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Das
Gebiet der Erfindung sind medizinische oder chirurgische, biokompatible,
bioresorbierbare Biomaterialien, die bei der Verhinderung von post-operativen
Verklebungen von Nutzen sind, insbesondere nach intraperitonealen
und pelvischen chirurgischen Eingriffen.
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Die
Erfindung betrifft ein Mittel, genauer gesagt, jedoch nicht umfassend,
einen Film, ein Gel oder eine Flüssigkeit
(zum Beispiel durch Zerstäubung
anwendbar) zur Verhinderung dieser post-chirurgischen Verklebungen,
das aus einem besonderen Kollagen-Peptid besteht, das chemisch modifiziert,
in situ vernetzt oder im vernetzten Zustand verwendet wird.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Gewinnung von, unter
anderem, dem zuvor erwähnten
Mittel.
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Eines
der Hauptprobleme in der Chirurgie, insbesondere bei der chirurgischen
Behandlung des Verdauungstrakts, des Unterleibs und im Bereich der
Frauenheilkunde, ist mit der Entstehung post-chirurgischer Verklebungen
verbunden (anormale Aneinanderfügung
von zwei Gewebeflächen
oder -abschnitten, die normalerweise getrennt sind), bedingt durch
eine Entzündung
und/oder Narbenbildung, die automatisch nach einer Gewebeverletzung
entsteht, die durch den Eingriff verursacht wird. Solche verlagerten
Verklebungen können
unangenehme Auswirkungen haben. So können diese Verklebungen bei
der chirurgischen Behandlung des Unterleibs Verstopfungen bewirken.
Bei der chirurgischen Behandlung im Bereich der Frauenheilkunde sind
die postoperativen Verklebungen im Beckenbereich einer der anerkannten
Gründe
für die
mangelnde Wirksamkeit der chirurgischen Behandlung der Unfruchtbarkeit.
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Es
wurden chemische und/oder therapeutische Maßnahmen vorgeschlagen, um zu
versuchen, dieses Problem zu beheben. Der chemische Ansatz besteht
darin, chemische Behandlungsmittel auf die chirurgischen Wunden
aufzubringen, die dazu geeignet sind, die physiologischen Erscheinungen
Entzündung
und Narbenbildung einzuschränken,
die die Ursache für
die Verklebungen sind. Diese Behandlungsmittel sind Enzyme wie Fibrinolysin
und Papase oder auch Produkte wie Phenylbutazon, Prednisolon, Polyvinylpyrrolidon oder
Dextrane.
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Der
physikalische Ansatz besteht darin, die chirurgische Wunde vom umgebenden
Gewebe zu isolieren, indem eine physikalische Sperre dazwischen
angeordnet wird, die ein faseriger oder nicht-faseriger, gewebter
oder nicht gewebter Film oder Verband sein kann oder in Form eines
Gels vorliegen kann. Diese physikalische Sperre verhindert die Verklebung
während
der Narbenbildung. Aber sobald Letztere nicht mehr stattfindet und
damit keine Gefahr der Verklebung mehr besteht, stellt diese physikalische
Sperre nichts anderes als einen unnötigen, ja sogar störenden,
Fremdkörper
dar, der in einigen Fällen
sogar gefährlich
ist.
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Daraus
folgt, dass die bekannten Mittel gegen Verklebungen aus polymeren
Werkstoffen des Typs Polytetrafluorethylen oder Silikon, die, obwohl
sie sich hinsichtlich ihrer Eigenschaften gegen Verklebungen bewährt haben,
nicht biologisch abbaubar sind und damit bei einem zweiten chirurgischen
Eingriff entfernt werden müssen.
Diese für
den Patienten doppelt traumatisierende Handlungsweise weist als
weiteren Nachteil die Verlagerung des Problems der post-chirurgischen
Verklebung von einem Gewebebereich in einen anderen auf, der während der
zweiten Operation (Laparotomie) geschädigt wird.
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So
wurde, um es nicht dabei bewenden zu lassen, versucht, Mittel zur
Verhinderung von chirurgischen postoperativen Verklebungen zu entwickeln,
die aus biologisch abbaubaren (oder bioresorbierbaren) Werkstoffen
bestehen, am Ende der Narbenbildung, sobald ihre Sperrfunktion erfüllt worden
ist und keine Gefahr der Verklebung mehr besteht.
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Da
sie die vermuteten Eigenschaften natürlicher Polymere und ihrer
Abkömmlinge
hinsichtlich biologischer Abbaubarkeit und Biokompatibilität kennen,
haben einige Forscher die Verwendung von unter anderem Kollagen-Peptiden (Kollagen,
Gelatine), Polysacchariden (Cellulose-Stärke und Abkömmlinge), Mucopolysacchariden
als Grundbestandteil von Implantaten oder chirurgischen Prothesen
und insbesondere von Sperren gegen post-chirurgische Verklebungen vorgeschlagen.
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Johnson & Johnson Products
Inc. hat einen bioresorbierbaren Werkstoff auf der Grundlage von
oxidierter RegeneratCellulose entwickelt, die als Sperre gegen post-operative
Verklebungen geeignet ist und in Form eines Gewebes vorliegt, das
eine Dichte von 8 bis 15 mg/cm2 und eine
Porosität
von 10 bis 20 % aufweist. (EP-A-0 213 563). JOHNSON & JOHNSON hat außerdem ein
Verfahren zur Herstellung von neutralisierter oxidierter Cellulose
entwickelt, deren Unversehrtheit und Zugfestigkeit erhalten sind,
in Hinblick auf insbesondere die Verwendung als Mittel zur Verhinderung
von post-chirurgischen Verklebungen (EP-A-0 437 095). Weiterführend dazu
hat dieses Unternehmen auch einen mehrschichtigen Film aus oxidierter
Cellulose und Cellulose entwickelt, der als Sperre gegen post-chirurgische Verklebungen
oder Verband geeignet ist (EP-A-0 815 881).
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In
den Patentschriften US-A-5,017,229 und US-A-5,527,893 offenbaren die Erfinder BURNS
et al. von GENZYME CORPORATION eine Sperre zur Verhinderung von
post-chirurgischen Verklebungen, die aus einem polyanionischen Polysaccharid
und zwar Carboxymethylcellulose besteht, die derart mit Hyaluronsäure verbunden
ist, dass sie ein Gel bildet.
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Im
Allgemeinen ist die Anwendung kollagener Werkstoffe als Filme zur
chirurgischen Verwendung seit langem bekannt. So beschreibt die
englische Patentschrift GB-A-1 095 552 von 1964 einen Kollagenfilm,
der aus einer Vielzahl nicht gewebter Fäden hergestellt ist.
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Die
französische
Patentschrift FR-A-2 628 634 beschreibt einen Flicken zur Verwendung
in der Viszeralchirurgie, der aus einem Biomaterial hergestellt ist,
das aus zwei Kollagenschichten hergestellt ist, die übereinander
gelegt und eng miteinander verbunden sind, und zwar aus einer porösen klebefähigen Schicht
aus faserigem Kollagen und einem Kollagen- und/oder Gelatinefilm.
Ziel dieses Flickens ist es, eine gute Vernarbung der Eingeweide
zu ermöglichen.
Es handelt sich um einen Verband, der zeitweise die wiederherzustellende
Eingeweidewand ersetzen soll. Er ist als vollkommen biologisch abbaubar
und als geeignet dargestellt, eine hervorragende einschließende und
blutstillende Wirkung zu bewirken. Es handelt sich nicht ausdrücklich um
eine Anwendung zur Verhinderung post-chirurgischer Verklebungen.
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Die
Patentanmeldung PCT WO 96/08 277 betrifft die Verwendung von Kollagenmembranen
als Prothese zur peritonealen Neubildung. Das betrachtete kollagene
Material ist ein Kollagengel, das gegebenenfalls vernetzt, durchsichtig,
biokompatibel, nähbar
oder zum Klammern geeignet und bioresorbierbar ist. Das verwendete
Kollagen ist ein Kollagen mit oder ohne Telopeptide, das gegebenenfalls
mit einem Glykosaminoglykan verbunden ist. Es ist festzuhalten,
dass das Vernetzungsmittel, das gegebenenfalls eingesetzt wird,
eine reaktive chemische Verbindung ist (Glutaraldehyd, Diphenylphosphorylazid,
Carbodiimid), die hinsichtlich ihrer Giftigkeit nicht neutral ist.
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In
der Patentschrift FR-A-2 628 634 ist der Flicken aus zwei Kollagenschichten
gebildet, die übereinander
gelegt und eng miteinander verbunden sind. Die erste Schicht besteht
aus faserigem Kollagen, wodurch ihr eine poröse und klebefähige Beschaffenheit
verliehen wird. Die zweite Schicht wird durch Aufkleben eines Kollagen-
oder Gelatinefilms auf die erste Schicht aus faserigem Kollagen
gewonnen. Dieser Flicken weist laut den Erfindern der Patentschrift
PCT WO 96/08277 eine verhältnismäßig geringe
mechanische Festigkeit auf. In der Schrift FR-A-2 628 634 wird sich
nicht zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen geäußert.
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Die
europäische
Patentanmeldung EP-A-0 686 402 offenbart eine Kollagenmembran zur
Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen, die einen Träger auf
Kollagenbasis umfasst, der mit einer Gelatineschicht bedeckt ist,
die nicht mit dem Träger
vermischt ist. Diese Membran liegt vorzugsweise in gefriergetrockneter
Form vor. Das verwendete Kollagen kann mithilfe von Diphenylphosphorylazid
(DPPA) vernetzt werden. Auch hier ist die Wahl dieser Art vernetzten
Kollagens keine Gute aufgrund der Probleme hinsichtlich der Giftigkeit,
die ihr zugrunde liegen.
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Die
französische
Patentanmeldung FR-A-2 759 083 offenbart einen kollagenen Werkstoff,
der insbesondere für
die Verhinderung von post-operativen Verklebungen geeignet ist.
Dieser kollagene Werkstoff ist laut den Erfindern biokompatibel,
ungiftig, potenziell haftend und in weniger als einer Woche biologisch
abbaubar. Dieser kollagene Werkstoff umfasst Kollagen, das durch
oxidative Spaltung und Erhitzen über
37 °C modifiziert
und in Gegenwart mindestens eines hydrophilen, makromolekularen
Zusatzstoffs vernetzt wird, der gegenüber Kollagen chemisch reaktionsunfähig ist.
Das hydrophile Mittel ist beispielsweise Polyethylenglykol oder
ein Polysaccharid wie Stärke,
Dextran oder Cellulose.
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Aus
diesem Überblick über den
Stand der Technik folgt, dass kein biologisch abbaubarer Werkstoff, insbesondere
Cellulose- oder kollagene Werkstoffe, der bisher bei der Verhinderung
von post-chirurgischen Verklebungen eingesetzt wird, zufriedenstellend
ist, insbesondere aus den im Folgenden aufgeführten Gründen.
- • Einige
können
in Anbetracht ihrer Art der chemischen Vernetzung, beispielsweise
unter Verwendung von Aldehyden, eine Restgiftigkeit aufweisen.
- • Die
biologische Abbaubarkeit kann nicht ausreichend gesteuert werden,
dass sie mit dem Erhalt ihrer physikalischen Sperrfunktion zwischen
den Geweben während
und ausschließlich
während
der Dauer der Narbenbildung, während
der die Gefahr der chirurgischen Verklebung besteht, in Übereinstimmung
gebracht werden kann.
- • Einige
weisen eine sehr geringe mechanische Ausgangsfestigkeit auf.
- • Da
es sich um kollagene Werkstoffe handelt, können sie nicht als Lösungen hergestellt
werden, die über Filter
gefiltert werden können,
deren Porosität
ausreichend niedrig ist, dass biologische Verunreinigungen zurückgehalten
werden können
(Sterilisation).
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Ein
wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein
Mittel auf der Grundlage von Kollagen zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen bereitzustellen, wobei dieses Mittel die Anforderungen
zu erfüllen
hat, durch die die zuvor erwähnten Nachteile
der Werkstoffe nach dem Stand der Technik behoben werden.
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Ein
weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel
zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen bereitzustellen, das einen kollagenen Werkstoff umfasst
und dazu geeignet ist, als Träger
für ein
oder mehrere chemische Wirkstoffe gegen post-chirurgische Verklebungen
dienen zu können.
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Ein
weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel
zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen bereitzustellen, das ein modifiziertes und vernetztes
Kollagen umfasst, das in Form eines Films oder einer Membran hergestellt
werden kann. Dieser Film oder diese Membran kann aus einem Verbundwerkstoff
bestehen, der einerseits chemisch modifiziertes und vernetztes Kollagen
umfasst, das den zuvor erwähnten
Anforderungen genügt,
und andererseits ein vorzugsweise biologisch abbaubares Verstärkungsmaterial,
das gewebt oder nicht gewebt, kollagener oder nicht kollagener Art
ist.
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Ein
weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel
zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen bereitzustellen, das eine flüssige Form aufweist (z.B. zerstäubbare Flüssigkeit
oder Gel) mit passender Zähflüssigkeit,
das modifiziertes Kollagen umfasst, das wenigstens teilweise nicht
vernetzt und in situ auf biologischen Geweben vernetzbar ist.
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Ein
weiteres wesentliches Ziel der Erfindung besteht darin, ein Mittel
zur Verhinderung von post- chirurgischen
Verklebungen bereitzustellen, das wirtschaftlich ist und einfach
gewonnen, gehandhabt und eingesetzt werden kann.
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Nachdem
sie sich alle diese Ziele gesetzt hatten, haben die Erfinder lang
dauernde und aufwändige Untersuchungen
und Versuche durchgeführt,
an deren Ende sie völlig überraschenderweise
und unerwartet ein neues Kollagen-Peptid entwickeln konnten, das
chemisch modifiziert und durch Disulfid-Brücken vernetzbar und/oder vernetzt
ist, die durch Amid-Bindungen mit den Carboxylgruppen der Asparaginsäuren und
Glutaminsäuren
der Kollagen-Ketten verbunden sind. Dieses neue vernetzbare/vernetzte
Kollagen hat sich als besonders geeignet erwiesen als wesentlicher
Bestandteil eines Mittels – das
tatsächlich
ebenfalls neu ist – zur Verhinderung
von post-chirurgischen Verklebungen.
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Daraus
folgt, dass die vorliegende Erfindung die zuvor erwähnten Ziele
erfüllt,
indem unter anderem ein Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen bereitgestellt wird, dadurch gekennzeichnet, dass es
mindestens ein Kollagen-Peptid umfasst, das durch Pfropfen von freien
oder substituierten Thiol-Funktionen
modifiziert ist, das vernetzbar und/oder wenigstens teilweise vernetzt
ist, und wobei die Thiol-Funktionen
durch Mercaptoamin-Reste bereitgestellt sind, die ausschließlich auf
die Asparaginsäuren
und Glutaminsäuren
der Kollagen-Ketten durch Amid-Bindungen gepfropft sind.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Kollagen-Peptid" insbesondere Kollagen mit (natives)
oder ohne Telopeptid, denaturiertes Kollagen sowie Gelatine.
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In
der US-Patentschrift
US 5,412,076 ist
ebenfalls vernetzbares Kollagen beschrieben, das durch Pfropfen
von Thiol-Funktionen modifiziert ist, die Mercaptoamin-Resten gehören, die
am Kollagen durch einen Abstandshalter vom Typ Dicarbonsäure befestigt
sind. Die Carboxylfunktionen der Letzteren reagieren mit den Alkoholgruppierungen
oder den freien Amin-Gruppierungen
des Kollagens. Der Mercaptoamin-Rest reagiert seinerseits über seine
freie Amin-Funktion mit den Carboxylgruppierungen, die in der Kollagen-Kette
vorhanden sind. Diese Gruppierungen sind somit zweierlei Art: die,
die vom Abstandshalter bereitgestellt werden, und die, die natürlich im
Kollagen vorkommen, das heißt
die von den Asparagin- und Glutaminsäuren.
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Im
Gegensatz zur US-Patentschrift 5,412,076 weist das Kollagen-Peptid,
das in Übereinstimmung
mit der Erfindung ausgewählt
wurde, die Besonderheit auf, dass die Vernetzbarkeit ausschließlich von
den Carboxylresten der Asparagin- und Glutaminsäuren der Kollagen-Kette bereitgestellt
wird. Dadurch werden ihm vorteilhafte unerwartete Eigenschaften,
in mechanischer Hinsicht, hinsichtlich der Löslichkeit in flüssigen Medien,
hinsichtlich des Haftvermögens
und in biologischer Hinsicht (biologische Abbaubarkeit) verliehen.
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Dieses
chemisch modifizierte Kollagen-Peptid kann in mindestens drei verschiedenen
Formen vorliegen:
- A. Vorläufer mit substituierten Thiol-Funktionen,
- B. vernetzbarer Vorläufer
mit freien Thiol-Funktionen,
- C. -S-S- vernetzte Form.
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Form
B kann aus Form A gewonnen werden und Form C aus Form B.
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Das
erfindungsgemäße Mittel
zur Verhinderung von Verklebungen umfasst mindestens eine der Formen
A, B oder C. Es ist offensichtlich, dass die Formen A und B insbesondere
dem Mittel im Konditionierungs- und Lagerzustand des Mittels vor
Anwendung an dem Ort entsprechen, an dem es seiner Funktion gegen
Verklebungen Ausdruck verleihen soll. Und in der vernetzten Form
C ist dieses Mittel am besten in der Lage, dieser Funktion Ausdruck
zu verleihen.
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In
der vernetzten Form C kann das chemisch modifizierte Kollagen-Peptid,
das in die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Mittels einfließt, eine
hohe Dichte an Disulfid-Brücken
aufweisen, was ihm eine ausgezeichnete Stabilität sowie gute elastische Eigenschaften
und eine hohe mechanische Festigkeit verleiht. Ein weiterer Vorteil
dieses wohlüberlegt
ausgewählten
Kollagen-Peptids
kommt dadurch zustande, dass sein Vernetzungsgrad steuerbar sein
kann. Schließlich
schadet die chemische Modifizierung des betrachteten Kollagen-Peptids durch Pfropfen
von Mercaptoamin-Resten seiner Biokompatibilität nicht oder wenig.
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Die
Verwendung dieses Kollagen-Peptids, das zumindest teilweise vernetzt
ist (C), als Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen
ist vollkommen wohlüberlegt
und schöpferisch.
Damit steht ein neues Mittel gegen Verklebungen zur Verfügung, das
zwischen den Geweben vollkommen wirksam eine Sperre bildet und vom
Organismus des Patienten sehr gut vertragen wird. Seine Bioresorbierbarkeit
kann derart geregelt werden, dass das Mittel seine Barrierewirkungsfunktion
während
der Zeit behält,
die die Narbenbildung erfordert.
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Durch
das erfindungsgemäße Mittel
können
verschiedene gewerbliche Erzeugnisse vom Typ Filme, Gele, zerstäubbare Flüssigkeiten,
Verbände,
Mullbinden, Umschläge,
Salbenverbände
usw. hervorgebracht werden.
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Eine
weitere vorteilhafte Anordnung dieses Mittels ergibt sich aus der
Tatsache, dass die Zwischenformen A und B als Lösung vorliegen können, die über Maschen
gefiltert werden kann, die kleiner als 0,22 Mikrometer sind. Damit
kann schnell und einfach eine Sterilisation erfolgen, die für Produkte
unumgänglich
ist, die in den lebenden Organismus eingepflanzt werden sollen.
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Vorteilhafterweise
liegt wenigstens ein Teil des modifizierten Kollagen-Peptids, das
Bestandteil des erfindungsgemäßen Mittels
ist, in Form eines Vorläufers
A vor, auf den Mercaptoamin-Reste gepfropft sind, welche substituierte
Thiol-Funktionen tragen, wobei mindestens ein Teil dieser Mercaptoamin-Reste
folgende allgemeine Formel (I) aufweist:
worin
- • x = 1 oder
2,
- • R0 = H oder CH3,
- • R1 H oder COOR3 bedeutet,
wobei R3 einen aliphatischen, aromatischen
oder alicyclischen Kohlenwasserstoff-Rest, bevorzugt Alkyl, Alkenyl,
Aryl, Aralkyl, Alkylaryl, Aralkenyl, Alkenylaryl und noch weiter
bevorzugt Methyl oder Ethyl bedeutet;
- • R2 ein aliphatischer und/oder alicyklischer
und/oder aromatischer Rest ist, bevorzugt ein Alkyl- oder ein Acyl-Rest,
der gegebenenfalls Schwefel- und/oder Amino-Gruppen enthält, und
noch weiter bevorzugt weist R2 die folgende
Formel (II) auf:
- • worin
für y,
R00 und R4 dieselbe
Definition gilt wie für
x, R0 et R1 bezüglich Formel
(I) angegeben.
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In
der Praxis sind die auf die Form A des Kollagen-Peptids gepfropften
Mercaptoamin-Reste ausgewählt
aus der Gruppe der folgenden Reste:
-
-
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Zur
Umwandlung des Vorläufers
A, bei dem R2: -S-Kohlenwasserstoff-Rest
(substituierte Thiole) entspricht, in den intermediären vernetzbaren
Vorläufer
B vom Typ Thiol erfolgt eine Reduktion mithilfe von bekannten Reduktionsmitteln
wie Merkaptanen (Mercaptoethanol, Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylamin, Benzylmercaptan,
Thiocresol, Dithiothreitol...) und/oder von reduzierenden Salzen
(NaBH4, Na2SO3 ...) und/oder von organischen Reduktionsmitteln
(Phosphin).
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Somit
liegt gemäß einer
bevorzugten Eigenschaft der Erfindung wenigstens ein Teil des modifizierten Kollagen-Peptids
in einer Form B eines intermediären
vernetzbaren Vorläufers
vom Typ Thiol vor, auf welchen Mercaptoamin-Reste gepfropft sind,
von denen wenigstens ein Teil die zuvor angegebene allgemeine Formel (I)
aufweist und worin der Substituent R2 Wasserstoff
entspricht und worin R3 Wasserstoff oder
ein Salz (Na+, K+,
Li+) bedeuten kann, außer den Kohlenwasserstoffgruppierungen,
so wie sie oben in der Legende von Formel (I) definiert sind, vorausgesetzt,
dass der Schutz des Esters aufgehoben wird.
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In
Bezug auf vernetzbare Vorläufer
B vom Typ Thiol, die der Formel (I) entsprechen, worin R2 = H, erfolgt ihre Umwandlung in das vernetzte
Kollagen-Peptid
C (Vernetzung) durch Oxidation der Thiole unter Bildung von Disulfid-Brücken. Dadurch
wird ein dreidimensionales Kollagennetz gewonnen, das in physiologischen
Medien unlöslich
und in reduzierenden Medien löslich
ist, durch die die Disulfid-Brücken
reduziert werden können.
Diese Oxidation kann in Gegenwart des Sauerstoffs der Luft von selbst
ablaufen, vorzugsweise in einem schwach basischen Medium und gegebenenfalls
in Gegenwart von zusätzlichen
Oxidationsmitteln wie Wasserstoffperoxid oder Iodverbindungen (Iodlösung, Betadin).
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Somit
liegt gemäß einer
bevorzugten Art und Weise des erfindungsgemäßen Mittels wenigstens ein Teil
des modifizierten Kollagen-Peptids in einer vernetzten Form C vor,
welche Kollagen-Ketten umfasst, die miteinander durch Disulfid-Brücken verbunden
sind, wobei die Schwefelatome, welche die Brücken bilden, Mercaptoamin-Resten gehören, die
ausschließlich
auf die Asparaginsäuren
und Glutaminsäuren
der Kollagen-Ketten über
Amid-Bindungen gepfropft sind.
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Noch
bevorzugter wird das Kollagen-Peptid der Form C aus dem Kollagen-Peptid
B erhalten.
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Die
vernetzten Kollagen-Peptide C weisen einen steuerbaren Vernetzungsgrad
auf, indem der Substitutionsgrad der Carboxylgruppen der Asparaginsäure- und
Glutaminsäurereste
der Kollagen-Ketten verändert wird.
Damit steht ein gewisser Handlungsspielraum zur Auswahl der mechanischen
Beschaffenheit der Werkstoffe zur Verfügung, die für die angestrebte Anwendung
geeignet sind.
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Die
Disulfid-Brücken
dieser vernetzten Kollagen-Peptide C können mithilfe geeigneter Reduktionsmittel
reduziert werden, wofür
zuvor Beispiele genannt wurden.
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Gemäß einer
Abwandlung der Erfindung trägt
das Kollagen-Peptid A, das vernetzbare Kollagen-Peptid B und/oder
das wenigstens teilweise vernetzte Kollagen-Peptid C, das Bestandteil des beanspruchten
Mittels ist, ebenfalls Pfropf-Gruppen G, die an wenigstens einem
Teil der freien Amin-Gruppen der Kollagen-Ketten über Amid-Bindungen
befestigt sind, wobei G ein Acyl-Rest
ist, der eine Kohlenwasserstoff-Einheit umfasst, wobei Mercaptoamin-Reste,
insbesondere solche wie oben definiert, ausgeschlossen sind, wobei
diese Einheit gegebenenfalls Heteroatome (vorteilhafterweise O und/oder
N) enthält,
bevorzugt ausgewählt
ist aus Alkyl und/oder Alkenyl und/oder alicyclischen und/oder aromatischen
Resten und noch weiter bevorzugt aus Gruppierungen, die eine gegebenenfalls
ungesättigte
Alkylkette umfassen, die 1 bis 22 Kohlenstoffatome aufweist, oder
die folgende Formel (III) aufweisen:
worin:
R
5 = H oder CH
3;
R
6 = H, ein linearer oder verzweigter Alkylrest
und bevorzugt Methyl ist;
Z = 0, 1 oder 2 und n > 0.
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Diese
zusätzliche
Funktionalisierung an den Aminogruppen der Lysine kann den modifizierten
Kollagen-Peptiden
eine zusätzliche
Fähigkeit
zur Vernetzung verleihen oder auch eine hydrophile oder hydrophobe, sogar
oberflächenaktive
Beschaffenheit. Es ist auch vorstellbar, dass diese Funktionalisierung
durch die Verankerung eines Wirkstoffs, der bei der betreffenden
Anwendung zum Beispiel ein oder mehrere chemische Wirkstoffe zur
Behandlung gegen Verklebungen sein könnte, therapeutische Ziele
hat.
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Gemäß einer
vorteilhaften Eigenschaft der Erfindung modifiziert die Pfropf-Gruppe
G, die an den freien Aminen der Kollagen-Kette des vernetzten Kollagen-Peptids befestigt
ist, die hydrophile/hydrophobe Beschaffenheit des Produkts, wodurch
die Eigenschaften hinsichtlich Quellung, mechanischer Festigkeit
und Abbaukinetik abgestimmt werden können.
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Was
die Gewinnung eines Kollagenvorläufers
A betrifft, der Mercaptoamin-Reste (I) trägt, besteht sie im Wesentlichen
daraus, das Kollagen-Peptid in Lösung
mit mindestens einem Vorläufer
eines Mercaptoamin-Rests zur Reaktion zu bringen, dessen Thiol-Funktion
und die optionale Carboxyl-Funktion blockiert sind, in Gegenwart
mindestens eines Pfropfmittels, vorzugsweise aus der Gruppe von
Produkten ausgewählt,
die Carboxyl-Gruppierungen
aktivieren, vorzugsweise aus Carbodiimiden. Die Bedingungen zur
Gewinnung werden derart ausgewählt,
dass das Pfropfen des Mercaptoamin-Rests an den freien Carbonsäure-Gruppen
der Asparaginsäure-
und Glutaminsäurereste
der Kollagen-Kette erfolgt.
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Zu
diesem Zweck muss der zu pfropfende Vorläufer eine freie Amin-Funktion
aufweisen, die mit den COOH des Kollagens reagieren kann, um eine
Amid-Bindung zu bilden. Dieser Vorläufer ist zum Beispiel ein Cystein,
ein Homocystein oder ein Cysteamin, dessen Thiol-Funktion und die
optionale Carbonsäure-Funktion richtig
geschützt
(ist) sind. Ein wirksames Mittel zum Schutz der Thiol-Funktion besteht
darin, als zu pfropfenden Cysteinrest Cystin, Homocystin oder Cystamin
auszuwählen,
die alle drei eine Disulfid-Brücke
aufweisen, die die Mercapto-Funktion stabilisiert. Als weiteres
Mittel zum Schutz der Letzteren kann jede herkömmliche Funktion zum Schutz
von Thiolen gewählt
werden, die im Fachgebiet bekannt ist (siehe zum Beispiel "Greene: Protecting
Groups in Organic Chemistry, WILEY, 1975").
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Die
COOH-Funktionen ihrerseits können
mithilfe einer Schutzgruppe oder jeder anderen organischen Funktion
geschützt
werden, die eine beliebige vorteilhafte Eigenschaft mit sich bringen
kann (PEG, hydrophobe oder hydrophile oder geladene Gruppierungen).
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Gemäß einer
vorteilhaften Anordnung der Erfindung weist der Vorläufer des
zu pfropfenden Mercaptoamin-Rests eine Formel (IV) auf, die Formel
(I) entspricht, die oben angegeben ist und worin die freie Valenz durch
einen Substituenten ersetzt ist, der geeignet ist, mit den Carboxyl-Funktionen
der Asparaginsäuren
und Glutaminsäuren
der Kollagen-Kette derart zu reagieren, wobei dieser Substituent
vorzugsweise Wasserstoff ist, dass die reaktive Funktion ein primä res Amin
ist. Die Vorläufer
von Formel (IV), die insbesondere bevorzugt sind, sind Cystamin
(I.1), Cystindimethylester (I.2) und Cystindiethylester (I.3), die
alle drei eine Disulfid-Brücke umfassen,
die die Mercapto-Funktion schützt.
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In
der Praxis erfolgt das Pfropfen des Mercaptoamin-Rests durch Auflösen des
Kollagen-Peptids und anschließend
des Vorläufers
des zu pfropfenden Mercaptoamin-Rests in einem geeigneten Lösungsmittel. Dies
kann zum Beispiel Wasser (vorzugsweise) oder ein organisches Lösungsmittel
wie Dimethylsulfoxid (DMSO), N-Methylpyrrolidon (NMP) oder andere
sein. Der Vorläufer
des zu pfropfenden Mercaptoamin-Rests ist immer mit einem starken Überschuss
vorhanden, um zu verhindern, dass das aktivierte Kollagen mit den
Aminen reagiert, die in seiner eigenen Hauptkette vorhanden sind.
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Der
Reaktionslösung
wird anschließend
ein Kopplungsmittel wie ein Carbodiimid zugegeben und das Pfropfen
ermöglicht,
während
das Medium für
einige Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird.
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Diese
Kollagen-Peptide A, die mit Mercaptoamin-Resten substituiert sind, die Vorläufer der
vernetzbaren Thiolreste sind, sind neue stabile und wasserlösliche Zwischenprodukte.
Sie können
isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Dialyse, Diafiltration
und anschließende
Gefriertrocknung oder durch Ausfällung in
einem organischen Medium und anschließende Trocknung.
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Die
intermediären
Kollagenvorläufer
B vom Typ Thiol, bei denen R2 = H, können durch
ein Verfahren gewonnen werden, das im Wesentlichen darin besteht,
den Schutz der Mercapto-Funktionen der Mercaptoamin-Reste, die auf
die modifizierten Kollagen-Peptide A gepfropft sind, wie zuvor angegeben
ist, aufzuheben (Umwandlung in Thiole).
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Wenn
der Schutz oder die Maskierung der Mercapto-Funktionen durch eine
Disulfid-Brücke
gewährleistet
ist (das heißt,
wenn die Vorläufer
der Pfropf-Gruppen
z.B. Cystamin oder Cystin sind), erfolgt die Regeneration der Thiol-Funktion
durch Reduktion. Letztere kann mithilfe von Reduktionsmitteln wie
Merkaptanen (Mercaptoethanol, Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylamin, Benzylmercaptan,
Thiolcresol, Dithiothreitol ...) und/oder reduzierenden Salzen (NaBH4, Na2SO3 ...)
und/oder organischen Reduktionsmitteln (Phosphin) erfolgen.
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Vorteilhafterweise
wird die Reduktion der schützenden
Disulfid-Brücke
mithilfe von Dithiothreitol in einem wässrigen basischen Medium durchgeführt. Nach
diesem Schritt wird das gewonnene thiolhaltige Kollagen durch Dialyse/Diafiltration
gereinigt und kann, z.B. durch Gefriertrocknung, isoliert werden.
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Wie
sich bereits aus dem Vorstehenden ergibt, werden die vernetzten
Kollagen-Peptide C durch Oxidation der Thiol-Funktionen des vernetzbaren
modifizierten Kollagen-Peptids B hergestellt, sodass sich Disulfid-Brücken zwischen
den Ketten bilden.
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Was
die Funktionalisierung der vorgenannten Kollagen-Peptide durch Pfropf-Gruppen
G betrifft, die sich in ihrer Beschaffenheit von den Pfropf-Gruppen
von Formel (I) (gegebenenfalls hydriert) unterscheiden, die an den
COOH der Asparaginsäuren
und Glutaminsäuren
befestigt sind, besteht sie im Wesentlichen:
- • aus der
Acylierung zumindest eines Teils der freien Amin-Funktionen der
Kollagen-Kette, sodass darauf Pfropf-Gruppen G befestigt werden,
die eine Kohlenwasserstoff-Einheit umfassen, wobei Mercaptoamin-Reste,
insbesondere solche wie oben definiert, ausgeschlossen sind, wobei
diese Einheit gegebenenfalls Heteroatome (vorteilhafterweise O und/oder
N) enthält,
und bevorzugt ausgewählt
ist aus Alkyl und/oder Alkenyl und/oder alicyclischen und/oder aromatischen
Resten und noch weiter bevorzugt aus Gruppierungen, die eine gegebenenfalls
ungesättigte
Alkylkette umfassen oder die folgende Formel (III) aufweisen: worin:
R5 =
H oder CH3;
R6 =
H, ein linearer oder verzweigter Alkylrest und bevorzugt Methyl
ist;
Z = 0, 1 oder 2 und n > 0;
- • aus
dem Zurreaktionbringen des Kollagen-Peptids in Lösung mit mindestens einem Vorläufer eines
Mercaptomin-Rests, dessen Thiol-Funktion und die optionale Carboxyl-Funktion
blockiert sind, in Ge genwart mindestens eines Pfropfmittels, vorzugsweise
aus der Gruppe ausgewählt,
die Verbindungen umfasst, die Carboxyl-Gruppierungen aktivieren
können,
vorzugsweise Carbodiimide.
-
Damit
sie durch Acylierung mit den freien Amin-Funktionen der Lysine der Kollagen-Kette
reagieren können,
müssen
die Vorläufer
der Pfropf-Gruppen G mindestens eine aktivierbare Carbonsäure-Funktion
aufweisen.
-
Die
Acylierungsreaktion und die Kopplungsreaktion von Amin-Funktionen
mit den Carboxylgruppen, die Proteinen gehören, sind dem Fachmann im Bereich
der Proteinbiochemie bekannt. Für
ausführlichere
Angaben hierzu wird insbesondere auf folgende Arbeiten verwiesen:
- • „Techniques
in protein chemistry" R.
L. LUNDBLAD Chap. 10–14,
- • „Chemistry
of protein conjugation and cross-linking" S. S. WONG, Boca raton, CRC Press,
1993, Chap. 2.
-
Nach
dieser Beschreibung des Produkts und wesentlichen Bestandteils des
erfindungsgemäßen Mittels
sind im Folgenden Einzelheiten zu den physikalischen Eigenschaften,
dem Herstellungsverfahren und der Verwendungsweise dieses Mittels
zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen angegeben.
-
Gemäß einer
ersten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
liegt es in Form eines Films vor.
-
Unter
dem Begriff „Film" wird im Sinn der
vorliegenden Erfindung ein Material in Form einer Folie verstanden,
dessen Oberfläche
deutlich größer als
die Stärke
ist.
-
Gemäß einer
zweiten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
liegt es in Form eines faserigen, gewebten oder nicht gewebten Materials
vor, vorzugsweise in gewebter Form und noch weiter bevorzugt in
gewebter Form mit gestrickten Maschen.
-
Als
Beispiel für
erfindungsgemäße Mittel,
die aus faserigen kollagenen Werkstoffen bestehen, können gewebte
und/oder gestrickte und/oder geflochtene Tücher oder auch Filze und Matten
genannt werden.
-
Gemäß einer
dritten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
kann es in Form eines Films (oder eines Tuchs) aus einem inhomogenen
Verbundwerkstoff vorliegen, wobei ein Verstärkungsmaterial aus einem biologisch
abbaubaren Polymer kollagener oder nicht kollagener Art in der Matrix
enthalten ist, die aus dem zuvor definierten Kollagen-Peptid besteht.
Das Polymer, das das Verstärkungsmaterial
bildet, kann das Kollagen-Peptid
sein, das gemäß der Erfindung
ausgewählt
wurde, nicht modifiziertes Kollagen oder weitere biokompatible und
biologisch abbaubare Polymere wie Polymere von α-Hydroxycarbonsäuren (z.B. Polymilchsäure und/oder
Polyglycolsäure),
modifizierte oder nicht-modifizierte Cellulosen oder Stärken. Nicht
auszuschließen
ist, dass diese enthaltenen Polymere synthetische oder natürliche Polymere
sind, die nicht biologisch abbaubar, jedoch biokompatibel sind (z.B.
Silikone,....).
-
Das
Verstärkungsmaterial
kann in verschiedenen physikalischen Formen vorliegen, z.B.: Füllstoffteilchen
oder Faserfüllstoff,
Matten, Filze, gewebtes, gestricktes, geflochtenes Material... In
der Praxis kann das erfindungsgemäße Mittel zum Beispiel aus
einem Verbundfilm bestehen, der eine Kollagen-Peptid-Matrix umfasst,
die wenigstens teilweise in vernetzter Form C vorliegt, so wie sie
oben definiert ist, und ein Verstärkungsmaterial, das aus einem
Gewebe oder einer Matte besteht, das bzw. die Fasern aus Polymeren
von α-Hydroxycarbonsäuren umfasst
(Polymilchsäure
und/oder Polyglycolsäure).
-
Dieses
faserige Verstärkungsmaterial
weist zum Beispiel dieselbe Form auf wie die Matrix (beispielsweise
rechteckig), wobei es etwas geringere Abmessungen aufweist.
-
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Mittel
in Form eines Films vorliegen, der nur auf einer Seite seiner Oberfläche ein
faseriges Verstärkungsmaterial
aufweist. In der Praxis kann das faserige Verstärkungsmaterial in seinem Mittelbereich
ausgehöhlt
werden.
-
Auf
jeden Fall ist es vorteilhaft, dass das faserige Verstärkungsmaterial
auf mindestens einem Teil des Rands des Verbundfilms so vorliegt,
dass ein Bereich geschaffen wird, der dafür geeignet ist, Nähte aufzunehmen.
-
Ausgehend
vom vernetzten Kollagen-Peptid in Form eines Films (gegebenenfalls
Verbundfilm) ist es erfindungsgemäß möglich, nähbare Membranen herzustellen,
die wirksam bei der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen
sind.
-
Vorzugsweise
ist das erfindungsgemäße Mittel
ein Verbundfilm, dessen Matrix aus vernetztem Kollagen-Peptid besteht und
dessen Verstärkungsmaterial
in Form eines faserigen, gewebten oder nicht gewebten Materials
vorliegt, vorzugsweise in gewebter Form und noch weiter bevorzugt
in gewebter Form mit gestrickten Maschen, wobei dieses Verstärkungsmaterial
außerdem
vorteilhafterweise aus (Co)Polymeren von α-Hydroxycarbonsäuren ausgewählt ist,
vorzugsweise Polymilchsäuren
und/oder Polyglycolsäuren.
-
Es
ist jedoch erfindungsgemäß ganz und
gar vorstellbar, dass das Mittel zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen
an der Stelle, an der es als Sperre dienen soll, nicht in einer
festen Form, sondern in einer flüssigen
Form (flüssig
oder zähflüssig) angeordnet
(angewendet) und/oder implantiert wird. Daraus folgt, dass das Mittel
gemäß einer
vierten Ausführungsform
des Mittels der Erfindung in nicht fester, vernetzbarer und/oder
wenigstens teilweise vernetzter Form vorliegt und auf und/oder in
einem Träger
anwendbar und/oder implantierbar ist.
-
In
diesem Fall ist die nicht feste Form zum Beispiel eine Lösung aus
vernetzbarem Kollagen-Peptid (Vorläufer B). Sie wird unmittelbar
auf einem Träger
angewendet (zum Beispiel biologische Gewebe) und wird anschließend einer
Vernetzung unterworfen, durch die ihre Aushärtung zum Gel möglich ist.
Die Vernetzung kann in situ durch Wirkung eines oxidierenden chemischen
Wirkstoffs erreicht werden, der medizinisch akzeptiert ist, durch
den Sauerstoff der Luft oder durch jedes andere Mittel zur Oxidation,
das während
einem chirurgischen Eingriff einfach eingesetzt werden kann (UV,
Elektrokoagulation...).
-
Bei
dieser vierten Ausführungsform
kann die nicht feste Form des Kollagen-Peptids, die im erfindungsgemäßen Mittel
enthalten ist, vorteilhafterweise in Form einer Flüssigkeit
vorliegen, die in Form eines Gels insbesondere durch Oxidation und/oder
physikalisch geliert werden kann, das auf einem Träger angewendet
werden soll (z.B. biologische Gewebe), wo es seine Wirkung gegen
Verklebungen ausübt.
-
In
dieser nicht festen gelierten Form kann das Kollagen-Peptid, gegebenenfalls,
jedoch nicht notwendigerweise, teilweise in einer vernetzten Form
vorliegen. Es versteht sich jedoch von selbst, dass bei dieser Möglichkeit
der Anteil des vernetzten Kollagen-Peptids C im Vergleich zu seinem
nicht-vernetzten Vorläufer
B derart gewählt
ist, dass der feste Aggregatzustand nicht erreicht wird.
-
Die
nicht feste Form (d.h. flüssig)
Kollagen-Peptid-Vorläufers, nämlich z.B.
eine flüssige
Kollagenlösung,
kann unmittelbar mithilfe eines Werkzeugs, vorzugsweise einer Spritze
oder einem Zerstäuber
(Spray) angewendet werden. Somit umfasst gemäß einer vorteilhaften Abwandlung
der vierten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
Letzteres wenigstens ein Werkzeug, vorzugsweise eine Spritze oder
einen Zerstäuber,
zur Lagerung und Anwendung in und/oder auf einem Träger, in
der Form eines nicht festen vernetzbaren und/oder wenigstens teilweise
vernetzten Kollagen-Peptids,
wie sie zuvor definiert ist.
-
Wenn
das erfindungsgemäße Mittel
ein Zerstäuber
des modifizierten Kollagen-Peptids in flüssiger Form (Spray) ist, kann
die Zerstäubung
durch ein Pumpe/Düse-System und/oder durch
ein gasförmiges
Treibmittel gewährleistet
werden.
-
Der
Träger
kann hier als biologisches Gewebe verstanden werden (beispielsweise
tierisch), das verbunden werden soll und/oder behandelt wird, z.B.
am lebenden Organismus, um post-chirurgische Verklebungen zu verhindern.
-
Gegebenenfalls
können
die Fließeigenschaften
der Kollagenlösung
durch Zugabe eines natürlichen oder
synthetischen Polymers eingestellt werden, das biokompatibel und
vorzugsweise biologisch abbaubar ist (zum Beispiel Polysaccharide,
Glykosaminoglykane, Proteine oder Glykoproteine, ethoxylierte Polymere
wie Polyethylenglykol...).
-
Wird
zur Vernetzung der Lösung
ein chemischer Wirkstoff verwendet, wird er vorteilhafterweise aus den
Oxidationsmitteln ausgewählt,
die üblicherweise
in der Medizin verwendet werden, beispielsweise Wasserstoffperoxid.
-
Mit
dieser vierten Ausführungsform
des Mittels der Erfindung (Kollagen-Peptid-Flüssigkeit/-Gel) kann ein Verfahren
zum Bereitstellen eines Mittels zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen an lebenden Geweben verbunden sein, das dadurch gekenn zeichnet
ist, dass es im Wesentlichen aus Folgendem besteht:
- • Verwendung
eines Kollagenfluids, z.B. einer Lösung, des Kollagen-Peptids
der Art, wie sie zuvor definiert wurde;
- • Anwendung
dieses Fluids auf biologische Gewebe, zum Beispiel mithilfe einer
Spritze der eines Zerstäubers;
- • und
Bewirken einer Vernetzung des Kollagenfluids in situ, zum Beispiel
mithilfe eines biokompatiblen Oxidationsmittels (z.B. Sauerstoff
der Luft, H2O2...).
-
Gemäß einer
ersten Durchführungsart
dieses Verfahrens kann das Mischen von Oxidationsmittel und Fluid,
zum Beispiel der Kollagenlösung,
vor der Aufbringung erfolgen. In diesem Fall ist die angewendete
Lösung
zum Zeitpunkt der Aufbringung bereits teilweise vernetzt. Die Homogenität des Gemischs
Lösung/Oxidationsmittel
kann durch eine Anwendungsvorrichtung wie ein Doppelspritzensystem
gewährleistet
werden, das mit einem Mischkopf versehen ist (ähnliche Vorrichtung wie die,
die für
biologische Klebstoffe auf der Grundlage von Fibrin verwendet wird),
wie ein Doppelzerstäuber,
der mit einer Mischdüse
versehen ist, oder wie jede andere Vorrichtung, mit der ein homogenes
Gemisch gewährleistet
werden kann.
-
Gemäß einer
zweiten Durchführungsart
dieses Verfahrens erfolgt die Anwendung in zwei Abschnitten. Vorzugsweise
erfolgt zuerst die Aufbringung des Fluids, zum Beispiel der flüssigen Kollagenlösung, und
anschließend
wird die Oxidationslösung
aufgebracht.
-
Jedoch
kann die Zugabe auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen.
-
Gemäß einer
fünften
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
liegt dieses in Form eines homogenen oder zusammengesetzten Blocks
vor, der nicht mit einem Film vergleichbar ist.
-
Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung von Mitteln zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen, wie sie zuvor beschrieben sind.
-
Gemäß einem
ersten Weg der Durchführung,
der der Herstellung der festen Formen entspricht (beispielsweise
homogene oder zusammengesetzte Filme oder Blöcke: erste, dritte und fünfte Ausführungsform), umfasst
das Verfahren die folgenden wesentlichen Schritte:
- 1. Bereitstellen einer bevorzugt wässrigen Lösung von vernetzbarem Vorläufer eines
modifizierten Kollagen-Peptids;
- 2. gegebenenfalls Filtrieren dieser Lösung, um Bestandteile mit einer
Größe von 0,8 μm oder größer, bevorzugt
größer oder
gleich 0,45 μm
und noch weiter bevorzugt größer oder
gleich 0,2 μm
zu entfernen;
- 3. Formen des Filtrats in die für das herzustellende Mittel
zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen vorgesehene
Konfiguration;
- 4. gegebenenfalls Gelieren der geformten Lösung bei einem Sättigungsstadium,
indem die Temperatur der Lösung
unter ihre Geliertemperatur erniedrigt wird;
- 5. gegebenenfalls Entfernen des Lösungsmittels, vorzugsweise
durch Verdampfen;
- 6. Bewirken der Vernetzung, vorzugsweise durch Oxidation;
- 7. gegebenenfalls Entfernen des verwendeten optionalen Oxidationsmittels
durch aufeinanderfolgendes Spülen;
- 8. gegebenenfalls Imprägnieren
des Materials in vernetztem Zustand oder im Verlauf der Vernetzung
mithilfe einer Lösung
wenigstens eines Weichmachers (beispielsweise Glycerin, Polyethylenglycol
mit niedriger Molekülmasse);
- 9. gegebenenfalls Trocknen des vernetzten Materials;
- 10. gegebenenfalls Zuschneiden des Materials zu Abmessungen
für die
Anwendung;
- 11. gegebenenfalls Sterilisieren des vernetzten Materials durch
Bestrahlen.
-
Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
kommt daher, dass es einfach, steril und wirtschaftlich durchgeführt werden
kann.
-
Schritt
1 des Inlösungbringens
erfolgt zum Beispiel mithilfe eines Lösungsmittels, das aus sterilem Wasser
besteht, bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 °C und einem
pH-Wert zwischen 6 und 8. Gemäß einer
bevorzugten Eigenschaft dieses ersten erfindungsgemäßen Verfahrenswegs
weist die in Schritt 1 gebildete Lösung einen Gehalt an vernetzbarem
Vorläufer
eines Kollagen-Peptids auf, der größer oder gleich 1 % ist und
vorzugsweise zwischen 1 und 15 % liegt.
-
Schritt
2 der Filtration, der fakultativ, jedoch trotzdem bevorzugt ist,
ist ein Mittel zur Reinigung, sogar zur Sterilisation der in Schritt
1 gebildeten Lösung.
Dank der Wasserlöslichkeit
des Vorläufers
des vernetzten Kollagen-Peptids, das erfindungsgemäß ausgewählt wurde,
ist es möglich,
die Vorläuferlösungen über Filter zu
filtrieren, deren Porosität
unter 0,8 Mikrometer liegt, vorzugsweise % 0,45 Mirkometer und noch
bevorzugter in der Größenordnung
von 0,2 Mikrometer. Diese Möglichkeit,
durch Filtration eine Sterilisation vornehmen zu können, ist
ein wichtiger Vorteil in industrieller Hinsicht.
-
Schritt
3 besteht im Formen der gefilterten Lösung, um einen vernetzten Gegenstand
mit kontrollierter Form und Größe zu erhalten.
Um Schritt 3 durchzuführen,
kann die gefilterte Lösung
zum Beispiel in vorzugsweise sterile Formen gegossen werden. Gemäß einer
Abwandlung dieses Schritts kann die gefilterte Lösung auch durch Beschichten
auf einen ebenen sterilen Träger
aufgebracht werden. Gemäß einer
weiteren Abwandlung kann das Formen durch Extrudieren der Lösung über eine
Form gewährleistet
werden, die eine für das
vorgesehene Mittel geeignete Form aufweist, zum Beispiel rechteckig.
In diesem letzten Fall muss beim Extrudieren eine gewisse Verfestigung
erfolgen, damit sie möglich
ist.
-
Die
Sättigung
der Lösung
von Schritt 4 (oder physikalische Gelierung), die fakultativ, jedoch
trotzdem bevorzugt ist, besteht darin, die geformte Lösung für mehrere
Stunden, ja sogar mehrere Tage, bei einer Temperatur unter ihrer
Geliertemperatur oder ihrer Temperatur des Übergangs gelförmig/fest
ruhen zu lassen, die im Fall einer wässrigen Kollagen-Peptidlösung zum
Beispiel zwischen 20 °C
und 30 °C
liegen kann.
-
Die
Entfernung des Lösungsmittels,
vorzugsweise Wasser, gemäß Schritt
5 ist ein freiwilliger Abschnitt, der während oder nach der Gelierung
durchgeführt
werden kann, vorzugsweise danach. Es kann sich vorzugsweise um eine
Verdampfung bei einer bestimmten Temperatur in optionaler Gegenwart
von Trockenmitteln handeln.
-
Die
Vernetzung gemäß Schritt
6 erfolgt an geformten Gegenständen,
die gegebenenfalls geliert sind und vorteilhafterweise in trockener
Form vorliegen. Die Vernetzung besteht in der Oxidation des Kollagen-Peptid-Vorläufers vom
Typ Thiol mithilfe eines Oxidationsmittels wie Iod oder H2O2. Nach mehreren
Minuten Kontakt mit dem Oxidationsmittel wird vorzugsweise (Schritt
7) das aufeinanderfolgende Spülen
der so geformten Gegenstände
durchgeführt.
Sie können
anschließend
nach Wunsch in verschiedene Mittel zur Verhinderung von postchirurgischen
Verklebungen umgestaltet werden.
-
Am
Ende dieser Schritte befinden sich die erhaltenen vernetzten Materialien
in einem hydratisierten Zustand. Sie können gegebenenfalls (Schritt
8) mithilfe eines Weichmachers, der üblicherweise für das Formen
von kollagenen Werkstoffen verwendet wird (Glycerin, Polyethylenglycol
mit geringer Molekülmasse)
imprägniert
werden. Der Weichmacher kann auch bereits ab Schritt 1 der Herstellung
der Lösung
zugegeben werden.
-
Schließlich können die
kollagenen Werkstoffe getrocknet werden (Schritt 9), die mit Weichmacher(n) versehen
oder nicht versehen wurden.
-
Obwohl
dieses Verfahren mithilfe steriler Mittel durchgeführt werden
kann und gegebenenfalls einen sterilisierenden Filtrationsschritt
umfassen kann, kann ein zusätzlicher
Sterilisationsschritt (Schritt 10) vorgesehen werden, zum Beispiel
mit β-Strahlung.
-
Die
erhaltenen Gegenstände,
zum Beispiel die Filme, sind im trockenen Zustand über einen
langen Zeitraum stabil und können
nach Rehydration in jeder geeigneten wässrigen Flüssigkeit gehandhabt werden.
-
Gemäß einer
Abwandlung dieses ersten Wegs zur Herstellung des Mittels der Erfindung
kann zum Beispiel ein Verstärkungsmaterial
während
Schritt 3 eingebracht werden, entweder durch Gießen der gefilterten Kollagenlösung auf
das Verstärkungsmaterial,
das sich in der Form befindet, oder auf den Träger, oder durch Aufbringen
des Verstärkungsmaterials
auf die bereits gegossene und gegebenenfalls gelierte Lösung. Im
letzten Fall kann wieder eine zweite Schicht der Kollagenlösung aufgebracht
werden. Je nach der Art und Weise, wie das Verstärkungsmaterial eingebracht
wird, kann so eine Membran gewonnen werden, die eine „Kollagen-Peptid"seite und eine „Verstärkungsmaterial"seite aufweist oder
eine dreischichtige Membran „Kollagen-Peptid/Verstärkungsmaterial/Kollagen-Peptid". Diese Beispiele
sind nicht einschränkend
und es können weitere
Abwandlungen des Verfahrens in Betracht gezogen werden, durch die
Verbundwerkstoffe aus dem zuvor definierten Kollagen-Peptid erhalten
werden können.
-
Gemäß einem
zweiten Weg der Durchführung,
der den nicht festen (flüssigen)
Formen der erfindungsgemä ßen Mittel
entspricht, umfasst das Verfahren die folgenden wesentlichen Schritte:
- 1. Bereitstellen einer bevorzugt wässrigen
Lösung
von vernetzbarem Vorläufer
eines modifizierten Kollagen-Peptids;
- 2. gegebenenfalls Filtrieren dieser Lösung, um Bestandteile mit einer
Größe von 0,8 μm oder größer, bevorzugt
größer oder
gleich 0,45 μm
und noch weiter bevorzugt größer oder
gleich 0,2 μm
zu entfernen;
- 3. gegebenenfalls Konzentrieren der Lösung;
- 4. steriles Konditionieren der Lösung in inerter Atmosphäre.
-
Gemäß einer
bevorzugten Eigenschaft dieses zweiten erfindungsgemäßen Verfahrenswegs
weist die in Schritt 1 gebildete Lösung einen Gehalt an vernetzbarem
Vorläufer
eines modifizierten Kollagen-Peptids auf, der größer oder gleich 1 % ist und
vorzugsweise zwischen 1 und 15 % liegt und einen pH-Wert aufweist
zwischen 4 und 10 und vorzugsweise zwischen 6 und 8.
-
Während Schritt
1 können
der Lösung
biokompatible synthetische oder natürliche Polymere oder kleine
biokompatible Moleküle
zugegeben werden, die die Reologie der Lösung modifizieren können und
die Gelierung des Materials verzögern
(zum Beispiel Harnstoff).
-
In
der Praxis ist die enthaltene Menge der Polymere derart, dass die
Polymere in der vernetzten Endform des Mittels zur Verhinderung
zwischen 1 und 50 % der Gesamttrockenmasse ausmachen und vorzugsweise
zwischen 1 und 20 %. Schritt 1 wird vorzugsweise unter sterilen Bedingungen
unter Verwendung von sterilen Polymeren (Kollagen-Peptid-Vorläufer und
optionale zusätzliche
Polymere) durchgeführt.
-
Schritt
2 zur Filtration ist freiwillig und nicht notwendig, wenn Schritt
1 unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurde. Findet die Filtration
statt, wird sie bei einer Temperatur von über 35 °C und vorzugsweise zwischen
40 und 50 °C
durchgeführt.
-
Schritt
3 zur Konzentration ist freiwillig. Sie erfolgt steril durch teilweises
Verdampfen des Lösungsmittels,
um konzentrierte Lösungen
zu gewinnen, die einen Gehalt an vernetzbarem Vorläufer eines
Kollagen-Peptids von zwischen 5 und 30 % und vorzugsweise zwischen
10 und 20 % aufweisen.
-
Schritt
4 zur Konditionierung wird steril in einer inerten Atmosphäre (Stickstoff
oder Argon) durchgeführt.
Die Lösung
wird in einem Behälter
konditioniert, der die endgültige
Anwendungsform sein kann (Spritze oder Zerstäuber) oder eine Vorratsflasche.
-
Es
ist festzuhalten, dass die flüssige
Form des Mittels bei Raumtemperatur in gelierter Form vorliegen kann.
Dieses Gel, das kennzeichnend für
Kollagenprodukte ist, kann nach Rühren für einige Sekunden bei 40 °C wieder
verflüssigt
werden.
-
Diese
Lösung
kann schließlich
durch Oxidation zu einem chemischen Gel vernetzt werden.
-
Gemäß einem
dritten Weg der Durchführung,
bei dem die beiden ersten verbunden werden, wird die kondi tionierte
Lösung,
die am Ende von Schritt 4 des zweiten Wegs gewonnen wird, auf einem
Träger
angewendet und es wird eine Vernetzung bewirkt, vorzugsweise mithilfe
eines biokompatiblen Oxidationsmittels.
-
Ein
weiterer Gesichtspunkt der Erfindung umfasst die Verwendung der
zuvor beschriebenen Mittel (Film, Flüssigkeit/Gel auf der Grundlage
des Kollagen-Peptids) zur Verhinderung von postoperativen Verklebungen.
-
Die
Mittel der Erfindung weisen den Vorteil auf, dass sie während des
chirurgischen Eingriffs einfach angeordnet werden können. Dies
hängt von
der physikalischen und chemischen Form des Mittels ab (vernetzte
Membran oder nicht-vernetzte flüssige
Form).
-
Die
Membranen können
zu dem Zeitpunkt, wenn sie benötigt
werden, auf die Abmessungen des geschädigten zu schützenden
Bereichs zugeschnitten werden. Die Membranen werden zwischen den
biologischen Geweben angewendet, die chirurgische Verklebungen bilden
könnten.
Sie können
in trockener Form angeordnet oder kurz vor der Anordnung in physiologischer
Kochsalzlösung
hydratisiert werden. Durch Nähte oder
durch vorheriges Aufbringen eines Klebstoffs für chirurgische Zwecke (auf
der Grundlage von Fibrin oder kollagenen Werkstoffen) kann sichergestellt
werden, dass sie halten.
-
Gemäß einer
Abwandlung der Verwendung kann die Membran nach einem herkömmlichen
chirurgischen Verfahren der Laparoskopie zusammengerollt und mithilfe
eines Trokars eingebracht werden.
-
Was
die nicht festen Mittel (Flüssigkeiten/Gele)
zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen betrifft, können sie
insbesondere auf zwei Arten angewendet werden, die im Folgenden
definiert sind.
-
Gemäß einer
ersten Anwendungsweise kann die flüssige Form mithilfe einer Spritze,
eines Zerstäubers
oder jeder anderen Anwendungsvorrichtung unmittelbar auf die beschädigten Gewebe
aufgebracht werden. Je nach Zusammensetzung der Zubereitung und
Anwendungsweise kann es notwendig sein, die Lösung für einige Sekunden vor der Anwendung
auf 40 °C
zu erhitzen. Die Vernetzung wird dann in situ in einem zweiten Schritt
durch Anwendung eines oxidierenden chemischen Wirkstoffs gewährleistet,
der für
chirurgische Zwecke akzeptabel ist, zum Beispiel eine verdünnte Wasserstoffperoxidlösung. Gemäß der Abwandlungen dieser
Anwendungsweise können
der Sauerstoff der Luft, UV-Strahlen
oder andere Energiequellen verwendet werden, die eine Oxidation
bewirken können.
-
Gemäß einer
zweiten Anwendungsweise wird die flüssige Form (Vorläufer) des
nicht-vernetzten Kollagen-Peptids kurz vor der Anwendung mithilfe
einer geeigneten Vorrichtung (Doppelspritze, die mit einem Mischkopf
versehen ist, Doppelzerstäuber
mit Mischdüse
oder anderere Mischvorrichtung) mit einem oxidierenden chemischen
Wirkstoff vermischt.
-
Diese
beiden Anwendungsweisen können
auch derart angepasst werden, dass sie bei der laparoskopischen
Chirurgie verwendet werden können.
-
Allgemeiner
ausgedrückt
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen,
dadurch gekennzeichnet, dass man die konditionierte Lösung auf
einen Träger
(biologische Gewebe) aufträgt
(z.B. Einspritzen oder Zerstäuben)
und eine Vernetzung bewirkt, vorzugsweise durch ein biokompatibles
Oxidationsmittel.
-
Aus
der vorstehenden Beschreibung folgt, dass die erfindungsgemäßen Mittel
zur Verhinderung von post-chirurgischen
Verklebungen zum Beispiel sind:
- • entweder
feste Mittel wie Filme oder Membranen, die gegebenenfalls zusammengesetzt
sind und/oder aus mehreren Schichten bestehen, die im Wesentlichen
das Kollagen-Peptid enthalten, das wenigstens teilweise vernetzt
ist, so wie oben definiert,
- • oder
nicht feste Mittel (Flüssigkeiten/Gele),
die denselben kollagenen Werkstoff in nicht-vernetzter Form umfassen,
der am lebenden Organismus angewendet werden und vernetzen soll,
um in situ am Wirkort (biologische Gewebe) die festen Mittel zur
Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zu bilden.
-
Durch
die Beschaffenheit ihres wesentlichen Bestandteils weisen diese
Mittel in der vernetzten Form ausgezeichnete Eigenschaften hinsichtlich
der mechanischen Festigkeit, als physikalische Sperre gegen Verklebungen,
hinsichtlich der Biokompatibilität,
der Bioresorbierbarkeit, der Ungiftigkeit und der Herstellung industriell
herstellbarer Zubereitungen auf, wobei diese Eigenschaften denen
der Mittel nach dem Stand der Technik ganz und gar überlegen
sind.
-
Durch
die folgenden Beispiele kann die Erfindung in all ihren Gesichtspunkten
verstanden werden und können
alle ihre Vorteile und Abwandlungen der Anwendung gezeigt werden.
-
BEISPIELE
-
TEIL 1 : SYNTHESE DER
MITTEL
-
BEISPIEL 1: SYNTHESE EINES
KOLLAGEN-PEPTIDS (FORM B), DESSEN CARBONSÄUREN DURCH CYSTEIN-ETHYLESTER
SUBSTITUIERT SIND (SUBSTITUTIONSGRAD 7 MOLPROZENT DER AMINOSÄUREN).
-
1) Schritt I: Kopplung
(Herstellung von Form A)
-
25
g Atelokollagen (Typ I + III, aus Kalbshaut gewonnen, 1,3 mmol COOH/g)
werden in 2,5 1 Wasser gegeben und die Temperatur des Mediums wird
unter Rühren
auf 50 °C
erhöht.
Die so gewonnene 1 % m/v Lösung
wird über
0,22 μm
filtriert.
-
Sobald
die Temperatur auf 30 °C
gesenkt ist, werden 46,5 g Cystindiethylester zugegeben und der pH-Wert
wird auf 4,2 eingestellt. Dann werden 12 g 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid zugegeben,
und man lässt
die Reaktion für
2 h bei 30 °C
unter Rühren
ablaufen. Das Reaktionsmedium wird auf 5 m/v konzentriert und gegen
Wasser dialysiert, um überschüssige Reaktionspartner
und die Nebenprodukte der Reaktion zu entfernen.
-
Das
gewonnene Produkt ist ein stabiles Synthesezwischenprodukt. Es handelt
sich um ein Kollagen-Peptid (Form A), bei dem ein Teil der Asparaginsäuren und
Glutaminsäuren
durch Cystindiethylester ersetzt ist. Es kann durch Gefriertrocknung
isoliert oder reduziert werden, damit das entsprechende Thiolkollagen
(Form B) entsteht.
-
2) Schritt II: Reduktion
(Herstellung von Form B):
-
Zu
dem modifizierten Kollagen-Peptid in Lösung in Wasser bei 5 % m/v,
das in Schritt I gewonnen wurde, werden 7,6 g Glycin, 5,8 g 1,4-Dithiothreitol
und die Menge 4 N NaOH zugegeben, die ausreicht, um einen pH-Wert von 9,0 zu erreichen.
Das Reaktionsmedium wird drei Stunden lang bei 35 °C gerührt. In
diesem Abschnitt wird die Lösung
mit 6 N HCl auf pH 2 sauer eingestellt, gegen 0,012 N HCl dialysiert,
um alle Reaktionspartner und Nebenprodukte der Reaktion zu entfernen
und anschließend über 0,22 μm filtriert.
Das so gereinigte Produkt wird durch Gefriertrocknung isoliert.
-
Der
Substitutionsgrad wird durch Bestimmung mit 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB)
gemessen, einem Reaktionspartner, der spezifisch für Thiol-Funktionen
ist. Diese Bestimmung ist beschrieben in: "Ellman G. L., Tissue sulfhydryl groups,
Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82, 70–77".
-
[SH]:
0,706 mmol/g des Trockenguts, d.h. 7 Molprozent substituierte Aminosäuren.
-
Die
gesamte Synthese kann steril erfolgen, sodass das Produkt am Ende
in Form eines sterilen Lyophilisats gewonnen wird.
-
BEISPIEL 2: HERSTELLUNG
EINES FILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN ZUR VERHINDERUNG VON POSTOPERATIVEN
VERKLEBUNGEN, MIT IOD VERNETZT.
-
Schritt 1:
-
Eine
Lösung
mit 20 g/l Kollagen-Peptid-Vorläufer
gemäß Beispiel
1 wird durch Auflösen
des Lyophilisats in sterilem Wasser hergestellt. Bei diesem Beispiel
werden 2,0 g Lyophilisat in 98 g sterilem Wasser aufgelöst. Die
Lösung
wird in einem geschlossenen Behälter
für 15
min bei 40 °C
gerührt,
um die vollständige Auflösung zu
erreichen. Der pH-Wert der Lösung
wird mit 1 N Soda bei 25 °C
auf 6,5 eingestellt. Die Lösung wird
für 10
min bei 40 °C
erneut gerührt.
-
Schritt 2:
-
Die
Lösung
wird bei 40 °C über Membranen
mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert,
anschließend über Membranen
mit einer Porengröße von 0,2 μm. Die letzte
Filtration erfolgt über
sterilen Formen (es können Petrischalen
aus Polystyrol verwendet werden).
-
Schritt 3:
-
40,0
g filtrierte Lösung
werden in zwei Formen von 12 cm × 12 cm gegossen. Die Formen
werden wieder geschlossen.
-
Schritt 4:
-
Die
Sättigung
der Lösung,
die in einer physikalische Gelierung zum Ausdruck kommt, erfolgt über 24 h
bei einer Temperatur von 16 °C ± 1. Diese
Temperatur liegt notwendigerweise unter der Temperatur des Gel-Sol-Übergangs.
Die Sättigung
erfolgt in einem Raum mit Temperaturregelung, wobei sich die Formen
auf einer waagerechten Platte befinden.
-
Schritt 5:
-
Nach
24 h werden die Deckel von den Formen abgenommen, und es erfolgt über 24 h
das Verdampfen der gelierten Lösungen
bei der gleichen Temperatur in einem geschlossenen Raum in Gegenwart
von Trocknungsmitteln (üblicherweise
Sodatabletten). Nach 24 h sind die gewonnenen Filme trocken, klar
und glatt.
-
Schritt 6:
-
Die
Vernetzung der trockenen Filme erfolgt bei 20 °C, indem 30 g Iodalkohollösung dazugegossen werden,
die durch Auflösen
von 1,0 g Iod in 100 ml Ethanol gewonnen wird, und 30 g Wasser ist
notwendig, um einen vernetzten Film zu erhalten. Der vernetzte Film
wird aus der Iodlösung
entnommen.
-
Schritt 7:
-
Es
wird nacheinander mit 80 %igen Ethanollösungen und anschließend mit
Phosphatpuffer bis zur vollständigen
Entfärbung
des Films gespült.
-
Alle
verwendeten Lösungen
sind steril.
-
Schritt 8:
-
Bei
diesem Beispiel erfolgt kein Imprägnierungsschritt mit einem
Weichmacher.
-
Schritt 9:
-
Der
Film wird anschließend
unter einer Laminarbox über
24 h trocknen gelassen. Der gewonnene getrocknete Film enthält einen
Restwassergehalt von etwa 10 %.
-
Schritt 10:
-
Der
Film wird anschließend
einfach auf die der Anwendung entsprechenden Abmessungen zugeschnitten.
-
Schritt 11:
-
Jedes
Stück wird
einzeln in einen Beutel konditioniert, damit es mit R-Strahlung
sterilisiert werden kann.
-
Die
gewonnenen Filme sind bei Raumtemperatur mehrere Monate stabil.
Nach 24 h in Wasser oder einem Phosphatpuffer bleiben sie stabil
und können
gehandhabt werden.
-
BEISPIEL 3: HERSTELLUNG
EINES FILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN ZUR VERHINDERUNG VON POSTOPERATIVEN
VERKLEBUNGEN, MIT WASSERSTOFFPEROXID VERNETZT.
-
Das
Verfahren ist das Gleiche, ungeachtet der Art des Ausgangsstoffs
(Kollagen) als auch des Pfropfgrads des Kollagen-Peptid-Vorläufers. Schritt
1 bis 5 von Beispiel 3 bis zur Gewinnung der trockenen nicht-vernetzten Filme
werden wiederholt.
-
Schritt 6':
-
Die
Vernetzung der trockenen Filme erfolgt bei 20 °C, indem 30 g 0,3 %ige Wasserstoffperoxidlösung in
eine wässrige
0,1 m-Ammoniumacetatlösung
gegossen werden.
-
Schritt 7:
-
Der
vernetzte Film wird herausgenommen und nacheinander mit 30 g Phosphatpuffer
mit pH 7,4 und 30 g Wasser gespült.
-
Alle
verwendeten Lösungen
sind steril.
-
Schritt 8:
-
Bei
diesem Beispiel erfolgt kein Imprägnierungsschritt mit einem
Weichmacher.
-
Schritt 9:
-
Der
Film wird anschließend
unter einer Laminarbox über
24 h trocknen gelassen. Der gewonnene getrocknete Film enthält einen
Restwassergehalt von etwa 10 %.
-
Schritt 10:
-
Der
Film wird anschließend
einfach auf die der Anwendung entsprechenden Abmessungen zugeschnitten.
-
Schritt 11:
-
Jedes
Stück wird
einzeln in einen Beutel konditioniert, damit es mit Betastrahlen
sterilisiert werden kann. Die gewonnenen Filme sind bei Raumtemperatur
stabil. Nach 24 h in Wasser oder einem Phosphatpuffer bleiben sie
stabil und können
gehandhabt werden.
-
BEISPIEL 4: ZUGEIGENSCHAFTEN
DER FILME, DIE GEMÄSS
BEISPIEL 2 GEWONNEN WURDEN.
-
Die
Messungen der mechanischen Eigenschaften der vernetzten Kollagenfilme
werden mit einem Universalprüfgerät DY34 von
Adamel Lhomargy durchgeführt.
Die Filme werden bei Raumtemperatur in einem physiologischen Phosphatpuffer
(PBS, pH = 7,4) für
2 h hydratisiert. Anschließend
werden sie mit einem sehr scharfen Stanzwerkzeug in Bänder mit
den Maßen
4 mm mal 30 mm geschnitten. Die Dicke wird an den hydratisierten
Prüfkörpern gemessen.
Die Prüfkörper werden
an einem Papprahmen befestigt, der dabei hilft, sie in den Spannbacken
anzuordnen. Der Filmprüfkörper bleibt
hydratisiert. Der Rahmen wird kurz vor dem Zugversuch geschnitten,
der bei einer gleichmäßigen Geschwindigkeit
von 2 mm/min abläuft.
-
Der
Anfangselastizitätsmodul
sowie die Bruchspannung werden anhand der Spannungs-Dehnungskurve
unter Verwendung der Abschnitte der hydratisierten Prüfkörper berechnet.
-
Die
Zugeigenschaften der Filme, die gemäß dem Verfahren gewonnen wurden,
das unter Beispiel 3 beschrieben ist, hängen vom Ausgangsstoff (Kollagen
oder Gelatine) und dem Pfropfgrad der Kollagen-Peptid-Vorläufer ab.
-
Die
folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften eines Films, der gemäß Beispiel
2 gewonnen wurde.
-
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BEISPIEL 5: HERSTELLUNG
EINES VERNETZTEN VERBUNDFILMS AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN UND SYTHETISCHEM
GEWEBE ZUR VERHINDERUNG VON POSTOPERATIVEN VERKLEBUNGEN.
-
Das
Verfahren zur Filmherstellung ist das Gleiche, ungeachtet der Art
des Ausgangsstoffs (Kollagen) als auch des Pfropfgrads des Kollagen-Peptid-Vorläufers. Schritt
1 und 2 stimmen genau mit denen überein, die
bei Beispiel 3 beschrieben sind.
-
Schritt
3 ist folgendermaßen
abgewandelt.
-
Ein
synthetisches Gewebe (beispielsweise im Handel erhältliches
biologisch abbaubares Polyestergewebe, mit den Maßen 10 × 10 cm2 und einer Dicke von etwa 200 μm) wird in
jeder Form (12 × 12
cm2) angeordnet.
-
40,0
g filtrierte Lösung
werden auf das Gewebe gegossen. Die Formen werden wieder geschlossen.
-
Schritt
4 und 5 stimmen genau mit denen überein,
die bei Beispiel 3 beschrieben sind.
-
Die
Oxidation kann mit einer Iodlösung
oder Wasserstoffperoxid erfolgen. Schritt 6 bis 11 stimmen je nach
gewähltem
Verfahren mit denen überein,
die bei Beispiel 3 oder Beispiel 4 beschrieben sind.
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Die
gewonnenen Filme sind bei Raumtemperatur stabil. Nach 24 h in Wasser
oder einem Phosphatpuffer bleiben sie stabil und können gehandhabt
werden. Sie weisen mechanische Eigenschaften auf, die denen der
nicht-verstärkten Membranen überlegen
sind. Sie weisen außerdem
eine sehr gute Reißfestigkeit
auf, durch den sie sehr leicht genäht werden können. Sie können zusammengerollt werden,
wodurch sie in Trokare eingeführt
werden können.
-
BEISPIEL 6: HERSTELLUNG
EINER FLÜSSIGEN
FORM AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN ZUR VERHINDERUNG POSTOPERATIVER
VERKLEBUNGEN, DAS IN SITU VERNETZBAR IST.
-
Das
Verfahren zur Herstellung der flüssigen
Form ist das Gleiche, ungeachtet der Art des Ausgangsstoffs (Kollagen)
als auch des Pfropfgrads des Kollagen-Peptid-Vorläufers.
-
Bei
diesem Beispiel liegt der Kollagen-Peptid-Vorläufer (Beispiel 1) in Form eines
sterilen Lyophilisats vor.
-
Schritt 1:
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Eine
Lösung
mit 85 g/l modifiziertem Kollagen wird durch Auflösen des
Lyophilisats (Beispiel 1) unter sterilen Bedingungen in sterilem
Wasser hergestellt. Bei diesem Beispiel werden 1,50 g Lyophilisat
mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 11 % in 8,3 g sterilem Wasser
aufgelöst
(vorher mit sterilem Stickstoffstrom entgast). Die Lösung wird
in einem geschlossenen Behälter
für 15
min bei 45 °C
gerührt,
um die vollständige
Auflösung zu
erreichen. Der pH-Wert der Lösung
wird mit 5,9 ml 0,1 N Soda auf 7 eingestellt, die durch Filtration über 0,2 Mikrometer
sterilisiert sind.
-
Schritt 2 und 3:
-
Bei
diesem Beispiel finden keine Filtrations- und Konzentrationsschritte statt, da
das Ausgangslyophilisat steril ist und mit der angestrebten Endkonzentration
unter sterilen Bedingungen in Lösung
gebracht wird.
-
Schritt 4:
-
Die
Lösung
wird in hermetisch verschlossene sterile Spritzen je 1 ml aufgeteilt.
-
BEISPIEL 7:
-
Es
wird alles wiederholt, mit dem Unterschied, dass die Lösung bei
Schritt 4 nicht in Spritzen, sondern in einer Zerstäuberflasche
steril konditioniert wird.
-
TEIL II: BIOLOGISCHE BEWERTUNG
BEISPIEL 8: ERPROBUNG EINES ERFINDUNGSGEMÄßEN KOLLAGENFILMS, WIE ER IN
BEISPIEL 3 GEWONNEN WIRD.
-
Das
Ziel dieser Untersuchung besteht darin, die Eigenschaften eines
erfindungsgemäßen Kollagenfilms,
so wie er in Beispiel 3 gewonnen wird, hinsichtlich der Verhinderung
von post-chirurgischen Verklebungen zu bewerten.
-
Diese
Untersuchung erfolgt an weiblichen Ratten, an einer peritonealen
Stelle, über
einen Beobachtungszeitraum von mindestens 2 Wochen.
-
Die
Wirksamkeit des Produkts wird durch makroskopische Beobachtung möglicher
Verklebungen an den Anwendungsstellen bewertet. Es werden untersucht:
die Häufigkeit,
Größe und Schwere
der ausgebildeten Verklebungen.
-
Im
Bereich der Gebärmutterhörner und
eines parietalen Fensters werden bei weiblichen Ratten traumatische
Verletzungen der peritonealen Serosa erzeugt.
-
Der
Film wird derart angeordnet, dass die erzeugten parietalen und Gebärmutterverletzungen über einen
Zeitraum von mindestens 2 Wochen getrennt werden. Bei jeder weiblichen
Ratte werden eine Vergleichsstelle und eine Teststelle angelegt.
-
Nach
den mindestens 2 Wochen werden die Tiere durch Einspritzen einer
tödlichen
Barbituratdosis geopfert.
-
Die
Schwere der Verklebungen wird mit einer Einteilung von 0 bis 3 bewertet:
- – 0:
keine Verklebungen,
- – 1:
unauffällige
Verklebungen, die durch stumpfe Durchtrennung gelöst werden
können,
- – 2:
mäßige Verklebungen,
die eine teilweise scharfe Durchtrennung erfordern,
- – 3:
ernsthafte Verklebungen, die nicht ohne umfangreiche scharfe Durchtrennung
gelöst
werden können.
-
Um
die Ergebnisse auszudrücken,
werden die Einteilungen der 10 Vergleichsstellen zusammengezählt und
wird anschließend
der Durchschnitt ermittelt. Dieser Durchschnittswert entspricht
damit der mittleren Schwere der Verklebungen.
-
Bei
den Vergleichsstellen beträgt
der erhaltene Durchschnitt 2,2. Außerdem weisen alle untersuchten Stellen
Verklebungen auf 95 % der Fläche
der Verletzung auf.
-
Bei
den Teststellen beträgt
die mittlere Einteilung 0,22.
-
Es
ist festzuhalten, dass nur 3 Stellen von 10 untersuchten Stellen
Verklebungen aufwiesen und dass die Verklebungen nur auf etwa 10
% der Fläche
der Verletzung vorhanden waren.
-
Schlussfolgernd
wird eine Verringerung der Stärke
der Verklebungen um 90 % erhalten. Sowie eine sehr starke Verringerung
der Anzahl und der Fläche
dieser Verklebungen.
-
BEISPIEL 9: ERPROBUNG
EINES ERFINDUNGSGEMÄßEN FILMS
AUS MODIFIZIERTEM KOLLAGEN/GEWEBE, WIE ER IN BEISPIEL 5 GEWONNEN
WIRD.
-
Das
Ziel dieser Untersuchung besteht darin, die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Films
aus modifiziertem Kollagen/Gewebe, der in Beispiel 5 beschrieben
ist, hinsichtlich der Verhinderung von post-chirurgischen Verklebungen zu bewerten.
-
Diese
Untersuchung erfolgt an weiblichen Ratten, an einer peritonealen
Stelle, über
einen Beobachtungszeitraum von mindestens 2 Wochen.
-
Die
Wirksamkeit des Produkts wird durch makroskopische Beobachtung möglicher
Verklebungen an den Anwendungsstellen bewertet. Es werden untersucht:
die Häufigkeit,
Größe und Schwere
der ausgebildeten Verklebungen.
-
Im
Bereich der Gebärmutterhörner und
eines parietalen Fensters werden bei weiblichen Ratten traumatische
Verletzungen der peritonealen Serosa erzeugt. Der Film aus modifiziertem
Kollagen/Gewebe wird dann derart angeordnet, dass die erzeugten
parietalen und Gebärmutterverletzungen über einen
Zeitraum von mindestens 2 Wochen getrennt werden. Bei jeder weiblichen
Ratte werden eine Vergleichsstelle und eine Teststelle angelegt.
-
Nach
den mindestens 2 Wochen werden die Tiere durch Einspritzen einer
tödlichen
Barbituratdosis geopfert.
-
Die
Schwere der Verklebungen wird mit einer Einteilung von 0 bis 3 bewertet:
- – 0:
keine Verklebungen,
- – 1:
unauffällige
Verklebungen, die durch stumpfe Durchtrennung gelöst werden
können,
- – 2:
mäßige Verklebungen,
die eine teilweise scharfe Durchtrennung erfordern,
- 3: ernsthafte Verklebungen, die nicht ohne umfangreiche scharfe
Durchtrennung gelöst
werden können.
-
Um
die Ergebnisse auszudrücken,
werden die Einteilungen der 10 Vergleichsstellen zusammengezählt und
wird anschließend
der Durchschnitt ermittelt. Dieser Durchschnittswert entspricht
damit der mittleren Schwere der Verklebungen.
-
Bei
den Vergleichsstellen beträgt
der erhaltene Durchschnitt 2,2. Außerdem weisen alle untersuchten Stellen
Verklebungen auf 0 % der Fläche
der Verletzung auf.
-
Bei
den Teststellen beträgt
die mittlere Einteilung 0,1.
-
Es
ist festzuhalten, dass nur 3 Stellen von 20 untersuchten Stellen
Verklebungen aufwiesen und dass die Verklebungen nur auf etwa 10
% der Fläche
der Verletzung vorhanden waren.
-
Schlussfolgernd
wird eine Verringerung der Stärke
der Verklebungen um 96 % erhalten. Sowie eine sehr starke Verringerung
der Fläche
der vorhandenen Verklebungen.
-
BEISPIEL 10: ERPROBUNG
DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN
FLÜSSIGEN
FORM, WIE SIE IN BEISPIEL 6 GEWONNEN WIRD
-
Das
Ziel dieser Untersuchung besteht darin, die Eigenschaften der erfindungsgemäßen flüssigen Form,
die in Beispiel 6 beschrieben ist, hinsichtlich der Verhinderung
von post-chirurgischen Verklebungen zu bewerten.
-
Diese
Untersuchung erfolgt an weiblichen Ratten, an einer peritonealen
Stelle, über
einen Beobachtungszeitraum von mindestens 2 Wochen.
-
Die
Wirksamkeit des Produkts wird durch makroskopische Beobachtung möglicher
Verklebungen an den Anwendungsstellen bewertet. Es werden untersucht:
die Häufigkeit,
Größe und Schwere
der ausgebildeten Verklebungen.
-
Im
Bereich der Gebärmutterhörner und
eines parietalen Fensters werden bei weiblichen Ratten traumatische
Verletzungen der peritonealen Serosa erzeugt. Vor Verwendung der
Lösung
werden die Spritzen im Wasserbad auf 37 °C erhitzt, um wieder eine zähflüssige Lösung zu
gewinnen. Diese Lösung
kann auf einem Träger
angewendet werden. Durch die Zähflüssigkeit
dieser Lösung
kann sie eine Ablagerung bilden, wobei gleichzeitig eine ausreichende
Dicke gewährleistet
ist. 300 μl
dieser Lösung
werden dann derart angeordnet, dass die erzeugten parietalen und
Gebärmutterverletzungen über einen
Zeitraum von mindestens 2 Wochen getrennt werden. Die Vernetzung
der Ablagerung erfolgt durch Zerstäuben einer 1 %igen Wasserstoffperoxidlösung. Die
Gelierung der Ablagerung erfolgt beinahe sofort. Es wird ein homogenes
Kollagenhydrogel erhalten. Bei jeder weibli chen Ratte werden eine
Vergleichsstelle und eine Teststelle angelegt.
-
Nach
den mindestens 2 Wochen werden die Tiere durch Einspritzen einer
tödlichen
Barbituratdosis geopfert.
-
Die
Schwere der Verklebungen wird mit einer Einteilung von 0 bis 3 bewertet:
- – 0:
keine Verklebungen,
- – 1:
unauffällige
Verklebungen, die durch stumpfe Durchtrennung gelöst werden
können,
- – 2:
mäßige Verklebungen,
die eine teilweise scharfe Durchtrennung erfordern,
- – 3:
ernsthafte Verklebungen, die nicht ohne umfangreiche scharfe Durchtrennung
gelöst
werden können.
-
Um
die Ergebnisse auszudrücken,
werden die Einteilungen der 10 Vergleichsstellen zusammengezählt und
wird anschließend
der Durchschnitt ermittelt. Dieser Durchschnittswert entspricht
damit der mittleren Schwere der Verklebungen.
-
Bei
den Vergleichsstellen beträgt
der erhaltene Durchschnitt 2,2. Außerdem weisen alle untersuchten Stellen
Verklebungen auf 90 % der Fläche
der Verletzung auf.
-
Bei
den Teststellen (300 μl
Kollagenhydrogel) beträgt
die mittlere Einteilung 0,7.
-
Es
ist festzuhalten, dass nur 7 Stellen von 10 untersuchten Stellen
Verklebungen aufwiesen und dass die Verklebungen nur auf etwa 30
% der Fläche
der Verletzung vorhanden waren.
-
Schlußfolgernd
wird eine Verringerung der Stärke
der Verklebungen um 70 % erhalten. Sowie eine sehr starke Verringerung
der Fläche
der vorhandenen Verklebungen.