Es wurde eine Anzahl von Verfahren beschrieben, die die Verbesserung dieser Probleme anstreben. Hoch konzentrierte Lösungen aus einer Anzahl von Polymeren wurden zum Bedecken des Operationsfeldes vor und während des chirurgischen Eingriffs verwendet, um das Austrocknen zu minimieren und als ein „Polster" zur Prävention einiger der manipulativen Traumen zu wirken. Beispiele dieser Verfahren sind im US-Patent Nr. 4,819,617 an Goldberg et al., US-Patent Nr. 4,886,787 an De Belder et al. und in der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung, Eingangsnummer 08/436,770, beschrieben. Unter den verwendeten Materialien befanden sich Polyvinylpyrrolidon, Dextrane, Carboxymethylcellulosen und eine Anzahl anderer Polymere, wie zum Beispiel Protein- oder Polypeptid-Lösungen. Ein viel versprechendes Polymer, das verwendet wurde, stellt die Hyaluronsäure („HA") dar. Eine Reihe von Patenten von Goldberg et al., insbesondere US-Patent Nr. 5,080,893 und US-Patent Nr. 5,140,016 zeigen die Verwendung der Vorbehandlung von Operationsfeldern mit Hyaluronsäure-Lösungen als Mittel zur Verhinderung chirurgischer Adhäsionen.
Mit der Verwendung von Hyaluronsäure gehen mehrere Probleme einher. Ein Problem bei der Verwendung von Hyaluronsäure stellen ihre Kosten dar. Hyaluronsäure kann aus den Kämmen von Hähnen oder der humanen Nabelschnur gewonnen werden und erfordert eine erhebliche Reinigung, um sie zur Verwendung in chirurgischen Verfahren rein genug zu machen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,141,973 an Balazs, der Verfahren zur Reinigung von Hyaluronsäure beschreibt. Hyaluronsäure kann auch in rekombinanter Form erhalten werden, sie ist aber teuer. Selbst wenn die hohen Kosten und/oder Schwierigkeiten bei der Reinigung gerechtfertigt sein können, kann Hyaluronsäure mit ihr assoziierte Proteine aufweisen, welche eine Verunreinigung der offenen chirurgischen Wunde hervorrufen können.
Als Arzneimittelabgabesysteme wurden eine Reihe verschiedener Polymere eingesetzt, wie z. B Therapeutika mit protrahierter Wirkstofffreigabe. Polymere Arzneimittelabgabesysteme bestehen im Allgemeinen aus zwei Typen: Polymere, die ein Arzneimittel physikalisch einschließen und Polymere, die mit einem Therapeutikum chemisch verknüpft sind. Im ersteren Fall wird das Arzneimittel durch graduelle Diffusion aus der Polymermatrix freigegeben, wenn die Matrix zerfällt oder abgebaut wird, während das Arzneimittel in den letzteren Polymeren aus dem Polymer chemisch freigesetzt wird. Solche Polymere mit protrahierter Wirkstofffreigabe können an einen Patienten, z. B. durch Injektion oder Implantation verabreicht werden, um über eine verlängerte Zeitdauer hinweg eine Arzneimitteltherapie bereitzustellen. Polymere mit protrahierter Wirkstofffreigabe sind zweckmäßig, weil die Depot-Dosierung die Patienten-Compliance mit dem Arzneimittel-Regime erhöht, wobei es den Bedarf an einer wiederholten Arzneimittelverabreichung reduziert oder eliminiert. Eine Polymer-Formulierung mit protrahierter Wirkstofffreigabe kann außerdem in ein diskretes Organ oder Gewebe implantiert werden, wodurch in einigen Fällen eine lokalisierte therapeutische Wirkung des freigegebenen Arzneimittels bereitgestellt wird, während die systemischen Nebenwirkungen abnehmen.
Chitin, der primäre Baustein der Schalen von Schalentieren und vielen Insekten, wurde zur Verwendung als ein Polymer in medizinischen Applikationen modifiziert. Chitin kann relativ preisgünstig erworben werden, primär aus den Abfallprodukten, die andernfalls entsorgt werden könnten. Im nach der Anmeldung an Hayes erteilten US-Patent Nr. 4,619,995 wird ein neues Derivat des Chitins, NOCC, beschrieben. NOCC besitzt Carboxymethyl-Substitute an einigen der Amino- wie auch Hydroxylorte der Glucosamineinheiten der Chitosanstruktur und kann in einer unvernetzten verknüpften Form als eine Lösung verwendet werden; es kann in ein stabiles Gel vernetzt oder komplexiert werden. In den NOCC-Zusammensetzungen von Hayes betrug der Substitutionsgrad zum Beispiel in der Regel weniger als eins mit einer Verteilung der Hydroxyl- zu Aminosubstitution von ca. 2 : 1. Folglich werden ca. 50 % der Aminogruppen des NOCC-Materials von Hayes nicht mit Carboxymethylgruppen substituiert (siehe auch US-Patent 5,412,084 an Elson et al.). Aufgrund seiner vorteilhaften physikalischen Eigenschaften und seiner relativ geringen Kosten im Vergleich zu Materialien wie Hyaluronsäure stellt NOCC vorteilhafte Eigenschaften zur Verwendung in Applikationen, wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren, bereit.
Zuvor beschriebene Verfahren zum Vernetzen von NOCC haben jedoch an gewissen Nachteilen gelitten. NOCC wurde zum Beispiel durch die Verwendung bifunktioneller Reagenzien, wie zum Beispiel Glyoxal, worin jede der beiden Aldehydgruppen von Glyoxal mit einer Aminogruppe von NOCC reagiert, kovalent vernetzt, was in einem vernetzten Produkt resultiert (siehe z. B. das vorstehend erwähnte US-Patent Nr. 4,619,995). Dieses Produkt schließt die 2-Kohlenstoff-Hauptkette von Glyoxal als eine kovalent gebundene Brückenbildungskomponente des vernetzten Addukts ein; diese Brückenbildungskomponente kann nicht ohne weiteres aus dem vernetzten NOCC entfernt werden, ohne das vernetzte NOCC zu zerstören. NOCC wurde auch ionisch vernetzt, z. B. durch Zufügen eines Kations, wie zum Beispiel divalentes Calcium zur Bildung von Gelen. Ionisch vernetzte NOCC-Gele besitzen jedoch nur eine mäßige Stabilität, z. B. gegenüber Hitze oder Lösungsmitteln, und können sich in wässrigen Lösungen auflösen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung kovalent verknüpfter NOCC, in denen keine Brückenbildungskomponente vorhanden ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung eines NOCC-Derivats, worin ein Therapeutikum zur Freigabe an NOCC gebunden oder durch NOCC eingeschlossen ist, um eine Verbindung mit hinhaltender Freigabe, umfassend NOCC und ein Therapeutikum, bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung vernetzter NOCC, worin die Verknüpfung durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt.
Gegenstand der Erfindung ist noch weiter die Bereitstellung von Verfahren zur Wundbehandlung mittels Verabreichung von verknüpftem NOCC an einen Patienten.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung stellt die Bereitstellung von Verfahren zur Verhinderung postoperativer Adhäsionen durch Verabreichung von verknüpftem NOCC an einen Patienten dar.
Ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung stellt die Bereitstellung von Verfahren zur Verabreichung eines Therapeutikums an einen Patienten mittels Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend NOCC und ein Therapeutikum, an den Patienten dar.
Diese und andere erfindungsgemäßen Aufgaben, Merkmale und Vorteile sind in der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden erfindungsgemäß neue Zusammensetzungen von NOCC, Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung von NOCC-Zusammensetzungen bereitgestellt.
Definitionen
Wie hierin verwendet, versteht man unter dem Begriff „Verknüpfung" den Vorgang zur Bildung einer kovalenten Bindung zwischen zwei reaktionsfähigen funktionellen Gruppen oder Komponenten (z. B. zwei funktionellen Gruppen von NOCC oder einer funktionellen Gruppe von NOCC und einer funktionellen Gruppe eines Wirkstoffs), z. B. einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe. Eine Verknüpfung kann durch Verwendung eines Kopplungsreagenzes erreicht werden, das die Reaktion von zwei reaktionsfähigen funktionellen Gruppen miteinander zur Bildung einer direkten Bindung fördert oder mit einem Vernetzungsreagenz, das vor der Reaktion mit der anderen funktionellen Gruppe mindestens eine der funktionellen Gruppen modifiziert und in der Inkorporation einer Brückenbildungskomponente im kovalent verknüpften Produkt resultiert. Eine Verknüpfung kann zwischen zwei funktionellen Gruppen einer einzelnen NOCC-Kette (intramolekulare Verknüpfung), zwischen funktionellen Gruppen von zwei NOCC-Ketten oder zwischen einer NOCC-Kette und einem Wirkstoff (beide bilden eine intermolekulare Verknüpfung) auftreten.
Eine Carboxylgruppe und eine Aminogruppe können zum Beispiel mittels der Verwendung eines Kopplungsreagenzes, wie zum Beispiel eines Carbodiimids, z. B. Dicyclohexylcarbodiimids (DCC) reagieren. Die DCC-geförderte Reaktion resultiert in der Bildung einer Amidbindung direkt zwischen der Aminogruppe und der Carboxylgruppe, d. h. durch eine Dehydratationsreaktion. Dem Durchschnittsfachmann sind viele Carbodiimid-Kopplungsreagenzien bekannt, und viele sind im Handel erhältlich. Zu Beispielen gehören DCC und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) (beide erhältlich von z. B. Aldrich Chemical, Milwaukee, WI). Andere Kopplungsmittel sind bekannt, die erfindungsgemäß Verwendung finden können. So sind zum Beispiel eine Reihe verschiedener Mittel bekannt, wie z. B. zum Koppeln von Aminosäuren. Beispielhafte Kopplungsreagenzien schließen BOP, HBTU, TBTU, TOPPipU, PyBOP und BOP-Cl ein (siehe z. B. G.A. Grant, Hrsg., „Synthetic Peptides: A User's Guide", W.H. Freeman, New York (1992), Kapitel 3, und M. Bodansky, „Principles of Peptide Synthesis", 2. Auflage, Springer-Verlag (1993).
Unter dem Begriff „intermolekulare Verknüpfung", wie hierin verwendet, versteht man mehr die Verknüpfung zwischen zwei chemischen Verbindungen als die intramolekulare Verknüpfung in einem Molekül. Folglich versteht man hierin unter der Verknüpfung von NOCC mit einem Wirkstoff oder der Verknüpfung einer NOCC-Kette mit einer zweiten NOCC-Kette eine intermolekulare Verknüpfung. Wenn NOCC mit einem Wirkstoff verknüpft ist, versteht man hierin unter dem NOCC-Wirkstoff ein „NOCC-Wirkstoffaddukt".
Die Verwendung eines „Brückenbildungsreagenzes", so wie dieser Begriff hierin verwendet wird, resultiert in der Bildung einer kovalenten Verknüpfung der beiden funktionellen Gruppen, welche Verknüpfung eine Verknüpfungs- oder Brückenbildungskomponente inkorporiert. Folglich kann die Aminogruppe einer Aminosäure mit einer Carboxylgruppe von NOCC (zur Bildung einer ersten Amidbindung) reagieren, und die verbleibende Carboxylgruppe der Aminosäure kann mit einer Aminogruppe von NOCC (unter Bildung einer zweiten Amidbindung) reagieren. Eine kovalente brückenbildende Verknüpfung kann folglich zwischen zwei funktionellen Gruppen von NOCC gebildet werden, wobei eine Aminosäurekomponente die beiden funktionellen NOCC-Gruppen überbrückt. Die beiden Reaktionen eines Brückenbildungsreagenzes brauchen nicht simultan abzulaufen; so kann zum Beispiel eine Aminosäure, die eine Blockierungsgruppe an der Carboxylfunktionalität trägt, mit NOCC (durch Reaktion einer Carboxylgruppe von NOCC mit der freien Aminogruppe der Aminosäure) verknüpft werden, und die Blockierungsgruppe kann dann entfernt werden, um eine Carboxylkomponente der Aminosäure zu offenbaren, die dann zur Reaktion mit einer Aminogruppe von NOCC fähig ist. Zwecks Beispielen für Brückenbildungsreagenzien siehe z. B. S.S. Wong, „Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991) und G.T. Hemianson, „Bioconjugate Techniques", Academic Press (1995).
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die beiden zu verknüpfenden reaktionsfähigen funktionellen Gruppen unterschiedlich sein können (z. B. eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe) oder gleich sein können (z. B. zwei Aminogruppen). Zur Verknüpfung von zwei unterschiedlichen funktionellen Gruppen können entweder Kopplungsreagenzien oder Vernetzungsreagenzien (Brückenbildungsreagenzien) eingesetzt werden, wohingegen ein Brückenbildungsreagenz im Allgemeinen bevorzugt ist, wenn die funktionellen Gruppen gleich sind.
Die Begriffe „Patient" oder „Individuum", wie hierin verwendet, verweisen auf ein Tier, bevorzugt auf einen Warmblütler, wie zum Beispiel einen Säuger, einschließlich Vieh, Schafe, Schweine, Pferde, Hunde, Katzen und Menschen.
Die Begriffe „therapeutischer Wirkstoff" oder „Wirkstoff", wie hierin verwendet, verweisen auf Verbindungen, die bei einem Patienten einen bekannten therapeutischen Nutzen aufweisen. Therapeutische Wirkstoffe schließen Arzneimittel, wie zum Beispiel Antibiotika, Entzündungshemmer, Antihypertensiva, Cholesterin-senkende Arzneimittel und Antineoplastika ein. Therapeutische Wirkstoffe schließen synthetische und natürlich vorkommende Verbindungen ein, bei denen es sich z. B. um Proteine, Peptide, Kohlenhydrate oder kleine Moleküle handeln kann. Wirkstoffe können – wie hierin beschrieben – activ sein, wenn sie frei in Lösung vorliegen und/oder wenn sie mit NOCC verknüpft sind. Wenn ein Wirkstoff nur im freien Zustand aktiv ist, ist er bevorzugt über eine spaltbare kovalente Bindung mit NOCC verknüpft.
Der Begriff „Wundbehandlung" ist im Stand der Technik bekannt und verweist, wie hierin verwendet, auf Behandlungen zur Verbesserung oder Förderung der Wundheilung, einschließlich Wundtoilette, Verhinderung oder Minimierung von Infektionen und Entzündungen, topischer Applikation von Wirkstoffen auf Wunden, Absorption von Exsudatflüssigkeit, Feuchthaltung von Wunden und Wundverbänden ein.
In einem erfindungsgemäßen Aspekt ist verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt, worin Verknüpfung durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt.
Die Bindung, die eine Carboxylgruppe und eine Aminogruppe verknüpft, kann eine Amidbindung, zum Beispiel eine Amidbindung sein, die eine O-Carboxymethylgruppe (z. B. eine 3- oder 6-Carboxymethylgruppe), oder eine N-Carboxymethylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette mit einer 2-Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette verknüpft. Das kovalent verknüpfte NOCC kann in der Form eines Hydrogels oder in einer dehydratisierten Form vorliegen, die das 50fache oder mehr ihres Flüssigkeitsgewichts absorbiert, die einen Wirkstoff, wie zum Beispiel einen therapeutischen Wirkstoff, einschließen kann. Eine intermolekulare Verknüpfung kann durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe einer zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftreten, und ein intermolekular verknüpftes NOCC kann ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens 500 000 Dalton aufweisen. Verknüpfung kann durch eine direkte Amidbindung zwischen einer Carboxylgruppe der ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe der zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftreten, oder die ersten und zweiten N,O-Carboxymethylchitosanketten können durch eine Brückenbildungskomponente verknüpft sein. In bestimmten Applikationen ist die Verknüpfung intramolekular.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Verfahren zur Herstellung von verknüpftem N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt. Das Verfahren schließt den Schritt des Reagierens von N,O-Carboxymethylchitosan in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes unter Bedingungen dergestalt ein, dass eine Aminogruppe von einer N,O-Carboxymethylchitosankette eine direkte Amidbindung mit einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette bildet, wodurch direkt verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan hergestellt wird. Das Kopplungsreagenz kann ein Reagenz, wie zum Beispiel ein Carbodiimid oder ein Kopplungsreagenz darstellen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus BOP, HBTU, TBTU, TOPPipU, PyBOP und BOP-Cl. Das Verfahren kann optional die Verwendung eines Katalysators einschließen, der die Bildung der Amidbindung, wie zum Beispiel N-Hydroxysuccinimid oder HOBt, fördert.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Verfahren zur direkten Verknüpfung eines Wirkstoffs mit N,O-Carboxymethylchitsosan, d. h. zur Bildung eines NOCC-Wirkstoffaddukts bereitgestellt. Das Verfahren schließt das Reagieren von N,O-Carboxymethylchitosan und dem Wirkstoff in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes unter Bedingungen dergestalt ein, dass eine direkte kovalente Bindung zwischen dem N,O-Carboxymethylchitosan und dem Wirkstoff gebildet wird, wobei der Wirkstoff direkt intermolekular mit N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung eines NOCC-Wirkstoffaddukts verknüpft wird. Wie mit den vorstehend beschriebenen NOCC-Verbindungen kann die kovalente Bindung eine Amidbindung sein; die kovalente Bindung ist bevorzugt, aber optional hydrolysierbar, d. h. sie kann bevorzugt unter physiologischen Bedingungen, durch entweder enzymatische oder nicht enzymatische Verfahren, hydrolysiert werden. Eine Carboxylgruppe des Wirkstoffes kann mit einer Aminogruppe von N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung der Amidbindung reagieren, bei der es sich um eine direkte Bindung zwischen einer Carboxylgruppe des Wirkstoffes und einer Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette handeln kann. Als Alternative kann eine Aminogruppe des Wirkstoffs mit einer Carboxylgruppe von N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung der Amidbindung, bei der es sich um eine direkte Bindung zwischen einer Aminogruppe des Wirkstoffs und einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosangruppe handeln kann, reagieren. Der Wirkstoff kann jedwedes Mittel darstellen, das mit NOCC, einschließlich Proteinen und Peptiden, reagieren kann. In einigen Ausführungsformen ist das mit dem Wirkstoff verknüpfte N,O-Carboxymethylchitosan selbst intra- oder intermolekular verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan. Der Wirkstoff kann ein therapeutischer Wirkstoff sein.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Verbindung bereitgestellt, umfassend ein mit einem Wirkstoff (d. h. einem NOCC-Wirkstoffaddukt) verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, worin das NOCC über eine Amidbindung mit dem Wirkstoff verknüpft ist. Die Zusammensetzung kann weiter einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen. Die N,O-Carboxymethylchitosan-Komponente kann mit dem Wirkstoff direkt oder über eine Brückenbildungskomponente verknüpft sein.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Verabreichung eines therapeutischen Wirkstoffs an einen Patienten bereitgestellt. Das Verfahren schließt die Applikation eines kovalenten Addukts aus N,O-Carboxymethylchitosan und einem therapeutischen Wirkstoff oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon in einem pharmazeutisch verträglichen Träger an den Patienten unter Bedingungen dergestalt ein, dass der therapeutische Wirkstoff an den Patienten verabreicht wird.
Es wird erfindungsgemäß weiter ein Verfahren zur Minimierung postoperativer Adhäsionen bereitgestellt. Das Verfahren schließt den Schritt der Applikation einer wirksamen Menge von kovalent verknüpftem N,O-Carboxymethylchitosan oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon an Gewebe unter Bedingungen dergestalt ein, dass postoperative Adhäsionen minimiert werden.
Es werden erfindungsgemäß auch Verfahren zur Wundbehandlung bereitgestellt. Das Verfahren schließt den Schritt der Applikation einer wirksamen Menge von kovalent verknüpftem N,O-Carboxymethylchitosan oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon an eine Wunde unter Bedingungen dergestalt ein, dass die Wundheilung gefördert wird.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt ist intermolekular brückenbildendes N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt, worin die Brückenbildung durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Carboxylgruppe einer zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette bereitgestellt ist.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird intermolekular brückenbildendes N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt, worin die Brückenbildung durch eine Amidbindung zwischen Aminogruppen an ersten und zweiten N,O-Carboxymethylchitosanketten auftritt, worin die Aminogruppen durch eine Überbrückungskomponente verknüpft sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft kovalent verknüpftes NOCC, NOCC, das kovalent mit einem Therapeutikum verknüpft ist, Verfahren zur Herstellung der neuen Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung eines Patienten durch Verabreichung der erfindungsgemäßen neuen NOCC-Zusammensetzungen.
1. Verbindungen
In einem erfindungsgemäßen Aspekt ist kovalent verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt, worin die Verknüpfung über eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe von einer N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe von einer N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt. Es werden erfindungsgemäß auch pharmazeutisch verträgliche Salze der kovalent verknüpften NOCC bereitgestellt. Die Zusammensetzungen können weiter einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen. Die kovalente Verknüpfung kann durch die Verwendung eines Kopplungsreagenzes oder Brückenbildungsreagenzes, wie hierin beschrieben, erreicht werden. Die Verknüpfung kann intramolekular (zwischen Amino- und Carboxylgruppen einer einzelnen NOCC-Kette) oder intermolekular (zwischen Amino- und Carboxylgruppen unterschiedlicher NOCC-Ketten) erfolgen.
Die bevorzugte Bindung ist eine Amidbindung. Folglich resultiert zum Beispiel die Verwendung eines Kopplungsreagenzes, wie zum Beispiel eines Carbodiimids, in direkter Verknüpfung einer Aminogruppe von NOCC mit einer Carboxylgruppe von NOCC zur Bildung einer direkten Amidbindung. Eine Brückenbildungskomponente kann jedoch auch eingesetzt werden. Eine Aminogruppe von NOCC kann zum Beispiel direkt (intermolekular) mit einer Carboxylkomponente einer Aminosäure verknüpft werden; die Aminogruppe der Aminosäure kann dann direkt mit einer Carboxylgruppe von NOCC (bei der es sich um die gleiche NOCC-Kette oder eine unterschiedliche NOCC-Kette handeln kann) verknüpft werden, um eine Aminogruppe von NOCC verknüpft mit einer Carboxylgruppe von NOCC über eine Amidbindung (oder mehr als eine Amidbindung) bereitzustellen, die eine Brückenbildungskomponente (in diesem Beispiel eine Aminosäurehauptkette) einschließt. Die Amidbindung verknüpft bevorzugt eine 3- oder 6-Carboxymethylgruppe oder eine N-Carboxymethylgruppe von einer N,O-Carboxymethylchitosankette mit einer 2-Aminogruppe von einer N,O-Carboxymethylchitosankette.
Das kovalent verknüpfte NOCC kann vorteilhafterweise in der Form eines Gels, einschließlich eines Hydrogels vorliegen. Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, produziert die Verknüpfung von NOCC mit einem Kopplungsreagenz ohne weiteres Gele. Derartige Gele können leicht gehandhabt und appliziert werden auf, z. B. Wunden oder Operationsfelder, zu therapeutischen Zwecken, wie zum Beispiel zur Wundbehandlung oder Inhibition chirurgischer Adhäsionen. Gemäß einer erfindungsgemäßen praktischen Ausführung ist in das Gel ein Wirkstoff, z. B. ein therapeutischer Wirkstoff, wie zum Beispiel ein Arzneimittel, eingeschlossen. In dieser Ausführungsform dient das kovalent verknüpfte NOCC als ein Träger für den therapeutischen Wirkstoff, um eine hinhaltende Wirkstofffreigabe oder Aktivität des Mittels bereitzustellen. Der therapeutische Wirkstoff ist physikalisch in die Gelmatrix eingeschlossen und kann durch Diffusion durch die Gelporen entweichen oder kann durch physikalischen oder chemischen Abbau der Gelstruktur freigegeben werden.
Intermolekulare Verknüpfung kann über eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe einer zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftreten. Das resultierende intermolekular verknüpfte NOCC-Derivat weist im Allgemeinen ein Molekulargewicht auf, das größer als das durchschnittliche Molekulargewicht der in der Verknüpfungsreaktion verwendeten individuellen NOCC-Ketten ist. Das intermolekular verknüpfte NOCC kann zum Beispiel ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens 500 000 Dalton aufweisen. Die Verknüpfung kann über eine direkte Amidbindung zwischen einer Carboxylgruppe der ersten NOCC-Kette und einer Aminogruppe der NOCC-Kette auftreten. In bestimmten Fällen können die ersten und zweiten NOCC-Ketten durch eine Brückenbildungskomponente verknüpft werden.
Die Verknüpfung kann auch (d. h. zwischen funktionellen Gruppen einer einzelnen NOCC-Kette) intramolekular sein. Das durchschnittliche Molekulargewicht eines derartig intramolekular verknüpften NOCC ist nicht signifikant unterschiedlich vom durchschnittlichen Molekulargewicht des nicht verknüpften NOCC, obwohl das scheinbare Molekulargewicht, wie anhand von Verfahren, wie zum Beispiel Gelfiltration gemessen, aufgrund von Änderungen der Molekülgröße oder -gestalt, welche das Verknüpfungsverfahren begleiten, unterschiedlich erscheinen können. Es wird erkannt werden, dass eine gegebene NOCC-Kette sowohl intramolekular als auch intermolekular verknüpft sein können. Intramolekular verknüpftes NOCC kann auch mit einem Wirkstoff zur Bildung eines NOCC-Wirkstoffaddukts verknüpft werden.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Verbindung bereitgestellt, umfassend N,O-Carboxymethylchitosan, das kovalent mit einem Wirkstoff (zur Bildung eines NOCC-Wirkstoffaddukts) oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon verknüpft ist. Das N,O-Carboxymethylchitosan kann optional mit dem Wirkstoff über eine Amidbindung verknüpft sein. Die N,O-Carboxymethylchitosangruppe kann kovalent mit dem Wirkstoff über eine Brückenbildungskomponente verknüpft sein, oder das NOCC kann direkt mit dem Wirkstoff ohne eine Brückenbildungskomponente verknüpft sein. Intermolekular verknüpfte Verbindungen, mit oder ohne einer Brückenbildungskomponente können durch intermolekulare Verknüpfung des Wirkstoffs mit NOCC, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, hergestellt werden.
Der Wirkstoff kann mit NOCC dergestalt verknüpft werden, dass er aus dem NOCC in therapeutisch wirksamer Form freigegeben werden kann. Folglich kann zum Beispiel ein therapeutischer Wirkstoff über eine Bindung mit NOCC verknüpft werden, die in vivo, entweder enzymatisch oder nicht enzymatisch, hydrolysiert werden kann. Bestimmte Amidbindungen können zum Beispiel durch Enzyme, wie zum Beispiel Proteasen, hydrolysiert werden. (Als Beispiele anderer Bindungen, die in vivo gespalten werden können, siehe z. B. R.B. Silverman, „The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", (1992), Kapitel 8, Academic Press). Es ist erfindungsgemäß folglich ein NOCC-Wirkstoffaddukt bereitgestellt, das den Wirkstoff durch chemische Spaltung der kovalenten Bindung zwischen NOCC und dem Wirkstoff freigeben kann. Zur Verabreichung an einen Patienten kann die Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird intermolekular brückenbildendes N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt, worin die Brückenbildung über eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Carboxylgruppe einer zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird intermolekular brückenbildendes N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt, worin die Verknüpfung über eine Amidbindung zwischen Aminogruppen an ersten und zweiten N,O-Carboxymethylchitosanketten, worin die Aminogruppen über eine Brückenbildungskomponente verknüpft sind, auftritt. Folglich kann zum Beispiel eine Dicarbonsäure, wie zum Beispiel Bernsteinsäure, als ein bifunktionelles Brückenbildungsreagenz zwischen zwei NOCC-Aminogruppen dergestalt eingesetzt werden, dass das resultierende brückenbildende NOCC über mindestens eine (oder in diesem Beispiel zwei) Amidbindungen verknüpft ist. Eine derartige Brückenbildung kann durch Reaktion von NOCC mit z. B. Bernsteinsäureanhydrid zur Bereitstellung von succinyliertem NOCC erreicht werden; die Bernsteinsäure-Carboxylatkomponenten können dann direkt mit Aminogruppen einer zweiten NOCC-Kette (bevorzugt in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes) zur Bereitstellung von brückenbildendem NOCC, wobei die Brückenbildung über eine Amidbindung zwischen Aminogruppen an den ersten und zweiten NOCC-Ketten auftritt, verknüpft werden.
II. Verfahren
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Verfahren zur Herstellung von kovalent verknüpftem N,O-Carboxymethylchitosan bereitgestellt. Das Verfahren schließt den Schritt des Reagierens von N,O-Carboxymethylchitosan in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes unter Bedingungen dergestalt ein, dass eine Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette bildet, wodurch kovalent verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan hergestellt wird.
Die Verwendung von Kopplungsreagenzien zur Förderung der Reaktion einer Aminogruppe mit einer Carboxylgruppe zur Bildung einer Amidbindung ist weithin bekannt, und eine Reihe verschiedener Kopplungsreagenzien und Verfahren stehen für diesen Zweck zur Verfügung (siehe z. B. G.A. Grant, Hrsg., „Synthetic Peptides: A User's Guide", vorstehend, und M. Bodansky, „Principles of Peptide Synthesis", vorstehend). Das Kopplungsmittel kann ein Carbodiimid, wie zum Beispiel DCC oder EDC darstellen, oder das Kopplungsreagenz kann aus anderen Reagenzien, wie zum Beispiel BOP, HBTU, TBTU, TOPPipU, PyBOP und BOP-Cl ausgewählt werden. Das Verfahren kann optional die Verwendung eines Katalysators einschließen, der die Bildung der Amidbindung fördert. Beispielhafte Katalysatoren schließen N-Hydroxysuccinimid und HOBt ein. Verknüpfungsreaktionen können in einer Reihe verschiedener Lösungsmittel durchgeführt werden, obwohl die begrenzte Löslichkeit von NOCC in vielen organischen Lösungsmitteln im Allgemeinen fordert, dass das Lösungsmittel Wasser oder ein wässriges Gemisch sein soll. Es wird erkannt werden, dass in Lösungen von NOCC sowohl intramolekulare als auch intermolekulare Verknüpfung auftreten kann. Die Menge von gebildetem intramolekularem Produkt im Vergleich zu der Menge von intermolekular verknüpftem Produkt kann durch Faktoren verändert werden, wie zum Beispiel Verdünnung (verdünnte Lösungen begünstigen im allgemeinen die intramolekulare Reaktion) oder die Gegenwart von anderen Mitteln, die mit NOCC reagieren können.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur intermolekularen Verknüpfung eines Wirkstoffs mit N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung eines NOCC-Wirkstoffaddukts bereitgestellt. Das Verfahren schließt das Reagieren von N,O-Carboxymethylchitosan und dem Wirkstoff in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes unter Bedingungen dergestalt ein, dass eine direkte Bindung zwischen dem N,O-Carboxymethylchitosan und dem Wirkstoff gebildet wird, wobei der Wirkstoff mit dem N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung eines NOCC-Wirkstoffaddukts (intermolekular) direkt verknüpft wird. Die direkte Bindung kann eine Amidbindung darstellen, oder sie kann in einigen Fällen eine Bindung, wie zum Beispiel einen Ester oder Thioester darstellen. Wenn ein therapeutischer Wirkstoff mit NOCC verknüpft wird, kann es vorteilhaft sein, wenn die direkte Bindung zur Hydrolyse (oder anderen Spaltung, wie zum Beispiel Oxidation oder Reduktion) unter in vivo gefundenen Bedingungen fähig ist. Folglich kann das Mittel nach Verabreichung an einen Patienten, zum Beispiel durch ein Enzym, wobei der therapeutische Wirkstoff freigegeben wird, aus NOCC gespalten werden.
Eine Carboxylgruppe des Wirkstoffs kann mit einer Aminogruppe von N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung einer Amidbindung, bei der es sich um eine direkte Bindung zwischen einer Carboxylgruppe des Wirkstoffs und einer Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette handelt, reagieren. Als Alternative kann eine Aminogruppe des Wirkstoffs mit einer Carboxylgruppe von N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung einer Amidbindung, bei der es sich um eine direkte Bindung zwischen einer Aminogruppe des Wirkstoffs und einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette handeln kann, reagieren. Der Wirkstoff ist bevorzugt ein therapeutischer Wirkstoff. Jedweder Wirkstoff, der eine funktionelle Gruppe einschließt, die zur Reaktion mit NOCC oder mit einer Brückenbildungsgruppe, die mit NOCC verknüpft ist, fähig ist, kann eingesetzt werden. Der Wirkstoff kann zum Beispiel ein Protein oder Peptid sein, das in einer Reihe verschiedener Weisen, einschließlich direkter Verknüpfung (z. B. durch die terminale Amin- oder terminale Carboxylgruppe eines Proteins oder durch eine reaktionsfähige Gruppe einer Seitenkette, wie zum Beispiel ein Amin, eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Thiolgruppe eines Proteins) mit NOCC verknüpft sein kann. Das N,O-Carboxymethylchitosan kann inter- oder intramolekular verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan darstellen.
Verknüpfung eines Wirkstoffs mit NOCC in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes kann auch in intramolekularer oder intermolekularer direkter Verknüpfung von NOCC, wie vorstehend beschrieben wird, resultieren. Die Bildung des NOCC-Wirkstoffaddukts kann begünstigt werden durch zum Beispiel Verwendung von Schutzgruppen, um reaktionsfähige Gruppen von NOCC vorübergehend zu blockieren. Die Aminogruppen von NOCC können zum Beispiel vorübergehend mit einer Aminschutzgruppe blockiert werden, wobei die Carboxylgruppen von NOCC ungeschützt bleiben. Das geschützte NOCC kann dann direkt mit einem Amin enthaltenden Wirkstoff in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes, ohne exzessive intra- oder intermolekulare Verknüpfung von NOCC, verknüpft werden. Wenn die Bildung des geschützten NOCC-Wirkstoffaddukts abgeschlossen ist, können die Amin-Schutzgruppen an der NOCC-Kette zur Bereitstellung des NOCC-Wirkstoffaddukts entfernt werden. Die Carboxylgruppen von NOCC können auf ähnliche Weise blockiert werden, wenn eine direkte Verknüpfung mit einem Carboxyl-enthaltenden Wirkstoff erwünscht ist. (Allgemeine Verweise auf Schutzgruppen siehe z. B. T.W. Greene und P.G.M. Wuts, „Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Auflage, John Wiley & Sons (1991).
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Verfahren zur Verabreichung eines therapeutischen Wirkstoffs an einen Patienten bereitgestellt. Das Verfahren schließt die Applikation eines NOCC-Wirkstoffaddukts oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, optional in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, an den Patienten unter Bedingungen dergestalt ein, dass der therapeutische Wirkstoff an den Patienten verabreicht wird. Der therapeutische Wirkstoff kann durch Spaltung der kovalenten Bindung an NOCC, wie vorstehend beschrieben wird, freigegeben werden. Die kovalent verknüpften Verbindungen von NOCC mit einem therapeutischen Wirkstoff können wie hierin beschrieben hergestellt werden. Wenn das NOCC-Wirkstoffaddukt in der Form eines Gels vorliegt, kann das Gel direkt verabreicht werden. Das Addukt kann auch in einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Verabreichung über andere Routen, die im Stand der Technik üblich sind, aufgelöst oder suspendiert werden.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zum Minimieren postoperativer Adhäsionen bereitgestellt. Das Verfahren schließt den Schritt des Applizierens einer wirksamen Menge von kovalent verknüpftem N,O-Carobxymethylchitosan oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon an Gewebe unter Bedingungen dergestalt bereit, dass postoperative Adhäsionen minimiert werden. Beispiele der Verabreichung von NOCC-Gelen zur Verhinderung postoperativer Adhäsionen werden ausführlicher in der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung, Eingangsnummer 08/436,770, beschrieben.
Es werden erfindungsgemäß auch Verfahren zur Wundbehandlung, z. B. zur Wundtoilette, Verhinderung oder Minimierung von Infektionen und Entzündungen, topischen Applikation von Wirkstoffen auf Wunden, Absorption von Exsudatflüssigkeit, Feuchthaltung von Wunden oder für Wundverbände bereitgestellt. Das Verfahren schließt den Schritt des Applizierens einer wirksamen Menge von kovalent verknüpftem N,O-Carboxymethylchitosan oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon auf eine Wunde unter Bedingungen dergestalt ein, dass die Wunde behandelt wird, d. h. dergestalt, dass die Wundheilung gefördert wird. Es wird erkannt werden, dass das kovalent verknüpfte NOCC in der Form eines Gels (z. B. eines Hydrogels) oder in der Form eines Feststoffes, z. B. eines getrockneten Feststoffes, vorliegen kann, vorausgesetzt, dass die NOCC-Zusammensetzung zum Absorbieren erheblicher Mengen von Exsudatflüssigkeit aus der Wunde fähig ist. Eine erfindungsgemäß verknüpfte NOCC-Zusammensetzung kann, wenn in trockener Form appliziert, vorteilhafterweise mindestens das 50fache ihres Trockengewichts an Flüssigkeit absorbieren und kann in bestimmten Ausführungsformen bis zum 500fachen ihres Gewichts an Flüssigkeit absorbieren. Es wird auch erkannt werden, dass die Wundbehandlung gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren Kombinationen aus zwei oder mehr der hierin beschriebenen Wundbehandlungsmodalitäten einschließen kann, z. B. kann kovalent verknüpftes NOCC, das mit einem Wirkstoff verknüpft wurde, auf eine Wunde appliziert werden, um sowohl das Exsudat zu absorbieren als auch eine Formulierung mit hinhaltender Wirkstofffreigabe bereitzustellen, um die Wundheilung zu fördern, wobei die Wundheilung durch eine Kombination von Mechanismen gefördert wird.
Erläuterung
Beispiel 1: Carbodiimid-vermittelte Verknüpfung von NOCC
Trockenes NOCC (2,0 g) wurde einer Lösung aus deionisiertem Wasser (200 ml) und einer kleinen Menge von Natriumchlorid (0,5 g) zugefügt und ca. 30 min gerührt. Es wurde geringgradig Wärme angewendet, um sicherzustellen, dass das Polymer vorschriftsmäßig aufgelöst war. Der pH der Lösung wurde so eingestellt, dass er zwischen sieben und acht lag. Wenn der gemessene pH über acht lag, wurde der Lösung zum Senken des pH auf zwischen sieben und acht verdünnte Salzsäure zugefügt. Die Zugabe von Säure führte manchmal zur teilweisen Präzipitation von NOCC, in welchem Fall das Gemisch gerührt wurde, bis das NOCC wieder vollkommen aufgelöst war (im Allgemeinen mindestens 3 h). Das Carbodiimid-EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid) wurde in 5 – 7 ml Wasser aufgelöst, und der pH der EDC-Lösung wurde eingestellt, damit die Messung zwischen sieben und acht lag. Die EDC-Lösung wurde dann der NOCC-Lösung unter kräftigem Rühren tropfenweise zugefügt. N-Hydroxysuccinimid (NHS) wurde in Wasser (3 – 5 ml) aufgelöst, der pH wurde auf zwischen sieben und acht wie oben eingestellt, und die NHS-Lösung wurde dem NOCC/EDC-Gemisch, bevorzugt innerhalb von 2 – 3 min der EDC-Zugabe zugefügt. Die Lösung wurde weitere 15 min oder bis die Lösung gelierte gerührt, wobei das schnelle Rotieren des Rührstabs verhindert wurde. Wenn sich das Gel schnell absetzt und das Rühren beeinträchtigt wurde, wurde die gelatinöse Substanz zur Gewährleistung von ordnungsgemäßem Mischen mit einem Spatel gerührt. Der Rührstab wurde mit einer Bergungsvorrichtung entfernt, und der Becher wurde mit Parafilm abgedeckt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur stehen lassen und wies eine durchschnittliche Härtungszeit von achtzehn Stunden auf. Das Verfahren blieb für alle Aufbereitungen gleich, wobei nur die Molverhältnisse von EDC und NHS variiert wurden. Über alle Experimente hinweg wurde die Lösung schnell gerührt, und jedwede Zugaben wurden langsam vorgenommen, um die Bildung jeglicher Bereiche mit einer hohen Konzentration von Reagenzien zu verhindern. Das Molverhältnis von bei den Verknüpfungsreaktionen verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 1 ersichtlich.
Tabelle 1
Es wurde festgestellt, dass die Reihenfolge des Zufügens der verschiedenen Reaktionskomponenten (z. B. das Zufügen von EDC zu NOCC, dann Zufügen von NHS zu NOCC oder vice versa) nur einen geringen Effekt auf die Ausbeute oder die Reinheit des Produktes aufwies. Wenn das Molverhältnis von EDC zu NOCC relativ hoch lag, lief die Reaktion schnell ab, und das Reaktionsgemisch wurde in einigen Fällen so viskos, dass das ordnungsgemäße Mischen von zusätzlichen Reagenzien (wie zum Beispiel NHS) schwierig war.
Wenn NOCC-Lösungen mit EDC und NHS zur Reaktion gebracht wurden, nahm die Viskosität innerhalb von fünfzehn Minuten merklich zu, und die Lösung blieb klar. Nach 30 min bis 3 Stunden, in Abhängigkeit von der zugefügten EDC-Menge (das Gel setzte sich mit erhöhtem EDC schneller ab), war die Lösung nicht mehr gießbar, und es wurde ein transparentes, klares Gel (ein Hydrogel) gebildet. Die Reaktion führte zu einem gelatinösen, formfüllenden Hydrogel, das – wenn es aus einem Reaktionsgefäß entfernt wurde – seine Form beibehielt und eine feste Hydrogel-ähnliche Substanz ergab. Wenn sich das Hydrogel gesetzt hatte, blieb keine übermäßige Wassermenge zurück, und das Hydrogel gab nach mehrtägigem Stehenlassen im Allgemeinen kein Wasser ab.
Während die Reaktion zum direkten Verknüpfen in Abwesenheit von NHS ablief, trat bei Abwesenheit von Carbodiimid keine signifikante Reaktion auf. NHS ist jedoch ein Katalysator für Carbodiimid-vermittelte Reaktionen, und es wurde festgestellt, dass es die Rate der Verknüpfungsreaktion signifikant erhöhte. Bei bestimmten niedrigen Molverhältnissen von EDC : NOCC und keinem NHS würden die hergestellten Gele zum Beispiel zum Festwerden bis zu 12 Stunden benötigen; diese Zeit wurde häufig auf 5 – 6 Stunden reduziert, wenn NHS im Reaktionsgemisch vorlag. Mit hohen Molverhältnissen von EDC : NOCC und keinem NHS hergestellte Gele können sich in nur 35 min absetzten, was bei Vorliegen von NHS auf 10 – 15 Minuten reduziert wurde. Die durchschnittlichen Ausbeuten (~ 80 %) waren mit oder ohne NHS gleich. Folglich veränderte NHS die Reaktionsrate, erhöhte aber nicht die Ausbeute.
Ohne durch Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die Carbodiimid-vermittelte Verknüpfungsreaktion von NOCC durch einen Mechanismus auftritt, der dem allgemein akzeptierten Mechanismus für die Carbodiimid-vermittelte Verknüpfung ähnlich ist. Es wird angenommen, dass das Zufügen von NHS die schnelle Reaktion durch Umwandlung des O-Acylharnstoff-Intermediärproduktes (das durch Reaktion einer Carboxylatgruppe von NOCC mit dem Carbodiimid gebildet wurde) in einen aktivierten NHS-Ester förderte, der dann mit einer Aminogruppe von NOCC zur Bildung des intermolekular verknüpften Produktes reagierte.
Nachdem die Reaktion für die gewünschte Zeit abgelaufen war, wurde das Produkt isoliert. Im Allgemeinen lag das Produkt in der Form eines extrem hydrophilen, nicht löslichen, klaren Hydrogels vor. Das Hydrogel, bestehend aus 2,0 g NOCC in 200 ml Wasser wurde gereinigt und zu einem Feststoff zur Analyse reduziert. Initial wurde das Hydrogel in vier gleiche Portionen aufgeteilt, die individuell in einem Mischgerät mit ca. 200 ml einer Mischung aus Aceton und Isoproponal von 50 : 50 bei niedriger Geschwindigkeit gemischt wurden. Es wurde ein weißes flockiges Präzipitat gebildet, das dann filtriert und gefriergetrocknet wurde. Das Isolierungsverfahren konnte modifiziert werden, um einen Schritt einzuschließen, mit dem jedwede Salze (NaCl), Nebenprodukte (Harnstoff) oder zurückgebliebene Reagenzien (EDC, NHS) entfernt würden. Zur Entfernung dieser Verunreinigungen wurde das Hydrogel in einem großen Becher mit deionisiertem Wasser (300 – 500 ml) quellen lassen und wurde dann in Dialyseschläuche gegeben. Die vollen Dialyseschläuche wurden fünf bis sieben Tage in deionisiertes Wasser eingetaucht, wobei das Wasser zweimal täglich gewechselt wurde. Sobald das gequollene Hydrogel aus dem Schlauch entfernt wurde, wurde es durch Eintauchen in einem Gemisch (50 : 50) aus Aceton und Isopropanol (2,01) dehydratisiert. Es bildete sich ein weißes schwammiges Präzipitat, das dann gefriergetrocknet wurde. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung des Mischgerätes für dieses Verfahren unnötig war; durch 24-stündiges Eintauchen des Hydrogels in das Gemisch (50 : 50) aus Aceton : Isopropanol, dann Filtrieren des Hydrogels durch einen Büchner-Trichter und sein Zurückgeben in ein frisches Gemisch aus Aceton : Isopropanol für weitere 2 – 3 Tage wurde ein Präzipitat erhalten. Das weiße schwammige Produkt wurde dann gefriergetrocknet. Das Endprodukt war ein weißer Feststoff, der unter Verwendung eines Mörsers zerdrückt wurde und dann zur weiteren Analyse durch ein feines Sieb (300 μm) gegeben wurde.
Das gereinigte feste Produkt wurde analysiert, und die Ergebnisse waren mit dem intra- und/oder intermolekular verknüpften NOCC konsistent.
Beispiel 2: Quellung von direkt verknüpften NOCC-Gelen
Zwei verschiedene Typen von Quellungsexperimenten wurden an den direkt verknüpften Gelprodukten von Beispiel 1 zur Bestimmung der Fähigkeit der Hydrogele, Wasser zu absorbieren, durchgeführt. Das erste Quellungsexperiment beinhaltete die Bestimmung der Wassermenge, die von der Hydrogelform (d. h. vor der Isolierung und Reinigung) absorbiert wurde. Die Hydrogel-Produkte der Verknüpfungsreaktionen wurden in einem Überschuss deionisierten Wassers über Nacht quellen lassen, wobei das zugefügte Wasservolumen notiert wurde. Der Wasserüberstand wurde dann abfiltriert und gemessen, wobei die vom Hydrogel absorbierte Wassermenge bestimmt wurde.
In einem zweiten Experiment wurden 0,4 g isoliertes und gereinigtes festes Produkt (0,40 g) in deionisiertem Wasser (500 ml) quellen lassen. Das gequollene Produkt wurde abfiltriert, und die absorbierte Wassermenge wurde bestimmt. Es wurden Produkte mit variierenden Molverhältnissen von NOCC, EDC und NHS verwendet.
Wenn das Verhältnis von EDC zu NOCC erhöht wurde, nahm die vom Hydrogel absorbierte Wassermenge ab, was darauf hindeutete, dass das Hydrogel aufgrund der ausgiebigen intermolekularen Verknüpfung weniger polar war, oder dass die Porengröße des Hydrogels kleiner war, wobei das Hydrogel weniger permeabel gemacht wurde und weniger dazu fähig war, zur Retention von Wasser zu expandieren. In der Tat, setzte das Hydrogel bei dem höchsten eingesetzten Verhältnis von EDC zu NOCC tatsächlich eine kleine Wassermenge frei. Es wurde auch festgestellt, dass die isolierten, getrockneten Verknüpfungsprodukte weniger Wasser absorbieren, wenn höhere Verhältnisse von EDC zu NOCC eingesetzt wurden. Es wurde festgestellt, dass das isolierte, getrocknete Produkt das 50fache seines Gewichts an Wasser absorbieren konnte, wenn zum Verknüpfen ein Verhältnis von NOCC : EDC : NHS von 1 : 1 : 0,04 verwendet wurde, aber das getrocknete Produkt konnte mehr als das 500fache seines Gewichtes an Wasser absorbieren, wenn zum Verknüpfen ein Verhältnis von NOCC : EDC : NHS von 10 : 1 : 0,04 verwendet wurde.
Es wurde auch bemerkt, dass die Exposition gegenüber hohen Temperaturen (z. B. durch Erhitzen in einem Autoklaven) in etwas Verlust der Starrheit des Hydrogels resultierte.
Beispiel 3: Direkte Verknüpfung von Mitteln mit NOCC
Für das Zufügen von Mitteln zu NOCC wurde eine modifizierte Version des Verfahrens von Beispiel 1 verwendet. Trockenes NOCC (2,0 g) wurde in 200 ml deionisiertem Wasser aufgelöst, NaCl (0,5 g) wurde zugefügt, und die Lösung wurde gut gerührt. Der pH wurde auf zwischen sieben und acht eingestellt. Wenn der pH über acht lag, wurde etwas verdünnte Salzsäure zugefügt und zum Wiederauflösen von jeglichem NOCC, das aus der Lösung ausgefallen sein könnte, gut gerührt. Dieser Lösung wurde das Mittel zugefügt (in diesem Beispiel wurden Butylamin und Cystein eingesetzt), gut gerührt und die gewünschten EDC- und NHS-Mengen wurden dem Reaktionsgemisch zugefügt. Für die Reaktion mit der Aminosäure Cystein wurden EDC und Cystein in 50 ml PBS-Puffer zusammengemischt, und das NOCC wurde in 150 ml Puffer aufgelöst. Die beiden Lösungen wurden dann gemischt, und das NHS-Reagenz wurde zugefügt. Die Reaktionen wurden bei einem pH durchgeführt, bei dem die Aminogruppen von Butylamin und Cystein größtenteils protoniert sind.
Das mit NOCC zu verknüpfende Mittel wurde zur Minimierung der intramolekularen direkten Verknüpfung mit dem NOCC in molarem Überschuss bereitgestellt. In der Tat produzierte die Reaktion mit Butylamin oder Cystein unter den eingesetzten Bedingungen kein den Hydrogelen von Beispiel 1 ähnliches Hydrogel. Die Reaktionsgemische blieben vielmehr als viskose Lösungen zurück, was darauf hindeutete, dass eine intra- oder intermolekulare Verknüpfung von NOCC nicht in dem Ausmaß aufgetreten war, wie sie in den Reaktionen von Beispiel 1 gesehen wurde.
Es wurde gefunden, dass die Verwendung hoher Molverhältnisse von NOCC:EDC in den Reaktionen die am leichtesten charakterisierten Produkte bereitstellte. Die Elementaranalyse des Reaktionsproduktes aus Butylamin:NOCC war mit der Bildung eines mit NOCC:Butylamin verknüpften Produktes konsistent. Die Elementaranalyse des mit NOCC:Cystein verknüpften Produktes wies auf die Gegenwart von Schwefel im verknüpften Produkt hin. Folglich trat die erwartete Verknüpfungsreaktion zwischen Cystein und NOCC selbst in Gegenwart von Phosphat im Puffer auf.
Der Durchschnittsfachmann wird unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimentierung zahlreiche Äquivalente für die hierin beschriebenen Verfahren erkennen oder dazu in der Lage sein, sie zu ermitteln. Es wird berücksichtigt, dass solche Äquivalente in den erfindungsgemäßen Rahmen fallen und durch die folgenden Ansprüche abdeckt sind.

Claims

Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan, worin die Verknüpfung durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer N,O-Carboxylmethylchitosankette und einer Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 1, worin die Bindung eine Amidbindung darstellt, worin die Amidbindung bevorzugt eine 3-, 6- oder N-Carboxylmethylgruppe einer N,O-Carboxylmethylchitosankette mit einer 2-Aminogruppe einer N,O-Carboxymethylchitosankette direkt verknüpft.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 1, worin das N,O-Carboxymethylchitosan intermolekular verknüpft ist, wobei genannte intermolekulare Verknüpfung durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Aminogruppe einer zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt.
Intermolekular verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 3, worin das intermolekular kovalent verknüpfte NOCC ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens 500 000 Dalton aufweist.
Intermolekular verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 3 oder 4, worin die Verknüpfung durch eine direkte Amidbindung zwischen einer Carboxylgruppe der ersten N,O-Carboxylmethylchitosankette und einer Aminogruppe der zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt.
Intermolekular verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 3, worin die ersten und zweiten N,O-Carboxymethylchitosanketten durch einen brückenbildenden Teil verknüpft sind.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 1, worin die Verknüpfung intramolekular ist.
Intermolekular überbrücktes N,O-Carboxymethylchitosan, worin Brückenbildung durch eine Bindung zwischen einer Carboxylgruppe einer ersten N,O-Carboxymethylchitosankette und einer Carboxylgruppe einer zweiten N,O-Carboxymethylchitosankette auftritt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Intermolekular überbrücktes N,O-Carboxymethylchitosan, worin die Überbrückung durch eine Amidbindung zwischen Aminogruppen an ersten und zweiten N,O-Carboxymethylchitosanketten auftritt, worin genannte Aminogruppen durch einen brückenbildenden Teil verknüpft sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das kovalent verknüpfte NOCC in der Form eines Hydrogels vorliegt.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach Anspruch 10, worin das Hydrogel einen therapeutischen Wirkstoff einschließt.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 9, weiter umfassend einen therapeutischen Wirkstoff, der mit dem N,O-Carboxymethylchitosan verknüpft ist.
Verfahren zur Herstellung von verknüpftem N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend zur Reaktion bringen von N,O-Carboxymethylchitosan bei Anwesenheit eines Kopplungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Kopplungsreagenz ein Carbodiimid darstellt, das bevorzugt aus BOP, HBTU, TBTU, TOPPipU, PyBOP und BOP-Cl ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, weiter umfassend einen Katalysator, der die Bildung der Amidbindung fördert, worin der Katalysator bevorzugt N-Hydroxysuccinimid oder HOBt darstellt.
Verfahren zur intermolekularen Verknüpfung eines therapeutischen Wirkstoffs an verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Bildung eines Addukts aus NOCC und therapeutischem Wirkstoff, umfassend zur Reaktion bringen des verknüpften N,O-Carboxymethylchitosans und des therapeutischen Wirkstoffs in Gegenwart eines Kopplungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 16, worin eine Carboxylgruppe des therapeutischen Wirkstoffs mit einer Aminogruppe von N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung einer direkten Amidbindung reagiert; oder eine Aminogruppe des therapeutischen Wirkstoffs mit einer Carboxylgruppe von N,O-Carboxymethylchitosan zur Bildung einer direkten Amidbindung reagiert.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, worin der therapeutische Wirkstoff aus Proteinen und Peptiden ausgewählt ist.
Zusammensetzung, umfassend verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das kovalent mit einem therapeutischen Wirkstoff verknüpft ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon; worin das N,O-Carboxymethylchitosan mit dem therapeutischen Wirkstoff durch eine Amidbindung verknüpft ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin die N,O-Carboxymethylchitosangruppe kovalent mit dem therapeutischen Wirkstoff durch einen brückenbildenden Teil verknüpft ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin die N,O-Carboxymethylchitosangruppe mit dem therapeutischen Wirkstoff direkt verknüpft ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, weiter umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, zur Verwendung bei der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Verbindung an einen bedürftigen Patienten.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Verwendung bei der Wundbehandlung, worin die Wundbehandlung bevorzugt mindestens eines des Folgenden: Wundtoilette, Infektionsminimierung, Applikation eines therapeutischen Wirkstoffs auf die Wunde, Absorption von Exsudatflüssigkeit und Feuchthaltung der Wunde einschließt.
Verknüpftes N,O-Carboxymethylchitosan nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Verwendung bei der Minimierung postoperativer Adhäsionen.