DE69728961T3

DE69728961T3 - Klebstoffzusammensetzung auf der basis von hochmolekularem polyaldehyd und verfahren zur vernetzung von kollagen

Info

Publication number: DE69728961T3
Application number: DE69728961T
Authority: DE
Inventors: Michel Tardy; Herve Volckmann; Jerôme Tiollier; Philippe Gravagna; Jean-Louis Tayot
Original assignee: Imedex Biomateriaux
Current assignee: Imedex Biomateriaux
Priority date: 1996-10-07
Filing date: 1997-10-07
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2017-10-08
Also published as: DE69728961T2; BR9706817A; ATE265868T1; JP2000503883A; EP0862468B1; ES2221070T3; FR2754268B1; ES2221070T5; AR009960A1; AU721494B2; FR2754268A1; NZ330572A; WO1998015299A1; DE69728961D1; JP3238711B2; EP0862468B2; AU4626997A; US6165488A; EP0862468A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der biologischen Klebstoffe, die biologisch abbaubar, nichttoxisch und für eine chirurgische oder therapeutische Verwendung vorgesehen sind.
Insbesondere betrifft sie eine Klebstoffzusammensetzung, die biologisch verträglich, bioresorbierbar, nichttoxisch und auf der Basis von mindestens einem makromolekularen Polyaldehyd ist nach Anspruch 1 oder 2.
Sie ist weiterhin auf ein Verfahren zur Vernetzung von solubilisiertem Collagen gerichtet, das es erlaubt, einen Klebstoff zu erhalten, der vorgesehen ist, schnell auf ein Gewebe und/oder Biomaterial aufgebracht zu werden.
Dabei kann die Vernetzung des Collagens entweder auf chemischem Wege mit Gerbstoffen wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd, mit Diisocyanaten bzw. anderen Recktanten oder durch physikalische Mittel wie γ-, β- oder Ultraviolettstrahlung durchgeführt werden.
Jedoch ist letzteres Verfahren aufwendig und mitunter schwierig durchzuführen, wobei es außer den Vernetzungsvorgängen auch Bindungsspaltungen verursacht.
Was den chemischen Weg betrifft, so ist die Behandlung mit Glutaraldehyd (oder Formaldehyd) die am häufigsten angewendete, um das Collagen zu vernetzen, und besteht darin, in eine Glutaraldehydlösung Collagenpulver, -filme und -gele oder mehr oder weniger konzentrierte Collagenlösungen einzutauchen. Sie hat jedoch je nach den Anwendungen eine gewisse Anzahl von Nachteilen. Die Einführung von Glutaraldehyd in eine wässrige Collagenstruktur kann insbesondere durch Diffusion durch das gebildete Gel hindurch zu einer schnellen Ausfällung des überschüssigen Glutaraldehyds führen.
In der Chirurgie oder Therapie ist dies der Ausgangspunkt toxischer Reaktionen, die Gewebenekrosen oder weniger schwere Reaktionen verursachen, die zu einer schlechten Vernarbung der Wunde oder zu deren Verlangsamung führen. Dies ist der Fall bei dem Collagenklebstoff, der zurzeit auf dem Markt zur Verfügung steht.
Bei diesem als GRF bezeichneten Klebstoff wird die Vernetzung der Gelatine durch Formaldehyd in Gegenwart von Resorcin durchgeführt, wobei letzteres im Wesentlichen dazu dient, die Auflösung des Klebstoffs zu verringern. Dieser Klebstoff wurde in den 60er bis 80er Jahren des vergangenen Jahrhunderts verwendet, wobei zurzeit sein Einsatz in der Chirurgie auf einige seltene Fälle (Aortendissektion) beschränkt ist, worin der Vorteil die Gefahren aufgrund der Möglichkeit der Ausfällung des Formaldehyds und von dessen Toxizität überwiegt. Dabei ist eine überschüssige Formaldehydmenge erforderlich, um eine schnelle Vernetzung des Collagengels und eine gute Haftung an dem umgebenden Gewebe zu erhalten. Dieser Formaldehydüberschuss ist für die schlechte biologische Verträglichkeit des Klebstoffs GRF verantwortlich. Dessen Anwendung kann daher heute nicht auf die Heilung chirurgischer oder chronischer Wunden, den Schutz bzw. die Abdichtung von Nähten oder auch die Abgabe von Medikamenten ausgedehnt werden.
Jüngst ist eine Verbesserung vorgeschlagen worden, wobei die Viskosität eines Mediums, das Formaldehyd, Glutaraldehyd oder ein anderes Dialdehyd enthält, durch Zugabe eines Geliermittels wie Agarose erhöht wird (Patentanmeldung von IZORET, G., WO 96/14368 ). Jedoch beseitigt das nicht die Gefahr der Diffusion des Vernetzungsmittels, selbst wenn diese verlangsamt wird.
Weiterhin kann die biologische Verträglichkeit des Collagens, das durch toxische chemische Mittel vernetzt worden ist, verbessert werden, indem die Menge an verwendeten Vernetzungsmitteln bis auf ein Minimum verringert wird. Dies wird in vorgeformten Materialien realisiert, die für eine Implantation vorgesehen sind, wobei die Reaktionszeit vom Hersteller des Materials so sehr wie nötig verlängert werden kann. In diesem Fall wird eine geringe Menge an Vernetzungsmittel eingesetzt und das vernetzte Material am Ende des Herstellungsverfahrens sorgfältig gewaschen, um jeden Überschuss an Recktanten zu entfernen.
Das fertige vernetzte Material, das vom Chirurgen verwendet wird, ist in diesem Fall ein Feststoff oder eine Suspension aus Collagenfasern, wobei jedoch diese Materialien am umgebenden Gewebe nicht anhaften.
Die Herstellung eines biologischen Klebstoffs erfordert daher oft das Vermischen von zwei verschiedenen Lösungen, die eine schnelle Vernetzung des Collagens, der Gelatine oder eines anderen makromolekularen oder reaktiven Moleküls erlauben durch den Chirurgen in Berührung mit dem zu behandelnden biologischen Gewebe.
Weiterhin ist beispielsweise der Klebstoff bekannt, der von der Gesellschaft IMMUNO unter der Bezeichnung "TISSUCOL" (TISSEEL), danach von BEHRINGWERKE unter der Bezeichnung "BERIPLAST" und von BIOTRANSFUSION unter der Bezeichnung "BIOCOL" vertrieben wird. Dabei handelt es sich um eine konzentrierte Fibrinogenlösung (70 bis 140 mg/ml), die den Faktor XIII und Fibronectin enthält, dessen Polymerisation von einer Thrombinlösung (4 bis 400 Internationale Einheiten) in einer zubereiteten und sofort zu verabreichenden Mischung ausgelöst wird. Das Fibrinogen polymerisiert anschließend zu Fibrin, wobei sich ein Gerinnungsmittel bildet, das die Haftung der miteinander in Berührung gebrachten Gewebe sicherstellt.
Die von diesem Mittel und seinen Komponenten verursachten großen Schwierigkeiten und Probleme sind einerseits die fehlende vollständige und reproduzierbare Charakterisierung der Menge einer jeden Komponente der Fibrinogenlösung (Faktor XIII, Fibronectin und Aprotinin) und andererseits die Schwierigkeit der viralen Inaktivierung eines solchen Mittels gegenüber nicht behüllten Viren wie auf außergewöhnlichem Wege übertragbare Agentien. Dies hat zu einer Beschränkung der Möglichkeiten des Einsatzes solcher Produkte im großen Maßstab geführt.
Von TARDY et al. ( französische Patentanmeldung Nr. 9 400 715 ) ist ein biologischer Collagenklebstoff beschrieben worden, der mittels eines Kits hergestellt werden kann, der beispielsweise aus zwei Spritzen besteht, die eine Lösung von Collagen (oder Gelatine), das/die von Natriumperiodat oxidiert und bei einem sauren pH-Wert in gefrorener Form bei einer Temperatur von unter 0°C, vorzugsweise von etwa –20°C, konserviert wird, bzw. eine alkalische wässrige Lösung enthalten. Das Vermischen ihrer Inhalte wird von einem mit den beiden Spritzen verbundenen Mischer nach Erwärmung des Gels aus oxidiertem Collagen (oder oxidierter Gelatine) auf etwa 40°C sichergestellt, um einen biologisch verträglichen Klebstoff zu erhalten, dessen Vernetzung innerhalb von zwei bis drei Minuten beendet ist.
Die Eigenschaften dieses Klebstoffs sind für verschiedene Zwecke interessant, wobei jedoch das Hauptproblem dieser Technologie in der Notwendigkeit einer komplexen Kühlkette für den Vertrieb dieses Produktes besteht, wodurch die Kosten erhöht werden und die Verwendung in Einrichtungen, die nicht mit einem Tiefkühlschrank ausgestattet sind, erschwert wird.
Weiterhin ist die Verwendung von reaktiven Polyethylenglykolderivaten vorgeschlagen worden, um biologische Klebstoffe auf der Basis von Albumin oder Collagen zu bilden (Patent von BARROWS et al. WO 96/03159 A1 und SIERRA, D. "Tissue Sealants Meeting", La Jolla, 1996). Jedoch sind diese Recktanten in Wasser wenig stabil und können bestimmte Konservierungsformen erfordern. Der optimale pH-Wert ihrer Aktivität ist alkalisch und daher nicht physiologisch. Weiterhin ist die Resorptionszeit dieser Produkte sehr lang, länger als drei bis vier Wochen, was für bestimmte Verwendungen ein großer Nachteil ist.
Die unbestreitbare Notwendigkeit, schnell und mitunter fast sofort die Verfestigung einer fluiden Lösung zu erreichen, um eine starke Haftung zu erhalten, kann den Einsatz eines Überschusses an chemischen Vernetzungsmitteln erforderlich machen, die für die Toxizität und mäßige biologische Gewebeverträglichkeit verantwortlich sind.
Gewebeklebstoffe auf der Basis von kommerzieller Gelatine und Glutaraldehyd oder oxidierter Stärke sind kürzlich in dem Dokument WO 97/29715 (Fusion Medical Technologies, Inc.) vorgeschlagen worden.
Diese Klebstoffe bilden sehr viskose Gele, die auf eine hohe Temperatur von etwa 50 bis 80°C erhitzt werden müssen, um in einer Spritze verwendet werden zu können.
Abgesehen von dem potentiellen Toxizitätsrisiko je nach eingesetztem Aldehyd können diese Klebstoffe insbesondere wegen ihrer hohen Verwendungstemperatur die behandelten Gewebe schädigen.
Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, eine Klebstoffzusammensetzung bereitzustellen, welche die zuvor beschriebenen großen Nachteile nicht aufweist.
Somit liegt ihr als Aufgabe zugrunde, eine Klebstoffzusammensetzung bereitzustellen, die biologisch verträglich, bioresorbierar und nichttoxisch ist, für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung geeignet und langzeitstabil ist und unter relativ einfachen Bedingungen aufbewahrt werden kann, wobei sie leicht zu verwenden und insbesondere durch Kanülen oder Katheter injizierbar ist.
Weiterhin liegt ihr als Aufgabe zugrunde, eine Klebstoffzusammensetzung bereitzustellen, die verbesserte mechanische Beständigkeits- und Hafteigenschaften besitzt.
Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe besteht insbesondere in der Bereitstellung einer Klebstoffzusammensetzung, bei welcher die Vernetzung des Collagens oder der Gelatine sehr schnell verläuft, wobei deren Geschwindigkeit leicht verändert werden kann.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung einer Klebstoffzusammensetzung, von welcher keine Toxizitätsgefahr, insbesondere durch Diffusion des Vernetzungsmittels, ausgeht.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe besteht auch in der Bereitstellung einer Klebstoffzusammensetzung für die Verbindung von biologischen Geweben, wobei lebende Gewebe eingeschlossen sind, untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial, das der Klebstoff selbst (alleinige Verwendung) sein kann.
Der Erfindung liegt darüber hinaus als Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Vernetzung des Collagens (oder der Gelatine) bereitzustellen, das es ermöglicht, insbesondere eine solche Klebstoffzusammensetzung herzustellen, und welches leicht und ohne Gefahr für den Empfängerorganismus durchzuführen ist.
Der Erfindung liegt schließlich als Aufgabe zugrunde, Kits bereitzustellen, die eine Klebstoffzusammensetzung wie zuvor beschrieben für eine chirurgische und/oder therapeutische Anwendung umfassen, und welche einfach und praktisch zu verwenden sind.
Dazu hat die Erfindung eine Klebstoffzusammensetzung, die biologisch verträglich, bioresorbierbar und nichttoxisch ist, für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung, insbesondere für die Verbindung von biologischem Gewebe untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial zum Gegenstand, enthaltend mindestens ein oxidiertes polyaldehydisches makromolekulares Polysaccharid oder Mucopolysaccharid in wässriger Lösung, mit einem sauren natürlich erhaltenen pH-Wert ist.
Dabei wird angenommen, dass die Stabilität solcher wässriger Lösungen auf natürliche Weise dadurch erhalten wird, dass die Lösung spontan sauer wird.
Die Erfindung hat weiterhin zum Gegenstand eine Klebstoffzusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einerseits eine Collagenkomponente, die im wässrigen Medium solubilisiert und aus

– Collagen, das nicht hydrolysiert ist, wenigstens teilweise seine Helixstruktur verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, und
– nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5% ausgewählt ist, und

Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines nichttoxischen, bioresorbierbaren und biologisch verträglichen Klebstoffs für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung bereitgestellt, der vorgesehen ist, auf Gewebe und/oder ein Biomaterial aufgebracht zu werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Stufe umfasst, die im Vermischen mindestens eines biologisch abbaubaren makromolekularen Polyaldehyds natürlichen Ursprungs in wässriger Lösung mit dem wie zuvor definierten pH-Wert mit einer im wässrigen Medium solubilisierten Collagenkomponente, die aus

– Collagen, das nicht hydrolysiert ist, wenigstens teilweise seine Helixstruktur verloren hat und im Wesentlichen aus α-Ketten besteht, und
– nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5%

Die Erfindung hat ferner die Verwendung eines Polysaccharids oder eines oxidierten polyaldehydischen makromolekularen biologisch abbaubaren makromolekularen Mucopolysaccharid natürlichen Ursprungs in wässriger Lösung zur Herstellung einer biologisch verträglichen, bioresorbierbaren und nichttoxischen Klebstoffzusammensetzung für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung für die Verbindung von biologischen Geweben miteinander oder mit einem implantierten Biomaterial, das gegenüber dem Polyaldehyd reaktive Aminfunktionen besitzt, zum Gegenstand.
Die Erfindung hat auch die Verwendung eines solchen Polyaldehyds in Kombination mit einer Collagenkomponente, wie zuvor definiert, in wässriger Lösung für die oben beschriebene Verwendung zum Gegenstand.
Die Erfindung hat ebenfalls zum Gegenstand Kits für die nichttoxische, bioresorbierbare und biologisch verträgliche Klebstoffzusammensetzung, die für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung vorgesehen und dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 umfassen.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand Kits, die darüber hinaus umfassen:

– eine wässrige Lösung einer Collagenkomponente, die ausgewählt ist aus • Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, und • nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5%, und
– Mittel zum sofortigen Vermischen dieser Lösungen.

Die Verwendung nach Anspruch 20 entspricht der Applikation einer Temperatur von 20 bis 45°C auf diese Gewebe und/oder diese Biomaterialien, wobei das Biomaterial insbesondere Aminfunktionen besitzt, die gegenüber dem Polyaldehyd reaktionsfähig sind.
Die Verwendung nach Anspruch 21 entspricht einer Applikation der Art, dass

– bei neutralem, physiologischem pH-Wert eine wässrige Lösung einer Collagenkomponente, die ausgewählt aus: • Collagen, das nicht hydrolysiert, ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, und • nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5%, mit einer wässrigen Lösung, die mindestens ein biologisch abbaubares makromolekulares Polyaldehyd natürlicher Herkunft wie weiter oben definiert enthält, vermischt wird,
– das erhaltene Gel schnell auf das Gewebe und/oder das Biomaterial, das Funktionen, insbesondere Aminfunktionen, die mit den makromolekularen Polyaldehyden reaktionsfähig sind, besitzt, bei einer Temperatur von 20 bis 45°C aufgebracht und
– das Gemisch polymerisieren gelassen wird.

Von den Erfindern ist überraschenderweise festgestellt worden, dass die potentiell adhäsiven Eigenschaften solcher biologisch abbaubarer makromolekularer Polyaldehyde natürlichen Ursprungs an lebendem Gewebe und das Haftvermögen der Klebstoffe, die daraus folgen, vom Empfängerorganismus äußerst gut toleriert werden, wobei ihre Hafteigenschaften während des Verbleibs im Organismus erhalten bleiben.
Somit ist festgestellt worden, dass biologische Gewebe, lebende Gewebe eingeschlossen, untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial, das gegenüber den makromolekularen Polyaldehyden reaktive Funktionen, insbesondere Aminfunktionen, besitzt, verklebt werden können.
Von den Erfindern ist weiterhin überraschenderweise festgestellt worden, dass ein biologischer Klebstoff erhalten werden kann, indem der Überschuss an chemischen Recktanten, der zur Vernetzung bestimmter Collagene oder Gelatine erforderlich ist, in Form eines solchen biologisch abbaubaren makromolekularen Polyaldehyds bereitgestellt wird und dass dieser Klebstoff sich wirkungsvoll auf lebendes Gewebe bei einer Temperatur aufbringen lässt, die sich in der Nähe der physiologischen Temperatur befindet, wobei er keine Gewebeverletzungen verursacht und verbesserte Eigenschaften besitzt, insbesondere was die Qualität der Haftung und der mechanischen Beständigkeit betrifft.
Erfindungsgemäß ist somit unter einem "biologisch abbaubaren makromolekularen Polyaldehyd natürlicher Herkunft" eine Verbindung zu verstehen, die mehrere Aldehydfunktionen besitzt und von einem biologisch abbaubaren natürlichen Polymeren abgeleitet ist.
Dabei wird mit "biologisch abbaubar" ein makromolekulares Polyaldehyd bezeichnet, das durch fortschreitenden Abbau (Verstoffwechselung) verschwinden kann.
Das makromolekulare Polyaldehyd kann leicht durch Oxidation von Polysacchariden oder Mucopolysacchariden mit insbesondere Periodsäure oder ihren Salzen durch ein seit langem bekanntes Verfahren hergestellt werden. Solche Präparate aus oxidiertem Polysaccharid sind bereits anderswo in Dokumenten des Standes der Technik (Patent US-A-3 093 439 , Johnson & Johnson, und GB-A-1 109 509 Unilever) zum Vernetzen und Stabilisieren von festen Collagenmaterialien oder von solubilisierter Gelatine im gepufferten Medium vorgeschlagen worden.
Jedoch ist von den Erfindern festgestellt worden, dass, wenn ein solches Vernetzungsmittel verwendet wird, bei ihm kein Diffusionsphänomen beobachtet wird, ein Phänomen, das bei bekannten biologischen Klebstoffen, speziell dem Klebstoff GRF, insbesondere unter den Gesichtspunkten von Toxizität und biologischer Gewebeverträglichkeit, sehr problematisch ist.
Insbesondere ist festgestellt worden, dass das makromolekulare Polyaldehyd, indem es die erforderliche Aldehydmenge in der Collagen- oder Gelatinelösung zur Verfügung stellt, in dem Klebstoffgel eingeschlossen wird, das es zu bilden erlaubt.
Das erfindungsgemäß verwendete makromolekulare Polyaldehyd besteht vorteilhafterweise aus einem oxidierten Polysaccharid oder Mucopolysaccharid.
Das Polysaccharid besitzt vorteilhafterweise ein Molekulargewicht von 10 000 bis 2 Millionen Dalton.
Von den Polysacchariden oder Mucopolysacchariden, die zur Ausführung der Erfindung geeignet sind, sind Stärke, Dextran, Agarose, Cellulose, Chitin, Chitosan, Alginsäure, Glycosaminoglycane, Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat oder ihre Derivate zu nennen.
Erfindungsgemäß sind Stärke und Dextran bevorzugt, wobei Stärke besonders bevorzugt ist.
Dabei können die Polyaldehyde allein oder im Gemisch verwendet werden.
Mit dem hier benutzten Begriff "Polyaldehyd" wird unterschiedslos ein Polyaldehyd allein oder ein Gemisch aus mehreren Polyaldehyden bezeichnet.
Erfindungsgemäß kann das Polyaldehyd aus der Oxidation einer zuvor genannten Verbindung durch Periodsäure oder eines ihrer Salze, vorzugsweise Natriumperiodat, gemäß einem bekannten Verfahren resultieren.
Dazu wird zu der Polysaccharid- oder Mucopolysaccharidlösung eine Lösung von Periodsäure oder einem ihrer Salze bis zur Herstellung einer Konzentration von 0,01 bis 1 M und vorzugsweise 0,25 bis 0,5 M zugegeben.
Die Oxidationsstufe kann mit Lösungen, Gelen oder Suspensionen von Polysaccharid/en durchgeführt werden.
Das aus dem oxidierten Polysaccharid bestehende Präparat kann anschließend einer Dialyse, Diafiltration, Filtration und Ultrafiltration mit dem Ziel unterworfen werden, die Oxidationsprodukte der Reaktion und die Recktanten sowie die Iodderivate, die sich bei der Reaktion gebildet haben oder im Überschuss vorliegen, zu entfernen.
Weiterhin kann eine Gefriertrocknung vorgesehen werden, wobei die Auflösung des Lyophilisats in Wasser oder mit dem erforderlichen physiologischen Puffer erfolgen kann.
Die erfindungsgemäße Klebstoffzusammensetzung umfasst mindestens ein biologisch abbaubares makromolekulare Polyaldehyd natürlicher Herkunft, wie weiter oben definiert.
Dabei kann es sich um eine wässrige Lösung handeln, die vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.-% Polyaldehyd/e enthält.
Dabei ist festzustellen, dass die wässrige Polyaldehydlösung spontan sauer wird, was ihre Stabilität begünstigt. In Gegenwart von diesen pH-Wert modifizierenden Puffern ist ein mit der Zeit fortschreitender Reaktivitätsverlust festzustellen. Das Polyaldehyd wird daher vorteilhafterweise mit dem sauren pH-Wert, den es natürlicherweise in wässriger Lösung angenommen hat, oder auch in gefriergetrockneter Form bis zum Zeitpunkt seiner Verwendung aufbewahrt.
Die Lösung ist vor Luft geschützt stabil und wird vorzugsweise bei zwischen +1 und +25°C aufbewahrt.
Diese Klebstoffzusammensetzung wird vorteilhafterweise nach Neutralisation mit einem geeigneten Puffer vor ihrem Einsatz zum Verbinden von biologischem Gewebe untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial verwendet.
Unter diesen Bedingungen ist die neutralisierte Polyaldehydlösung mindestens einen Tag lag bei Umgebungstemperatur stabil.
Die Verwendungstemperatur der Polyaldehydlösung beträgt 20 bis 45°C.
Bei einem implantierten Biomaterial besitzt dieses Funktionen, die gegenüber dem/den Polyaldehyd/en, das/die in der Zusammensetzung enthalten ist/sind, reaktiv sind und insbesondere von Aminfunktionen gebildet werden.
Dabei kann das Material Collagen oder Gelatine wie weiter unten beschrieben umfassen.
Vorteilhafterweise wird eine Kontaktzeit des Biomaterials mit der Klebstoffzusammensetzung von etwa 10 Sekunden bis 3 Minuten vor dem in-situ-Aufbringen dieses Materials vorgesehen.
Das Collagen entsteht fortschreitend, im Allgemeinen innerhalb von zwischen 10 Sekunden und 3 Minuten bei einem physiologischen pH-Wert und einer Temperatur von etwa 37 bis 40°C.
Der Zeitraum für das Collagen und den in-vivo-Abbau des gebildeten Klebstoffs kann in Abhängigkeit von der Konzentration der Lösung des makromolekularen Polyaldehyds sowie vom Oxidationsgrad des Polysaccharids wie weiter unten erläutert gesteuert werden.
Entsprechend einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die Klebstoffzusammensetzung eine Lösung, die mindestens ein biologisch abbaubares makromolekulares Polyaldehyd natürlicher Herkunft wie weiter oben definiert enthält, sowie die Lösung einer Collagenkomponente.
Erfindungsgemäß wird als "Collagenkomponente" Collagen, das seine Helixstruktur wenigstens teilweise durch Erwärmen oder ein anderes Verfahren verloren hat, oder auch natives Collagen bezeichnet.
Im Falle eines Erwärmens, um die Helixstruktur des Collagens zu denaturieren, muss die Erwärmung moderat sein und unter milden Bedingungen so durchgeführt werden, dass ein Abbau der so gebildeten Gelatine durch hydrolytische Spaltung verhindert wird.
Das Collagen ist nicht hydrolysiert und besteht überwiegend aus α-Ketten.
Unter α-Ketten sind erfindungsgemäß vollständige α-Ketten oder verschiedene Fragmente zu verstehen, die von vollständigen α-Ketten durch Verlust einer kleinen Anzahl von Aminosäuren entstanden sind.
Das Molekulargewicht der vollständigen α-Ketten beträgt im Allgemeinen etwa 100 kDa, d. h. je nachdem 95 bis 130 kDa.
Die erfindungsgemäß benutzte Bezeichnung "nicht hydrolysiert" bedeutet, dass weniger als 10% der Collagenketten ein Molekulargewicht von unter etwa 100 kDa besitzen.
Unter "nativem Collagen" ist Collagen zu verstehen, das seine ursprüngliche Helixstruktur behalten hat, aber chemisch modifiziert oder auch behandelt worden sein kann, um, wie weiter unten erläutert, die Telopeptide zu entfernen.
Das erfindungsgemäß verwendete Collagen kann humanen oder tierischen Ursprungs und vom Typ I, III oder IV sein oder aus deren Mischung hervorgegangen sein.
Das Ausgangscollagen kann auch durch Methylierung, Succinylierung oder ein anderes bekanntes Verfahren chemisch modifiziert werden.
Das Collagen ist vorzugsweise frei von Telopeptiden, die insbesondere durch Behandlung mit Pepsin derart entfernt werden, dass es über Filter mit einer für die Sterilisierung (Entfernung der Mikroben) geeigneten Porosität filtrierbar gemacht wird.
Die handelsüblichen Gelatine sind für die erfindungsgemäßen Zwecke ungeeignet. Solche Gelatine enthaltende Klebstoffe ergeben Gele, die nicht flüssig werden und, insbesondere in Spritzen, erst ab höheren Temperaturen von über 45 bis 50°C verwendbar werden, die zu Verbrennungen und Nekrosen von Gewebe (Gehirn, Nerven, Darm und Cornea) führen können, was selbstverständlich dem Ziel, es zu schützen, entgegensteht.
Erfindungsgemäß wird das Collagen in Form einer wässrigen Lösung verwendet.
Dazu wird das Collagen in Wasser unter sterilen Bedingungen solubilisiert, wobei es vorteilhafterweise auf eine geeignete Temperatur von 40 bis 70°C erwärmt wird.
Dabei werden die Solubilisierungsbedingungen an das verwendete Collagen angepasst.
Das Präparat aus so erhaltener Gelatine kann anschließend einer Filtration unter sterilen Bedingungen unterworfen werden, wobei die Temperatur auf zwischen 40 und 70°C bleibt.
Der pH-Wert der Collagenlösung ist vorteilhafterweise der physiologische, gegebenenfalls bei Anwesenheit eines Puffers, insbesondere eines Phosphatpuffers.
Erfindungsgemäß kann die Gelatinelösung eine 10- bis 20%ige und vorzugsweise eine 15- bis 18%ige Lösung sein.
Entsprechend einer erfindungsgemäßen Abwandlung, insbesondere für Gelatinepräparate mit einer hohen Konzentration in der Nähe von 20%, die schwierig zu filtrierten sind, kann die Lösung unter sterilen Bedingungen hergestellt und verwendet werden, um direkt eine erfindungsgemäße Klebstoffzusammensetzung zu erhalten.
Gemäß dieser Abwandlung und für diese hohen Konzentrationen kann das Präparat durch Gefriertrocknung einer sterilen verdünnten Lösung und anschließendes Auflösen des sterilen Pulvers in sterilem Wasser in einem sterilen Behälter erhalten werden, was es erlaubt, diesen Vorgang ohne die Gefahr einer Kontaminierung durchzuführen.
Ganz allgemein wird das Collagen auf über 37°C erwärmt und verliert so den größten Teil seiner dreifachen Helixstruktur. Man kann das fertige Präparat mit Gelatine vergleichen, wobei jedoch sein Molekulargewicht der Elementarketten mehr als oder gleich 100 000 Dalton beträgt und weniger als 10% der Ketten ein niedrigeres Molekulargewicht haben. Diese Gelatine ist somit nicht hydrolysiert und unterscheidet sich von der auf dem Markt erhältlichen Gelatine.
Erfindungsgemäß bezieht sich, wenn der Begriff "Gelatine" benutzt wird, dieser auf ein solches Präparat.
Ist es erwünscht, die Helixstruktur des Collagens zu erhalten, insbesondere, um die Abbauzeit in vivo zu verlängern, wird die Lösung nicht erwärmt. Es ist dann bevorzugt, weniger konzentrierte Lösungen mit weniger als 5%, vorzugsweise zwischen 0,2 und 5%, und insbesondere zwischen 1 und 3% herzustellen, indem von einem, gegebenenfalls von Pepsin verdauten, nativen Collagen ausgegangen wird.
Das erfindungsgemäße Vernetzungsverfahren umfasst das Vermischen der zwei zuvor beschriebenen Lösungen. Es wird vorteilhafterweise ein homogenes Gemisch hergestellt.
Das Polyaldehyd wird mit dem Collagen oder der Gelatine mit einem Anteil von 0,5 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise von 3 bis 10 Gew.-% vermischt.
Das Vermischen der zuvor beschriebenen Lösungen wird vorzugsweise bei einem neutralen, physiologischen pH-Wert und einer Temperatur von 20 bis 45°C und vorzugsweise von etwa 37 bis 42°C durchgeführt.
Für das mit einer Konzentration von unter 5% verwendete native Collagen ist es bevorzugt, die Collagenlösung bei Umgebungstemperatur, beispielsweise etwa 20 bis 30°C, zu verwenden.
Erfindungsgemäße Klebstoffzusammensetzung und erfindungsgemäßes Vernetzungsverfahren können insbesondere, um das Bluten von Gewebeverletzungen zu stoppen, biologisches Gewebe untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial zu verbinden, chirurgische oder chronische Wunden ausheilen zu lassen, Nähte zu schützen oder abzudichten, die Bildung postoperativer Anhaftungen zu verhindern oder auch Arzneimittel durch ein verzögertes Freisetzungssystem abzugeben sowie in der refraktiven Augenchirurgie, speziell der Epikeratoplastik, angewendet werden.
Je nach den Verwendungen besteht das implantierte Biomaterial aus dem Klebstoff selbst, der dann allein verwendet wird.
Die Erfindung findet eine besonders vorteilhafte Anwendung bei der Verhinderung von postoperativen Anhaftungen.
Sie erlaubt auch auf dem Gebiet der refraktiven Augenchirurgie das Kleben von Linsen, insbesondere Collagenlinsen, auf die Cornea.
Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zum Verbinden eines Biomaterials mit biologischem Gewebe bereitgestellt, welches das Aufbringen eines biologischen abbaubaren makromolekularen Polyaldehyds natürlicher Herkunft wie weiter oben definiert in Form einer wässrigen Lösung mit dem sauren pH-Wert, der natürlicherweise erhalten oder vor der Verwendung neutralisiert worden ist, auf dieses Gewebe und/oder Biomaterial, das Funktionen, insbesondere Aminfunktionen, besitzt, die gegenüber dem Polyaldehyd reaktionsfähig sind, bei einer Temperatur von 20 bis 45°C umfasst.
Entsprechend einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zum Verbinden von biologischem Gewebe untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial bereitgestellt, welches das Vermischen einer wässrigen Lösung eines biologisch abbaubaren makromolekularen Polyaldehyds natürlicher Herkunft wie weiter oben beschrieben mit einer wässrigen Lösung einer Collagenkomponente wie weiter oben definiert bei neutralem, physiologischem pH-Wert umfasst.
Danach wird schnell, d. h. vorzugsweise innerhalb von weniger als einer Minute, das so erhaltene Gel auf das Gewebe und/oder Biomaterial, das Funktionen, insbesondere Aminfunktionen, besitzt, die gegenüber dem makromolekularen Polyaldehyd reaktionsfähig sind, bei einer Temperatur von 20 bis 45°C und vorzugsweise 37 bis 42°C aufgebracht und anschließend das Ganze polymerisieren gelassen.
Wenn die Collagenkomponente natives Collagen ist, so ist es nicht erforderlich, die Klebstoffzusammensetzung zu erwärmen, die dann bei Umgebungstemperatur aufgebracht werden kann.
Die Lösungen der Collagenkomponente und des Polyaldehyds können aus der Auflösung der Komponenten, die jeweils in gefriergetrockneter Form aufbewahrt worden sind, in einem gegebenenfalls gepufferten wässrigen Medium resultieren.
Durch das Vermischen von Lösung der Collagenkomponente und Lösung des makromolekularen Polyaldehyds nimmt das erhaltene viskose, homogene Gel fortschreitend an Masse zu und härtet schnell aus, wobei es stark, beispielsweise an dem biologischen Gewebe, auf welches es aufgebracht worden ist, anhaftet.
Erfindungsgemäß kann der Vernetzungszeitraum gesteuert und auf über 30 Sekunden verlängert werden, indem die Konzentration der Polyaldehydlösung, insbesondere auf unter 3%, bei ein und demselben Collagenanteil gesenkt wird.
So erlauben es beispielsweise Konzentrationen an makromolekularem Polyaldehyd von 3 bis 0,5%, die Polymerisationszeit einer 15%igen Gelatinelösung von 15 Sekunden bis auf 5 Minuten zu verlängern.
Dabei erfolgt die Polymerisation fortschreitend im Allgemeinen bei dem physiologischen pH-Wert und einer Temperatur von etwa 37 bis 40°C.
Entsprechend einer erfindungsgemäßen Abwandlung kann auch die in-vivo-Resorptionszeit des gebildeten Klebstoffs eingestellt werden, indem der Oxidationsgrad des Polysaccharids verändert wird, das zur Herstellung des verwendeten makromolekularen Polyaldehyds eingesetzt worden ist. Sie kann somit auf zwischen 1 bis 2 Tage und 30 bis 60 Tage eingestellt werden.
Dazu können vorteilhafterweise die Endkonzentrationen an Natriumperiodat zwischen 0,05 und 0,1 M variiert werden.
Ganz allgemein verlängert sich die Resorptionszeit mit steigender Polyaldehydkonzentration.
Erfindungsgemäß werden auch Kits bereitgestellt, die für eine chirurgische oder therapeutische und insbesondere eine der weiter oben beschriebenen Verwendungen vorgesehen sind.
Entsprechend einer ersten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst der Kit eine Lösung, die mindestens ein bioresorbierbares makromolekulares Polyaldehyd enthält und sich in einer Spritze befindet.
Vorzugsweise wird eine saure wässrige Lösung verwendet, die 0,5 bis 5 Gew.-% Polyaldehyd/e enthält.
Entsprechend einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der Kit vorteilhafterweise in Form von zwei Spritzen vorliegen, welche die Lösung der Collagenkomponente bzw. die Lösung des makromolekularen Polyaldehyds enthalten. Dabei besitzt die Collagenlösung in der betreffenden Spritze einen physiologischen pH-Wert und ist gegebenenfalls gepuffert (insbesondere mit einem Phosphatpuffer).
Die Spritzen werden in einer Haltevorrichtung befestigt, die mit Mischungsmitteln ausgestattet ist, die gestaltet sind, um ihren Inhalt sofort homogen vermischen und verwenden zu können, nachdem sie, je nach gewünschter Fluidität, auf eine geeignete Temperatur von 37 bis 45°C erwärmt worden sind.
Der Kit kann eine 10- bis 20%ige Lösung von nicht hydrolysiertem Collagen, das überwiegend aus α-Ketten besteht, und eine 0,5- bis 5%ige Polyaldehydlösung enthalten.
Entsprechend einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist ein Kit vorgesehen, der einerseits eine 18%ige Collagenlösung und andererseits eine 3%ige Lösung von oxidierter Stärke in einem Verhältnis 1/24 enthält.
Wird natives Collagen verwendet, enthält der Kit eine wässrige Lösung mit einer Konzentration von 5% oder weniger, vorzugsweise von 0,2 bis 5%, und besonders bevorzugt von 1 bis 3%.
Die erfindungsgemäße Klebstoffzusammensetzung und insbesondere der zuvor beschriebene Kit haben den Vorteil, dass sie bei zwischen +1 und +25°C und vorzugsweise +2 und +8°C gelagert werden können.
Weiterhin kann erfindungsgemäß der Vernetzungszeitraum auf unter 3 Minuten verkürzt und je nach den Anforderungen gesteuert werden.
Parallel dazu ist die von dem erfindungsgemäßen Produkt entwickelte Klebkraft größer als diejenige, die von bekannten Klebstoffen, insbesondere Fibrinklebstoffen, erreicht wird, wobei eine ausgezeichnete biologische Verträglichkeit erhalten bleibt.
Weiterhin wird erfindungsgemäß vorteilhafterweise eine Verwendungssicherheit geboten, die mit den Verfahren zur Herstellung des Collagens verknüpft ist, die zur Entfernung von Viren und Prionen (auf außergewöhnlichem Wege übertragbare Agentien), insbesondere durch eine Alkalibehandlung, wirksam sind. Dadurch wird eines der großen Probleme von Fibrinklebstoffen beseitigt.
Außerdem ist die Viskosität der erfindungsgemäßen Klebstoffzusammensetzung höher als diejenige der Fibrinklebstoffe, wobei sie jedoch unter 1 000 Centipoise bleibt, wodurch ihre sofortige Haftung erleichtert wird.
Die Erfindung wird anschließend anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung einer Lösung von makromolekularem Polyaldehyd
Zu einer Lösung von gereinigter löslicher Stärke oder Dextran, die/das gegebenenfalls positive Ladungen (Amingruppen) oder negative Ladungen (Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppen) oder andere funktionelle Gruppen enthält und deren/dessen Molekulargewicht von 10 000 bis 2 Millionen Dalton variieren kann, mit einer Konzentration von 5% in Wasser wurde eine Periodsäure- oder Natriumperiodatlösung bis zum Erreichen einer Konzentration von 0,01 bis 1 M und vorzugsweise 0,25 M gegeben.
Nach zwei Stunden Kontakt bei Umgebungstemperatur wurde die Lösung mit einer Membran mit einer Trenngrenze von 5 000 Dalton gegen destilliertes Wasser dialysiert (oder durch ein Ultrafilter diafiltriert). Die Dialyse wurde bis zur vollständigen Entfernung der dialysierbaren Produkte der Oxidationsreaktion und der Recktanten sowie der Iodderivate, die sich bei der Reaktion gebildet hatten oder im Überschuss vorlagen, fortgesetzt.
Es wurde festgestellt, dass die erhaltene Polyaldehydlösung spontan sauer wurde, was ihre Stabilität begünstigt, wobei es deshalb bevorzugt war, dass kein neutraler Puffer zugegeben wurde.
Die fertige konzentrierte Lösung des polymeren Polyaldehyds, das vom anfänglichen Polysaccharid abgeleitet war, wurde anschließend durch Spülen mit Stickstoff gesättigt und nach Filtration über einer Membran mit einer Porosität von 0,2 μ steril verpackt.
Das Produkt ist mindestens ein Jahr lang luftgeschützt bei zwischen +4 und 25°C stabil.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Kits wurde die hergestellte Lösung in Spritzen gefüllt.
Beispiel 2: Herstellung einer Collagenlösung
Durch 30 Minuten langes Auflösen eines sauren Collagenpulvers in Wasser bei einer Temperatur von 40 bis 70°C wurde eine 15%ige saure Collagenlösung hergestellt.
Nachdem es die Fluidität erlaubte, wurde die Lösung mit normaler Natronlauge auf pH 7,5 neutralisiert.
Rindercollagen vom Typ I kann säurelöslich sein (Lederhaut- und Sehnenextrakt mit saurem pH-Wert) oder durch Verdauen mit Pepsin solubilisiert werden, was es im Folgenden zum Filtrieren geeigneter gemacht.
Humanes Collagen aus einer Plazenta kann durch Extraktion mit Pepsin gemäß dem in der Patentanmeldung EP-A-0 214 035 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Selbstverständlich können andere dem Fachmann bekannte Collagenquellen verwendet werden.
Anschließend wurde die so erwärmte, verflüssigte und neutralisierte Collagenlösung steril über einer Membran mit einer Porosität von 0,2 μm nach Vorfiltration über Filtern mit immer mehr abnehmender Porosität bei einer geeigneten Temperatur von zwischen 40 und 70°C steril filtriert.
Wenn die Filtration mit einer Collagenkonzentration von 20% (oder mehr) nicht durchgeführt werden kann, wird die Collagenlösung vor der Filtration verdünnt.
Entsprechend einer erfindungsgemäßen Abwandlung wird die sterile verdünnte Lösung gefriergetrocknet und anschließend das sterile Pulver in sterilem Wasser in einem sterilen Behälter auf die gewünschte Konzentration aufgelöst.
Das Produkt ist mindestens ein Jahr bei Umgebungstemperatur stabil.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Kits kann die so erhaltene Collagenlösung leicht bei einer Temperatur von 40°C in Spritzen gefüllt werden.
Beispiel 3: Herstellung eines Klebstoffgemischs
Es wurde eine Spritze mit 0,5 ml 5%igem makromolekularem Polyaldehyd gemäß Beispiel 1 und eine Spritze mit 2 ml 15%igem Collagen gemäß Beispiel 2 hergestellt. Die Spritzen wurden in einer Haltevorrichtung befestigt, die mit einem Mischer versehen waren, der konstruiert war, um ihren Inhalt homogen zu vermischen, nachdem sie auf eine Temperatur von 40 bis 42°C und sogar 45°C, falls eine größere Fluidität erwünscht ist, erwärmt worden waren.
Das viskose, homogene Gel, das am Ausgang erhalten wurde, nahm bei dieser Temperatur fortschreitend von 15 bis 30 Sekunden bei physiologischem pH-Wert an Masse zu und härtete schnell aus, wobei es stark an dem biologischen Gewebe anhaftete, auf welches es aufgebracht worden war.
Wird das Gemisch auf eine Gewebefläche oder eine Wunde aufgebracht, deren Temperatur niedriger als 37°C ist, wird die Polymerisation, die von der chemischen Reaktion zwischen den Aldehydfunktionen und den Aminfunktionen des Collagens ausgelöst wird, von einer Verfestigung vervollständigt, die aus dem Gelieren des Collagens unterhalb von 37°C resultiert.
Die Polymerisationszeit kann auf über 15 Sekunden durch Verdünnung des makromolekularen Polyaldehyds auf unter 5% oder indem eine Menge von unter 0,5 ml pro Spritze auf 2 ml Collagen verwendet wird, verlängert werden.
Konzentrationen von makromolekularem Polyaldehyd von 5 bis 0,5% erlauben es, die Polymerisationszeit von 15 Sekunden auf bis zu 5 Minuten zu verlängern.
Dabei ist es auch möglich, eine 5%ige Lösung von weniger oxidiertem Polysaccharid zu verwenden, das beispielsweise mit einer Natriumperiodatendkonzentration von 0,05 bis 0,1 M entsprechend der Abwandlung von Beispiel 1 hergestellt worden ist.
HAFTFÄHIGKEITSPRÜFUNG
Es wurde die Kraft gemessen, die von dem so hergestellten Gewebeklebstoff entwickelt wurde, indem das zuvor beschriebene Gemisch zwischen zwei Schweinehautstücke von 6,25 cm² aufgebracht wurde, die auf der Epidermisseite durch Verkleben mit einem Acrylklebstoff mit den zwei Platten eines Kraftmessers verbunden waren.
Nachdem das vermischte und bei 40°C fluide Produkt auf die beiden Hautstücke auf der Dermisseite aufgebracht worden war, wurden die zwei Platten sofort einander angenähert, um das Ganze 1 Minute lang mit einer Kraft von 4 Newton zusammenzupressen, wonach es 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert wurde.
Danach wurden die Platten fortschreitend voneinander entfernt, wobei die Reißfestigkeit der zwei Hautstücke gemessen wurde.
Die gemessene Kraft betrug 7,26 Newton. Die Arbeit, die aufgebracht werden musste, um die Streckfestigkeit zu überwinden, betrug 10,96 Millijoule.
Unter denselben Bedingungen ergab der Fibrinklebstoff "TISSUCOL" eine Kraft von 6,30 Newton und 11,25 Millijoule.
Beispiel 4:
Die Kraft oder Arbeit des Beispiels 3 kann um das Doppelte oder Dreifache vergrößert werden, indem die Konzentration des Collagens oder makromolekularen Polyaldehyds wie anschließend beschrieben erhöht wird.
Es wurde eine Spritze mit 0,5 ml einer 5%igen Lösung von makromolekularem Polyaldehyd gemäß Beispiel 1 und eine Spritze mit 2 ml einer 20%igen Collagenlösung gemäß einer Abwandlung des Beispiels 2 hergestellt.
Es wurde wie in Beispiel 3 verfahren.
Bei der Haftfähigkeitsprüfung betrug die gemessene Kraft 12,15 Newton und die Arbeit, die aufgewendet werden musste, um die Streckfestigkeit zu überwinden, betrug 27,72 Millijoule.
Beispiel 5: Aufkleben einer Collagenlinse mit einer Lösung von makromolekularem Polyaldehyd auf eine Kaninchencornea und auf die Cornea eines Primaten (kein Mensch)
Zum Aufkleben einer Collagenlinse wurden die Augenlider mit einem Blepharostaten offen gehalten und wurde die Cornea über einen Bereich, der größer als der Durchmesser der Linse war, vom Epithel befreit und anschließend der vom Epithel befreite Bereich sorgfältig gewaschen, um die Zellrückstände zu entfernen.
Die 2,5%- oder 5%ige Polyaldehydlösung, die gemäß der Vorschrift von Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde auf die konkave Seite der Linse aufgebracht, bis deren Hohlraum vollständig mit der Polyaldehydlösung gefüllt war.
Nach 30 Sekunden bis 2 Minuten Kontaktzeit wurde die Corneaoberfläche getrocknet, die überschüssige Polyaldehydlösung durch Absaugen entfernt und anschließend die konkave Seite der Linse auf der Cornea angeordnet, wobei dafür gesorgt wurde, dass die Linse in Bezug auf die optische Achse zentriert wurde.
Der Linsenrand wurde mittels einer Lanzette korrekt an die Cornea angedrückt.
Nach 5 Minuten Kontaktzeit war es möglich, mit einer auf der Linse angeordneten Lanzette den Augapfel zu mobilisieren.
Unter diesen Bedingungen verursachte die Verwendung von makromolekularem Polyaldehyd mit einer Konzentration von 2,5 bis 5% weder bei dem Albinokaninchen (New Zealand) noch bei dem Primaten (kein Mensch) (Macaccus cynomolgus) klinische Entzündungsreaktionen an den vorhandenen Augapfelstrukturen Cornea, Bindehaut, Iris und Augenlider.
Dieses Nichtvorhandensein von toxischen Reaktionen oder lokalen Reizungen unterstreicht den Vorteil der erfindungsgemäßen Klebstoffzusammensetzung gegenüber der Verwendung herkömmlicher Vernetzungsmittel des Standes der Technik für die Herstellung von Gewebeklebstoffen.
Beispiel 6: Verhinderung der Bildung postoperativer Anhaftungen
Der Tierversuch, der angewendet wurde, um die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Klebstoffs bei der Verhinderung postoperativer Anhaftungen zu zeigen, wurde von Elisabeth HARRIS und George RODEHEAVER et al. (Surgery, 117, 6, 663–669, (1995)) veröffentlicht.
In der in jener Veröffentlichung beschriebenen Vorschrift wurden Gruppen zu jeweils 10 Ratten verwendet.
Die Versuche bestanden darin, auf Flächen von 2 cm² von Bauchfell- und Blinddarmwand, die sich im Kontakt miteinander befanden, eine Abrasion und eine Dehydratation vorzunehmen.
Die Ratten der Kontrollgruppe erhielten kein Mittel zum Schutz der so verursachten Wunden; diese wurde mit einer Gruppe von Ratten verglichen, die 1 bis 2 ml erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff gemäß Beispiel 3 erhalten hatten, wobei ein Kit verwendet worden war, der zwei Spritzen wie in jenem Beispiel beschrieben enthielt, und der Klebstoff auf die beiden Wunden, die sich einander gegenüber befanden, aufgebracht wurde.
Nach 7 Tagen Warten, entsprechend der veröffentlichten Vorschrift, waren die Ergebnisse klar:
Zwischen den zwei verletzten Flächen in der Gruppe aus Ratten, die mit dem erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff behandelt worden waren, wurden keine Anhaftungen beobachtet.
Die Kontrollgruppe aus Ratten, die nicht mit dem erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff behandelt worden waren, zeigte bei allen 10 Ratten Anhaftungen, deren Charakteristika identisch mit den Ergebnissen waren, die in der zuvor genannten Surgery, 117, 6, 663–669 (1995) veröffentlicht worden waren.
Aus jener Veröffentlichung (Tabelle II, Seite 667) geht hervor, dass der Fibrinklebstoff (Fibrin sealant) nicht wirksam ist, um die Bildung postoperativer Anhaftungen vollständig zu verhindern.
Die das Anhaften verhindernden Eigenschaften, die für den erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff gezeigt wurden, sind vollkommen überraschend, wenn man sie mit denjenigen der Fibrinklebstoffe vergleicht, die diese Eigenschaften nicht besitzen.
Erfindungsgemäß kann die Klebstoffzusammensetzung, die eine haftungsverhindernde Barriere bildet, auf einer genauen Stelle aufgebracht werden, beispielsweise mittels Injektion durch einen Katheter, ohne dass die Gefahr besteht, dass diese Barriere verschoben wird, wodurch Sicherheit und Wirksamkeit für den behandelten Patienten weiter erhöht werden.
Beispiel 7: Einfluss der Konzentration des makromolekularen Polyaldehyds auf die Reaktivitätszeit der erfindungsgemäßen Klebstoffzusammensetzung
Es wurde eine Klebstoffzusammensetzung auf der Basis von einerseits einer 16,5%igen Collagenlösung und andererseits einer 3,3%igen Lösung von oxidierter Stärke mit einem pH-Wert von 3,3 (mittlere Konzentration, bestimmt durch Messung des Brechungsindex (3,1%) und durch Kontrolle der Trockenstoffe (3,5%)) hergestellt.
In dieser Studie wurden Verdünnungen von oxidierter Stärke in Wasser von 1%, 0,75% bzw. 0,5% hergestellt.
Weiterhin wurde von Collagenlösungen mit verschiedenen pH-Werten in Gegenwart eines Phosphatpuffers ausgegangen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1

pH Collagen	Phosphatkonzentration (M)	Konzentration der oxidierten Stärke (Endkonzentration)	Polymerisationszeit des Gemischs
7,44	0,05	1% (0,2%)	45 s
		0,75% (0,15%)	1 min und 5 s
		0,5% (0,1%)	3 min
7,08	0,02	1% (0,2%)	2 min
		(0,75% (0,15%)	2 min und 30 s
		0,5% (0,1%)	5 min
7,33	0,02	1% (0,2%)	1 min und 15 s
		0,75% (0,15%)	2 min
		0,5% (0,1%)	4 min

Die Ergebnisse zeigen, dass das Klebstoffgemisch mit höherer Konzentration der oxidierten Stärke und mit höherem pH-Wert des Gemischs schneller aushärtet.
Die Konzentrationen der oxidierten Stärke von 1% und 0,75% führten zu ähnlichen Ergebnissen mit einem Unterschied von 30 Sekunden. Dem gegenüber wurde ein beträchtlicher Unterschied zwischen den Konzentrationen 0,75% und 0,5% festgestellt.
Alle Gele wiesen eine gute Kohäsion auf und ihre Elastizität war umso größer, je geringer die Konzentration der oxidierten Stärke war, wobei dieser Unterschied im Laufe der Zeit erhalten blieb.
Das Gel mit einer oxidierten Stärke mit 0,5% besaß eine große Elastizität.
Die Standardkonzentration der oxidierten Stärke von 3% führte zu einem Gel, das sehr widerstandsfähig und weniger elastisch war. Die Elastizität des Gels wurde mit der Konzentration der oxidierten Stärke von etwa 1% oder weniger größer. Diese Eigenschaft kann für zahlreiche Anwendungen interessant sein.
Beispiel 8: Einfluss von Pufferkonzentration und pH-Wert des Collagens auf die Reaktivitätszeit der erfindungsgemäßen Haftstoffzusammensetzung
Es wurde eine Klebstoffzusammensetzung auf der Basis von einerseits einer etwa 17%igen Collagenlösung und andererseits einer 3,3%igen Lösung von oxidierter Stärke mit einem pH-Wert von 3,3 wie in Beispiel 7 hergestellt.
Zu dem Collagen wurde ein Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 0,01 M bis 0,1 M zugegeben, und es wurde ein phosphatfreies Collagen hergestellt und beide auf denselben pH-Wert eingestellt.
Der Einfluss des pH-Werts auf das Collagen wurde untersucht, indem Lösungen mit einem pH-Wert von 6,9 bis 7,45 hergestellt wurden.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2

Collagenkonzentration (%)	pH Collagen	Phosphatkonzentration M	Polymerisationszeit des Gemischs	pH nach Vermischen mit oxidierter Stärke
17	7,12	0	45 s	6,75
17,3	7,44	0,05	18 s	7,15
17	7,45	0,1	15 s	7,30
16,6	7,05	0	1 min und 20 s	6,60
16,8	7,25	0	1 min und 5 s	6,69
16,9	7,06	0,05	33 s	6,94
16,9	7,36	0,05	17 s	7,11
16,6	6,95	0,01	1 min	6,72
16,7	7,08	0,02	40 s	6,92
17	7,33	0,02	28 s	7,02

Es ist festzustellen, dass die Reaktivität des Gemischs mit dem pH-Wert des Collagens und seinem Puffervermögen größer wird.
Beispiel 9: Herstellung eines Klebstoffgemischs aus nativem Collagen
Es wurde Collagen, das durch Verdauung mit Pepsin solubilisiert und aufgereinigt worden war, in einer 2%igen wässrigen Lösung, die 9 g/l Natriumchlorid enthielt und auf pH 7 eingestellt worden war verwendet.
Das Collagen, das chemisch nicht modifiziert oder durch Succinylierung oder Methylierung modifiziert worden war, konnte in diesem Beispiel gleichermaßen verwendet werden.
In allen Fällen behielt es seine Helixstruktur.
Das Produkt wurde steril in eine 2-ml-Spritze gefüllt und bei +4°C gelagert.
Eine 1%ige Lösung von oxidierter Stärke wurde hergestellt, indem ein gefriergetrocknetes saures Pulver aus oxidierter Stärke in 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,50, gelöst wurde. Es wurde eine 0,5-ml-Spritze hergestellt.
Die Collagen-Spritze und die Stärke-Spritze wurden in einem Kit, der ähnlich dem von Beispiel 3 war, zusammengefasst und auf Umgebungstemperatur (etwa 20°C) erwärmt.
Um die Haftkraft des aus diesem Kit erhaltenen Gemischs zu bewerten, wurde der Haftfähigkeitsversuch gemäß Beispiel 3 mit Schweinehautstücken von 6,25 cm² durchgeführt.
Die Ergebnisse sind folgende:
Die gemessene Kraft betrug 4,5 Newton. Die Arbeit, die aufgebracht werden musste, um dem Ziehvorgang zu widerstehen, betrug 3,15 Millijoule.

Claims

Klebstoffzusammensetzung, die biologisch verträglich, bioresorbierbar und nicht toxisch ist, für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung, insbesondere für die Verbindung von biologischen Geweben untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial, umfassend mindestens ein biologisch abbaubares, makromolekulares polyaldehydisches oxidiertes Polysaccharid oder Mucopolysaccharid natürlicher Herkunft in wässriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein biologisch abbaubares, makromolekulares Polyaldehyd natürlicher Herkunft in wässriger Lösung mit saurem pH-Wert, der auf natürliche Weise erhalten worden ist, umfasst.
Klebstoffzusammensetzung, die biologisch verträglich, bioresorbierbar und nicht-toxisch ist, für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung, insbesondere für die Verbindung von biologischem Gewebe untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial, dadurch gekennzeichnet, dass sie – mindestens ein biologisch abbaubares, makromolekulares polyaldehydisches oxidiertes Polysaccharid oder Mucopolysaccharid natürlicher Herkunft und – eine Collagen-Komponente umfasst, die im wässrigen Medium solubilisiert und aus – Collagen, das nicht hydrolysiert ist, wenigstens teilweise seine Helixstruktur verloren hat und überwiegend aus einer α-Kette besteht, wobei diese Zusammensetzung bei ihrer endgültigen Verwendung nur eine Erwärmung erfordert, welche die Herstellung der Klebstoffzusammensetzung durch Vermischen und anschließend ihr Aufbringen auf das Gewebe bei einer Temperatur von 20 bis 45°C erlaubt, und – nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5%, wobei die Zusammensetzung dann die endgültige Verwendung bei Umgebungstemperatur erlaubt, ausgewählt ist.
Klebstoffzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein biologisch abbaubares, makromolekulares Polyaldehyd natürlicher Herkunft in wässriger Lösung mit saurem pH-Wert, der auf natürliche Weise erhalten worden ist, umfasst.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid oder Mucopolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die Stärke, Dextran, Agarose, Cellulose, Chitin, Chitosan, Alginsäure, Glykosaminoglykane, Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat oder ihre Derivate umfasst.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid aus Stärke und Dextran ausgewählt und vorzugsweise Stärke ist.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyaldehyd aus einem Polysaccharid oder Mucopolysaccharid besteht, das durch Periodsäure oder eines ihrer Salze oxidiert ist.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ein Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 2 Millionen Dalton besitzt.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wässrige Lösung von Polyaldehyd(en) mit einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-% umfasst.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung durch Auflösung eines Polyaldehyds in saurer gefriergetrockneter Form in Wasser oder mit einem physiologischen Puffer erhalten worden ist.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Lösung von Collagen, das seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und nicht hydrolysiert ist, mit einer Konzentration von 10 bis 20% und vorzugsweise 15 bis 18% umfasst.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wässrige Lösung von nativem Collagen mit einer Konzentration von 0,2 bis 5% und vorzugsweise 1 bis 3% umfasst.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vermischen der Polyaldehydanteil, bezogen auf das Collagen, 0,5 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-% beträgt.
Klebstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Organismus innerhalb von 1 bis 2 Tagen und 30 bis 60 Tagen resorbierbar ist.
Verfahren zur Herstellung eines nicht-toxischen, bioresorbierbaren und biologisch verträglichen Klebstoffs für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung, der vorgesehen ist, auf Gewebe und/oder ein Biomaterial aufgebracht zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Stufe umfasst, die im Vermischen einer im wässrigen Medium solubilisierten Collagenkomponente, die aus – Collagen, das nicht hydrolysiert ist, wenigstens teilweise seine Helixstruktur verloren hat und im Wesentlichen aus α-Ketten besteht, und – nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5% ausgewählt ist, vor ihrer Vernetzung mit mindestens einem biologisch abbaubaren, makromolekularen polyaldehydischen oxidierten Polysaccharid oder Mucopolysaccharid natürlicher Herkunft in wässriger Lösung besteht.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung der Collagenkomponente und die Lösung des makromolekularen Polyaldehyds wie in einem der Ansprüche 3 bis 13 definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Vermischen bei einer Temperatur von 20 bis 45°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Vermischen bei einer Temperatur von etwa 37 bis 42°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Vermischen bei einem neutralen, physiologischen pH-Wert durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Vernetzung innerhalb von weniger als 5 Minuten durchgeführt wird.
Verwendung eines biologisch abbaubaren, makromolekularen polyaldehydischen oxidierten Polysaccharids oder Mucopolysaccharids natürlicher Herkunft in wässriger Lösung zur Herstellung einer nicht-toxischen, bioresorbierbaren und biologisch verträglichen Klebstoffzusammensetzung für eine chirurgische und/oder therapeutische Verwendung zur Verbindung von biologischem Gewebe untereinander oder mit einem implantierten Biomaterial, das gegenüber dem Polyaldehyd reaktive Aminfunktionen besitzt.
Verwendung nach Anspruch 20 in Verbindung mit einer im wässrigen Medium solubilisierten Collagenkomponente, die aus – Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, und – nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5% ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 20 oder 21 zur Herstellung einer Klebstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert.
Kit, der eine Zusammensetzung nach Anspruch 1 umfasst.
Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass er in Form einer Spritze vorliegt.
Kit nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass er eine wässrige Lösung von Polyaldehyd(en) mit einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-% umfasst.
Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem – eine wässrige Lösung einer Collagenkomponente, die aus – Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, und – nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5% ausgewählt ist, und – Mittel zum sofortigen Vermischen dieser Lösungen umfasst.
Kit nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass er in Form von zwei Spritzen vorliegt, die mit Mischmitteln versehen sind, wobei eine der Spritzen die Lösung der Collagenkomponente und die andere die Lösung des makromolekularen Polyaldehyds enthält.
Kit nach Anspruch 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass er eine 0,5- bis 5%ige Polyaldehydlösung enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyaldehydlösung durch Auflösung eines Polyaldehyds in saurer gefriergetrockneter Form in Wasser oder mit einem physiologischen Puffer erhalten worden ist.
Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass er eine 10- bis 20%ige und vorzugsweise 15- bis 18%ige Lösung von Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass er einerseits Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, in 18%iger wässriger Lösung und andererseits eine 3%ige wässerige Lösung von oxidierter Stärke mit einem Verhältnis von 1/24 umfasst.
Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass er eine wässrige Lösung von nativem Collagen mit einer Konzentration von 0,2 bis 5% und vorzugsweise 1 bis 3% umfasst.
Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösungen) auf einer Temperatur von +1 bis +25°C und vorzugsweise +2 bis +8°C gehalten werden.
Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält.
Verwendung nach Anspruch 20 einer Zusammensetzung, die vorgesehen ist, bei einer Temperatur von 20 bis 45°C auf Gewebe und/oder Biomaterial aufgebracht zu werden, wobei das Biomaterial Funktionen, insbesondere Aminfunktionen, besitzt, die gegenüber dem Polyaldehyd reaktionsfähig sind.
Verwendung nach Anspruch 35 zur Verbindung mit einer Collagenlinse.
Verwendung nach Anspruch 21 einer Zusammensetzung derart, dass – bei neutralem, physiologischem pH-Wert eine wässrige Lösung einer Collagenkomponente, die aus – Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, und – nativem Collagen mit einer Konzentration von unter 5% ausgewählt ist, mit einer wässrigen Lösung, die mindestens ein biologisch abbaubares, makromolekulares Polyaldehyd natürlicher Herkunft enthält, vermischt wird, wobei – das erhaltene Gel auf das Gewebe und/oder Biomaterial, das Funktionen, insbesondere Aminfunktionen, die mit den makromolekularen Polyaldehyden reaktionsfähig sind, besitzt, bei einer Temperatur von 20 bis 45°C schnell aufgebracht und – das Gemisch polymerisieren gelassen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Polyaldehydlösung mit einem auf natürliche Weise erhaltenen sauren pH-Wert verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Polyaldehydlösung mit zuvor neutralisiertem pH-Wert verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen, das nicht hydrolysiert ist, seine Helixstruktur wenigstens teilweise verloren hat und überwiegend aus α-Ketten besteht, bei einer Temperatur von 37 bis 42°C aufgebracht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das native Collagen bei Umgebungstemperatur aufgebracht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 34 verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 43 zur Verhinderung postoperativer Anhaftungen.