DE60316291T2

DE60316291T2 - Esterderivate von hyaluronsäure zur herstellung von hydrogelmaterialien durch photohärtung

Info

Publication number: DE60316291T2
Application number: DE60316291T
Authority: DE
Inventors: Davide Bellini; Anna Maria Zanellato
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: US20090075911A1; JP4458852B2; EP1519962A1; AU2003227050A1; US20090076257A1; EP1519962B1; US20050119219A1; DE60316291D1; US7462606B2; ITPD20020064A1; ES2294305T3; AU2003227050B2; US8178499B2; US8178663B2; CA2478655C; ATE373018T1; CA2478655A1; WO2003076475A1; JP2005535736A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Hyaluronsäureester-Derivate und Hydrogel-Materialien, die aus den Ester-Derivaten bestehen, Verfahren zu deren Herstellung durch Photohärtung und deren Verwendung im biomedizinischen Bereich und im Bereich von Operationen, sowie im medizinischen Bereich als Systeme mit gesteuerter Freisetzung für Arzneimittel dank ihrer vorteilhaften mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften.
Stand der Technik
Einige Gele und Hydrogele sind bekannt, die hergestellt werden ausgehend von synthetischen Polymeren wie beispielsweise Polyhydroxyethylmethacrylat (PHEMA) (F. J. Holly et al., Biomed. Res. 1975, 9: 315), oder ausgehend von halbsynthetischen Derivaten natürlicher Polysaccharide, wie beispielsweise das Hyaluronsäure-Derivat, vernetzt mit Vinylsulfon (E. A. Balazs et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2: 173 – 178), die beim Verhindern von Adhäsionen, bei der Freisetzung von Arzneimitteln oder biologisch aktiven Proteinen und in tissue-repair (Gewebe-Reparatur)-Prozessen verwendet werden können.
Seit einigen Jahren ist es bekannt, dass Hydrogele bei Operationen verwendet werden, wo sowohl nicht-resorbierbare Polymere wie beispielsweise Polyester und Polyamide als auch biologisch abbaubare Polymere wie beispielsweise diejenigen, die auf Kollagen, Glycolsäure und Milchsäure basieren (S. J. Holland et al., J. Controlled Release, 1986, 4: 155 – 180), sowie Hyaluronsäure verwendet werden. Es ist auch bekannt, dass Hydrogele durch ultraviolette Bestrahlung sowohl aus synthetischen Polymeren (Amarpreet S. Sawhney et al., Macromolecules, 1993, 26: 581 – 587) als auch aus halbsynthetischen Derivaten wie beispielsweise Hydrogelen von vernetzten und polymerisierten Makromeren ( US-Patent Nr. 5,410,016 ) erhalten werden können, und dass Gele hergestellt werden können aus natürlichen Polymeren wie beispielsweise Hyaluronsäure ( US-Patent Nr. 6,031,017 ) oder aus verschiedenen Glycosaminoglycanen ( europäisches Patent Nr. 0 554 898 ), wobei man auf diesem Wege Hydrogel-Produkte erhält, die nützlich sind zum Verhindern extensiver Adhäsionen und für verschiedene biomedizinische Anwendungen wie beispielsweise die Freisetzung von Arzneimitteln.
Die oben genannten Hydrogel-Materialien werden alle erhalten durch Vernetzen des Polymers wie beispielsweise Hyaluronsäure mit photoreaktiven Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Divinylsulfon oder anderen Molekülen, die alle wenigstens eine C=C-Bindung aufweisen.
Einige dieser vernetzenden Mittel sind toxisch, und dies spielt offensichtlich eine Rolle, wenn beabsichtigt ist, das Hydrogel für die Verwendung als biomedizinisches Material oder für ähnliche Verwendungen anzuwenden. Darüber hinaus werden bei diesem Typ vernetzender Verbindungen dann, wenn sich die Netzwerk-Struktur des Hydrogels bildet, Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die aus der Bestrahlung der oben genannten vernetzenden Verbindungen stammen, in die Hydrogel-Struktur eingebaut und sind schwierig zu entfernen. Schließlich führen die Hyaluronsäure-Derivate, die durch das Vernetzen mit solchen Verbindungen modifiziert wurden, zu einem Gel, das in Wasser oder in wässrigen Lösungen nicht löslich ist.
Es ist auch bekannt, dass Gele, die nützlich für die Verkapselung von biologischem Material sind, ausgehend von wasserlöslichen Biopolymeren hergestellt werden können, die wenigstens zwei Unsättigungsstellen enthalten, und zwar durch Polymerisation mit Radikal-Initiator-Lösungen, die durch eine Bestrahlung bei einer Wellenlänge von zwischen 320 und 900 nm aktiviert werden ( US-Patent Nr. 6,258,870 ). Die Einkapselung von Zellen wie beispielsweise Chondrozyten kann verwendet werden zum Produzieren von einem Engineering unterworfenen Knorpel (Bryant et al., Biomed. Sci. Instrum. 1999, 35: 309 – 314), während die Photo-Vernetzung von Polymeren mit Propylenfumarat zur Bildung dreidimensionaler Matrices zur Verwendung bei der Rekonstruktion von Knochengewebe (ihren kann (J. P. Fisher et al., J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 2001, 12 (6): 673 – 687).
Daher besteht ein dringend gefühlter Bedarf nach neuen Hyaluronsäure-Derivaten, die nützlich zur Herstellung von Hydrogelen sind, die nicht die oben für Materialien des Standes der Technik erwähnten Nachteile zeigen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Anmelderin hat nun gefunden, dass die speziellen Ester-Derivate von Hyaluronsäure und von Hyaluronsäure-Derivaten mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I), die nachfolgend genannt werden, bei Photohärten ein Hydrogel-Material ergeben, das vorteilhafte mechanische und viskoelastische Eigenschaften aufweist.
Es sind daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Ester-Derivate von Hyaluronsäure oder von Hyaluronsäure-Derivaten, worin ein Teil der Carboxyl-Gruppen von Hyaluronsäure oder von Hyaluronsäure-Derivaten verestert ist mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I)
worin R gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Hydroxy-Gruppen, Alkoxy-Gruppen mit einer Alkyl-Kette C₁ bis C₂₀, die eine oder mehrere Hydroxy-Gruppen trägt, und Heterozyklus-Gruppen, die eine oder mehrere Hydroxy-Gruppen tragen; und R₁, R₂ und R₃ gleich zueinander oder voneinander verschieden sind und gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl-C₁ bis -C₂₀, möglicherweise substituiert mit einer oder mehreren Hydroxy-Gruppen, und Alkoxy-C₁ bis -C₂₀, möglicherweise substituiert mit einer oder mehreren Hydroxy-Gruppen.
Das Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Ester-Derivate sowie das Hydrogel-Material, das aus den Ester-Derivaten besteht, das Verfahren zur Herstellung des Hydrogel-Materials und die Verwendungen davon im biomedizinischen Bereich und im chirurgischen Bereich sowie im medizinischen Bereich als Systeme mit gesteuerter Freisetzung von Arzneimitteln sind weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A zeigt die 10fach vergrößerten gefärbten lebensfähigen Zellen innerhalb des Hydrogels gemäß der Erfindung nach 24 Stunden in Kultur, hergestellt wie in Beispiel 10.
1B zeigt die 32fach vergrößerten gefärbten lebensfähigen Zellen innerhalb des Hydrogels gemäß der Erfindung nach 24 Stunden in Kultur, hergestellt wie in Beispiel 10.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Ester-Derivate gemäß der Erfindung können ausgehend von Molekülen von Hyaluronsäure oder von deren Derivaten hergestellt werden, wie beispielsweise diejenigen, über die nachstehend berichtet wird, die partiell mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) als Radikal-Initiatoren verestert wurden, die in der Lage sind, ohne irgendeine Unsättigung des C=C-Typs innerhalb des Moleküls zu vernetzen.
Die Hyaluronsäure, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann erhalten werden aus irgendeiner beliebigen Quelle, beispielsweise durch Extraktion aus Hahnenkämmen ( europäisches Patent Nr. 0 138 572 ) oder durch Fermentation ( europäische Patentanmeldung Nr. 0 716 688 ) oder auf biotechnologischem Wege ( italienisches Patent Nr. PD94A000042 ) und kann ein Molekulargewicht zwischen 400 und 3.000.000 Da aufweisen, vorzugsweise zwischen 150.000 und 1.000.000 Da.
Die Start-Hyaluronsäure-Derivate zur möglichen Verwendung gemäß der Erfindung umfassen keine C=C-Bindungen und sind vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, die besteht aus:

1) HYAFF^®: Hyaluronsäureester mit Alkoholen der aliphatischen, araliphatischen, cykloaliphatischen, aromatischen, cyklischen und heterocyklischen Reihe (so lange keine Doppelbindungen C=C in den Molekülen zugegen sind), und zwar mit einem Prozentsatz der Veresterung, der nach dem Typ und der Länge des verwendeten Alkohols schwankt, jedoch niemals 75 % übersteigt, so dass das Polymer wasserlöslich bleibt, während die restliche Prozentmenge der nicht veresterten Hyaluronsäure mit quaternären Ammoniumsalzen eine Salz-Bindung eingeht und so eine zweite Veresterung mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) ermöglicht, wie mit denen, die offenbart sind in dem US-Patent Nr. 4,851,521 , das wir durch die In-Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung übernehmen;
2) HYADD^TM: Hyaluronsäure-Amide mit Aminen der aliphatischen, araliphatischen, cykloaliphatischen, aromatischen, cyklischen und heterocyklischen Reihe (so lange keine Doppelbindungen (C=C-Bindungen) in den Molekülen zugegen sind), mit einer Prozentmenge der Amidierung, die 50 % nicht übersteigt, so dass das Polymer wasserlöslich bleibt, während die restliche Prozentmenge der Hyaluronsäure, die keine Amidierung eingegangen ist, mit quaternären Ammoniumsalzen eine Salz-Bindung eingeht und so eine zweite Veresterung mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) ermöglicht, wie diejenigen, die offenbart sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 1 095 064 , deren Offenbarung wir durch die In-Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung übernehmen;
3) Quaternäre Ammonium-Salze von O-sulfatierten Derivaten, wie diejenigen, die offenbart sind in dem US-Patent Nr. 6,027,741 , dessen Offenbarung wir durch die In-Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung übernehmen, oder N-sulfatierte Derivate von Hyaluronsäure, wie diejenigen, die in dem europäischen Patent Nr. 0 971 961 offenbart sind, dessen Offenbarung wir durch die In-Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung übernehmen;
4) ACP^®: Innere Ester von Hyaluronsäure mit einem Prozentwert der Veresterung, der 20 % nicht übersteigt, so dass das Polymer wasserlöslich bleibt, während die verbleibende, nicht veresterte Prozentmenge von Hyaluronsäure mit quaternären Ammoniumsalzen allein eine Salzbindung eingeht und so eine zweite Veresterung mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) ermöglicht, wie diejenigen, die offenbart sind in dem europäischen Patent Nr. 0 341 745 , dessen Offenbarung wir durch In-Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung übernehmen.

Bevorzugte Propiophenon-Derivate der Formel (I) sind gewählt aus der Gruppe, die besteht aus 4-(2,3-Dihydroxypropoxy-)3-methoxy-propiophenon, 4'-(2-Hydroxy-3-morpholinopropoxy-)propiophenon und 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (Register of Toxic Effect of Chemical Substance, 1985 – 86).
Besonders bevorzugt ist 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon.
Die vorliegenden Ester-Derivate können hergestellt werden nach einem Verfahren, das das Umsetzen der Ausgangs-Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivate mit dem Bromid der Propiophenon-Derivate der Formel (I) umfasst, d. h. einer Verbindung der Formel (I), in der wenigstens eine Hydroxy-Gruppe des Substituenten R durch Br erstezt ist, unter Erhalt der gewünschten Ester-Derivate.
Die Bromide der Propiophenon-Derivate der Formel (I) können nach Verfahrensweisen hergestellt werden, die irgendeinem Fachmann mit Sachverstand in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind, wie beispielsweise entsprechend der Bromierungs-Reaktion, die beschrieben wurde durch Lewis und Boozer in „Am. Chem. Soc., 1952, 74, 308".
In den vorliegenden Ester-Derivaten übersteigt die Prozentmenge an Carboxyl-Gruppen, die mit den oben angegebenen Propiophenon-Derivaten verestert sind, vorzugsweise nicht 75 %. Die verbleibenden Carboxyl-Gruppen, die nicht mit den Propioenon-Derivaten der Formel (I) verestert wurden, können mit quaternären Ammoniumsalzen oder mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen, vorzugsweise mit Natrium, zum Salz umgesetzt werden.
Die oben beschriebenen vorliegenden Ester-Derivate können verwendet werden zum Herstellen neuer Hydrogel-Materialien auf der Basis von Hyaluronsäure, die sich von allen bekannten Gelen und Hydrogelen auf der Basis von Hyaluronsäure unterscheiden oder die andere Polymere zusammen mit Hyaluronsäure enthalten. Die vorliegenden Hydrogel-Materialien, die aus dem Produkt bestehen, das durch Photohärten der vorliegenden Ester-Derivate erhalten wurde, werden gegebenenfalls in Wasser oder in einer wässrigen Lösung gelöst. Das Photohärten kann durchgeführt werden bei einer Temperatur, die im Bereich zwischen 1 und 40 °C liegt, vorzugsweise bei Raumtemperatur.
Wenn die vorliegenden Ester-Derivate in Wasser oder in einer wässrigen Lösung gelöst sind, kann ihre Konzentration im Bereich von beispielsweise zwischen 0,01 und 100 % (w/w) liegen und liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 50 % (w/w).
Das Photohärten gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durchgeführt durch Bestrahlen mit Licht, das eine Wellenlänge im Bereich zwischen 280 und 750 nm aufweist, und noch mehr bevorzugt durch Bestrahlen mit ultravioletten Strahlen und insbesondere mit ultraviolettem Licht, das eine Wellenlänge von 366 nm aufweist.
Das Bestrahlen gemäß der Erfindung wird vorzugsweise durchgeführt bei einer Bestrahlungszeit zwischen 2 und 30 Minuten und noch mehr bevorzugt zwischen 3 und 15 Minuten.
Die so erhaltenen Hydrogel-Materialien zeigen wertvolle Eigenschaften und haben insbesondere die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

a) Abwesenheit von C=C-Unsättigung in den Ester-Derivaten ohne Zusatz irgendeiner Komponente, die als Katalysator für die Vernetzungs-Reaktion ohne irgendeine Unsättigung innerhalb des Moleküls dient; bis jetzt wurde angenommen, dass das Vorliegen von C=C-Unsättigung im zu vernetzenden Molekül unentbehrlich für den Radikal-Initiator ist, und diese wurde zugefügt entweder mittels chemischer Mittel oder durch einfaches Mischen mit dem zu einem Gel zu verarbeitenden Polymer um die Polymerisations-Reaktion auszulösen;
b) Sterilität: Es ist möglich, ein steriles Hydrogel zu erhalten, da das Ester-Derivat zuerst vor einem Photohärten dampf-sterilisiert wird;
c) Exzellente viskoelastische Eigenschaften: Das vorliegende Hydrogel-Material ist gekennzeichnet durch partielle Veresterung mit einem Radikal-Initiator, der wiedergegeben wird durch ein Derivat von Propiophenon, und darüber hinaus durch partielle Salz-Bildung mit quaternären Ammonium-Salzen oder mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen. Diese Hydrogele haben eine chemisch-physikalische Struktur, die vollständig verschieden von derjenigen bekannter Gele ist, die aus inneren oder äußeren Ester von Hyaluronsäure bestehen. Tatsächlich werden Gele, die aus inneren Ester von Hyaluronsäure bestehen, gebildet durch Mikroteilchen eines vernetzten Polymers, die durch schwache Bindungen physikalischer Art verbunden sind. Jedoch können die äußeren Ester in Form eines Gels vorliegen, dank einfacher Hydratation und abhängig von der Prozentmenge ihrer Veresterung und ihrer Konzentration in Wasser. Im Gegensatz dazu zeigen die vorliegenden Hydrogel-Materialien eine kompakte, dreidimensionale Struktur des Wand-zu-Wand-Typs. Sie sind daher gekennzeichnet durch größere mechanische Beständigkeit (und können daher zum Vorteil in verschiedenen Sektoren der Medizin und Chirurgie verwendet werden) und durch viskoelastische Eigenschaften, die in Abhängigkeit davon schwanken, wie lang sie einer Bestrahlung ausgesetzt waren, und abhängig vom Typ der wässrigen Lösung, die zum Erhalt des Hydrogels verwendet wurde. Gemäß der Erfindung werden vorzugsweise redestilliertes Wasser, Puffer oder normale Kochsalzlösung wie beispielsweise Phosphat-Puffer oder eine Salzlösung zum Lösen der vorliegenden Ester-Derivate verwendet.

Die vorliegenden Hydrogel-Materialien, die so hergestellt wurden, können mit Vorteil in den Bereichen Biomedizin, Chirurgie, Gesundheitspflege und Pharmazie verwendet werden, und sie können viele mögliche Anwendungen haben. Insbesondere können Biomaterialien, Gesundheitspflege-Produkte und chirurgische Artikel, die aus den vorliegenden Hydrogel-Materialien hergestellt sind, hergestellt werden. Die vorliegenden Hydrogel-Materialien können in die Form von Filmen, Membranen und Gaze-Pads verarbeitet werden und können in der Dermatologie zur Förderung des Wundheilungs-Prozesses verwendet werden, in der inneren Chirurgie zum Verhindern einer Oberflächen-Gewebehaftung verwendet werden und als Polymer-Überzug für Organe und Blutgefäße verwendet werden.
Darüber hinaus können die vorliegenden Hydrogele nützlich in Systemen für die gesteuerte Freisetzung eines oder mehrerer aktiver Komponenten wie beispielsweise von Proteinen, Wachstumsfaktoren, Enzymen, Anti-Krebs-Arzneimitteln und antientzündlichen Arzneimitteln des Steroid-Typs und Nicht-Steroid-Typs zur topischen, subkutanen, intramuskulären oder intraartikularen Verabreichung verwendet werden. In diesem letztgenannten Fall ist die Verwendung der vorliegenden Hydrogel-Materialien bei der Behandlung von Osteoarthritis als Alternative zu der klassischen Behandlung für diesen Zustand von besonderem Interesse. Diese Therapie erfordert eine intraartikulare Injektion von anti-entzündlichen Arzneimitteln des Steroid- oder Nicht-Steroid-Typs und/oder anderen „Arzneimitteln", die eine hauptsächlich mechanische Wirkung auf die Visko-Supplementation haben.
Die intraartikulare Injektion der vorliegenden Ester-Derivate ist auch möglich, bei anschließendem Vernetzen mittels einer Endoskop-Sonde mit optischen Fasern, die geeig net sind für das in-situ Photohärten der vorliegenden Ester-Derivate und die durch Arthroskopie in das Knie eingeführt werden, und dies ermöglicht die Bildung eines Hydrogel-Materials, das aus den vorliegenden Ester-Derivaten besteht, direkt in der Synovial-Kavität. Die Ester-Derivate können mit Human-Fibroblasten und/oder einem Arzneimittel zusammen gegeben werden, wie beispielsweise einem anti-entzündlichem Arzneimittel und/oder einem Metall-Protease-Inhibitor und/oder einem NO-Synthase-Inhibitor oder anderen biologisch aktiven Molekülen, zur Verwendung bei der Behandlung von Arthrose und/oder Arthritis. Wenn ein Arzneimittel den vorliegenden Ester-Derivaten weiter zugegeben wird, erlaubt das Hydrogel, dass sich in-situ im Anschluss an die Bestrahlung bildet, die langsame Freisetzung des Arzneimittels und führt gleichzeitig seine mechanische Wirkung der Visko-Supplementation aus.
Darüber hinaus hat Hyaluronsäure in Form eines Hydrogels längere chemische Abbauzeiten als ein Visko-Supplementations-Mittel in flüssiger Form. Tatsächlich zeigten in-vitro-Tests, die durchgeführt wurden, um die Abbauzeiten des vorliegenden Hydrogels ohne irgendwelche eingearbeiteten Arzneimittel zu ermitteln, dass bei 37 °C das Hydrogel seine dreidimensionale Struktur vollständig intakt eine lange Zeit von 4 Wochen und mehr beibehält.
Die wissenschaftliche Literatur weltweit berichtet über Experimente, die mit Gelen auf Basis von biokompatiblen, jedoch nicht biologisch abbaubaren synthetischen Polymeren durchgeführt wurden (Malmoge et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 2000, 33 (3): 307-312), die chirurgisch in beschädigte Gelenke als „künstliche Knorpel" transplantiert wurden.
Das Hydrogel-Material der Erfindung unterscheidet sich wesentlich von den bekannten Polymeren und von dem oben angegebenen Typ von Transplantat, da – neben der Tatsache, dass es auf Hyaluronsäure basiert, von der bekannt ist, dass sie ein in hohem Maße biologisch abbaubares natürliches Polymer ist, das nur nicht-toxische Olgiosaccharide freisetzt – keine Arthrotomie für seine Anwendung erforderlich ist, da die Ester-Derivate in flüssiger Form injiziert und mittels einer Endoskop-Sonde vernetzt werden, die geeignet ist zum Photohärten der Ester-Derivate und die durch Arthroskopie eingeführt wird.
Ein Kit zum Implantieren von durch Engineering erhaltenem Knorpel-Material mittels Arthroskopie-Operation ist daher ein weiterer Gegenstand der Erfindung, wobei das Kit ein Ester-Derivat gemäß der Erfindung gelöst in Wasser oder in einer wässrigen Lösung, einen Behälter für das Ester-Derivat, vorzugsweise einen Behälter, der für eine Injektion geeignet ist, und eine Endoskop-Sonde mit optischen Fasern umfasst, die geeignet sind für das in-situ-Photohärten des Ester-Derivats. Die Sonde ist vorzugsweise geeignet für eine UV-Bestrahlung. Den von dem vorliegenden Kit umfassten Ester-Derivaten werden vorzugsweise Human-Fibroblasten und/oder ein Arzneimittel zugesetzt, wie oben beschrieben wurde.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorliegenden Hydrogel-Materialien in den Verfahren zum Beschichten von Vorrichtungen sowohl im medizinischen Bereich als auch in anderen Industrie-Bereichen, da sie die Oberflächen der Materialien, die als Träger verwendet werden, mit neuen biologischen charakteristischen Eigenschaften ausstatten können. Der Bio-Überzug, der aus dem vorliegenden Hydrogel besteht, kann auch aktive Komponenten wie beispielsweise Arzneimittel, Proteine und Wachstumsfaktoren enthalten, die aus der Polysaccharid-Matrix während der Aufbringung freigesetzt werden können.
Die Vorrichtungen, die beschichtet werden können, sind beispielsweise gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Kathetern, Leit-Kanälen, Herzklappen, Gefäß-Stents, Weichgewebe-Prothesen, Prothesen tierischen Ursprungs wie beispielsweise Schweineherzklappen, künstliche Sehnen, Kontaktlinsen und Intraokular-Linsen, Blutoxygenatoren, künstlichen Organen wie beispielsweise Nieren, Herz, Leber und Pankreas, Blutbeuteln, chirurgischen Instrumenten, Filtrations-Systemen und Labor-Instrumenten.
Das Verfahren zum Beschichten der Oberflächen der genannten Vorrichtungen kann beispielsweise die Plasma-Coating-Technik sein, die beschrieben wurde in der internationalen Patentanmeldung der Anmelderin, Veröffentlichungs-Nr. WO 96/24392 .
Eine weitere Verwendung des vorliegenden Hydrogel-Materials ist die Verwendung für die gesteuerte und kontinuierliche Freisetzung von Arzneimitteln, neuronalen Wachstumsfaktoren, Antikörpern und Zusammensetzungen davon, für die intramedulläre Verabreichung zur Förderung einer Regenerierung der Knochenmark-Neuronen speziell nach traumatischen Schädigungen.
Tatsächlich ist es bekannt, dass einige Proteine wie zum Beispiel IGF-I, GDNF und andere Neurotrophine motorische Neuronen vor einem Absterben schützen können, wenn sie direkt auf die Knochenmarks-Verletzungsstelle durch kontinuierliche Infusion aufgebracht werden, jedoch müssen sie innerhalb eines sehr begrenzten Zeitintervalls verabreicht werden (M. M. Bilak et al., Neuroreport 2001, 8, 12 (11): 2531 – 2535). Es ist auch bekannt, dass Hyaluronsäure im Rückenmark zugegen ist, verteilt sowohl in der weißen Substanz, wo sie das Myelin umgibt als auch um die Zellkörper der Neuronen herum (A. Bignami et al., Exp. Neurol. 1992, 117 (1): 90 – 93).
Weiter ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der vorliegenden Ester-Derivate für die in-situ-Verabreichung, d. h. direkt in den geschädigten Bereich des Knochenmarks, der vorgenannten Arzneimittel in Mischung mit den Ester-Derivaten gemäß der Erfindung, die zuerst injiziert und dann direkt im Knochenmark photopolymerisiert werden. Es ist so möglich, eine kontinuierliche und gesteuerte langsame Freisetzung von biologisch und pharmakologisch aktiven Komponenten zu erhalten, ohne irgendein Fremd-Produkt und/oder toxisches Produkt in das Knochenmark einzuführen, da – wie bereits oben gesagt – Hyaluronsäure eine natürliche Komponente der Knochenmark-Substanz ist.
Dieser neue Typ einer intramedullären Verabreichung wurde nie zuvor beschrieben, da alle Arzneimittel, die in der Therapie für traumatisiertes Knochenmark verwendet werden, durch kontinuierliche Infusion direkt in die Verletzungsstelle verabreicht werden.
Das Hydrogel-Material der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden zur Herstellung von Gerüsten für das Wachstum zahlreicher Typen humaner oder tierischer Zellen, und zwar sowohl differenzierter Zellen (wie beispielsweise Keratinozyten, Fibroblasten, Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten) als auch nicht-differenzierter Zellen, wie beispielsweise mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks.
Die nachfolgend angegebenen Beispiele zeigen, dass UV-Strahlung den Karyotyp der Zellen, die in die Ester-Derivate gemäß der Erfindung eingearbeitet wurden (d. h. die polymerisiert wurden) nicht ändert, und dass die Lebensfähigkeit und spezielle Morphologie der Zellen unverändert bleiben. Aus diesem Grund ist es möglich, verschiedene Typen von „künstlichem Gewebe" speziell mit verbindendem Ursprung in vitro herzustellen und anschließend in vivo anzuwenden, die durch Zellen gebildet werden, die in das Hydrogel eingearbeitet sind, das die Faktoren enthält, die für ihr Wachstum sowie für ihre Differenzierung und Zell-Funktion nötig sind, beispielsweise als Epidermis, Dermis, Fettgewebe, Knochengewebe und Knorpelgewebe.
Das Knorpelgewebe, das hier als Beispiel beschrieben wird, stellt einen neuen Typ von durch Engineering bearbeitetem Knorpel dar, der durch eine Matrix gebildet wird, die aus dem Hydrogel besteht, das differenzierte Zellen (Chondrozyten) oder nicht-differenzierte Zellen (Stammzellen) enthält, wobei die Hyaluronsäure mit Wachstumsfaktoren und/oder differenzierenden Faktoren und/oder anderen pharmakologisch und/oder biologisch aktiven Komponenten komplimentiert sein kann, und zwar für das Wachstum und die Differenzierung der Zellen, die das Gel enthält.
Der so hergestellte Aufbau (Hydrogel + Zellen) kann in das Gelenk injiziert und anschließend durch Bestrahlung vernetzt werden, dank einer Strahlungsquelle, die direkt in die Synovial-Kavität durch Arthroskopie eingeführt wird. Mit diesem neuen Typ von durch Engineering bearbeitetem Knorpel ist es daher möglich, geschädigten Knorpel mittels Arthroskopie zu reparieren. Die Verwendung von Zellen enthaltenden Gelen, die photopolymerisiert werden, direkt in das Gelenk wurde bisher nie zuvor beschrieben. Die wissenschaftliche Literatur der ganzen Welt zu diesem Thema berichtet nur über Experimente, die mit Chondrozyten durchgeführt wurden, die in Kollagen-Fibrin-Gele eingearbeitet wurden (Perka et al., Clin. Exp. Rheumatol., 2000, 18 (1): 13 – 22), oder die in Alginat-Matrices enthalten sind (K. T. Paige et al., Plas. Reconstr. Rug. 1996, 97 (1): 179 – 180) oder in Agarose-Gelen gezüchtet wurden und chirurgisch auf den geschädigten Knorpel aufgebracht wurden, jedoch wurde in keinem dieser Experimente das die Zellen enthaltende Gel direkt an der Anwendungsstelle polymerisiert.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrogelen, gegebenenfalls mit Zellen, als viskoelastische Ersatzstoffe für den Nukleus pulposus der Bandscheibe im Anschluss an degenerative Pathologien oder einem Vorfall der Wirbelsäule. Auch in diesem Fall ist die Möglichkeit eines Gelierens des Biopolymers durch Photovernetzung in situ durch örtliche Bestrahlung unter Verwendung von Endoskopie-Sonden mit optischen Fasern sehr interessant und innovativ.
Darüber hinaus können die Hydrogele in Bezug auf deren besondere viskoelastische charakteristische Eigenschaften, die durch die Photo-Vernetzung der vorliegenden Ester-Derivate erhalten werden, im Bereich der Augen-Chirurgie als Visko-Integratoren des Glaskörpers verwendet werden.
Für rein beschreibende Zwecke ohne Beschränkung der Erfindung geben wir nachfolgend einige Beispiele der Herstellung von Hydrogelen gemäß der vorliegenden Erfindung an.
Beispiel 1
Herstellung eines Hyaluronsäure-Derivats, bei dem 70 % der Carboxyl-Gruppen mit 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (HHMP) verestert sind und die restlichen 30 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
6,21 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (10 mEq) wurden in 248 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) bei Raumtemperatur solubilisiert. Dieser Lösung wurden 2 g HHMP-Bromid (7 mEq) zugesetzt, und die so erhaltene Lösung wurde bei 37 °C 48 h lang gehalten. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der dann filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton: Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
5,3 g des Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatography) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 2
Herstellung eines Hyaluronsäure-Derivats, bei dem 50 % der Carboxyl-Gruppen mit 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (HHMP) verestert sind und die restlichen 50 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
6,21 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (10 mEq) wurden in 248 ml DMSO bei Raumtemperatur solubi lisiert. Dieser Lösung wurden 1,4 g HHMP-Bromid (5 mEq) zugesetzt, und die so erhaltene Lösung wurde bei 37 °C 36 h lang gehalten. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der dann filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton: Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
4,9 g des gewünschten Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatography) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 3
Herstellung eines Hyaluronsäure-Derivats, bei dem 25 % der Carboxyl-Gruppen mit 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (HHMP) verestert sind und die restlichen 75 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
6,21 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (10 mEq) wurden in 248 ml DMSO bei Raumtemperatur solubilisiert. Dieser Lösung wurden 0,72 g HHMP-Bromid (2,5 mEq) zugesetzt, und die Lösung wurde bei 37 °C 24 h lang gehalten. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der dann filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton: Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
4,4 g des gewünschten Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatography) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 4
Herstellung eines Hyaluronsäure-Derivats, bei dem 25 % der Carboxyl-Gruppen mit 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (HHMP) verestert sind, 25 % der Carboxyl-Gruppen mit Benzylalkohol verestert sind und die restlichen 50 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
6,21 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (10 mEq) wurden in 248 ml DMSO bei Raumtemperatur solubilisiert. Dieser Lösung wurden 0,72 g HHMP-Bromid (2,5 mEq) zugesetzt, und die Lösung wurde bei 37 °C 24 h lang gehalten. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur zurückgebracht, und es wurden 0,29 ml Benzylbromid (2,5 mEq) zusätzlich zugesetzt. Die Lösung wurde dann für weitere 36 h erneut auf 37 °C erwärmt. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton:Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
4,6 g des gewünschten Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP und Benzylalkohol wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatograhpy) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 5
Herstellung eines Hyaluronsäure-Derivats, bei dem 15 % der Carboxyl-Gruppen mit Dodecylamin amidiert sind, 25 % der Carboxyl-Gruppen mit HHMP verestert sind und die restlichen 60 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
6,21 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (10 mEq) wurden in 248 ml DMSO bei Raumtemperatur solubilisiert. Dieser Lösung wurden 0,6 ml (9 mEq) 99 %ige Methansulfonsäure und anschließend 0,240 g (1,5 mEq) 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) zugesetzt. Die Mischung wurde für die Zeit von 60 bis 90 Minuten zur Umsetzung belassen. Sie wurde auf 37 °C erwärmt, und es wurden 0,465 g (2,5 mEq) Dodecylamin zugesetzt. Die Mischung wurde 24 h lang bei 37 °C reagieren gelassen. Man ließ die Lösung zurück auf Raumtemperatur kommen und es wurden 0,72 g HHMP-Bromid (2,5 mEq) zugesetzt. Die Lösung wurde erneut auf 37 °C für die Zeit von 24 h erwärmt. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton: Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
4,5 g des gewünschten Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP und Dodecylamin wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatography) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 6
Herstellung eines Hyaluronsäure-Esters, bei dem 50 % der Carboxyl-Gruppen mit HHMP verestert sind und die restlichen 50 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind, ausgehend von einer sulfatierten Hyaluronsäure mit einem Sulfatierungs-Grad von 3 (Sulfatierungs-Grad = Zahl der OH-Gruppen in einer wiederholenden Einheit von Hyaluronsäure, die durch SO₃-Gruppen ersetzt wurden).
1 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure wurde in 40 ml DMSO solubilisiert. Dieser Lösung wurden 5,22 g eines in 40 ml DMSO solubilisierten SO₃-Pyridin-Komplexes zugesetzt. Die Lösung wurde auf 4 °C abgekühlt und unter Rühren 1 h lang gehalten. Anschließend wurden 200 ml Wasser zugesetzt, und der pH-Wert der schließlich erhaltenen Lösung wurde auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 mit einer wässrigen 1 M Natriumhydroxid-Lösung eingestellt. Durch Zusatz von 850 ml absoluten Ethanols zu der so erhaltenen Lösung wurde ein Niederschlag erhalten, der dialysiert wurde, um die Rest-Salze zu eliminieren. Das so erhaltene Produkt wurde in Wasser solubilisiert und auf ein Sulfon-Harz (in der Tetrabutylammonium-Form) getropft, und so wurde das Anfangssalz erhalten. So wurden 12,7 g sulfatierte Hyaluronsäure mit einem Sulfatierungsgrad von 3 in Form des Tetrabutylammonium-Salzes erhalten.
7,9 g des Tetrabutylammonium-Salzes der sulfatierten Hyaluronsäure, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (5 mEq) wurden in 248 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) bei Raumtemperatur solubilisiert. Dieser Lösung wurden 0,7 g HHMP-Bromid (2,5 mEq) zugesetzt, und die Lösung wurde bei 37 °C 36 h lang gehalten. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton: Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
4 g des gewünschten Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatography) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 7
Herstellung eines Hyaluronsäure-Derivats, bei dem 25 % der Carboxyl-Gruppen mit 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (HHMP) verestert sind, 10 % der Carboxyl-Gruppen in die Bildung von inneren Ester-Bindungen involviert sind und die restlichen 65 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
6,21 g des Tetrabutylammonium-Salzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 180.000 Da (10 mEq) wurden in 248 ml DMSO bei Raumtemperatur solubilisiert. Dieser Lösung wurden 0,72 g HHMP-Bromid (2,5 mEq) zugesetzt, und die Lösung wurde bei 37 °C 24 h lang gehalten. Anschließend wurden 0,404 g Triethylamin (4 mEq) zugesetzt, und die Lösung wurde 30 min lang gerührt. Eine Lösung von 1,022 g (4 mEq) 2-Chlor-1-methyl-pyridiniodid in 100 ml DMSO wurde zugesetzt, und die Mischung wurde bei 30 °C 15 h lang gehalten. Eine 2,5 %ige (w/w) Lösung von NaCl in Wasser wurde dann zugesetzt, und die resultierende Mischung wurde unter Rühren in 750 ml Aceton gegossen. Es bildete sich ein Niederschlag, der filtriert und dreimal mit 100 ml einer Mischung aus Aceton: Wasser = 5:1 gewaschen wurde, dann dreimal mit 100 ml Aceton gewaschen wurde und zum Schluss 24 h lang bei 30 °C im Vakuum getrocknet wurde.
4,6 g des gewünschten Produktes gemäß Titel wurden so erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Gehalts an HHMP und Benzylalkohol wurde durch HPLC (high Pressure liquid chromatography) nach alkalischer Hydrolyse durchgeführt. Der Gesamtgehalt an Ester-Gruppen wurde nach dem Verseifungsverfahren gemessen, das auf den Seiten 169 – 172 der Druckschrift „Quantitative organic analysis via functional group", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons Publication, beschrieben ist.
Beispiel 8
Herstellung eines Hydrogels aus einem Hyaluronsäure-Derivat, bei dem 70 % der Carboxyl-Gruppen mit 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon (HHMP) verestert sind und die restlichen 30 % der Carboxyl-Gruppen mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
Das wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Ester-Derivat wurde bei Raumtemperatur in gereinigtem Wasser in einer Konzentration von 25 g/l solubilisiert. Die so erhaltene Lösung wurde ultraviolette Strahlung mit einer Wellenlänge von 366 nm unter Verwendung einer UV-Lampe, Modell CAMAG (220 V; 0,18 A) für eine Belichtungszeit von 30 Minuten ausgesetzt.
Beispiel 9
Bewertung der Wirkung von ultravioletter Strahlung (UV-Strahlung) auf den Karyotyp von bestrahlten Human-Fibroblasten
Drei Proben von Human-Fibroblasten (2 × 10⁶) wurden mit UV-Licht für drei unterschiedliche Belichtungszeiten (3, 15 und 30 Minuten) bestrahlt.
Nach Bestrahlung wurde jede Zellprobe in zwei Aliquots aufgeteilt und wie folgt behandelt:

– Das erste Aliquot wurde unmittelbar analysiert, um den Karyotyp zu bestimmen;
– das zweite Aliquot wurde in eine Kultur-Schale ausgebracht, die 10 % fetalen Kälberserums (nachfolgend bezeichnet als FCS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium enthielt (nachfolgend bezeichnet als DMEM-Kulturmedium).

Man ließ die zweite Probe von Zellen drei Zell-Lebenszyklen lang proliferieren, und am Ende wurden die Fibroblasten zur Bestimmung des Karyotyps hergestellt.
Analysen, die an den Zellen unmittelbar nach der Bestrahlung durchgeführt wurden und die an den Fibroblasten durchgeführt wurden, die in vitro drei Zell-Lebenszyklen lang belassen worden waren, zeigten, dass keine Veränderungen in den Chromosomen während irgendeiner der Belichtungszeiten mit UV-Strahlung aufgetreten waren.
Beispiel 10
Kultur von Human-Fibroblasten, die in dem Hydrogel gemäß der Erfindung enthalten waren
2 × 10⁶ Fibroblasten wurden von der Kultur-Schale entnommen, bei 1.500 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert und in 3 ml DMEM-Kulturmedium resuspendiert, das 10 % FCS enthielt. Die Zellen wurden dann unter schwachem Rühren zu 3 ml einer wässrigen Lösung des Hyaluronsäure-Derivats zugesetzt, das wie oben in Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden war, und zwar in einer Konzentration von 100 mg/ml, was eine End-Lösung von 6 ml ergab, die 2 × 10⁶ Zellen enthielt. Diese Lösung wurde erneut in Kultur-Wells ausgebracht, unmittelbar mit UV-Licht für 12 Minuten bestrahlt und dann in einen Inkubator eingebracht, der auf 37 °C eingestellt war. 24 Stunden später wurden die Zellen mittels MTT auf Zell-Lebensfähigkeit getestet: Ein Tetrazolium-Salz wurde einem Oxidations-Reduktions-Reaktionszyklus nur durch mitochondirale Enzyme lebensfähiger Fibroblasten ausgesetzt (F. Dezinot et al., J. Immunol. Methods, 1986, 22 (89): 271 – 277).
Die 1A und 1B zeigen die gefärbten lebensfähigen Zellen (10- und 32-fach vergrößert) innerhalb des vorliegenden Hydrogels nach 24 Stunden in Kultur.
Nachdem die Erfindung wie vorstehend beschrieben wurde, ist es klar, dass diese Verfahrensweisen auf verschiedene Weise modifiziert werden können.

Claims

Ester-Derivate von Hyaluronsäure oder von Hyaluronsäure-Derivaten, worin ein Teil der Carboxyl-Gruppen von Hyaluronsäure oder von Hyaluronsäure-Derivaten verestert ist mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I)
worin R gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Hydroxy-Gruppen, Alkoxy-Gruppen mit einer Alkyl-Kette C₁ bis C₂₀, die eine oder mehrere Hydroxy-Gruppen trägt, und Heterozyklus-Gruppen, die eine oder mehrere Hydroxy-Gruppen tragen; und R₁, R₂ und R₃ gleich zueinander oder voneinander verschieden sind und gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff, Hydroxy, Alkyl-C₁ bis -C₂₀, möglicherweise substituiert mit einer oder mehreren Hydroxy-Gruppen, und Alkoxy-C₁ bis -C₂₀, möglicherweise substituiert mit einer oder mehreren Hydroxy-Gruppen.
Ester-Derivate nach Anspruch 1, worin das Propiophenon-Derivat gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus 4-(2,3-Dihydroxypropoxy-)3-methoxypropiophenon, 4'-(2-Hydroxy-3-morpholinopropoxy-)propiophenon und 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon.
Ester-Derivate nach Anspruch 2, worin das Propiophenon-Derivat 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon ist.
Ester-Derivate nach Anspruch 1, worin die Prozentmenge an Carboxyl-Gruppen von Hyaluronsäure oder von Hyaluronsäure-Derivaten, die mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) verestert sind, niedriger ist als 75 %.
Ester-Derivate nach Anspruch 1, worin die Carboxyl-Gruppen, die nicht mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) verestert sind, mit Natrium zum Salz umgesetzt sind.
Ester-Derivate nach Anspruch 1, worin die Hyaluronsäure-Derivate keine C=C-Bindungen umfassen und gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus: – Hyaluronsäure-Estern, in denen eine Prozentmenge der Carboxyl-Gruppen, die nicht 75 % übersteigt, verestert sind mit Alkoholen der aliphatischen, araliphatischen, zykloaliphatischen, aromatischen, zyklischen und heterozyklischen Reihe, und die restliche Prozentmenge nicht veresterter Carboxyl-Gruppen mit quaternären Ammonium-Salzen zum Salz umgesetzt sind und so eine zweite Veresterung mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) erlauben; – Hyaluronsäureamiden, worin eine Prozentmenge der Carboxyl-Gruppen, die 50 % nicht übersteigt, mit Aminen der aliphatischen, araliphatischen, zykloaliphatischen, aromatischen, zyklischen und heterozyklischen Reihe amidiert sind, und die restliche Prozentmenge nicht amidierter Carboxyl-Gruppen mit quaternären Ammonium-Salzen zum Salz umgesetzt sind und so eine zweite Veresterung mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) erlauben; – quaternären Ammonium-Salzen von N-sulfatierten oder O-sulfatierten Derivaten von Hyaluronsäure; und – inneren Ester von Hyaluronsäure, worin eine Prozentmenge der Carboxyl-Gruppen, die 20 % nicht übersteigt, mit Alkohol-Gruppen derselben Hyaluronsäure-Kette oder einer davon verschiedenen Kette verestert sind und die restliche Prozentmenge nicht veresterter Carboxyl-Gruppen mit quaternären Ammonium-Salzen zum Salz umgesetzt sind und so eine zweite Veresterung mit den Propiophenon-Derivaten der Formel (I) erlauben.
Ester-Derivate nach Anspruch 6, worin die quaternären Ammonium-Salze Tetrabutylammonium-Salze sind.
Ester-Derivate nach Anspruch 6, worin der Hyaluronsäure-Ester mit Alkoholen der aliphatischen, araliphatischen, zykloaliphatischen, aromatischen, zyklischen und heterozyklischen Reihe ein Hyaluronsäure-Ester mit Benzylalkohol ist.
Ester-Derivate nach Anspruch 6, worin das Hyaluronsäure-Amid mit Aminen der aliphatischen, araliphatischen, zykloaliphatischen, aromatischen, zyklischen und heterozyklischen Reihe ein Hyaluronsäure-Amid mit Dodecylamin ist.
Ester-Derivate nach Anspruch 1, worin die Hyaluronsäure oder das Hyaluronsäure-Derivat ein Molekulargewicht hat, das im Bereich zwischen 150.000 und 1.000.000 Da liegt.
Ester-Derivate nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ester-Derivate mit Propiophenon-Derivaten der Formel (I) in Wasser löslich sind.
Verfahren zur Herstellung von Ester-Derivaten, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 11 beschrieben sind, umfassend die Reaktion von Hyaluronsäure oder von Hyaluronsäure-Derivaten mit dem Bromid der Propiophenon-Derivate der Formel (I), worin wenigstens eine Hydroxy-Gruppe des Substituenten R durch Br ersetzt ist, wodurch man die Ester-Derivate erhält.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Bromid des Propiophenon-Derivats das Bromid von 2-Hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy-)2-methylpropiophenon ist.
Hydrogel-Material, bestehend aus einem vernetzten Produkt, das erhalten wurde durch Photo-Härten eines Ester-Derivats, wie es in den Ansprüchen 1 bis 11 beschrieben ist.
Hydrogel-Material nach Anspruch 14, worin das Photo-Härten durchgeführt wird durch Bestrahlen mit Licht, das eine Wellenlänge aufweist, die im Bereich zwischen 280 und 750 nm liegt.
Hydrogel-Material nach Anspruch 14, worin das Photo-Härten durchgeführt wird durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen.
Hydrogel-Material nach Anspruch 14, worin das Photo-Härten durchgeführt wird durch Bestrahlung mit Licht mit einer Wellenlänge von 366 nm.
Verfahren zur Herstellung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist, umfassend ein Photo-Harten der Ester-Derivate, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 11 beansprucht sind, gegebenenfalls gelöst in Wasser oder in einer wässrigen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Photo-Härten durchgeführt wird durch Bestrahlen mit Licht, das eine Wellenlänge aufweist, die im Bereich zwischen 280 und 750 nm liegt.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Photo-Härten durchgeführt wird durch Bestrahlen mit ultravioletten Strahlen.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Photo-Härten durchgeführt wird durch Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge von 366 nm.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Ester-Derivate in Wasser oder in einer wässrigen Lösung gelöst sind und ihre Konzentration im Bereich zwischen 0,01 und 100 % (w/w) liegt.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Konzentration der Ester-Derivate im Bereich zwischen 0,1 und 50 % (w/w) liegt.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Photo-Härten durchgeführt wird mit einer Belichtungszeit, die im Bereich zwischen 2 und 30 Minuten liegt.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Photo-Härten durchgeführt wird bei einer Belichtungszeit, die im Bereich zwischen 3 und 15 Minuten liegt.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Photo-Härten durchgeführt wird bei einer Temperatur, die im Bereich von 1 bis 40 °C liegt.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Photo-Härten durchgeführt wird bei Raumtemperatur.
Biomedizinische Materialien, Produkte zur Gesundheitspflege und chirurgische Gegenstände, hergestellt aus dem oder beschichtet mit dem Hydrogel-Material, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist.
Biomedizinische Materialien, Produkte zur Gesundheitspflege und chirurgische Gegenstände nach Anspruch 28, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Kathetern, Leit-Kanälen, Herzklappen, Vaskular-Stents, Weichgewebe-Prothesen, Prothesen tierischen Ursprungs wie beispielsweise Schweine-Herzklappen, künstliche Sehnen und Organe, Kontaktlinsen und Intraokular-Linsen, Blut-Oxygenatoren, Blut-Beutel, Operationsinstrumente, Filtrations-Systeme und Labor-Instrumente.
Biomedizinische Materialien, Produkte zur Gesundheitspflege und chirurgische Gegenstände nach Anspruch 28, beschichtet mit dem Hydrogel-Material mittels Plasma-Beschichtungs-Technik.
Gerüste für das Wachstum humaner und tierischer, differenzierter und/oder undifferenzierter Zellen, umfassend das Hydrogel-Material, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend ein Hydrogel-Material, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 32, umfassend weiter eine pharmakologisch und/oder biologisch aktive Substanz oder eine Verbindung davon.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 33, worin die pharmakologisch oder biologisch aktiven Substanzen gewählt sind aus Proteinen, Wachstumsfaktoren, Enzymen, Antikörpern und Arzneimitteln.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 32 zur topischen, subkutanen, intramuskulären, intraartikularen und intramedullaren Verabreichung.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 33, worin das Hydrogel-Material das Mittel für eine gesteuerte Freisetzung der aktiven Substanzen ist.
Verwendung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist, in den Bereichen Biomedizin, Gesundheitspflege und Chirurgie und als Systeme für die gesteuerte Freisetzung von Arzneimitteln.
Verwendung des Hydrogel-Materials nach Anspruch 37 bei der Prävention von Haftungen bei chirurgischen Operationen.
Verwendung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist, für die Herstellung von bearbeiteten Bindegeweben.
Verwendung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist, für die Herstellung von engineertem Knorpelgewebe.
Verwendung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist, für die Herstellung von viskoelastischen Substituten des Nucleus pulposus der Bandscheiben.
Verwendung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist für die Herstellung von Viskointegratoren des Glaskörpers.
Kit zum Implantieren von engineertem Knorpelgewebe durch arthroskopische Chirurgie, umfassend ein Ester-Derivat, wie es in Ansprüchen 1 bis 11 beansprucht ist, gelöst in Wasser oder in einer wässrigen Lösung, einen Behälter für das Ester-Derivat und eine endoskopische Sonde mit optischen Fasern, die geeignet sind für das in-situ-Photo-Harten des Ester-Derivats.
Kit nach Anspruch 43, umfassend weiter Human-Fibroplasten und/oder ein den Ester-Derivaten zugesetztes Arzneimittel.
Kit nach Anspruch 43, worin der Behälter ein Behälter ist, der geeignet für eine Injektion des Ester-Derivats ist.
Kit nach Anspruch 43, worin die endoskopische Sonde geeignet ist für die in-situ-Bestrahlung des Ester-Derivats mit UV-Strahlen.
Verwendung des Hydrogel-Materials, wie es in den Ansprüchen 14 bis 17 beansprucht ist, für die Herstellung von engineertem Knorpelgewebe, das direkt an der Stelle der Aufbringung durch Arthroskopie vernetzt wird.