DE69925361T2

DE69925361T2 - Vernetzbare macromere, die eine initiatorgruppe tragen

Info

Publication number: DE69925361T2
Application number: DE69925361T
Authority: DE
Inventors: J. Stephen CHUDZIK; B. Aron ANDERSON
Original assignee: Surmodics Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: EP1063975B1; CA2323925A1; AU744190B2; US6007833A; DE69925361D1; MXPA00009170A; JP4727812B2; WO1999047129A1; EP1593377A1; AU2903599A; EP1063975A1; CA2323925C; US6156345A; JP2002506813A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Matrizes durch die Polymerisation von Makromeren. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Matrizes für solche Zwecke wie Zellimmobilisierung, Gewebeanhaftung und kontrollierte Arzneistoffabgabe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Matrizes sind polymere Netzwerke, die durch Unlöslichkeit in Wasser gekennzeichnet sind. Ein Typ von polymerer Matrix ist ein Hydrogel, das definiert werden kann als ein wasserhaltiges polymeres Netzwerk. Die Polymere, die verwendet werden, um Hydrogele herzustellen, können auf einer Vielzahl von Monomer-Typen beruhen, wie etwa denjenigen, die auf Methacryl- und Acrylester-Monomeren, Acrylamid(Methacrylamid-)-Monomeren und N-Vinyl-2-pyrrolidon beruhen. Um das Gel zu bilden, werden diese Monomer-Klassen typischerweise mit solchen Vernetzungsmitteln, wie Ethylendimethacrylat, N,N'-Methylenbisacrylamid, Methylenbis(4-phenylisocyanat), Ethylendimethacrylat, Divinylbenzol und Allylmethacrylat vernetzt.
Ein weiterer Typ von polymerem Netzwerk kann aus hydrophoberen Monomeren und/oder Makromeren gebildet werden. Matrizes, die aus diesen Materialien gebildet werden, schließen im allgemeinen Wasser aus. Polymere, die verwendet werden, um hydrophobe Matrizes herzustellen, können auf einer Vielzahl von Monomer-Typen beruhen, wie etwa Alkylacrylaten und -methacrylaten und Polyester-bildenden Monomeren, wie etwa ε- Caprolacton und Lactid. Wenn sie zur Verwendung in einer wäßrigen Umgebung formuliert sind, müssen diese Materialien nicht vernetzt werden, aber sie können mit Standardagentien wie etwa Divinylbenzol vernetzt werden. Hydrophobe Matrizes können auch aus Reaktionen von Makromeren gebildet werden, die die geeigneten reaktiven Gruppen tragen, wie etwa die Reaktion von Diisocyanat-Makromeren mit Dihydroxy-Makromeren und die Reaktion von Diepoxy-enthaltenden Makromeren mit Dianhydrid- oder Diamin-enthaltenden Makromeren.
Obgleich eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung polymerer Netzwerke existiert, ist, wenn diese Netzwerke in Gegenwart von lebensfähigem Gewebe erzeugt werden und/oder eine biologisch aktive Verbindung enthalten sollen, die Anzahl von annehmbaren Verfahren zur Herstellung polymerer Netzwerke extrem beschränkt.
Es ist nichtsdestoweniger wünschenswert, sowohl Hydrogel- als auch Nicht-Hydrogel-Matrizes in Gegenwart von lebensfähigem Gewebe oder biologisch aktiven Agentien für die Zwecke der Arzneistoffabgabe, zellulären Immunisolation, Verhinderung von Adhäsionen nach chirurgischem Eingriff, Gewebereparatur und dergleichen zu bilden. Diese polymeren Matrizes können in zwei Kategorien unterteilt werden: biologisch abbaubare oder biologisch resorbierbare Polymernetzwerke und biologisch stabile Polymernetzwerke.
Biologisch abbaubare polymere Matrizes sind bereits für eine Vielzahl von Zwecken vorgeschlagen worden, einschließlich Trägerstoffe mit kontrollierter Freisetzung, Klebstoffe und Dichtungsmittel. Wenn verwendet als Trägerstoffe mit kontrollierter Freisetzung, können polymere Matrizes zum Beispiel Arzneistoffe oder andere therapeutische Agentien enthalten und über die Zeit freisetzen. Solche Matrizes können zum Beispiel in einer Reihe von unterschiedlichen Verfahren hergestellt werden, einschließlich Lösemittelgießen hydrophober Polymere. Lösemittelgießen bringt typischerweise jedoch die Verwendung organischer Lösemittel und/oder hoher Temperaturen mit sich, was schädlich für die Aktivität biologischer Materialien sein kann und Herstellungsverfahren komplizieren kann. Lösemittelgießen von Polymeren aus der Lösung heraus führt auch zur Bildung nicht- vernetzter Matrizes. Solche Matrizes haben weniger Struktur als vernetzte Matrizes, und es ist schwieriger, die Freisetzung biologisch aktiver Agentien aus solchen Matrizes zu kontrollieren. Noch ein weiteres Verfahren, das die Polymerisation von Monomeren in oder um die gewünschten Materialien herum mit sich bringt, leidet an Komplikationen wegen der Cytotoxizität von Monomeren, Sauerstoffhemmung und Polymerisationswärme.
Ein weiteres Verfahren, das in der Vergangenheit verwendet worden ist, um biologisch abbaubare und biologisch stabile Hydrogele herzustellen, bringt die Polymerisation von vorgeformten Makromeren unter Verwendung von Initiatoren mit niedrigem Molekulargewicht mit sich. Dieses Verfahren bringt jedoch ebenso eine Reihe von Nachteilen mit sich, einschließlich Überlegungen zu Toxizität, Wirksamkeit und Löslichkeit. Wenn man zum Beispiel eine Makromerlösung verwendet, die einen löslichen Initiator mit niedrigem Molekulargewicht enthält, um lebensfähiges Zellmaterial einzukapseln, kann der Initiator die Zellmembran durchdringen und in die Zellen hinein diffundieren. Das Vorhandensein des Initiators kann einige toxische Folgen für die Zellen mit sich bringen. Wenn aktiviert, erzeugen diese Initiatoren jedoch freie Radikale mit ausgeprägtem cytotoxischen Potential. Weitere Nachteile treten auf, wenn der Initiator aus der gebildeten Matrix heraus diffundieren kann, wodurch Toxizität und andere Dinge erzeugt werden. Solche Initiatoren neigen auch dazu, in wäßriger Lösung zu aggregieren, was Effizienz- und Reproduzierbarkeitsprobleme verursacht. Schließlich ist es, angesichts der begrenzten Effizienz vieler Initiatoren zum Initiieren der notwendigen Radikalkettenpolymerisation, oft notwendig, einen oder mehrere monomere Polymerisations-„Beschleuniger" zur Polymerisationsmischung zuzugeben. Solche Beschleuniger neigen dazu, kleine Moleküle zu sein, die die Zellmembran durchdringen können, und führen oft zu cytotoxischen oder karzinogenen Bedenken.
U.S.-Patent Nrn. 5,410,016 (Hubbell et al.) und 5,529,914 (Hubbell et al.) betreffen zum Beispiel Hydrogele, die aus biologisch abbaubaren und biologisch stabilen polymerisierbaren Makromeren hergestellt sind. Die Hydrogele werden aus diesen polymerisierbaren Makromeren durch die Verwendung löslicher Initiatoren mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt. Solche Initiatoren können mit den Makromeren zusammengebracht und in Gegenwart von Zellen bestrahlt werden, um ein Gel zu bilden, das die Zellen einkapselt.
Hydrogele leiden oft an ähnlichen oder anderen Nachteilen bei Verwendung als biologische Kleber oder Dichtungsmittel, z.B. zur Verwendung als Gewebekleber, endovaskuläres Paving, Verhinderung von Adhäsionen nach chirurgischem Eingriff, etc.. In jeder der Anwendungen muß die Hydrogel-Matrix im allgemeinen an einer oder mehreren Gewebeflächen „anhaften". Gegenwärtige Verfahren beruhen auf physikalischer „Adhäsion" oder der Neigung von Hydrogelen, an einer Oberfläche zu „kleben". Ein überlegener Klebstoff würde sowohl physikalische als auch chemische Adhäsion an Oberflächen bereitstellen, durch Nutzung derselben physikalischen Eigenschaften wie gegenwärtige Hydrogel-Klebstoffe, aber auch durch Bereitstellung chemischer, kovalenter Kopplung des Matrixmaterials an die Gewebeoberfläche. Kovalente Bindungen sind im allgemeinen viel stärker als physikalische Adhäsionskräfte, wie etwa Wasserstoffbindung und van-der-Waals-Kräfte.
Wie oben beschrieben, neigen, wenn verschiedene Techniken verwendet werden, um polymere Matrizes über Photoinitiation von Makromeren herzustellen, die eingesetzten Photoinitatoren dazu, niedriges Molekulargewicht zu haben. Polymere Photoinitatoren sind ebenso beschrieben worden, obwohl für Anmeldungen und Systeme, die von denjenigen, die oben beschrieben sind, recht verschieden sind. Siehe zum Beispiel „Radical Polymerization", C.H. Bamford, S. 940-957 in Kroschwitz Hrg., Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 1990. In dem Unterabschnitt mit dem Titel "Photosensitized Initiation: Polymeric Photosensitizers and Photoinitiators", führt der Autor aus, daß "[p]olymere Photosensibilisatoren und Photoinitiatoren beschrieben worden sind. Viele von diesen sind Polymere auf der Basis von Benzophenon, z.B. Poly(p-divinylbenzophenon) (DVBP). Es wird berichtet, daß solche starren Polymere wirksame Sensibilisatoren sind, da Wasserstoffabstraktion von der Hauptkette durch angeregtes Benzophenon weniger wahrscheinlich ist." U.S.-Patent Nr. 4,315,998 (Neckers) beschreibt polymergebundene photosensibilisierende Katalysatoren zur Verwendung bei der heterogenen Katalyse photosensibilisierter chemischer Reaktionen, wie etwa Photooxidations-, Photodimerisations- und Photocycloadditionsreaktionen. Die polymergebundenen photosensibilisierenden Katalysatoren sind in Wasser und üblichen organischen Lösemitteln unlöslich und können daher leicht vom Reaktionsmedium und von Reaktionsprodukten durch einfache Filtration abgetrennt werden.
Was klar gebraucht wird, sind Makromere und Makromersysteme, die die mit herkömmlichen polymeren Matrizes verbundenen Probleme vermeiden und insbesondere diejenigen Nachteile, die auftreten, wenn polymere Matrizes in Gegenwart von lebensfähigem Gewebe und biologisch aktiven Agentien gebildet werden.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein vernetzbares Makromersystem bereitgestellt, das ein oder mehrere Polymere umfaßt, die gebundene polymerisierbare Gruppen und gebundene Initiatorgruppen liefern, wobei das System adaptiert ist, um polymerisiert zu werden, um eine für in-vivo-Anwendung geeignete Matrix zu bilden.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung einer polymeren Matrix bereitgestellt, die für in-vivo-Anwendung adaptiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß ein Makromersystem gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, das System auf ein Substrat aufgebracht wird und das System durch radikalische Polymerisation vernetzt wird, um eine Matrix zu bilden.
Zusätzlich wird auch eine polymere Matrix bereitgestellt, die für in-vivo-Anwendung adaptiert ist, wobei die Matrix ein Makromersystem gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt, wobei das System durch radikalische Polymerisation vernetzt worden ist, um eine Matrix zu bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein vernetzbares Makromersystem zur Verfügung, das zwei oder mehrere polymergebundene polymerisierbare Gruppen und eine oder mehrere polymergebundene Initiatorgruppen umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die polymerisierbaren Gruppen und die Initiatorgruppe(n) an dieselbe polymere Hauptkette gebunden. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform sind die polymerisierbaren Gruppen und die Initiatorgruppe(n) an unterschiedliche polymere Hauptketten gebunden.
In der ersten Ausführungsform umfaßt das Makromersystem eine polymere Hauptkette, an die sowohl die polymerisierbaren Gruppen als auch die Initiatorgruppe(n) kovalent gebunden sind. Initiator-Seitengruppen können bereitgestellt werden durch Binden der Gruppen an die Hauptkette zu jeder geeigneten Zeit, z.B. entweder vor der Bildung des Makromers (zum Beispiel an Monomere, die verwendet werden, um das Makromer herzustellen) oder an das vollständig ausgebildete Makromer selbst. Das Makromersystem wird typischerweise nur einen kleinen Prozentanteil Makromere umfassen, die sowohl Initiatorgruppen als auch polymerisierbare Gruppen tragen. Die Mehrzahl von Makromeren wird nur gebundene polymerisierbare Gruppen bereitstellen, da die Initiatorgruppen typischerweise ausreichend sind, wenn sie mit weit weniger als einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 mit Makromermolekülen vorliegen.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Makromersystem sowohl polymerisierbare Makromere, im allgemeinen ohne gebundene Initiatorgruppen, in Kombination mit einem polymeren Initiator. In jeder Ausführungsform wird der Initiator hierin als ein „polymerer Initiator" bezeichnet werden, wegen der Bindung solcher Initiatorgruppen an eine polymere Hauptkette.
Makromersysteme der vorliegenden Erfindung, die polymere Initiatoren einsetzen, stellen eine Reihe von unerwarteten Vorteilen gegenüber der Verwendung polymerisierbarer Makromere und separater Initiatoren mit niedrigem Molekulargewicht bereit. Solche Systeme stellen zum Beispiel eine optimale Kombination solcher Eigenschaften wie Ungiftigkeit, Effizienz und Löslichkeit bereit. Löslichkeit kann zum Beispiel durch die Fähigkeit verbessert werden, wäßrige oder organische Löslichkeit des polymerisierbaren Makromers durch Kontrolle der Hauptkette zu kontrollieren. Toxizität kann ebenfalls verbessert werden, da die polymeren Initiatoren dieser Erfindung typischerweise im Laufe der Immobilisierung nicht in Zellen hinein diffundieren können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Initiator-Seitengruppen aus der Gruppe ausgewählt, die aus durch langwelliges ultraviolettes (LWUV) Licht aktivierbaren Molekülen, wie etwa 4-Benzoylbenzoesäure, [(9-Oxo-2-thioxanthanyl)-oxy]essigsäure, 2-Hydroxythioxanthon und Vinyloxymethylbenzoinmethylether; durch sichtbares Licht aktivierbaren Molekülen; Eosin Y, Bengalrosa, Campherchinon und Erythrosin und thermisch aktivierbaren Molekülen; 4,4'-Azobis(4-cyanopentan)säure und 2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-Dihydrochlorid besteht. Eine wichtige Eigenschaft der Initiatorgruppe ist die Fähigkeit, gekoppelt zu werden an ein vorgeformtes Makromer, das polymerisierbare Gruppen enthält, oder modifiziert zu werden, um ein Monomer zu bilden, das an der Makromersynthese teilnehmen kann, der anschließend das Hinzufügen von polymerisierbaren Gruppen folgt.
In solch einer Ausführungsform sind die gebundenen polymerisierbaren Gruppen vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus Vinyl-Seitengruppen, Acrylat-Seitengruppen, Methacrylat-Seitengruppen, Ethacrylat-Seitengruppen, 2-Penylacrylat-Seitengruppen, Acrylamid-Seitengruppen, Methacrylamid-Seitengruppen, Itaconat-Seitengruppen und Styrol-Seitengruppen besteht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die polymere Hauptkette ausgewählt aus der Gruppe, die aus synthetischen Makromeren, wie etwa Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenoxid (PEO) und Polyethylenglykol (PEG); derivatisierbaren natürlich vorkommenden Polymeren, wie etwa Cellulose, Polysacchariden, wie etwa Hyaluronsäure, Dextran und Heparin; und Proteinen, wie etwa Collagen, Gelatine und Albumin, besteht.
Das Makromer der vorliegenden Erfindung kann in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich kontrollierter Arzneistoff-Freisetzung, der Herstellung von Gewebeklebstoffen und -dichtungsmitteln, der Immobilisierung von Zellen und der Herstellung dreidimensionaler Körper für Implantate. In einem Aspekt stellt die Erfindung zum Beispiel ein Verfahren zum Immobilisieren von Zellen bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß ein polymerer Initiator der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren polymerisierbaren Makromeren und in Gegenwart von Zellen unter Bedingungen, die geeignet sind, das Makromer in einer Weise zu polymerisieren, die die Zellen immobilisiert, umfaßt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Wie hierin verwendet, sollen die folgenden Worte und Begriffe die ihnen unten zugeschriebene Bedeutung haben:
„Makromersystem" soll sich auf ein polymerisierbares Polymersystem beziehen, das ein oder mehrere Polymere umfaßt, die polymerisierbare Seitengruppen und Initiatorseitengruppen bereitstellen. Gruppen können entweder auf derselben oder unterschiedlichen polymeren Hauptketten vorliegen, z.B. auf entweder einem polymerisierbaren Makromer oder einer nicht-polymerisierbaren polymeren Hauptkette;
„Polymerisierbares Makromer" soll eine polymere Hauptkette betreffen, die zwei oder mehr polymerisierbare (z.B. Vinyl-) Gruppen trägt;
„Initiatorgruppe" soll sich auf eine chemische Gruppe beziehen, die in der Lage ist, eine radikalische Reaktion zu initiieren, vorliegend als entweder eine Seitengruppe auf einem polymerisierbaren Makromer oder gebunden an eine separate, nicht-polymerisierbare Polymer-Hauptkette; und
„Polymerer Initiator" soll sich auf eine polymere Hauptkette (polymerisierbar oder nicht-polymerisierbar) beziehen, die eine oder mehrere Initiatorgruppen umfaßt und fakultativ eine oder mehrere weitere thermochemisch reaktive Gruppen oder Affinitätsgruppen enthält.
Die polymere Hauptkette dieser Erfindung kann entweder synthetisch oder natürlich vorkommend sein und schließt eine Reihe von Makromeren ein, die bereits zuvor als nützlich für die Herstellung von polymeren Matrizes beschrieben sind. Im allgemeinen ist die Hauptkette eine, die in wäßrigen Lösungen, wie etwa Wasser oder Wasser mit zugesetztem organischen Lösemittel (z.B. Dimethylsulfoxid), löslich oder nahezu löslich ist oder unter Verwendung eines geeigneten Lösemittels oder einer geeigneten Kombination von Lösemitteln löslich gemacht werden kann. Alternativ kann die polymere Hauptkette ein Material sein, das unter physiologischen Umgebungsbedingungen eine Flüssigkeit ist. Hauptketten zur Verwendung bei der Herstellung von biologisch abbaubaren Gelen sind vorzugsweise unter in-vivo-Bedingungen hydrolysierbar.
Im allgemeinen können die polymeren Hauptketten dieser Erfindung in zwei Kategorien unterteilt werden: biologisch abbaubare oder biologisch resorbierbare und biologisch stabile Reagentien. Diese können weiter in Reagentien unterteilt werden, die hydrophile Hydrogel-Matrizes bilden, und Reagentien, die Nicht-Hydrogel-Matrizes bilden.
Biologisch resorbierbare Hydrogel-bildende Hauptketten sind im allgemeinen natürlich vorkommende Polymere, wie etwa Polysaccharide, von denen Beispiele Hyaluronsäure (HA), Stärke, Dextran, Heparin und Chitosan einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sind; und Proteine (und andere Polyaminosäuren), von denen Beispiele Gelatine, Collagen, Fibronektin, Laminin, Albumin und aktive Peptiddomänen davon einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sind. Matrizes, die aus diesen Materialien hergestellt sind, zersetzen sich unter physiologischen Bedingungen, im allgemeinen über Enzym-vermittelte Hydrolyse.
Biologisch resorbierbare Matrix-bildende Hauptketten sind im allgemeinen synthetische Polymere, die über Kondensationspolymerisation eines oder mehrerer Monomere hergestellt sind. Matrix-bildende Polymere dieses Typs schließen Polylactid (PLA), Polyglykolid (PGA), Polycaprolacton (PCL) sowie Copolymere dieser Materialien, Polyanhydride und Polyorthoester ein.
Biologisch stabile Hydrogel-Matrix-bildende Hauptketten sind im allgemeinen synthetische oder natürlich vorkommende Polymere, die in Wasser löslich sind, deren Matrizes Hydrogele oder wasserhaltige Gele sind. Beispiele für diesen Typ von Hauptkette schließen Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Polyacrylamid (PAA), Polyvinylalkohol (PVA) und dergleichen ein.
Biologisch stabile Matrix-bildende Hauptketten sind im allgemeinen synthetische Polymere, die aus hydrophoben Monomeren hergestellt sind, wie etwa Methylmethacrylat, Butylmethacrylat, Dimethylsiloxanen und dergleichen. Diese Hauptketten-Materialien besitzen im allgemeinen keine signifikante Wasserlöslichkeit, können aber als reine Flüssigkeiten formuliert werden, die bei Aktivierung starke Matrizes bilden. Es ist auch möglich, Hauptkettenpolymere zu synthetisieren, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Monomere enthalten.
Polymere Hauptketten polymerisierbarer Makromere können fakultativ eine Reihe wünschenswerter Funktionen oder Attribute bereitstellen, wie z.B. beschrieben in den obengenannten Hubbell-Patenten, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme miteinbezogen sind. Hauptketten können mit wasserlöslichen Bereichen, biologisch abbaubaren Bereichen, hydrophoben Bereichen sowie polymerisierbaren Bereichen versehen werden.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „polymerisierbare Gruppe" sich im allgemeinen auf eine Gruppe beziehen, die durch Initiation durch Erzeugung freier Radikale polymerisierbar ist, am bevorzugtesten durch Photoinitiatoren, die durch sichtbare oder langwellige ultraviolette Strahlung aktiviert werden. Bevorzugte polymerisierbare Gruppen schließen Acrylate, Methacrylate, Ethacrylate, Itaconate, Acrylamide, Methacrylamid und Styrol ein.
Typischerweise werden polymerisierbare Gruppen in einem Makromer im Anschluß an die anfängliche Makromer-Herstellung unter Verwendung thermochemischer Standardreaktionen eingebaut. So können polymerisierbare Gruppen zum Beispiel zu Collagen über die Reaktion Amin-haltiger Lysinreste mit Acryloylchlorid oder Glycidylacrylat hinzugefügt werden. Diese Reaktionen führen zu Collagen, das polymerisierbare Seiteneinheiten enthält. In ähnlicher Weise können, wenn ein Makromer zur Verwendung, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, synthetisiert wird, Monomere, die reaktive Gruppen enthalten, in das Syntheseschema eingebaut werden Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) oder Aminopropylmethacrylamid (APMA) können zum Beispiel mit N-Vinylpyrrolidon oder Acrylamid copolymerisiert werden, was ein wasserlösliches Polymer mit Hydroxyl- oder Amin-Seitengruppen liefert. Diese Seitengruppen können anschließend mit Acryloylchlorid oder Glycidylacrylat umgesetzt werden, um wasserlösliche Polymere mit polymerisierbaren Seitengruppen zu bilden.
Initiatorgruppen, die im System der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen diejenigen ein, die verwendet werden können, um durch die Erzeugung freier Radikale die Polymerisation der Makromere bis zu einem gewünschten Ausmaß und innerhalb eines gewünschten Zeitrahmens zu initiieren. Vernetzung und Polymerisation werden im allgemeinen unter Makromeren durch einen lichtaktivierten Initiator für radikalische Polymerisation initiiert. Bevorzugte Initiatoren für Initiation durch langwelliges UV-Licht und sichtbares Licht schließen Ethyleosin, 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon, andere Acetophenon-Derivate, Thioxanthon, Benzophenon und Campherchinon ein.
Bevorzugte polymere Initiatoren sind photosensitive Moleküle, die Lichtenergie einfangen und die Polymerisation der Makromere initiieren. Weitere bevorzugte polymere Initiatoren sind thermosensitive Moleküle, die thermische Energie einfangen und die Polymerisation der Makromere initiieren.
Photoinitiation der radikalischen Polymerisation von Makromeren der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen durch einen von zwei Mechanismen eintreten. Der erste Mechanismus umfaßt eine homolytische alpha-Abspaltungsreaktion zwischen einer Carbonylgruppe und einem benachbarten Kohlenstoffatom. Dieser Reaktionstyp wird im allgemeinen als eine Reaktion vom Norrish-Typ I bezeichnet. Beispiele für Moleküle, die Reaktivität vom Norrish-Typ I zeigen und in einem polymeren Initiierungssystem nützlich sind, schließen Derivate von Benzoinether und Acetophenon ein.
Der zweite Mechanismus umfaßt eine Wasserstoffabstraktionsreaktion, entweder intra- oder intermolekular. Dieses Initiationssystem kann ohne zusätzliche Energieübertragungsakzeptormoleküle und unter Nutzung nicht-spezifischer Wasserstoffabstraktion verwendet werden, wird aber häufiger mit einem Energieübertragungsakzeptor, typischerweise einem tertiären Amin, verwendet, was zur Bildung von sowohl Aminoalkyl-Radikalen als auch Ketyl-Radikalen führt. Beispiele für Moleküle, die Wasserstoffabstraktionsreaktivität zeigen und in einem polymeren Initiierungssystem nützlich sind, schließen Analoga von Benzophenon, Thioxanthon und Campherchinon ein.
Wenn man einen polymeren Initiator der Wasserstoffabstraktions-Varietät verwendet, können gebundene tertiäre Amingruppen in die polymere Hauptkette des Makromers eingebaut werden. Dies wird sicherstellen, daß alle gebildeten freien Radikale polymergebunden sind.
Der dritte Mechanismus bringt Photosensibilisierungsreaktionen mit sich, die photoreduzierbare oder photooxidierbare Farbstoffe nutzen. In den meisten Fällen werden photoreduzierbare Farbstoffe zusammen mit einem Reduktionsmittel, typischerweise einem tertiären Amin, verwendet. Das Reduktionsmittel fängt das induzierte Triplett ab, wodurch das Radikal-Anion des Farbstoffs und das Radikal-Kation des Reduktionsmittels erzeugt werden. Beispiele für Moleküle, die Photosensibilisierungsreaktivität zeigen und in einem polymeren Initiierungssystem nützlich sind, schließen Eosin Y, Bengalrosa und Erythrosin ein. Reduktionsmittel können in die Polymer-Hauptkette eingebaut werden, wodurch sichergestellt wird, daß alle freien Radikale polymergebunden sein werden.
Thermisch reaktive polymere Initiatoren sind ebenfalls für die Polymerisation von Makromeren nützlich. Beispiele für thermisch reaktive Initiatoren, die in einem polymeren Initiierungssystem nutzbar sind, schließen 4,4'-Azobis(4-cyanopentansäure) und Analoga von Benzoylperoxid ein.
Ein überraschend günstiger Effekt der Verwendung polymerer Initiatoren, um Makromere zu polymerisieren, ist die erhöhte Effizienz der Polymerisation, die von diesen polymeren Initiatoren gezeigt wird, verglichen mit ihren Gegenstücken mit niedrigem Molekulargewicht. Diese erhöhte Effizienz ist in allen drei Photoinitiationsmechanismen, die für die Polymerisation von Makromeren nützlich sind, zu sehen.
Polymere Initiation von Monomer-Lösungen ist auf ihre Anwendung auf dem Gebiet der UV-härtbaren Beschichtungen für industrielle Zwecke untersucht worden, vgl. U.S.-Patent Nr. 4,315,998 (Neckers) und PCT-Anmeldung, Internationale Veröffentlichungsnummer WO 97/24376 (Kuester et al.), aber es hat keine Berichte über die Adaption der Verwendung polymerer Initiatoren für die Polymerisation von Makromeren in Gegenwart von biologischem Material oder zur Erzeugung von Arzneistoff-freisetzenden Matrizes gegeben.
Hohe Initiationseffizienz ist besonders wichtig in Systemen wie diesen. Es ist im allgemeinen wünschenswert, wenn polymere Matrizes in Gegenwart biologischer oder biologisch aktiver Materialien gebildet werden, die Einwirkungszeiten der Energiequelle, die verwendet wird, um die Polymerisation zu initiieren, auf das Material zu minimieren. Es ist daher zwingend erforderlich, daß das eingesetzte Initiationssystem optimale Initiationseffizienz besitzt.
Wenn Matrixfestigkeit oder -haltbarkeit für eine bestimmte Anwendung erforderlich sind, ist wieder hohe Effizienz eine notwendige Eigenschaft eines Initiationssystems. Wenn ein Matrix-bildendes System initiiert wird, wird die radikalische Polymerisation des Systems vorangetrieben, bis Gelierung und Glasumwandlung des polymerisierenden Systems die Diffusion der Elemente des Matrix-bildenden Systems zu schwierig machen. Daher gilt: Je höher die Effizienz des Initiationssystems, um so vollständiger die Polymerisation, was zur Bildung starker, haltbarerer Matrizes führt. Die polymeren Initiationssysteme, die in dieser Erfindung beschrieben sind, liefern einen höheren Grad an Effizienz, ohne die Verwendung von Beschleunigungsmitteln, als bei Verwendung von nicht-polymergebundenen Initiatoren mit niedrigem Molekulargewicht erreichbar ist.
Ein weiterer günstiger Effekt wird verwirklicht, wenn die initiierenden Gruppen auf den polymeren Initiatoren aus Gruppen bestehen, die Wasserstoffabstraktionsreaktivität zeigen, d.h. die Fähigkeit, Wasserstoffe intermolekular zu abstrahieren. Der günstige Effekt ist wichtig, wenn Makromersysteme, die diese Initiatoren enthalten, als Gewebeklebstoffe, endovaskuläres Paving, Bildung von Trennschichten, um Adhäsionen nach chirurgischem Eingriff zu verhindern, oder in jeder Anwendung, die die „Adhäsion" der Matrix an eine oder mehrere Oberflächen mit sich bringt, verwendet werden. Da Initiatoren, die diese Art von Reaktivität zeigen, Wasserstoffe von benachbarten Molekülen abstrahieren können, wenn ein Makromersystem, das polymere Initiatoren des Typs enthält, auf ein Substrat aufgebracht wird, bewirkt Photoaktivierung des Systems die Abstraktion von Wasserstoffen vom Substrat durch die Initiatoren, wodurch ein freies Radikal auf dem Substrat und ein freies Radikal auf dem Initiator gebildet wird. Dieses Diradikal kann anschließend kollabieren, wodurch eine kovalente Bindung zwischen dem Makromersystem und dem Substrat gebildet wird.
Weitere Initiatorgruppen auf demselben Makromer initiieren radikalische Reaktionen mit anderen Makromeren, was zu einer vernetzten Matrix führt, die kovalent an die Oberfläche gebunden ist. Initiatorgruppen, die diese Art von Reaktivität zeigen, schließen Analoga von Benzophenon und Thioxanthon ein. Wie man leicht verstehen kann, sind nur polymere Initiatoren in der Lage, die Adhäsion der Matrix an eine Oberfläche zu bewerkstelligen, Analoga dieser Initiatoren mit niedrigem Molekulargewicht können dieses Phänomen nicht erzeugen.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt der polymere Initiator eine polymere Hauptkette mit gebundenen Initiatorgruppen und gebundenen reaktiven Gruppen oder Affinitätsgruppen. Diese reaktiven Gruppen oder Affinitätsgruppen ermöglichen, daß der polymere Initiator sich an Zielgruppen auf interessierenden Oberflächen bindet. Dies ermöglicht, daß der polymere Initiator sich an die interessierende Oberfläche bindet. Auf diese Weise kann Grenzflächenpolymerisation von Makromeren erreicht werden. Eine Lösung von polymerem Initiator, der reaktive Seitengruppen oder Affinitätsseitengruppen enthält, wird auf eine Oberfläche mit Zielstellen aufgebracht. Die reaktiven Gruppen oder Affinitätsgruppen auf dem polymeren Initiator reagieren mit den Stellen auf der Oberfläche, was bewirkt, daß der polymere Initiator sich an die Oberfläche bindet. Überschüssiger polymerer Initiator kann dann weggewaschen werden. Eine Lösung eines polymerisierbaren Makromers wird dann auf die Oberfläche aufgebracht. Wenn das System mit Lichtenergie beaufschlagt wird, wird eine radikalische Polymerisationsreaktion nur an der interessierenden Oberfläche initiiert. Durch Variieren der Konzentration des polymerisierbaren Makromers und der Bestrahlungszeit kann die Dicke und Vernetzungsdichte der resultierenden Matrix auf der Oberfläche manipuliert werden.
Im allgemeinen gibt es zwei Verfahren, durch die eine Initiatorgruppe in eine polymere Hauptkette eingebaut werden kann. Das erste Verfahren bringt die Bildung eines Monomers mit sich, das den Initiator einschließt. Dies kann leicht unter Verwendung chemischer Standardreaktionen bewerkstelligt werden. Zum Beispiel kann das Säurechlorid-Analog eines Initiators mit einem aminhaltigen Monomer umgesetzt werden, um ein Monomer zu bilden, das den Initiator enthält.
Das zweite Verfahren für den Einbau von Initiatorgruppen in eine polymere Hauptkette bringt die Kopplung eines reaktiven Analogs des Initiators mit einem vorgeformten Polymer mit sich. Zum Beispiel kann ein Säurechlorid-Analog eines Initiators mit einem Polymer umgesetzt werden, das Amin-Seitengruppen enthält, wodurch ein Polymer gebildet wird, das Initiator-Seitengruppen trägt.
Polymere Matrizes, die aus Makromersystemen hergestellt sind, können in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich:
Zelluläre Enkapsulierung. Die Verwendung von Hydrogelen, um Mikro- oder Makrokapseln zu bilden, die Zellen und anderes Gewebe enthalten, ist in der Literatur gut dokumentiert. Anwendungen schließen die Behandlung von Diabetes, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, ALS, chronischen Schmerzen und anderen ein. Beschreibungen von Verfahren zur zellulären Enkapsulierung können in der gesamten Patentliteratur und wissenschaftlichen Literatur gefunden werden. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Enkapsulierung von Zellen auf zwei grundlegenden Wegen bereit.
1) Massepolymerisation
In dieser Ausführungsform wird zelluläres Material in einer Lösung des Makromersystems gemischt und anschließend Energie hinzugefügt, um die Initiation der radikalischen Polymerisation zu aktivieren. Vor der Initiation kann die Lösung, die das Makromersystem mit suspendiertem zellulären Material enthält, in Formen gegeben werden, die in bestimmten geometrischen Formen ausgeformt sind, oder in ein vorgeformtes Membransystem gegeben werden, wie etwa eine Hohlfaser. Bei Bestrahlung oder anderer Energiezugabe bewirkt die Initiation der radikalischen Polymerisation, daß das Makromersystem geliert, wodurch eine zellhaltige Matrix in der gewünschten Form gebildet wird. Wenn ausgeformt zu freistehenden geometrischen Formen, kann die Formulierung des Makromersystems konzipiert sein, um die gewünschten Grade an Haltbarkeit und Permselektivität für die anschließend ausgeformte Matrix bereitzustellen. Wenn ausgeformt innerhalb von Membranstrukturen, wie etwa Hohlfasern, die konzipiert sind, um die gewünschte Permselektivität bereitzustellen, kann das Makromersystem formuliert werden, um die gewünschten Eigenschaften der zellsuspendierenden Matrix zu liefern, wie etwa biologische Kompatibilität, etc..
2) Grenzflächenpolymerisation
In dieser Ausführungsform wird eine Membran direkt auf der Oberfläche des zellulären Materials ausgebildet. Eine Lösung von polymerisierbarem oder nicht-polymerisierbarem polymeren Initiator, der Affinitätsseitengruppen (z.B. positiv geladene Gruppen) enthält, wird mit dem zellulären Material gemischt. Die Affinitätsgruppen binden sich an die Stellen auf der Oberfläche des zellulären Materials. Der überschüssige polymere Initiator wird anschließend weggewaschen und das zelluläre Material in einer Lösung von polymerisierbarem Makromer suspendiert. Da Initiatorgruppen nur an der Oberfläche des zellulären Materials vorhanden sind, wird die Polymerisation, wenn Lichtenergie zugeführt wird, nur an der Oberflächen:Makromer-Grenzfläche initiiert. Durch Manipulation der Bestrahlungsdauer und Makromerformulierung wird eine polymere Matrix, die die gewünschten Eigenschaften von Dicke, Haltbarkeit, Permselektivität, etc. zeigt, direkt auf der Oberfläche des zellulären Materials ausgebildet.
Klebstoffe und Dichtungsmittel. Polymere Matrixsysteme haben auch umfangreiche Verwendung als Klebstoffe für Gewebe und andere Oberflächen gefunden. Für diese Anwendung wird eine Lösung eines Makromersystems auf eine Oberfläche aufgebracht, an die Adhäsion gewünscht ist, eine weitere Oberfläche wird mit dieser Oberfläche in Kontakt gebracht und Bestrahlung wird durchgeführt, um eine Oberfläche-zu-Oberfläche-Verbindung auszubilden. Wenn ein temporärer Klebstoff gewünscht ist, kann das Makromersystem aus abbaubaren Makromeren bestehen.
Trennschichten. Polymere Matrizes können zur Bildung von Trennschichten auf Oberflächen für verschiedene Anwendungen verwendet werden. Eine solche Anwendung ist eine Trennschicht zur Verhinderung von Gewebeadhäsion im Anschluß an einen chirurgischen Eingriff. Für diese Anwendung wird ein Makromersystem in flüssiger Form auf die Oberfläche von geschädigtem Gewebe aufgebracht. Die Flüssigkeit wird bestrahlt, um die Makromere zu polymerisieren. Die polymere Matrix verhindert, daß anderes Gewebe an dem beschädigten Gewebe anhaftet. Sowohl abbaubare als auch nicht-abbaubare Makromersysteme können für diesen Zweck verwendet werden. Wie oben beschrieben, können sowohl Massepolymerisations- als auch Grenzflächenpolymerisationsverfahren verwendet werden, um Oberflächenbeschichtungen dieses Typs herzustellen.
Trägerstoffe mit kontrollierter Freisetzung. Polymere Matrizes finden breite Anwendung als Trägerstoffe mit kontrollierter Freisetzung. Für diese Anwendung wird eine Lösung eines Makromersystems und des Arzneistoffs, Proteins oder der anderen aktiven Substanz auf eine Oberfläche aufgebracht. Die Lösung wird bestrahlt, um die Makromere zu polymerisieren. Die polymere Matrix enthält den Arzneistoff, wenn sie einer physiologischen oder anderen flüssigkeitshaltigen Umgebung ausgesetzt wird, wird der Arzneistoff langsam in die Umgebung freigesetzt. Das Freisetzungsprofil des mitgerissenen Arzneistoffs kann durch Variation der Formulierung des Makromersystems manipuliert werden. Sowohl abbaubare als auch nicht-abbaubare Makromersysteme können für diesen Zweck eingesetzt werden. In ähnlicher Weise können sowohl Masse- als auch Grenzflächenpolymerisationstechniken verwendet werden, um Oberflächen mit kontrollierter Arzneistofffreisetzung herzustellen. In einer alternativen Ausführungsform können ein Arzneistoff oder eine andere aktive Substanz durch eine vorgeformte Matrix auf einer Oberfläche imbibiert werden. Die Absorptions- und Freisetzungseigenschaften der Matrix können durch Variation der Vernetzungsdichte, der Hydrophobie der Matrix und des für die Imbibition verwendeten Lösemittels manipuliert werden.
Alternativ können arzneistoffhaltige Mikrokügelchen unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden. Ein breiter Bereich von Arzneistoffen und biologisch aktiven Materialien können unter Verwendung der Erfindung zugeführt werden, die Antithrombosemittel, entzündungshemmende Mittel, antimikrobielle Mittel, antiproliferative Mittel und Antikrebsmittel einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sind, sowie Wachstumsfaktoren, morphogene Proteine und dergleichen.
Gewebeersatz/Stützgewebe. Polymere Matrizes haben Verwendung gefunden als dreidimensionale Stützgewebe für hybride Gewebe und Organe. Für diese Anwendung wird ein Makromersystem in flüssiger Form auf einen Gewebedefekt aufgebracht und anschließend bestrahlt, um die Makromere zu polymerisieren, die eine Matrix bilden, woraufhin einwachsende Zellen wandern und sich zu einem funktionellen Gewebe organisieren können. In einer Ausführungsform schließt das Makromersystem zusätzlich einen Wachstumsfaktor ein, der langsam freigesetzt wird, und das Einwachsen gewünschter Zelltypen stimuliert. In einer weiteren Ausführungsform schließen die Makromere gebundene extrazelluläre Matrixpeptide ein, die das Einwachsen von gewünschten Zelltypen stimulieren können. Eine dritte Ausführungsform würde beide der obigen Merkmale einschließen. Eine alternative Ausführungsform schließt Zellen ein, die in der Matrix eingeschlossen sind, mit oder ohne zusätzlichen Wachstumsfaktor. Die Stützgewebebildung kann in vitro erzeugt werden, indem das flüssige Makromersystem in eine Form oder einen Hohlraum in einer Vorrichtung gegeben wird, oder kann in vivo erzeugt werden, indem das flüssige Makromersystem auf einen Gewebedefekt aufgebracht wird. Sowohl abbaubare als auch nicht-abbaubare Makromersysteme könnten für diese Anwendung verwendet werden, aber abbaubare Matrizes sind bevorzugt.
Wundabdeckung. Polymere Matrizes sind umfangreich als überlegene Wundabdeckungspräparate verwendet worden. Gegenwärtig werden Hydrogel- und Hydrokolloid-Wundabdeckungsmaterialien aufgrund ihrer überlegenen Wundheilungseigenschaften in zunehmendem Maße verwendet. Für diese Anwendung wird ein Makromersystem in flüssiger Form auf die Wundstelle aufgebracht und anschließend unter Einwirkung von Licht zu einer flexiblen polymeren Matrix ausgeformt. Wenn aufgebracht als eine Flüssigkeit, paßt sich die Makromerzubereitung an die unregelmäßige Oberfläche der Wunde an. Bei Bestrahlung wird eine flexible Matrix gebildet, die vollständig an der Oberfläche der Wunde anliegt; keine flüssigkeitsgefüllten Taschen, die als Stellen bakterieller Infiltration wirken, können existieren. In einer Ausführungsform schließt das Makromersystem zusätzlich ein oder mehrere therapeutische Mittel ein, wie etwa Wachstumsfaktoren oder antimikrobielle Mittel, die langsam in die Wunde freigesetzt werden. Sowohl abbaubare als auch nicht-abbaubare Makromersysteme können für diese Anwendung verwendet werden.
Bildung von in-situ-Einheiten. Polymere Materialien können in den Körper implantiert werden, um die Funktion von krankheitsbefallenen oder geschädigten Geweben zu ersetzen oder zu unterstützen. Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung hohler zylindrischer polymerer Einheiten, um die Struktur einer Koronararterie im Anschluß an perkutane transluminale Koronarangioplastik (PTCA) zu unterstützen. Gegenwärtig werden vorgeformte zylindrische Einheiten über Kathetereinführung implantiert, gefolgt von Ballonaufweitung, um die Einheit zu sichern. Die aufgeweitete Einheit stützt die Struktur der Arterie und verhindert die Rückkehr der Arterie in die geschlossene Stellung (Restenose).
Für diese Anwendung könnte eine flüssige Makromerzubereitung auf eine verletzte Arterie über einen Mehrlumenkatheter, der ein Bestrahlungselement enthält, aufgebracht werden. Nach Aufbringen des flüssigen Makromersystems auf das verletzte Gewebe kann eine halbstarre polymere Matrix durch kurze Bestrahlung gebildet werden. Bei Entfernen des Katheters verbleibt eine hohle, zylindrische, anliegende polymere Einheit, um die Arterie zu stützen und Restenose zu verhindern. In einer Ausführungsform schließt das Makromersystem zusätzlich ein freisetzbares therapeutisches Mittel oder freisetzbare therapeutische Mittel ein, wie etwa antiproliferative und/oder antithrombotische Arzneistoffe. Diese Mittel werden langsam aus der gebildeten Matrix freigesetzt, um zusätzlichen therapeutischen Nutzen für die verletzten Gewebe bereitzustellen. Sowohl abbaubare als auch nicht-abbaubare Makromersysteme können für diese Anwendung verwendet werden.
Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben werden. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentanteile gewichtsbezogen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Synthese von 7-Methyl-9-oxothioxanthen-3-carbonsäurechlorid (MTA-Cl)
Die 7-Methyl-9-oxothioxanthen-3-carbonsäure (MTA), 50,0 g (0,185 mol), wurde in 350 ml Toluol und 415 ml (5,69 mol) Thionylchlorid unter Verwendung eines Überkopfrührers in einem 2 Liter-Dreihalsrundkolben gelöst. N,N-Dimethylformamid (DMF), 2 ml, wurde zugeben und die Reaktion wurde für 2 Stunden auf Rückfluß gebracht. Danach wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Das Lösemittel wurde unter Vakuum abgezogen und das Produkt wurde mit 3 × 350 ml Toluol azeotrop destilliert, um das überschüssige Thionylchlorid zu entfernen. Das Produkt wurde aus 800 ml Chloroform umkristallisiert und der resultierende Feststoff wurde für 16 Stunden bei 45°C in einen Vakuumofen gegeben, um die Entfernung des Lösemittels zu vervollständigen. Das isolierte Produkt wog 45,31 g (85% Ausbeute) und kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) bestätigte die gewünschte Struktur. Dieses Produkt wurde für die Herstellung eines photoreaktiven Monomers verwendet, wie beschrieben in Beispiel 2.
Beispiel 2
Synthese von N-[3-(7-Methyl-9-oxothioxanthen-3-carboxamido)propyl]methacrylamid (MTA-APMA)
Das N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid (APMA), 4,53 g (25,4 mmol), wurde in 100 ml wasserfreiem Chloroform in einem 250 ml-Rundkolben, ausgestattet mit einem Trockenrohr, suspendiert. Nach Abkühlen der Aufschlämmung in einem Eisbad wurde das MTA-Cl, 7,69 g (26,6 mmol), als ein Feststoff unter Rühren zugegeben. Eine Lösung von 7,42 ml (53,2 mmol) Triethylamin (TEA) in 20 ml Chloroform wurde dann über einen Zeitraum von 1,5 Stunden zugegeben, gefolgt von einem langsamen Erwärmen auf Raumtemperatur. Die Mischung ließ man 16 Stunden bei Raumtemperatur unter einem Trockenrohr rühren. Danach wurde die Reaktion mit 0,1 N HCl gewaschen und das Lösemittel wurde unter Vakuum abgezogen, nach Zugabe einer kleinen Menge Phenothiazin als einem Inhibitor. Das resultierende Produkt wurde aus Tetrahydrofuran (THF)/Toluol (3/1) umkristallisiert und ergab 8,87 g (88,7% Ausbeute) Produkt nach Lufttrocknung. Die Struktur der Verbindung wurde durch NMR-Analyse bestätigt.
Beispiel 3
Herstellung von N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (MAL-EAC-NOS)
6-Aminohexansäure, 100,0 g (0,762 mol), wurde in 300 ml Essigsäure in einem 3 Liter-Dreihalskolben, ausgestattet mit einem Überkopfrührer und Trockenrohr, gelöst. Maleinsäureanhydrid, 78,5 g (0,801 mol), wurde in 200 ml Essigsäure gelöst und zu der 6-Aminohexansäure-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde eine Stunde gerührt, während sie auf einem siedenden Wasserbad erhitzt wurde, was zur Bildung eines weißen Feststoffes führte. Nach Abkühlen über Nacht bei Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit 2 × 50 ml Hexan gespült. Nach Trocknen betrug die typische Ausbeute der (Z)-4-Oxo-5-aza-2-undecendisäure 158-165 g (90-95%) mit einem Schmelzpunkt von 160-165°C. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt.
(Z)-4-Oxo-5-aza-2-undecendisäure, 150,0 g (0,654 mol), Essigsäureanhydrid, 68 ml (73,5 g, 0,721 mol), und Phenothiazin, 500 mg, wurden zu einem 2 Liter-Dreihalsrundkolben, ausgestattet mit einem Überkopfrührer, zugegeben. Triethylamin, 91 ml (0,653 mol), und 600 ml THF wurden zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren auf Rückfluß erhitzt. Nach insgesamt 4 Stunden Rückfluß wurde die dunkle Mischung auf <60°C abgekühlt und in eine Lösung von 250 ml 12 N HCL in 3 Litern Wasser gegossen. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wurde dann durch ein Celite-545-Kissen filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 4 × 500 ml Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach Zugabe von 15 mg Phenothiazin, um Polymerisation zu vermeiden, wurde das Lösemittel unter verminderten Druck abgezogen. Die 6-Maleimidohexansäure wurde aus Hexan/Chloroform (2/1) umkristallisiert, um typische Ausbeute von 76-83 g (55-60%) mit einem Schmelzpunkt von 81-85°C zu ergeben. Analyse auf einem NMR-Spektrometer was konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Die 6-Maleimidohexansäure, 20,0 g (94,7 mmol), wurde in 100 ml Chloroform unter einer Argonatmosphäre gelöst, gefolgt von der Zugabe von 41 ml (0,47 mol) Oxalylchlorid. Nach Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen, wobei 4 × 25 ml zusätzliches Chloroform verwendet wurden, um das letzte überschüssige Oxalylchlorid zu entfernen. Das Säurechlorid wurde in 100 ml Chloroform gelöst, gefolgt von Zugabe von 12,0 g (0,104 mol) N-Hydroxysuccinimid und 16,0 ml (0,114 mol) Triethylamin. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Produkt mit 4 × 100 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Abziehen von Lösemittel ergab 44,0 g (82%) MAL-EAC-NOS, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Beispiel 4
Herstellung eines Copolymers auf MTA-APMA, MAL-EAC-NOS und N-Vinylpyrrolidon
Ein polymerer Inititator wird hergestellt durch Copolymerisation einer Monomer-Beschickung, die aus 5 Mol-% MTA-APMA, 10 Mol-% MAL-EAC-NOS und 85 Mol-% N-Vinylpyrrolidon (VP) besteht. Die Polymerisation wird in Formamid oder einem anderen geeigneten Lösemittel unter Verwendung von 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN) als einem Inititator und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) als einem Sauerstoff-Scavenger durchgeführt. Mercaptoethanol wird als ein Kettenübertragungsmittel in einer Konzentration zugegeben, die so konzipiert ist, daß sie ein Molekulargewicht zwischen 2.000 und 20.000 Daltons ergibt. Nach Abschluß der Polymerisation wird das Copolymer durch Zugabe von Ether oder einem anderen Nicht-Lösemittel für das Polymer ausgefällt. Nach Isolation durch Filtration wird das Produkt ausgiebig mit dem Ausfällungslösemittel gewaschen, um restliche Monomere und Oligomere mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Copolymer wird unter Vakuum getrocknet und wird entwässert aufbewahrt, um die hydrolysierbaren N-Oxysuccinimid(NOS)-ester zu schützen.
Beispiel 5
Synthese eines photoreaktiven Makromers, abgeleitet von einem Poly(caprolacton-co-lactid)-Derivat von Pentaerythritolethoxylat
Eine Reaktion im 15 Gramm-Maßstab wurde durchgeführt durch Beschicken eines dickwandigen Rohres mit 8,147 g (56,5 mmol) 1-Lactid (3,6-Dimethyl-1,4-dioxan-2,5-dion) und 6,450 g (56,5 mmol) ε-Caprolacton. Zu dieser Mischung wurden 0,402 g (1,49 mmol) Pentaerythritolethoxylat (durchschnittliches MW ungefähr 270) zugegeben, um Polymerisationsstellen bereitzustellen und das Molekulargewicht zu steuern. Diese Mischung wurde vorsichtig erwärmt, bis die Auflösung aller Reagentien vollständig war. Der Katalysator, Zinn(II)-2-ethylhexanoat, (0,015 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgefäß verschlossen. Die Reaktionsmischung wurde auf 150°C erwärmt und für 20 Stunden gerührt. Das resultierende Polymer wurde in Chloroform gelöst und gegen Methanol unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 1000 dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Lösemittel im Vakuum abgezogen. Das gereinigte Polymer wurde in Chloroform gelöst und mit 2,41 g (23,8 mmol) TEA behandelt. Zu diese Reaktionsmischung wurden 292 mg (1,19 mmol) 4-Benzoylbenzoylchlorid (BBA-Cl) zugegeben und die resultierende Mischung wurde für 16 Stunden gerührt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,734 g (8,11 mmol) Acryloylchlorid zugegeben und die Reaktion wurde für zusätzlich 8 Stunden gerührt. Das modifizierte Polymer wurde durch Dialyse gegen Methanol unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 1000 gereinigt. Nach der Dialyse wurde das Lösemittel im Vakuum abgezogen und das Polymer (15,36 Gramm) entwässert bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Beispiel 6
Synthese von wasserlöslichem Siloxan-Makromer mit Initiator-Seitengruppen
Fünfzig Gramm eines wasserlöslichen Siloxan-Makromers mit Initiator-Seitengruppen wurden synthetisiert, indem zunächst 50 Gramm kommerziell erhältlicher Poly[dimethylsiloxan-co-methyl(3-hydroxypropyl)silocxan]-Pfropf-poly(ethylenglykol)-3-aminopropylether (Aldrich Chemical) in 50 ml Methylenchlorid gelöst wurden. Zu dieser Lösung wurden 5,0 g (49 mmol) TEA zugegeben. Die Reaktionslösung wurde auf –50°C abgekühlt, dann auf eine Rührplatte bei Raumtemperatur überführt. MTA-Cl, 1,0 g (3,5 mmol), hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren in Beispiel 1, und 5,0 g (55 mmol) Acryloylchlorid wurden zugegeben und die Lösung wurde für 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 3500 dialysiert und das Wasser wurde anschließend im Vakuum abgezogen. Das Produkt (48,4 Gramm) wurde entwässert bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Beispiel 7
Synthese einer polymerisierbaren Hyaluronsäure
Zwei Gramm Hyaluronsäure (Lifecore Biomedical, Chaska, MN) wurden in 100 ml trockenem Formamid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1,0 g (9,9 mmol) TEA und 4,0 g (31 mmol) Glycidylacrylat zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 72 Stunden gerührt. Nach umfangreicher Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12-14k wurde das Produkt (2,89 Gramm) durch Lyophilisation isoliert.
Beispiel 8
Herstellung eines photoderivatisierten Polyacrylamids (Photo-PAA)
Acrylamid, 10,24 g (0,144 mol) wurde in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst. Zur Lösung wurden 0,279 g (1,56 mmol) APMA, 0,33 g (1,45 mmol) Ammoniumpersulfat und 0,155 g (1,33 mmol) TEMED zugegeben. Die Lösung wurde in einem Filterkolben mit einer Wasserstrahlpumpe für 10 Minuten evakuiert. Der Schlauch wurde abgeklemmt und die Lösung für eine Stunde unter Vakuum belassen. Die resultierende Polymerlösung wurde gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12-14k dialysiert. Zu 150 ml Polymerlösung in einer PTFE-Flasche, die 3,0 Gramm Polymer enthielten, wurden 0,504 ml (3,62 mmol) TEA zugegeben. Zu dieser Lösung wurden 30 ml 28,4 mg/ml (3,48 mmol) 4-Benzoylbenzoylchlorid in CHCl₃ zugegeben. Die Flasche wurde fest mit einer Kappe verschlossen und für eine Stunde geschüttelt. Die Flasche wurde dann für 10 Minuten zentrifugiert, um die Phasen zu trennen, woraufhin die wäßrige Schicht entfernt, gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12-14k dialysiert und lyophilisiert wurde. Das Produkt (3,21 Gramm) wurde aufbewahrt, entwässert bei Raumtemperatur.
Beispiel 9
Synthese des N-Hydroxysuccinimidesters von Eosin Y
Eosin Y, 1,00 g (1,54 mmol), wurde in 10 ml trockenem Dioxan unter Rühren, vorsichtigem Erwärmen und etwas Beschallung gelöst. Nachdem die Lösung vollständig war, wurde die orangene Lösung unter Argon auf Raumtemperatur abgekühlt. N-Hydroxysuccinimid, 0,195 g (1,69 mmol), und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, 0,635 g (3,08 mmol), wurden als Feststoffe zugegeben. Die resultierende rote Mischung wurde bei Raumtemperatur für 48 Stunden unter einer inerten Atmosphäre gerührt. Danach wurde der Feststoff durch Filtration entfernt und mit Dioxan gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um 1,08 g (94% Ausbeute) eines glasartigen roten Feststoffes zu ergeben.
Beispiel 10
Synthese eines Copolymers aus APMA, Methylmethacrylat und N-Vinylpyrrolidon, gefolgt von Hinzufügen von Acryloylgruppen
Die folgenden Inhaltsstoffe für das Copolymer wurden in ein Glasgefäß gegeben und in 20 ml DMSO gelöst: APMA (2,68 g, 15,0 mmol), VP (6,74 ml, 63,1 mmol), Methylmethacrylat (mMA) (0,334 ml, 3,12 mmol), Mercaptoethanol (0,053 ml, 0,76 mmol), AIBN (0,041 g, 0,25 mmol) und TEMED (0,057 ml, 0,38 mmol). Nachdem die Lösung vollständig war, wurde die Monomerlösung entgast, mit Argon abgedeckt und in einen Bewegungsinkubator bei 55°C gegeben. Das Copolymer wurde gegen entionisiertes Wasser in einem Dialyseschlauch mit einem MWCO von 6-8.000 dialysiert. Die dialysierte Lösung (~ 400 ml) wurde mit Acrylatgruppen beladen. TEA, 5,0 ml (35,9 mmol), wurde unter Rühren zugegeben. Die Lösung wurde für 5-10 Minuten in ein Gefriergerät gegeben, um abzukühlen. Danach wurden 5,0 ml (61,5 mmol) Acryloylchlorid in 5 ml Chloroform unter Rühren zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 16 Std. gerührt. Danach wurde das acrylierte Polymer gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Schlauches mit einem MWCO von 6-8.000 dialysiert. Das Produkt wurde lyophilisiert und 7,10 g wurden erhalten.
Beispiel 11
Synthese eines Copolymers aus MTA-APMA, APMA, Methylmethacrylat und N-Vinylpyrrolidon, gefolgt von Hinzufügen von Acryloylgruppen
Die folgenden Inhaltsstoffe für das Copolymer wurde in ein Glasgefäß gegeben und in 20 ml DMSO gelöst: MTA-APMA (0,613 g, 1,55 mmol), APMA (2,578 g, 14,4 mmol), VP (6,27 ml, 58,7 mmol), mMA (0,319 ml, 2,98 mmol), Mercaptoethanol (0,054 ml, 0,77 mmol), AIBN (0,039 g, 0.24 mmol) und TEMED (0,053 ml, 0,35 mmol). Nachdem die Lösung vollständig war, wurde die Monomerlösung entgast, mit Argon abgedeckt und in einem Bewegungsinkubator bei 55°C gegeben. Das Copolymer wurde gegen entionisiertes Wasser in einem Dialyseschlauch mit einem MWCO von 6-8.000 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde vor Licht geschützt und mit Acrylatgruppen beladen. TEA, 5,0 ml (35,9 mmol), wurde unter Rühren zugegeben. Die Lösung wurde für 5-10 Minuten in ein Gefriergerät gegeben, um abzukühlen. Danach wurden 5,0 ml (61,5 mmol) Acryloylchlorid in 5 ml Chloroform unter Rühren zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 9 Std. gerührt. Danach wurde das acrylierte Polymer gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Schlauches mit einem MWCO von 6-8.000 dialysiert und vor Licht geschützt. Das Produkt (8,88 Gramm) wurde durch Lyophilisation isoliert.
Beispiel 12
Bewertung der Matrixbildung
Eine 15% Lösung des Copolymers aus Beispiel 11 wurde in 10% DMSO/Wasser hergestellt. Der MTA-Gehalt der Lösung wurde geschätzt durch Messen der Extinktion der Lösung bei 395nm (A@395nm=42,6). Eine 15% Lösung des Copolymers aus Beispiel 10 (selbes Copolymer wie dasjenige, das in Beispiel 11 beschrieben ist, aber ohne MTA-APMA) wurde in 10% DMSO/Wasser hergestellt. MTA wurde zu dieser Lösung zugegeben, bis seine Extinktion bei 395nm mit derjenigen der oben beschriebenen Lösung übereinstimmte. Die zwei Lösungen waren in Konzentration von Copolymer und Photoinitiator identisch, wobei der einzige Unterschied zwischen ihnen war, daß in einer Lösung der Photoinitiator in polymerer Form (POLY) vorlag und in der anderen der Photoinitiator in nicht-polymerer Form (NON) vorlag.
Um die Matrixbildungsfähigkeit der zwei Lösungen zu vergleichen, wurde die folgende Bewertung durchgeführt: die Vertiefungen im Deckel einer 96 Well Mikrotiterplatte wurden als Miniaturformen verwendet, um die Fähigkeit der photoreaktiven Polymerlösungen zu bewerten, um bei Bestrahlung feste Hydrogelscheiben zu bilden. Die Vertiefungen sind acht Millimeter im Durchmesser und ungefähr 0,6 Millimeter tief. 30 Mikroliter Polymerlösung werden die Vertiefung gerade füllen. 30 Mikroliter von sowohl den (POLY)- als auch (NON)-Lösungen wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Nach Zugabe der Polymerlösungen wurden die Deckel unter Verwendung eines Bestrahlungssystems EFOS Ultracure 100 SS bestrahlt, ausgerüstet mit einem 400-500nm-Filter, für verschiedene Zeitlängen. Nach Bestrahlung wurde der Deckel mit Wasser gespült und jede Polymerformulierung auf ihre Fähigkeit, feste Scheiben zu bilden, unter Verwendung der folgenden willkürlichen Skala bewertet:
0 = flüssig, keine Gelierung
1 = weiches Gel, kann nicht aus der Form entfernt werden
2 = festes Gel, mit leichten Schwierigkeiten aus der Form entfernbar
3 = sehr festes Gel, kann leicht aus der Form entfernt werden
4 = sehr festes Gel, elastomere Eigenschaften offensichtlich
Ergebnisse:
Matrixbildung
Die Polymerlösung, die den polymergebundenen Initiator (POLY) enthielt, bildete Matrizes schneller und vollständiger als die Polymerlösung, die nicht-polymergebundenen Initiator (NON) enthielt, unter Einwirkung von Lichtenergie.
Beispiel 13
Synthese eines Eosin-suibstituierten Polymers
N-Vinylpyrrolidon, 10,0 g (90,0 mmol), wurde in 50 ml DMSO gelöst. Zur Lösung wurden 0,30 g (1,68 mmol) APMA, 0,15 g (0,91 mmol) AIBN und 0,10 g (0,86 mmol) TEMED zugegeben. Die Lösung wurde mit Stickstoff für 20 Minuten gespült und bei 55°C für 20 Stunden inkubiert. Das resultierende Polymer wurde durch Dialyse gegen Wasser gereinigt und durch Lyophilisation isoliert.
Drei Gramm des Polymers wurden in 150 ml trockenem Dioxan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,504 ml (3,62 mmol) TEA zugegeben. Anschließend wurden 2,74 Gramm (3,5 mmol) des N-Hydroxysuccinimidesters von Eosin Y zugegeben und die Reaktionsmischung für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde gegen dH₂O unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem Schnitt von 12-14kDa dialysiert und lyophilisiert, um das Produkt zu isolieren. Die Reaktion lieferte 3,96 Gramm rotes Polymer.
Beispiel 14
Ein biologisch abbaubarer Gewebeklebstoff.
Eine Lösung wurde hergestellt, die aus 5% polymerisierbarer Hyaluronsäure (Beispiel 7) und 2% photoderivatisiertem Polyacrylamid (Beispiel 8) in Wasser bestand. Dieses Reagens wurde auf Verwendung als ein Gewebeklebstoff unter Verwendung von Cellulose-Dialyseschlauch als einem Gewebemodell bewertet.
Scherfestigkeitstests wurden am Dialyseschlauch durchgeführt. Der Schlauch wurde geschlitzt und in Stücke von 2 cm × 4 cm geschnitten. Die Stücke wurden kurz in Wasser getränkt, entnommen und getestet, während sie noch feucht waren. Ein Stück wurde flach auf eine Oberfläche gelegt und 10 μl Klebstoff auf ein Ende des Streifens aufgebracht. Ein weiteres Stück wurde über dieses Stück gelegt, mit einer Überlappung von 1 cm zwischen den Stücken. Wenn der photoaktivierbare Klebstoff (2/5 HA) bewertet wurde, wurde der Überlappungsbereich für 10 Sekunden bestrahlt. Wenn ein Kontrollklebstoff bewertet wurde, ließ man den Klebstoff für fünf Minuten aushärten. Die verklebten Proben wurden längs mit den Enden in einem Tensiometer angebracht, so daß die Ebene des Klebstoffbereiches parallel zur Achse des Tensiometers lag. Die Proben wurden mit einer Rate von 1 cm/Minute gedehnt, bis Klebstoff oder Substrat versagten, und die Kraft beim Versagen wurde aufgezeichnet. Nur-Substrat-Proben und, für photoaktivierbaren Klebstoff, nicht-bestrahlte Proben wurden als Kontrollen in die Bewertung miteinbezogen.
Beispiel 15
Bildung einer in-situ-Hydrogel-Wundabdeckung.
Photopolymerisierbare, matrixbildende Reagentien wurden auf Wirksamkeit als in-situ-Wundabdeckungen bewertet.
Herstellung der Reagentien:
Eine experimentelle, sich in-situ bildende Wundabdeckung wurde hergestellt durch:

1) Lösen von reaktivem Makromer aus Beispiel 10 mit 20% in einer sterilen 6% Glycerinlösung in Wasser.
2) Herstellen einer sterilen Lösung von polymerem Eosin-Reagens aus Beispiel 12 mit 4% in Wasser und einer sterilen Lösung von 2M Triethanolamin (TEA) in Wasser.
3) Transportieren der drei sterilen Lösungen zur Stelle eines chirurgischen Eingriffs zum Aufbringen auf Wundstellen, die auf Schweinhaut erzeugt worden sind.

Vier junge weibliche China-White-Schweine, die zwischen 15-20 kg wogen, wurden anästhesiert und 12 Wunden auf einer Seite jedes Schweins angebracht. Die Wunden waren 1'' × 2'' und 0,015'' tief und wurden mit einem kalibrierten Elektrodermatom (Padgett) beigebracht. Die Wunden wurden in zwei Reihen von sechs auf dem Thorax- und Paravertebralbereich jedes Schweins beigebracht, wobei ungefähr zwei Inches zwischen benachbarten Wunden gelassen wurden. Die Wunden wurden randomisiert und erhielten eine von drei Behandlungen:

1) Keine Behandlung (Kontrolle)
2) Aufbringen von OpSite^®, einer semi-okklusiven Wundabdeckung von Smith and Nephew, Inc.
3) Experimentelle photo-aushärtbare Abdeckung

Um die experimentelle Abdeckung aufzubringen, wurden 0,5 ml der Polymer-Eosin-Lösung und 0,5 ml der TEA-Lösung zur Makromer/Glycerin-Lösung zugegeben, was eine Photo-Wundabdeckungslösung lieferte. Die Lösung wurde in 16 sterile 3 ml-Spritzen (2 ml/Spritze) überführt und eine Spritze wurde zum Aufbringen auf jede Wundstelle verwendet. Die Lösungen wurden auf jede bezeichnete Wundstelle aufgebracht (ungefähr 1,5 ml Lösungen/Stelle) und über die Stelle fließen lassen. Die Lösungen wurden durch Bestrahlung mit einer 150 W-Glühbirne, vier Inches von der Wundoberfläche angeordnet, für 30 Sekunden fixiert. Die Abdeckungslösung bildete sich leicht zu einem haltbaren, gummiartigen Hydrogel, das sehr gut an den Wundstellen anhaftete. Sterile 4 × 4-Tupfer wurden über den gesamten verwundeten Bereich jeden Schweines plaziert und die Schweine in sterile Trikotschläuche gegeben. An ausgewählten Tagen (3, 4, 5 und 7) wurde ein Schwein euthanisiert und die Wirkung der Abdeckung auf die Wundepithelisierung und -reparatur bewertet.
Bewertung der Wirkung der Abdeckung auf Wundepithelisierung und -reparatur:
Im Anschluß an die Euthanasie wurden Hautwunden vom darunter liegenden tiefen subkutanen Gewebe entfernt und in 10% neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert. Nach Fixierung wurden fünf Biopsiestellen aus jeder Wunde mit einer 6 mm-Keys-Hautbiopsiestanze erhalten. Jede Biopsie wurde verpackt, markiert und für histologische Schnittpräparation vorgelegt. Histologische Schnitte wurden mit 4 Mikrons geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Histologische Schnitte wurden mit dem Mikroskop untersucht, ohne den Typ der Abdeckung zu kennen, der über der Wundstelle angebracht worden war. Die folgenden Kriterien wurden beurteilt und in der mikroskopischen Untersuchung bewertet:
Grad der Epithelisierung der Wunde
Umfang der Enzündungsreaktion
Grad der Fibroblasie in der Wunde
Grad der Schädigung an subkutanem Gewebe
Morphometrische Analyse von Zelltypen in den histologischen Schnitten wurde verwendet, um zu helfen, den Grad der vorliegenden Entzündungsreaktion zu differenzieren. Die Anzahl polymorphonukleärer Zellen, lymphocytischer Zellen und Fibroblasten wurde bewertet. Jede histologische Biopsie wurde auf einer Skale von 1 bis 5 bewertet.
Grad der Entzündungsreaktion:

1. Keine oder grenzwertige zelluläre Entzündungsreaktion
2. Minimale Entzündung
3. Mittlere Dichte von Entzündungszellen mit etwas Exudat
4. Schwere, hohe Dichte von Entzündungszellen in oder auf dem Wundgewebe mit dickerer Schicht von Exudat
5. Übermäßige Entzündung, mit Anzeichen von dichten Herden von Entzündungszellen, die das Grundgewebe infiltrieren, oder auf der Wunde, und eine dicke Schicht von Entzündungsexudat bilden.

Grad der Wundepithelisierung:

1. Stratum corneum ist vorhanden wenigstens in 4 Schichten von Zellen und gesamte Epidermisoberfläche ist vorhanden.
2. Stratum corneum ist vorhanden wenigstens 1 Schicht von Zellen und die gesamte Epidermisoberfläche ist vorhanden.
3. Stratum corneum ist vorhanden wenigstens 1 Schicht von Zellen und 1/2 Epidermisoberfläche ist bedeckt.
4. Kein Stratum corneum ist vorhanden; minimale Entzündung des Subepidermisgewebe.
5. Kein Stratum corneum ist vorhanden; mäßige Entzündung im Subepidermisgewebe.

Grad der Fibroblasie in der Wunde:

1. Keine Fibroblasie in der Wunde
2. Milde Fibroblasie in der Wunde, die 1/3 bis 1/2 der Wundoberfläche involviert
3. Milde Fibroblasie in der Wunde, die 2/3 oder mehr der Wunde involviert
4. Mäßige Fibroblasie, die 1/3 bis 1/2 der Wunde involviert
5. Schwere Fibroblasie, die 1/2 oder mehr der Wunde involviert.

Grad der Schädigung am subkutanen Gewebe:

1. Keine Schädigung am subkutanen Gewebe
2. Milde Schädigung am subkutanen Gewebe mit mildem Ödem und wenigen Entzündungszellen
3. Mäßige Schädigung am subkutanen Gewebe mit mäßigem Ödem und mäßiger Akkumulation von Entzündungszellen
4. Schwere Schädigung am subkutanen Gewebe mit schwerem Ödem und großer Zahl von Entzündungszellen
5. Übermäßige Schädigung am subkutanen Gewebe mit dichten Herden von Entzündungszellen

Ergebnisse:
Jede Biopsie wurde blind unter Verwendung der oben aufgelisteten Kriterien bewertet. Als die histologische Untersuchung abgeschlossen war, wurden die bewerteten Biopsien mit den Wundstellen korreliert. Eine einzige durchschnittliche Bewertung für jede Abdeckung wurde berechnet, indem alle Bewertungen für jede Stelle für jede Abdeckung zusammengezählt und durch die Anzahl der Bewertungen dividiert wurden.
Die Gesamtbewertung für jeden Typ von Wundabdeckung an den Tagen 3, 4, 5 und 7 wurden mit einem ANOVA-SAS-Programm für Datenintervalle bewertet, um statistisch zu bewerten, ob es irgendeinen Unterschied zwischen den drei aufgebrachten Typen von Wundabdeckungen gab. Nur zwei Bewertungen wurden als statistisch signifikant festgestellt:

1. An Tag 4 im Anschluß an die Wunderzeugung betrug der Durchschnittswert für die OpSite^®-Abdeckung 2,4 und wurde als statistisch signifikant festgestellt, verglichen mit den Kontrollstellen und den experimentellen Wundstellen.
2. An Tag 7 im Anschluß an die Erzeugung der Wunden wurde der Mittelwert für die experimentelle Abdeckung, 1,8, als statistisch signifikant festgestellt, verglichen mit den Kontrollabdeckungen und den OpSite^®-Wundabdeckungen.

An Tag 7 nach Erzeugung der Wunden zeigten die mit der experimentellen photoaushärtbaren Abdeckung behandelten Wundstellen signifikant überlegene Heilung gegenüber denjenigen, die unbehandelt oder mit OpSite®-Abdeckung behandelt waren, bewertet nach den beschriebenen Kriterien.
Beispiel 16
Eine biologisch resorbierbare Arzneistoffabgabebeschichtung.
Eine Lösung von 33% des Makromers aus Beispiel 5 wurde in Ethanol hergestellt. Zehn-Zentimeter-Längen Polyurethan-Stab (PU) wurden in die Makromer-Lösungen eingetaucht und für sechs Minuten bestrahlt, um eine Matrix zu bilden. Diese Verfahrensweise führte zur Bildung einer sehr haltbaren, zähen und flexiblen Beschichtung auf dem Stab. Ein Gramm Chlorhexidindiacetat (ein antimikrobielles Mittel) wurde in 10 ml der Makromer-Lösung gelöst und das Beschichtungsverfahren auf zusätzlichen PU-Stangen wiederholt. Dies führte ebenfalls zu einer zähen, haltbaren und flexiblen Beschichtung auf den Stäben. Die Stäbe wurde in Ein-Zentimeter-Stücke geschnitten und in einer Inhibitionszonenanalyse bewertet.
Beschichtete farbstoffhaltige Stücke, beschichtete Kontrollstücke ohne Arzneistoff und unbeschichtete Stücke wurden in Mueller-Hinton-Agarplatten gegeben, die mit einer 10⁶ Suspension von Staphylococcus epidermidis (Christensen RP62A) betupft wurden. Diese Stücke funktionierten als nicht-gewaschene Kontrollstücke und wurden auf frisch betupfte Agarplatten jeden Tag für 60 Tage überführt.
Zusätzliche Stücke, Kontrollstücke ohne Arzneistoff (sowohl beschichtet als auch nicht-beschichtet) und arzneistoffhaltig beschichtet, wurden in Ampullen mit Schnappverschluß gegeben und mit 50% normalem Kalbsserum in PBS gewaschen. Die Röhrchen wurden in einen Orbitalrüttler gegeben und bei 37°C und 20 UPM für 20 Tage inkubiert. Jeden Tag wurde die Waschlösung entfernt und durch frische Lösung ersetzt. Periodisch wurden Stücke aus dem Serum/PBS entnommen und in Agar gegeben, wie oben beschrieben. Inhibitionszonen, die aus diesen Stücken resultieren, wurden aufgezeichnet und mit den Zonen verglichen, die durch nicht-gewaschene Stücke erzeugt wurden.
Die beschichteten Kontrollstücke ohne Arzneistoff, sowohl beschichtet als auch unbeschichtet, produzierten keine Zonen. Am Tag 0 produzierten sowohl gewaschene als auch nicht-gewaschene arzneistoffhaltige Stücke eine Zone von 24,5 mm. An Tag 20, als die endgültigen gewaschenen Stücke bewertet wurden, produzierten die nicht-gewaschenen Stücke Zonen von 17,5 mm und die gewaschenen Stücke produzierten Zonen von 9,5 mm. An Tag 60, als das Experiment beendet wurde, produzierten die nicht-gewaschenen Stücke immer noch Zonen von 17 mm.
Dieses Experiment belegt die Nützlichkeit dieses matrixbildenden Polymers bei der Herstellung von Arzneistoffabgabebeschichtungen, die eine Langzeitabgabe eines biologisch aktiven Mittels bereitstellen.
Beispiel 17
Eine biologisch stabile Arzneistoffabgabebeschichtung.
Eine Lösung von 25% des Makromers aus Beispiel 6 wurde in 50% IPA/H₂O hergestellt. Zehn-Zentimeter-Längen Polyurethanstab wurden in die Makromer-Lösung eingetaucht und sechs Minuten bestrahlt, um eine Matrix zu bilden. Diese Vorgehensweise führte zur Bildung einer sehr haltbaren, zähen und flexiblen Beschichtung auf dem Stab. Fünfhundert Milligramm Chlorhexidaseacetat wurde in 10 ml Ethanol gelöst. Die Hälfte der beschichteten Stäbe wurde in dieser Lösung für 60 Minuten bei Raumtemperatur getränkt und die Hälfte der Stäbe wurde in reinem Ethanol unter denselben Bedingungen getränkt. Nach dem Tränken wurden die Stäbe aus dem Ethanol entnommen und für 20 Stunden bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Stäbe wurden in Ein-Zentimeter-Stücke geschnitten und in einer Inhibitionszonenanalyse bewertet.
Nicht beschichtete Kontrollstücke, beschichtete Kontrollstücke und beschichtete Arzneistoffstücke wurden in Mueller-Hinton-Agarplatten gegeben, die mit einer 10⁶ Suspension von Staphylococcus epidermidis (Christensen RP62A) betupft wurden. Diese Platten wurden für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zone, in der kein bakterielles Wachstum um jedes Stück herum deutlich war, wurde gemessen und das Stück auf eine frisch betupfte Agarplatte jeden Tag für 14 Tage überführt.
Die nicht beschichteten Kontrollstücke und die beschichteten Kontrollstücke produzierten keine Zonen. An Tag 0 produzierten die arzneistoffhaltigen beschichteten Stücke durchschnittliche Zonen von 25 mm. Diese Stücke produzierten weiterhin jeden Tag Zonen. An Tag 14, als das Experiment beendet wurde, produzierten die Stücke durchschnittlich Zonen von 6 mm.
Beispiel 18
Herstellung einer dreidimensionalen Einheit.
Ein Ende eines teflonbeschichteten Stabes mit einem Durchmesser von 3 mm wurde bis zu einem Niveau von 1,5 cm in reines BBA-Acryloylpolytetra(caprolacton-co-lactid)pentaerythritolethoxylat (siehe Beispiel 5) eingetaucht und unter Drehung für 10 Sekunden sofort bestrahlt, aufgehängt zwischen zwei gegenüberliegenden Dymax-Lampen. Nach der Bestrahlung hatte sich eine halbstarre elastomere Beschichtung auf dem Stab ausgebildet. Der Stab wurde abgekühlt, um die Entfernung der polymeren Beschichtung zu erleichtern. Das geschlossene Ende des Zylinders wurde mit einer Rasierklinge entfernt, wodurch eine hohle zylindrische Einheit mit 1,5 cm Länge und 3,5 mm Durchmesser gebildet wurde.
Beispiel 19
Synthese eines polymerisierbaren Collagens.
Ein Grammm lösliches Collagen (Semed-S, Kensey-Nash Corp.) (eine Mischung der Typen I und III) wurde in 50 ml 0,01 N HCl gelöst. Nach der Auflösung wurden 1,25 g Triethylamin (12,4 mmol) zur Reaktionsmischung zugegeben. Ein Gramm Acryloylchlorid (11,0 mmol), gelöst in einem Milliliter Methylenchlorid, wurde zum Reaktionsgefäß zugegeben und die Mischung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde umfassend gegen dH₂O dialysiert und das Produkt durch Lyophilisation isoliert. Eine Ausbeute von 1,17 Gramm polymerisierbarem Collagen wurde realisiert.
Beispiel 20
Ein Collagengerüst, das ein Knochenmorphogeneseprotein enthält.
A. Herstellung des verfestigten Gerüsts.
Eine Lösung von flüssigem Makromer wird hergestellt, die aus 5% (w/v) polymerisierbarem Collagen (Beispiel 19) plus 1 % (w/v) photoderivatisiertem Polyacrylamid (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 8) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, besteht. Hierzu werden 50 μg/ml (0,005% w/v) Knochenmorphogeneseprotein (BMP-7 aus einer privaten Quelle) zugegeben. Aliquote der obigen Lösung (150 μl) werden dann in Formen (8 mm Durchmesser und 3 mm Höhe) gegeben und für 10 Sekunden mit einer Dymax-Lampe bestrahlt (wie beschrieben in Beispiel 13), um das Collagengerüst zu verfestigen. Kontrollscheiben aus verfestigtem Collagengerüst werden mit derselben Vorschrift hergestellt, ausgenommen daß BMP-7 nicht zugegeben wird.
B. Bewertung des verfestigten Gerüsts.
Scheiben aus verfestigtem Collagengerüst mit BMP-7 werden auf Stimulation von Knochenwachstum in einem Rattenschädel-Onlayimplantat-Modell bewertet. In diesem Modell wird die periosteale Membran entfernt und die Collagenscheiben werden auf dem Schädel implantiert. Nach 30 Tagen werden die Implantate und der benachbarte Schädelknochen, in kaltem Methanol fixiert, in PMMA eingebettet, geschnitten, zu 50-100 μm Dicke geschliffen, mit Sandersons Rapid Bone Stain angefärbt und mit Van-Gieson-Picrofuchsin gegengefärbt. Das Protokoll bewertet nicht-dekalzifizierten Knochen, wobei reifer Knochen sich rot verfärbt, unreifer Knochen sich rosa verfärbt, Knorpel sich blau-grau verfärbt und nicht-abgebautes Collagen azellulär und schwach gelb erscheint.
Eine Kontrolle besteht aus Scheiben aus verfestigtem Collagengerüst, denen BMP-7 fehlt. Eine zweite Kontrolle besteht aus 150 μl nicht-bestrahlter flüssiger Makromer-Lösung, die BMP-7 enthält (dieselbe Lösungszusammensetzung, die in Formen gegeben und bestrahlt wurde, um das verfestigte Collagengerüst herzustellen, das BMP-7 enthält).
Wenn histologisch nach 30 Tagen bewertet, wie oben beschrieben, zeigen die experimentiellen Scheiben (verfestigtes Collagengerüst, das BMP-7 enthält) umfangreiche Knochenbildung in dem Raum, der ursprünglich durch die Collagenscheibe eingenommen wurde. Im Gegensatz dazu zeigen beide Kontrollen (das verfestigte Collagengerüst, dem BMP-7 fehlt, und die nicht-bestrahlte flüssige Kontrolllösung, die BMP-7 enthält) geringe oder keine Knochenbildung. Die Knochenmenge, die sich bei den Kontrollen bildet, ist weniger als 25% derjenigen, die bei den experimentellen Scheiben beobachtet wird, was daher belegt, daß das verfestigte Collagengerüst BMP-stimulierte Knochenbildung im großen Umfang verstärkt.

Claims

Vernetzbares Makromersystem, das ein oder mehrere Polymere umfaßt, die gebundene polymerisierbare Gruppen und gebundene Initiatorgruppen liefern, wobei das System adaptiert ist, um polymerisiert zu werden, um eine für in-vivo-Anwendung geeignete Matrix zu bilden.
Makromersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymerisierbaren Gruppen und die Initiatorgruppe(n) an dieselbe polymere Hauptkette gebunden sind.
Makromersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymerisierbaren Gruppen und Initiatorgruppe(n) an unterschiedliche polymere Hauptketten gebunden sind.
Makromersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gebundenen Initiatorgruppen an ein oder mehrere Monomere gebunden sind, die verwendet werden, um das polymere Makromer herzustellen.
Makromersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gebundenen Initiatorgruppen an das polymere Makromer selbst gebunden sind.
Makromersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das System Makromere umfaßt, die sowohl Initiatorgruppen als auch polymerisierbare Gruppen tragen, in Kombination mit Makromeren, die nur gebundene polymerisierbare Gruppen liefern.
Makromersystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gebundenen Inititatorgruppen ausgewählt sind aus mit langwelligem ultravioletten (LWUV) Licht aktivierbaren Molekülen, mit sichtbarem Licht aktivierbaren Molekülen und thermisch aktivierbaren Molekülen.
Makromersystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die LWUV-Moleküle ausgewählt sind aus 4-Benzoylbenzoesäure, [(9-Oxo-2-thioxanthanyl)-oxy]essigsäure, 2-Hydroxythioxanthon, Vinyloxymethylbenzoinmethylether, Benzophenon, Thioxanthon.
Makromersystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mit sichtbarem Licht aktivierbaren Moleküle ausgewählt sind aus Eosin Y, Bengalrosa, Campherchinon, Erythrosin und Ethyleosin.
Makromersystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die thermisch aktivierbaren Moleküle ausgewählt sind aus 4,4'-Azobis(4-cyanopentansäure) und 2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-Dihydrochlorid.
Makromersystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gebundenen polymerisierbaren Gruppen ausgewählt sind aus gebundenen Vinylgruppen, Acrylatgruppen, Methacrylatgruppen, Ethacrylatgruppen, 2-Phenylacrylatgruppen, Acrylamidgruppen, Methacrylamidgruppen, Itaconatgruppen und Styrolgruppen.
Makromersystem nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Photoinitiation mit Hilfe einer Wasserstoffabstraktionsreaktion eintritt.
Makromersystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das System weiter ein oder mehrere polymergebundene Energieübertragungsakzeptormoleküle umfaßt.
Makromersystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Energieübertragungsmolekül ausgewählt aus tertiären Aminen.
Makromersystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Hauptkette ausgewählt ist aus synthetischen Polymeren und natürlich vorkommenden Polymeren.
Makromersystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Hauptkette ausgewählt ist aus biologisch abbaubaren Polymeren und biologisch stabilen Polymeren.
Makromersystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgewählt ist aus Polymeren, die adaptiert sind, um Hydrogel-Matrizes zu bilden, und Polymeren, die adaptiert sind, um Nicht-Hydrogel-Matrizes zu bilden.
Makromersystem nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein biologisch abbaubares Polymer umfaßt, das adaptiert ist, um Hydrogel-Matrizes zu bilden.
Makromersystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein natürlich vorkommendes Polymer ist, das ausgewählt ist aus Polysacchariden und Polyaminosäuren.
Makromersystem nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharide ausgewählt sind aus Hyaluronsäure, Stärke, Dextran, Heparin und Chitosan und die Polyaminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Gelatine, Collagen, Fibronectin, Laminin, Albumin und aktiven Peptiddomänen derselben besteht.
Makromersystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein synthetisches Polymer umfaßt, das hergestellt ist über Kondensationspolymerisation eines oder mehrerer Monomere.
Makromersystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere hydrophobe, biologisch abbaubare Polymere sind, die ausgewählt sind aus Polylactiden, Polyglykoliden, Polycaprolactonen, einschließlich Copolymeren derselben, Polyanhydriden und Polyorthoestern.
Makromersystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere biologisch stabile, hydrophile Polymere sind, die ausgewählt sind aus Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol.
Makromersystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere synthetische, biologisch stabile Polymere sind, die gebildet sind durch Polymerisation hydrophober Monomere, die ausgewählt sind aus Methylmethacrylat, Butylmethacrylat und Dimethylsiloxanen.
Makromersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Hauptkette weiter gebundene reaktive Gruppen oder Affinitätsgruppen umfaßt.
Makromersystem nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Gruppen oder Affinitätsgruppen adaptiert sind, um sich an Zielgruppen auf einer interessierenden Oberfläche zu binden.
Verfahren zur Herstellung einer polymeren Matrix, die für in-vivo-Anwendung adaptiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Bereitstellen eines Makromersystems nach den Ansprüchen 1 bis 26, Aufbringen des Systems auf ein Substrat und Vernetzen des Systems durch radikalische Polymerisation, um eine Matrix zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die in-vivo-Anwendung ausgewählt wird aus zellulärer Enkapsulierung, Klebstoffen/Dichtungsmitteln, Trennschichten, Trägerstoffen mit kontrollierter Freisetzung, Gewebeersatz, Wundabdeckung und Bildung von in-situ-Einheiten.
Verfahren nach den Ansprüchen 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Photoinitiation des Systems mit Hilfe einer Wasserstoffabstraktionsreaktion eintritt.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das System weiter ein oder mehrere polymergebundene Energieübertragungsakzeptormoleküle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Energieübertragungsmoleküle ausgewählt sind aus tertiären Aminen.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Photoinitiation zur Bildung kovalenter Bindungen zwischen der Matrix und dem Substrat führt.
Polymere Matrix, die für in-vivo-Anwendung adaptiert ist, wobei die Matrix ein Makromersystem nach den Ansprüchen 1 bis 26 umfaßt, wobei das System durch radikalische Polymerisation vernetzt worden ist, um eine Matrix zu bilden.
Matrix nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die in-vivo-Anwendung ausgewählt aus zellulärer Enkapsulierung, Klebstoffen/Dichtungsmitteln, Trennschichten, Trägerstoffen mit kontrollierter Freisetzung, Gewebeersatz, Wundabdeckung und Bildung von in-situ-Einheiten.
Matrix nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Photoinitiation des Systems mit Hilfe einer Wasserstoffabstraktionsreaktion eintritt.
Matrix nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das System weiter ein oder mehrere auf dem Polymer sitzende Energieübertragungsakzeptormoleküle umfaßt.
Matrix nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Energieübertragungsmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus tertiären Aminen besteht.
Matrix nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Photoinitiation zur Bildung kovalenter Bindungen zwischen der Matrix und dem Substrat führt.