Patents

Search tools Text Classification Chemistry Measure Numbers Full documents Title Abstract Claims All Any Exact Not Add AND condition These CPCs and their children These exact CPCs Add AND condition
Exact Exact Batch Similar Substructure Substructure (SMARTS) Full documents Claims only Add AND condition
Add AND condition
Application Numbers Publication Numbers Either Add AND condition

Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránicích skupin

Abstract

Řešení popisuje způsob přípravy síťovaných materiálů na bázi polysacharidů pomocí elektromagnetického záření ve vodném roztoku obsahujícím polysacharid s navázanou karbamátovou fotolabilní chránicí skupinou (FCS se skupinou -NH-CO-O-) a polysacharid obsahující aldehydickou skupinu –CHO. Samotný síťovací proces je proveden pomocí kondenzační reakce fotolyticky uvolněné aminoskupiny (-NH.sub.2.n.) s aldehydickou skupinou (-CHO) za tvorby seskupení iminového typu (-N=CH-). Oba procesy probíhají simultánně a je možné je uskutečnit ve fyziologicky přijatelných podmínkách. Výhodou navrženého řešení je časová a prostorová kontrola procesu síťování umožňující přípravu pokročilých materiálů pro tkáňové inženýrství s možností řídit stupeň zesítění, a tím i mechanické vlastnosti ve struktuře materiálů.

Classifications

A61K47/36 Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
View 12 more classifications

Landscapes

Show more

CZ306479B6

Czechia

Other languages
English
Inventor
Tomáš Bobula
Radovan Buffa
Pavlína Procházková
Vladimír Velebný

Worldwide applications
2015 CZ 2016 KR WO EP US JP BR RU ES

Application CZ2015-398A events
Show all events

Description

Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránících skupin
Oblast techniky
Vynález popisuje síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránících skupin.
Dosavadní stav techniky
Hydrogely představují fyzikální nebo chemicky síťované polymemí struktury, které jsou schopné absorbovat značné množství vody bez toho, aby se ve vodném prostředí rozpouštěly. Vzhledem k vyhovujícím reologickým parametrům se hydrogely vlastnostmi podobají živým tkáním. Hydrogely se používají ve formě skafoldů při náhradě, či regeneraci tkání v případě jejich poškození. Pomocí nich je možné řídit buněčnou organizaci, proliferaci buněk, případně určovat jejich morfogenezi. Hydrogely jsou zároveň pro buňky vhodným zdrojem energie. Tyto nerozpustné trojrozměrné sítě umožňují imobilizaci biologicky aktivních látek (aminokyselin, peptidů, léčiv, enzymů, růstových faktorů atd.) a jejich následné kontrolované uvolňování v požadované koncentraci, čase a prostoru. Ze stavebních složek hydrogelů se upřednostňují biopolymery před syntetickými polymery hlavně tam, kde finální aplikace směřují do oblasti tkáňového inženýrství, Či regenerativní medicíny a musí být zabezpečená vysoká biokompatibilita testovaného materiálu (Slaughter V. B., Khurshid S. S., Fisher O. Z., Khademhosseini, Peppas, N. A. 2009. Aclv Mater 21: 3307). Vhodnými biopolymery jsou polysacharidy díky jejich lehké dostupnosti, relativně nízké ceně, výborné biokompatibilitě, užitečným mechanickým vlastnostem a pestré strukturní či funkční variabilitě. Pro farmaceutické a biomedicínské aplikace se nejčastěji používají:
Kyselina hyaluronová (HA) je přírodní heteropolysacharid glykosaminoglykanové řady, složený z D-glukuronové a A-acetyl-D-glukosaminové podjednotky, které jsou vzájemně vázané β( 1 -3) a β(1-4) O-glykosidovou vazbou. HA se přirozeně vyskytuje v mnohých pojivových tkáních, kloubovém mazu, oční tekutině, kůži a v chrupavkách (Smeds K. A., Pfister-Serres A., Miki D., Dastqheib K., Inoue M., Hatchell D. L., GrinstaffM. W. 2001. JBiomed Mater Res 54: 115). HA díky svojí biokompatibilitě nachází uplatnění v biomedicíně, výživě, kosmetickém a farmaceutickém průmyslu.
Chondroitin sulfát (CS) je glykosaminoglykan složený ze sulfatovaného A-acetylgalaktosaminu a D-glukuronové kyseliny, který je v největším množství zastoupený v mezibuněčné hmotě chrupavky. CS se podílí na artikulámím metabolizmu a je používaným terapeutickým prostředkem vůči degenerativní artritidě. V podobě výživových doplňků (např. Hyalgel) hraje důležitou úlohu v prevenci vzniku osteoartrózy (Bottegoni C, Muzzarelli R. A. A., Giovannini F., Busilacchi A., Gigante A. 2014: CarbPol 109: 126).
Chitosan (CH) je kationický homopolysacharid, který se připravuje deacetylací chitinu a je extrahovaný z pancířů mořských korýšů. CH tím, že pochází z přírodního, obnovitelného, netoxického a biodegradovatelného zdroje, je považovaný za ekologicky přijatelný produkt. Jeho kvalita a vlastnosti jsou závislé na jeho čistotě a na stupni deacetylace (obvykle v rozmezí 70 až 95 %), dále na molekulové hmotnosti a také na krystalinitě. CH se používá jako hypocholesterolemický a bakteriostatický přípravek, nosič léčiv nebo materiál pro tvorbu buněčných skafoldů (Pasqui D., De Cagna M., Barbucci, R. 2012. Polymers 4: 1517).
Sodium karboxymethylcelulóza (CMCNa) je hydrofilní derivát celulózy, kteiý vzniká alkylací nabotnané celulózy (homopolymer β-D-glukopyranózy) s chloroctovou kyselinou v bazickém prostředí. CMCNa v kombinaci s různými léčivy, případně ko-excipienty se v podobě zdravotnických prostředků (gázy, obvazy, kryty ran) používá v terapii kožních onemocnění. Aplikuje se při léčení diabetické nohy, kožních vředů, na pooperační chirurgické rány, při toxické epidermál
- 1 CZ 306479 B6 ní nekrolýze a také v podobě kožních výplní (Pasqui D., De Cagna M., Barbucci, R. 2012. Polymers A: 1517).
Polysacharidy v nativní podobě netvoří hydrogely. Proto vyžadují dodatečnou modifikaci fyzikálních vlastností. Jedná se hlavně o snížení rozpustnosti a zvýšení stability ve vodném prostředí. Jednou z možností je chemická modifikace, při které dochází ke snížení polarity polysacharidových řetězců např. blokováním karboxylovú skupiny za vzniku esteru (US 4 851 521, US 4 965 353), nebo hydrofobizaci polárních hydroxylových skupin (WO1996/035720, WO2010/105582, US 3 720 662).
Druhou z možností je chemické síťování ve struktuře polysacharidů. Mezi nejčastěji používané reakce, které vedou k chemickému síťování, patří polymerizace (Burdick J. A., Chung C, Jia X., Randolph M. A., Langer R. 2005. Biomacromolecules 6: 386), kondenzační reakce (WO2008014787, WO2009/108100, WO2011/069474), dimerizační reakce (EP0554898B1, EP0763754A2, US006 025 444), cykloadiční reakce (CZ304072), případně enzymatické reakce (CZ303879). Oxidačními reakcemi polysacharidů podle WO2011/069474 a WO2011/069475 se dají syntetizovat prekurzory polysacharidů, které jsou vhodné pro dodatečné chemické modifikace včetně síťovacích reakcí. DehydrataČní reakcí těchto prekurzorů, byly také připraveny α,βnenasycené analogy (CZ304512). Deacetylací polysacharidů podle US7 345 117 se připravují polyamino deriváty žádané např. pro adiční nukleofilní reakce.
Avšak klasické chemické síťování má i několik podstatných a nesporných omezení, a to nekontrolovatelný průběh chemické reakce, nedostatečná chemoselektivita, používání toxických síťovacích činidel a nutnost dodatečného přečištění finálních produktů. Kombinací klasického chemického síťování polysacharidů s využitím fotolabilních linkerů se dají výše zmiňované nedostatky úspěšně překonat. Fotolabilní linkery mají ve své struktuře zabudované fotolabilní chránící skupiny (FCS). Příprava monofunkčních fotolabilních karbamátových linkerů se dá provést podle (Figueiredo R. M., Frohlich R., Christmann M. 2006. JOrgCheml]: 4147, nebo Werner T., Barrett A. G. M. 2006. JOrgChemTi: 4302, nebo Furuta, T., Hirayama Y., Iwamura M. 2001. OrgLett 3: 1809) reakcí v přebytku bifunkčního aminolinkeru s acylačním činidlem nesoucím FCS.
Jedním z příkladů uplatnění FCS je maskování substrátu před rozpoznáním v biologickém systému in vitro nebo in vivo, tzv. spuštění biologické odpovědi na přítomnost specifické látky. Takto maskované substráty se nazývají uzavřené (z angl. caged) molekuly a v případě použitých FCS hovoříme o uzavíracích skupinách (z angl. caging groups - CG). CG napomáhají hlavně v biotechnologii a v buněčné biologii, protože jejich štěpení světlem se uskutečňuje za mírných podmínek, rychle, precizně a s vynikající časovou a prostorovou kontrolou. Aplikace CG spadají do oblasti fotolitografícké tvorby komplexních peptidů, oligonukleotidů nebo do oblasti uvolňování biologicky aktivních substancí v buňkách nebo tkáních (US2002/0016 472).
Dalším z praktických příkladů FCS může být chemická reakce dvou zúčastněných funkčních skupin, která neprobíhá, pokud je jedna z nich maskovaná pomocí fotolabilní chránící skupiny (FCS). Po odstranění FCS se obnoví původní reaktivní skupina, která reaguje s druhou participující skupinou v reakční směsi. Výhoda dvou-krokového přístupu, zavedení a štěpení FCS, tedy umožňuje kontrolu nad průběhem chemické reakce. Pokud je v reakční směsi substrát maskovaný (chráněn), chemická reakce neprobíhá. Pokud je substrát regenerovaný (uvolněn) v reakční směsi, chemická reakce probíhá. Množství, resp. koncentraci maskovaného a uvolněného substrátu je možné určovat zdrojem elektromagnetického záření jak z časového hlediska (spínač on-off, světelný impulz), tak i z prostorového hlediska (fokusované světlo, laser, použití fotomasky atd.). Další výhoda fotochemického štěpení je ta, že se dá spolehlivě uplatnit tam, kde jiné přístupy zavádění chránících skupin selhávají. Např. u pH nebo termosenzitivních substrátů, biomateriálů v in vitro, či in vivo aplikacích. Prezentovaný přístup tedy umožňuje řídit jak kvalitativní parametry (stupeň a přesnost zesítění), tak i kvantitativní parametry (celý objem vs. část vzorku)
-2CZ 306479 B6 zesíťovaného materiálu. Z tohoto důvodu mohou výsledné síťované produkty sahat od viskózních roztoků, přes měkké, až po elastické gely.
Pod fotochemicky kontrolovanou chemickou reakcí si je možné představit nejen konjugační reakci, nebo reakci vedoucí k imobilizaci, či naopak k uvolnění substrátu z nosné struktury. Tento přístup se dá aplikovat i k tvorbě síťovaných polymemích struktur pomocí síťovací reakce s maskovaným substrátem, což je předmětem vynálezu tohoto patentového spisu.
V literatuře je známo více praktických příkladů FCS, které podléhají fotolýze (Green T. W. & Wuts P. G. M., 1999, John Wiley, 3rdedition). Fotolýza (fotochemické štěpení) chemických vazeb v těchto skupinách je výsledkem absorpce světelného kvanta - fotonu molekulou substrátu. Fotochemické štěpení chránící skupiny se dá uskutečnit přímou excitací chromoforu po absorpci jediného fotonu o požadované energii nebo vícefotonovou absorpcí s následným elektronovým transferem na chránící skupinu CUS2010/0207 078). V případě zavádění chránících skupin na aminy se jedná o karbamátové funkční skupiny. Nejčastěji používanými FCS jsou alkoxy, případně nitro deriváty aromatických alkoholů (Klán P., Šolomek T., Bochet Ch. G., Blanc A, Givens R., Rubina M., Popik V., Kostikov A., Wirz J. 2013: ChemRev 113: 119; US2008/0009630), dále heteroaromáty typu kumarinu, chinolinu, xanthonu, či thioxanthonu (US2002/0016 472).
Aplikace karbamátových FCS spadají hlavně do oblasti kombinatoriální syntézy peptidů, či nukleových kyselin (Piggot A. M. & Karuzo P. 2005. Tetr Lett 46: 8241). Taktéž se objevují patentové dokumenty (US2013 309 706A1, US2008 0286 360A1, US2006 0216 324A1), které využívají fotolýzu na povrchovou úpravu polymemích materiálů, řízené uvolňování biologicky aktivní látky, nebo naopak její kovalentní imobilizaci k polymemí struktuře. Doposud však využívání FCS za účelem řízeného síťování polysacharidů nebylo v literatuře zmíněno. Pravděpodobnou příčinou je souhra vícerých faktorů, mezi které patří např. nedostatečný molámí absorpční koeficient zvolené FCS pro požadovaný rozsah vlnových délek, nízké kvantové výtěžky fotolýzy, pomalé uvolňování substrátu, nízká stabilita a hydrofobní charakter FCS, tvorba potencionálně toxických a absorbujících rozkladných produktů fotolýzy, jejich následná konkurenční reakce s uvolněným substrátem, či biologickým materiálem.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je způsob uskutečnění síťovací reakce v roztocích polysacharidů, který je založen na fotochemické kontrole chemického síťovacího procesu s využitím karbamátové FCS.
Pojem fotochemická kontrola, resp. řízení, představuje fotochemické štěpení karbamátové vazby (-NH-CO-O-) za vzniku příslušné aminoskupiny (-NH2) pomocí elektromagnetického záření. Pojem chemicky síťovací proces představuje kondenzační reakci uvolněné amino skupiny s aldehydickou skupinou za tvorby iminového seskupení (-N=CH~). Oba simultánně probíhající procesy je možné uskutečnit ve fyziologicky přijatelných podmínkách.
Výhodou navrženého řešení v porovnání s dosavadními postupy síťování polysacharidů je časová a prostorová kontrola nad průběhem síťování, která umožňuje přípravu pokročilých materiálů pro tkáňové inženýrství s možností ovlivnění stupně zesítění, a tím i mechanických vlastností ve struktuře materiálů. Fotochemická kontrola je velkou výhodou v případech, kdy je žádoucí usměrňovat růst buněk v daném prostředí, což je nezbytnost například pro biomateriály určené k reparaci nervových tkání (Perale G. et. al 2011. ACS Chem. Neursci. 2: 336), nebo při vývoji injekčních hydrogelů ve snaze o minimalizování dopadu klasické invazivní chirurgie (Pasqui D., De Cagna M, Barbucci R. 2012. Polymers 4: 1517).
Kombinací klasického chemického síťování s fotolabilními deriváty polysacharidů je možné dosáhnout výhod spočívajících v časové kontrole nad průběhem síťovací reakce, a to takovým způsobem, že reakce probíhá jedině tehdy, když je příslušný materiál ozařován elektromagnetickým
-3 CZ 306479 B6 zářením. Za normálních okolností totiž síťovací reakce probíhá až do stadia vyreagování výchozího materiálu, což je nežádoucí v případech, kdy se požadují specifické vlastnosti síťovaného produktu jako např. houževnatost materiálu, velikost pórů, permeabilita, či biodegradabilita. Taktéž prostorová kontrola nad průběhem reakce v podobě vhodné fotomasky, případně fokusovaného světla zabezpečuje lokální průběh síťovací reakce v reakční směsi. Typickým příkladem je fotolitografický přístup tvorby hydrogelů, který využívá světlo k přenosu geometrického vzoru fotomasky na světlo citlivý substrát (Khetan S., Burdick J. A. (2010). Biomaterials, 31: 8228).
Další výhodou zavedení FCS do struktury polysacharidů je chemospecifický průběh fotolýzy a v druhé řadě také síťovací reakce. Světlo o požadované energii excituje jenom FCS, které fotolýzou generují reaktivní místa pro následnou síťovací reakci v přesně definovaných polohách v polymemí struktuře polysacharidů. Dále, fotolýza i síťovací reakce probíhají za fyziologických podmínek bez nutnosti přídavku síťovacího činidla, organického rozpouštědla, či izolace finálních síťovaných produktů, které ve vodném prostředí tvoří gely, mají zvýšenou hydrolytickou stabilitu, vykazují sorpční vlastnosti a zabezpečují retenci kapalin a v nich přítomných látek. Aplikace těchto síťovaných polysacharidů spadají do oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny nebo biomedicínských aplikací v podobě skafoldů, výplní, nebo nosičů léčiv.
Podle vynálezu se pod karbamátovými deriváty polysacharidů rozumějí takové deriváty, které mají ve své struktuře zabudovanou karbamátovou FCS a to přímo nebo s použitím vhodného linkeru odvozeného od diaminu, aminoalkoholu, dihydrazidu, amino-kyseliny, alkoxyaminu, případně linkeru s kombinací následujících funkčních skupin: -OH, -NH2, -O-NH2, -COOH, -CONHNH2, -NH-NH2, -SH.
Dále platí, že karbamátová FCS je odvozená od aromatického nebo heteroaromatického alkoholu, který vykazuje absorpci elektromagnetického záření v rozmezí 320 až 400 nm, s výhodou 330 až 370 nm.
Karbamátová FCS se fotolyzuje (fotochemicky štěpí) během ozařování elektromagnetickým světlem na aromatický alkohol, oxid uhličitý a sloučeninu s uvolněnou aminovou nebo hydrazidovou skupinou. Tato aminová nebo hydrazidová skupina reaguje s aldehydickou skupinou druhého (nesubstituovaného) polysacharidů za vzniku iminového nebo hydrazonového seskupení. První i druhý polysacharid (polysacharid 1 a polysacharid2) mohou být stejné nebo odlišné struktury typu hyaluronanu, chondroitin sulfátu nebo celulózy, případně jejich farmaceuticky přijatelných derivátů a/nebo solí. Mezi deriváty polysacharidů tedy dochází k síťování prostřednictvím kondenzační reakce. Fotolýza karbamátové FCS vyžaduje přítomnost vody a probíhá na základě a jedině po ozáření materiálu elektromagnetickým zářením. Dále platí, že fotolýza probíhá simultánně se síťovací reakcí a dá se uskutečnit ve fyziologických podmínkách nebo v přítomnosti jiných aditiv (organických, anorganických solí, nebo pufrů).
Vynález tedy představuje způsob uskutečnění síťovací reakce ve vodných roztocích polysacharidu, který je kontrolovaný fotochemickou cestou. Z důvodu fotochemické kontroly je nutná přítomnost karbamátové fotolabilní skupiny (FCS), která chrání aminoskupinu (-NH2) derivátu polysacharidů před předčasnou a nežádoucí reakcí s aldehydickou skupinou druhého polysacharidu, kteiý je přidán do reakční směsi. V případě, že by amino skupina byla nechráněna, docházelo by k nekontrolovatelné reakci bez jakékoliv možnosti ovlivnění jejího průběhu.
V případě přítomnosti chránící FCS skupiny reakce mezi aminoskupinou a aldehydickou skupinou probíhá ve vodné reakční směsi až tehdy, když se na reakční směs působí elektromagnetickým zářením, s výhodou v rozsahu UVA o vlnových délkách 320 až 400 nm. Toto umožňuje kontrolovat reakci z hlediska časového, např. spínačem zdroje záření, stíněním reakční směsi. S rostoucí dobou ozařování roste i procento zesítění, viz Obr. 1, Příklady 8 a 9. Z hlediska prostorové kontroly (řízení) reakce, např. použitím fotomasky, nebo světelným paprskem probíhá pouze v ozařovaných místech, viz Obr. 2.
-4CZ 306479 B6
Konkrétně se tedy vynález týká způsobu přípravy síťovaných polysacharidických materiálů podle obecného vzorce (I) polysacharidl-Rl-N=CH-polysacharid2 (I), kde polysacharidl a polysacharid2 jsou stejné nebo rozdílné polysacharidy a R1 je C|-C3f)alkylový zbytek, Ci-C30 alkylarylový zbytek nebo C1-C30 alkylheteroarylový zbytek, volitelně obsahující jeden nebo více stejných nebo různých heteroatomů vybraných ze skupiny zahrnující N, O, S. Způsob se uskuteční tak, že k vodnému roztoku polysacharidul, substituovaného v místě aminové skupiny fotolabilní skupinou, podle obecného vzorce II polysaccharid 1 -R-NH-CO-O-CH2-R2 (II), kde R1 je definován výše: R2 je aromatický systém, a kde stupeň substituce polysacharidul je v rozmezí 1 až 10 %, se přidá vodný roztok aldehydu polysacharidu2 obecného vzorce III polysacharid2-CH=O (III), kde stupeň substituce polysacharidu2 na aldehyd je v rozsahu 1 až 50 %. Na takto vytvořenou směs se působí elektromagnetickým zářením za současné deoxygenace směsi. Reakci lze vyjádřit obecným schématem 1:
polysacharidl-R‘ -NH-CO-O-CH2-R2 + polysacharid2-CH=O
UV, H2O v
poly sac hand 1 -R1-N=CH-polysacharid/ + R2-CHiOH + CO2 + H2O
Schéma 1
Schéma 1 ve skutečnosti zahrnuje dvě simultánně probíhající reakce, a to fotolýzu polysacharidul s navázanou FCS, a kondenzační/síťovací reakci aminu polysacharidul s aldehydem polysacharidu2:
polysacharidl-R‘-NH-CO-O-CH2-R2
I UV, H2O polysacharidl-R'-Nth + R2-CH2OH + CO2
Schéma 1 a - Fotolýza polysacharidl-R^Nlh + polysacharid2-CH=O polysacharidl-Rl-N=CH-polysacharid2 + H2O
Schéma 1b - Síťování
Ve vzorcích (1) a (II) je zvlášť uváděn dusík, resp. skupina NH, ačkoli je součástí skupiny R1. Stejně tak i skupina CH ve vzorci (I), resp. CH=O ve vzorci (III) je uvedena zvlášť, přestože je
-5CZ 306479 B6 součástí polysacharidu2. Odborník zajisté pochopí, že je tak učiněno pouze pro snazší pochopení a přehlednost reakce a reakčních substrátů.
Jak bylo uvedeno výše, stupeň substituce polysacharidu 1 je v rozsahu v rozmezí 1 až 10 %, s výhodou 3 až 10 %, a jeho molekulová hmotnost je 10 až 400 kDa, s výhodou 20 až 300 kDa, výhodněji 20 až 100 kDa. Stupeň substituce polysacharidu2 na aldehyd je v rozsahu 1 až 50%, s výhodou 3 až 25 % a jeho molekulová hmotnost je 10 až 800 kDa, s výhodou 50 až 250 kDa. Výhodné polysacharidy zahrnují například hyaluronan, chondroitinsulfát, celulózu a jejich farmaceuticky přijatelné deriváty a/nebo soli.
S výhodou je R1 vybrán ze skupiny zahrnující dihydrazidadipát a hexamethylendiamin a R2je s výhodou kondenzovaný aromatický systém, výhodněji vybraný ze skupiny zahrnující pyren, antracen, fenantren, perylen, antrachinon, kumarin a jejich substituční deriváty, které mohou ve své struktuře libovolně obsahovat atomy C, H, O, S, N a vykazují absorpci elektromagnetického záření, nej výhodněji je R2 pyren.
Hmotnostní poměr polysacharidu 1 k polysacharidu2 je s výhodou v rozsahu 1:2 až 2:1. Vodné roztoky polysacharidů 1 a 2 dále mohou obsahovat ve vodě rozpustné pomocné látky vybrané ze skupiny obsahující anorganické soli, nebo pufry, s výhodou fosfátový pufr, přičemž pH roztoku je v rozsahu 6,5 až 7,5, s výhodou 7,0.
Ve způsobu podle vynálezu se na směs působí elektromagnetickým zářením po dobu 0,25 až 2 hodiny, s výhodou 0,5 až 1 hodinu, při teplotě 10 až 50 °C s výhodou 20 až 35 °C, přičemž použité elektromagnetické záření má vlnovou délku v rozsahu 320 až 400 nm, s výhodou 330 až 370 nm. Jak bylo uvedeno výše, výhodou vynálezu je to, že reakce může být časově řízena pomocí spínače zdroje elektromagnetického záření nebo pomocí pulzujícího zdroje elektromagnetického záření nebo pomocí stínění reakce. Dále vynález umožňuje i prostorové řízení reakce použitím fotomasky, fokusovaného elektromagnetického záření nebo paprskem elektromagnetického záření.
Materiál vyrobený způsobem podle vynálezu lze použít v oblasti tkáňového inženýrství nebo regenerativní medicíny v podobě skafoldů, výplní, nebo v oblasti biomedicíny v podobě nosičů léčiv na bázi světlo citlivých materiálů s řízeným uvolňováním biologicky aktivní látky.
Objasnění výkresu
Obr. 1 představuje použití upside-down metody prokázání gelace v reakční směsi, (a) Roztok dvousložkové reakční směsi (Pmoc-DHA-HA a HA-aldehyd) před fotolýzou. (b) Hydrogel síťovaného produktu (HA-DHA-HA) po fotolýze. (c) Hydrogel síťovaného produktu (HA-DHAHA) po 1 h v PBS (pH = 7,4, c = 0,9 %, w/v).
Obr. 2 ilustruje prostorovou kontrolu nad průběhem síťovací reakce (Pmoc-DHA-HA a HAaldehyd) s použitím fotomasky ve tvaru půlkruhu na 50 % povrchu reakční směsi, (a) reakční směs po fotolýze, (b) reakční směs po 15 min v PBS (pH = 7,4, c = 0,9 %, hmotn./obj.) a odlití roztoku PBS, (c) reakční směs po 15 min v PBS (pH = 7,4, c = 0,9 %, hmotn./obj.) a přídavku nového podílu PBS.
Obr. 3 ukazuje mikroskopické fotografie lyofilizovaných vzorků, (a): povrch hydrogelů (lOOx), (b) příčný řez hydrogelů (lOOx), (c) příčný řez hydrogelů po 1 h v PBS (pH = 7,4, 0,9% hmotn./obj.).
-6CZ 306479 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Zde používaný výraz ekvivalent (ekv.) se vztahuje na disacharid kyseliny hyaluronové, na disacharid chondroitin sulfátu nebo monosacharid sodiumkarboxymethylcelulózy, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozí kyseliny hyaluronové (zdroj: Contipro Pharma spol. s r.o., Dolní Dobrouč, ČR) je hmotnostně střední v rozsahu 104 až 106 g.mof1 a byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Molekulová hmotnost výchozího chondroitin sulfátu (zdroj: Sigma-Aldrich s.r.o., Praha, ČR) je hmotnostně střední v rozsahu 4.104 až 5.104 g.mor1 a byla stanovena metodou SEC-MALLS. Poměr chondroitin-4-sulfátu (C4S) a chondroitin-6-suIfátu (C6S) byl 2:3. Materiál byl izolovaný ze živočišného materiálu.
Molekulová hmotnost výchozí sodiumkarboxymethylcelulózy (zdroj: Sigma-Aldrich s.r.o., Praha, ČR) je hmotnostně střední v rozsahu 22.104 až 25.104 g.mor1 a byla stanovena metodou SEC-MALLS. Stupeň alkylace karboxymethylovou skupinou byl 70 %.
Stupeň substituce nebo modifikace ve struktuře glykosaminoglykánu byl stanovený podle následujícího výpočtu:
DS = stupeň substituce = 100 % * (molámí množství navázaného substituentu nebo modifikovaného disacharidu) / (molámí množství všech disacharidů)
Stupeň substituce nebo modifikace ve struktuře sodiumkarboxymethylcelulózy byl stanovený podle následujícího výpočtu:
DS = stupeň substituce = 100 % * (molámí množství navázaného substituentu nebo modifikovaného monosacharidu) / (molámí množství všech monosacharidů)
FCS = fotolabilní chránící skupina
DHA = dihydrazidadipát
HMD= 1,6-hexamethylendiamin
Pmoc = pyren-1 -ylmethoxykarbonyl
UVA = blízké ultrafialové záření v rozsahu vlnových délek 320 až 400 nm, emitováno pomocí dlouhovlnného ultrafialového zdroje Black-Ray mercury spot lamp, model B-100A (UVP) s deklarovanou Xmax = 365 nm.
Povrchová morfologie lyofilizováných gelů byla zkoumána skenovacím elektronovým mikroskopem Zeiss Ultra Plus.
Deacetylovaná kyselina hyaluronové byla připravena deacetylací hydrazinem podle Buffa R., a kol. VCZ3045I2.
Oxidace polysacharidů byla provedena podle Buffa R.. et al.: WO2011069474 a WO2011069475.
Příklad 1 Příprava Pmoc-dihydrazidadipáthyaluronanu (Pmoc-DHA-HA)
Aldehyd HA (100 mg, 0,265 mmol, DS = 43 %, Mw = 1,35 xlO5 g/mol) byl rozpuštěn v 5 ml destilované vody (roztok I). Pmoc-DHA (54 mg, 0,126 mmol) byl rozpuštěn v 5 ml DMSO (roz
-7 CZ 306479 B6 tok II). Oba roztoky byly smíchány a nechaly se reagovat 24 h při laboratorní teplotě. V druhém kroku byl přidán PicBH3 (81 mg, 0,754 mmol). Reakění směs byla míchána 48 h při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA.
DS = 10 %, Mw = 0,34 x 105 g/mol, izolovaný výtěžek 85 % 'HNMR (D2O) δ 1,60 (bs, 4H); 2,21 (bs, 2H); 2,25 (bs, 2H); 2,98 (bs, 1H, polymerN6a); 3,26 (bs, 1H, polymer-N6b); 5,89 (s, 2H,-CH?-pyr); 7,98 8,41 (m, 9Hat) ppm
H-H-COSY (D2O) krospík δ 1,60 - 2,21; 1,60 - 2,25; 2,98 - 3,26 ppm
HSQC (D2O) krospík δ 1,60 ('H) - 24,6 (13C); 2,21 ('H) - 33,0 (l3C); 2,25 ('H) - 33,1 (l3C); 2,98 ('H) - 50,0 (13C); 3,26 ('H) - 50,0 (13C); 5,89 ('H) - 64,3 (13C); 7,98 ('H) - 124,2 (l3C); 8,05 ('H) - 125,3 (i3C); 8,30 ('H) 129,6 (13C): 8,41 (’H) - 131,2 (13C)ppm
DOSY NMR (D2O) log D (1,60 ppm, 2x-CH2-linker) ~ -10,70 m2/s log D (2,03 ppm, Me-CO-NH-polymer) ~ -10,70 m2/s log D (2,21 ppm, -CH2-CONHNlb) ~ -10,70 m2/s log D (2,25 ppm, -CIT-CONHNH-polymer) —10,70 m2/s log D (2,98 ppm, polymer-N6a) —10,70 m2/s log D (3,26 ppm, polymer-N6b) —10,70 m2/s log D (5,89 ppm, -CH2-pyr) —10,70 m2/s log D (7,98 - 8,41 ppm, -CH2-pyr) ~-10,70 m2/s log D (4,72 ppm, H2O) ~ -8,6 m2/s
UV/Vis (0,01 %. H2O) λπ,3χΐ,2 = 350,329 nm
Příklad 2 Příprava Pmoc-hexamethylendiaminhyaluronanu (Pmoc-HMD-HA)
Aldehyd HA (100 mg, 0,265 mmol, DS = 10 %, Mw = 1,92 xlO5 g/mol) byl rozpuštěn v 5 ml destilované vody (roztok I). Pmoc-HMD (19 mg, 0,05 mmol) byl rozpuštěn v 5 ml DMSO (roztok II). Oba roztoky byly smíchány a nechaly se reagovat 24 h při laboratorní teplotě. V druhém kroku byl přidán PicBH3 (81 mg, 0,754 mmol). Reakění směs byla míchána 48 h při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA.
DS = 7 %, Mw = 1,92 x 105 g/mol, izolovaný výtěžek 71 %.
-8CZ 306479 B6
'HNMR (D2O) δ l,34(bs,4H); 1,45 (bs,2H); 1,66 (bs; 2H; 2H); 3,05 (bs; 2H; -CH2NHCO-pyr); 3,15 (bs: 2H; -CH2-NH-polymer); 3,26 (bs; 1H; polymer-Nóa); 3,48 (bs; 1H; polymer-N6b); 5,83 (bs, 2H, -CH2pyr), 8,00 - 8,45 (m, 9HAr) ppm
H-H COSY (D2O) krospík δ 1,34- 1,45; 1,34- 1,66; 1,66-3,05; 1,45 -3,15: 3,26-3,48 ppm
HSQC (D2O) krospík δ 1,34 ('H) - 26,3 (13C): 1,45 (’H) - 28,7 (13C); 1,66 ('H) - 26,1 (,3C); 3,05 (’H) - 48,2 (l3C); 3,15 ('H) - 41,3 (l3C); 3,26 (’H) - 48,5 (l3C); 3,48 ('H) - 48,5 (l3C); 5,83 (‘H) - 64,3 (13C); 8,00 ('H) 124,2 (13C); 8,09 (*Η) - 125,7 (13C); 8,26 (’H) - 130,1 (l3C); 8,45 ('H)-131,7 (13C) ppm
DOSY NMR (D2O) log D (1,34 ppm, 2x-CH2-linker) ~ -10,60 m2/s log D (1,45 ppm, -CH2-linker) —10,60 m2/s log D (1,66 ppm, -CH2-linker) —10,60 m2/s log D (2,03 ppm, Me-CO-NH-polymer) —10,60 m2/s log D (3,05 ppm, -CH2-NHCO~) ~ -10,60 m2/s log D (3,15 ppm, -CH2-NH-polymer) ~ -10,60m2/s log D (3,26 ppm, polymer-N6a) —10,60 m2/s log D (3,48 ppm, polymer-N6b) —10,60 m2/s log D (5,83 ppm, -CH2-pyr) —10,60 m2/s log D (8,00 - 8,45 ppm, HAr) —10,60 m2/s log D (4,72 ppm, H2O) ~ -8,6 m2/s
UV/Vis (0,01 %, H2O) Kmaxij2 = 348, 330 nm
Příklad 3 Příprava Pmoc-dihydrazidadipát chondroitin sulfátu (Pmoc-DHA-CS)
Aldehyd CS (50 mg, 0,10 mmol, DS = 14 %, Mw - 3,0^4,0 xlO5 g/mol) byl rozpuštěn ve 2,5 ml destilované vody (roztok I). Pmoc-DHA (8,7 mg, 0,02 mmol, 0,2 ekv.) byl rozpuštěn ve 2,5 ml DMSO (roztok II). Oba roztoky byly smíchány a nechaly se reagovat 24 h při laboratorní teplotě. V druhém kroku byl přidán PicBH3 (32 mg, 0,30 mmol, 3 ekv.). Reakění směs byla míchána 48 h při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA.
DS = 5-6 %, Mw = 3,0 4,0 xlO5 g/mol, izolovaný výtěžek 84 % 'HNMR (D2O) δ 1,66 (bs, 4H); 2,25-2,32 (m, 4H); 3,00 (bs, 1H, polymer-N6a); 3,25 (bs, 1H, polymer-Nób); 5,89 (bs, 2H, -CH2-pyr); 8,15 - 8,38 (m, 9HAr) ppm
H-H COSY (D2O) krospík
HSQC (D2O) krospík δ 1,66 - 2,25; 1,66 - 2,32; 3,00 - 3,25 ppm δ 1,66 (’H) - 25,0 (l3C); 2,25 ('H) - 31,2 (13C); 2,32 (]H) - 32,8 (,3C); 3,00 (’H) - 50,6 (l3C); 3,25 (Ή) - 50,6 (13C); 5,89 (*H) - 64,6 (l3C): 8,16 ('H) - 124,8 (13C); 8,38 (’H) - 125,6 (13C); 8,30 ('H) 129,6 (13C) ppm
-9CZ 306479 B6
DOSY NMR (D2O)
UV/vis (0,01 %H2O) log D (1,66 ppm, 2x-CH2-linker) —10,50 m2/s log D (2,04 ppm, Me-CO-NH-polymer) —10,50 m2/s log D (2,25-2,32 ppm, -CH2-CONHNH2-CH2-CONHNH-polymer) —10,50 m2/s log D (3,00 ppm, polymer-N6a) —10,50 m2/s log D (3,25 ppm, polymer-N6b) —10,50 m2/s log D (5,89 ppm, -CH2-pyr) ~ -10,50 m2/s log D (8,15 - 8,38 ppm, -CH2-pyr) ~ -10,50 m2/s log D (4,72 ppm, H2O) ~ -8,6 m2/s ^maxi,2 = 343,328 nm
Příklad 4 Příprava Pmoc-dihydrazidadipát sodiumkarboxymethylcelulózy (Pmoc-DHACMCNa)
Aldehyd CMCNa (100 mg, 0,45 mmol, DS = 4-5 %, Mw = 8,2 xlO5 g/mol) byl rozpuštěn v 5 ml destilované vody (roztok I). Pmoc-DHA (19,4 mg, 0,045 mmol, 0,1 ekv.) byl rozpuštěn v 5 ml DMSO (roztok II). Oba roztoky byly smíchány a nechaly se reagovat 24 h při laboratorní teplotě. V druhém kroku byl přidán PicBH3 (144 mg, 1,345 mmol, 3 ekv.). Reakční směs byla míchána 48 h při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA.
DS = 2 %, Mw = 0,80 x 105 g/mol, izolovaný výtěžek 88 % 'HNMR(D2O) δ 1,60-1,65 (bs, 4H); 2,22 (bs, 2H); 2,38 (bs, 2H); 3,00 (bs, 1H, polymer-H6a); 3,37 (bs, 1H, poiymer-HĎb); 5,84-5,87 (bs, 2H, -CH2-pyr); 8,05 - 8,33 (m, 9HAr) ppm
H-H COSY (D2O) krospík δ 1,60 - 2,22; 1,65-2,38; 3,00 - 3,37 ppm
HSQC (D2O) krospík δ 1,60-1,65 (]H) - 25,3 (13C); 2,22 (Ή) - 33,6 (l3C); 2,38 (’H) 32,7 (13C); 3,00 ('H)- 50,1 (,3C); 3,37 ('H) - 51,3 (l3C): 5,84-5,87 ('H) - 64,2 (l3C); 8,05 ('») - 123,5 (l3C); 8,30 (’Η) - 125,1 (,3C); 8,33 (’H)- 129,4 (l3C) ppm
DOSY NMR (D2O) log D (1,60-1,65 ppm, 2x-CH2-linker) ~ -10,60 m2/s log D (2,22-2,38 ppm, -CH2-CONHNH?-CH2-CONHNH-polymer) —10,60 m2/s log D (3,00 ppm, polymer-N6a) —10,60 m2/s log D (3,37 ppm, polymer-N6b) ~-10,60 m2/s log D (4,55—4,61 ppm, HlaHl'-poIymer) —10,60 m2/s log D (5,84-5,87 ppm, -CH2-pyr) ~ -10,60 m2/s log D (8,05 - 8,33 ppm, -CH7-pyr) —10,60 m2/s log D (4,72 ppm, H2O) —8,6 m2/s
FT-IR (KBr) C=O st 1750-1680 cm1 (karbamát)
-10CZ 306479 B6
UV/vis (0,01 %, H2O)
N-CO-O st as 1270-1210 cm 1 (karbamát) st sy 1050-850 cm 1 (karbamát)
Xmaxi,2= 344,329 nm
Příklad 5 Příprava Pmoc-HMD-HA
Pmoc-1-//-Í midazo I karboxylát (326 mg, 1 mmol) rozpuštěný ve 20 ml THF se přidal k20 ml vodného roztoku HMD-HA (200 mg, 0,5 mmol, DS = 36 %) a reakční směs se míchala 24 h při laboratorní teplotě. Produkt (DS = 8 %, Y = 40 %) se izoloval srážením s IPA.
Strukturní analýza produktu je uvedena v příkladu 2.
Příklad 6 Příprava Pmoc-DHA-HA
Pmoc-l-//-imidazol karboxylát (326 mg, 1 mmol) rozpuštěný ve 20 ml THF se přidal k 20 ml vodného roztoku DHA-HA (200 mg, 0,5 mmol, DS = 25 %) a reakční směs se míchala 24 h při laboratorní teplotě. Produkt (DS = 6 %, Y = 45 %) se izoloval srážením s IPA.
o.
NaOOC °HO^O HO—
OH o
NH
CH3CO -1 n
Strukturní analýza produktu je uvedena v příkladu 1.
Příklad 7 Příprava Pmoc-deacetylovaného hyaluronanu (Pmoc-DEA-HA)
Pmoc-l-//-imidazol karboxylát (326 mg, 1 mmol) rozpuštěný ve 20 ml THF se přidal k20 ml vodného roztoku DEA-HA (200 mg, 0,5 mmol, DS = 32 %, Mw = 0,37 xlO5 g/mol) a reakční směs se míchala 24 h při 40 °C. Produkt se izoloval srážením s IPA.
- 11 CZ 306479 B6
DS = 7 %, izolovaný výtěžek 35 %
*H NMR (D2O) δ 3,70 (bs, 1H, N2); 5,86 (bs, 2H, -CH2-pyr); 8,10 - 8,35 (m, 9H, pyr) ppm
HSQC (D2O) krospík δ 3,70 (’H)- 56,3 (l3C); 5,86 ('H)- 63,90 (l3C); 8,10 (’H) - 124,0 (,3C); 8,20 ('H) - 125,4 (13C); 8,30 (!H) - 129,0 (°C); 8,35 (]H) 131,8 (l3C)ppm
UV/Vis (0,01 %, H2O) žmaxi,2= 348, 329 nm
Příklad 8 Fotolýza Pmoc-DHA-HA v přítomnosti aldehydu HA a zesítění
Postup 1: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 2 ml D2O v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 11 %, Mw = 0,66 xlO5 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7, za současného míchání, přičemž se v 15 minutových intervalech odebraly vzorky na 'H NMR analýzu. Nárůst stupně zesítění (δ = 7,49 ppm, HA-CH=NHA) byl pro jednotlivé časové intervaly (15/30/45/60 min) zaznamenán na úrovni (18/31/66/85 %).
Příklad 9 Fotolýza Pmoc-DHA-HA v přítomnosti α,β-nenasyceného aldehydu HA a zesítění
Postup 1: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 xlO5 g/mol) se rozpustil ve 2 ml D2O v křemenné baňce. Přidal se a, β-nenasycený aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 5 %, Mw = 0,68 xlO5 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA pod N2, při 25 °C, pH = 7, za současného míchání, přičemž se v 15 minutových intervalech odebíraly vzorky na 'H NMR analýzu. Nárůst stupně zesítění (δ = 7,58 ppm (H6) a 5,60 ppm (H4), HA-CH=N-HA) byl pro jednotlivé časové intervaly (15/30/45/60 min) zaznamenán na úrovni (20/32/48/75 %).
Příklad 10 Fotolýza Pmoc-DHA-HA v přítomnosti nasyceného aldehydu HA a zesítění
Postup 1: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 2 ml D2O v křemenné bance. Přidal se aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 11 %, Mw = 0,66 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7, za současného míchání, přičemž se v 15 minutových intervalech odebraly vzorky na *H NMR analýzu. Po 60 min UV expozici došlo k 85% tvorbě hydrazonu (δ = 7,49 ppm, HA-CH=N-HA).
Postup 2: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 2 ml D2O v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS =45 %, Mw = 0,35 x 103 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7, za současného míchání, přičemž se v 15 minutových intervalech odebraly vzorky na 'H NMR analýzu. Po 60 min UV expozici došlo k 95% tvorbě hydrazonu (δ = 7,49 ppm, HA-CH=N-HA).
Postup 3: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustila ve 2 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS =11 %, Mw = 5,10 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 37 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k nárůstu viskozity roztoku.
Postup 4: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustila ve 2 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol. DS = 11 %, Mw = 5,10 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 50 °C, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k nárůstu viskozity roztoku.
Postup 5: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil v 3 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (20 mg, 0,050 mmol, DS = 11 %, Mw = 5,10 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k tvorbě gelu.
Postup 6: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil v 3 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (20 mg, 0,050 mmol, DS = 11 %, Mw = 5,10 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 0,25 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 6,5 za současného míchání. Po 0,25 h UVA expozici došlo k nárůstu viskozity roztoku.
Postup 7: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil v 3 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (20 mg, 0,050 mmol, DS = 11 %, Mw = 5,10 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 2 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7,5 za současného míchání. Po 2 h UVA expozici došlo k tvorbě gelu.
DS = 3 %, hydrazonová skupina 'HNMR (D2O)
HSQC (D2O) krospík
DOSY NMR (D2O) δ 7,49 (bs, lH,-N=CH-)ppm δ 7,49 (’H) - 146,6 (13C) ppm log D (2,04 ppm, Ac-NH-polymer) ~ — 11,5 m2/s log D (7,49 ppm, -N=CH-) —11,5 m2/s _
log D (4,75 ppm, H2O) ~ -8,6 m2/s
Příklad 11 Fotolýza Pmoc-DHA-HA v přítomnosti α,β-nenasyceného aldehydu HA a zesítění
Postup 1: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 2 ml D2O v křemenné baňce. Přidal se α,β-nenasycený aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 5 %, Mw = 0,68 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání, přičemž se v 15 minutových intervalech odebíraly vzorky na 'H NMR analýzu. Po 60 min UVA expozici došlo k 75% tvorbě hydrazonu (δ = 7,58 ppm (H6) a 5,60 ppm (H4), HA-CH=N-HA).
Postup 2: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol. DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 2 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se α,β-nenasycený aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 4 %, Mw = 2,05 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h expozici došlo k nárůstu viskozity roztoku.
Postup 3: Pmoc-DHA-HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 3 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se α,β-nenasycený aldehyd HA (20 mg, 0,05 mmol, DS = 4 %, Mw = 2,05 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k nárůstu viskozity roztoku.
Postup 4: Pmoc-DHA-HA (20 mg, 0,05 mmol, DS = 10 %, Mw = 2,64 x 105 g/mol) se rozpustil ve 3 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se α,β-nenasycený aldehyd HA (10 mg, 0,025 mmol, DS = 4 %, Mw = 2,05 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k nárůstu viskozity roztoku.
-14CZ 306479 B6 'H NMR (D2O)
HSQC (D2O) krospik
DOSY NMR (D2O) δ 7,58 (bs, 1H, -N=CH-); 5,60 (bs, 1H, -CH=C-) ppm δ 7,58 ('H) - 147,3 (13C); 5,60 (’H) - 110,30 (13C) ppm log D (2,04 ppm, Ac-NH-polymer) ~ -11,2 m2/s log D (5,60 ppm, -CH=C-) —11,2 m2/s log D (7,58 ppm, -N=CH-) —11,2 m2/s log D (4,75 ppm, H20) ~ -8,6 m2/s
Příklad 12 Fotolýza Pmoc-DHA-CS v přítomnosti nasyceného aldehydu HA a zesítění
Postup 1: Pmoc-DHA-CS (10 mg, 0,020 mmol, DS = 5 %, Mw = 0,20-0,40 x 105 g/mol) se rozpustil v 1 ml D2O v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (8 mg, 0,020 mmol, DS = 33 %, Mw= 0,40 x 103 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7, za současného míchání. Po 60 min UVA expozici došlo ke 100% tvorbě hydrazonu (δ = 7,60 ppm, HA-CH=N-DHA-CS).
Postup 2: Pmoc-DHA-CS (10 mg, 0,020 mmol, DS = 5 %, Mw = 0,20-0,40 x 105 g/mol) se rozpustil v 1 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (8 mg, 0,025 mmol, DS = 33 %, Mw = 0,40 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k 70% tvorbě hydrazonu.
DS = 5 %, hydrazonová skupina 'HNMR (D2O)
HSQC (D2O) krospík
DOSY NMR (D2O) δ 7,60 (bs, 1H, -N=CH-) ppm δ 7,60 (*H) - 145,0 (l3C) ppm log D (2,04 ppm, Ac-NH-polymer) ~ -11,2 m2/s log D (7,60 ppm, -N=CH-) ~ -11,2 m2/s log D (4,75 ppm, H2O) —8,6 m2/s
- 15 CZ 306479 B6
Příklad 13 Fotolýza Pmoc-DHA-CMCNa v přítomnosti nasyceného aldehydu HA a zesítění
Postup 1: Pmoc-DHA-CMCNa (10 mg, 0,038 mmol, DS = 3-4 %, Mw = 0,60-0,80 x 105 g/mol) se rozpustila v 1 mL D2O v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (15 mg, 0,038 mmol, DS = 33 %, Mw = 0,40 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7. Po 60 min UVA expozici došlo ke 100% tvorbě hydrazonu (δ = 7,55 a 7,60 ppm, HA-CH=N-DHA-CMC).
Postup 2: Pmoc-DHA-CMCNa (10 mg, 0,038 mmol, DS = 3-4 %, Mw = 0,60-0,80 x 105 g/mol) se rozpustila v 1 mL PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd HA (15 mg, 0,038 mmol, DS = 33 %, Mw = 0,40 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 1 h UVA expozici došlo k 90% tvorbě hydrazonu.
DS = 4 %, hydrazonová skupina ’HNMR (D2O)
HSQC (D2O) krospík
DOSY NMR (D2O) δ 7,55 a 7,60 (bs, 1H, -N=CH-) ppm δ 7,55 ('H) - 148,2 (l3C); 7,60 ('H) - 148,2 (l3C); ppm log D (2,04 ppm, Ac-NH-HA) —11,4 m2/s log D (4,55 - 4,60 ppm, HlaHl' -CMCNa) ~-11,4 m2/s log D (7,55 a 7,60 ppm, -N=CH-) ~ -11,4 m2/s log D (4,75 ppm, H2O) —8,6 m2/s
Příklad 14 Fotolýza Pmoc-DHA-CS v přítomnosti nasyceného aldehydu CS a zesítění
Pmoc-DHA-CS (10 mg, 0,020 mmol, DS = 5 %, Mw = 0,20-0,40 x 105 g/mol) se rozpustil v 1 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd CS (10 mg, 0,02 mmol, DS = 5 %). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 60 min UVA expozici došlo k nárůstu viskozity.
- 16 CZ 306479 B6
'H NMR (D2O) δ 7,55-7,60 (bs, 1H, -N=CH-) ppm
Příklad 15 Fotolýza Pmoc-DHA-CMCNa v přítomnosti aldehydu CMCNa a zesítění
Pmoc-DHA-CMCNa (10 mg, 0,038 mmol, DS = 3-4 %, Mw = 0,60-0,80 x 105 g/mol) se rozpustila v 1 ml PBS (c = 0,9 %, pH = 7,4) v křemenné baňce. Přidal se aldehyd CMCNa (9 mg, 10 0,038 mmol, DS = 3—4 %. Mw = 0,6 x 105 g/mol). Vzorek se deoxygenoval proudem dusíku a ozařoval po dobu 1 h v UVA, pod N2, při 25 °C, pH = 7 za současného míchání. Po 60 min UVA expozici došlo k nárůstu viskozity.
'H NMR (D2O) δ 7,55-7,60 (bs, 1H, -N=CH-) ppm

Claims (9)
Hide Dependent

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy síťovaných polysacharidických materiálů podle obecného vzorce I polysacharid 1 -R'-N=CH-polysacharid2 (1), kde polysacharidl a pólysacharid2 jsou stejné nebo rozdílné polysacharidy, vybrané ze skupiny zahrnující hyaluronan, chondroitinsulfát, celulózu a jejich farmaceuticky přijatelné soli, a R1 je vybrán ze skupiny zahrnující dihydrazidadipát a hexamethylendiamin, vyznačující se tím, že k vodnému roztoku polysacharidů!, substituovaného v místě aminové skupiny fotolabilní skupinou, podle obecného vzorce II polysacharid 1-R'-NH-CO-O-CH2-R2 (II), kde R1 je definován výše; R2 je vybrán ze skupiny zahrnující pyren, antracen, fenantren, perylen, antrachinon, kumarin a jejich substituční deriváty, které můžou ve své struktuře libovolně obsahovat atomy C, H, O, S, N a vykazují absorpci elektromagnetického záření, a kde stupeň substituce pólysacharidul je v rozmezí 1 až 10 %, se přidá vodný roztok aldehydu polysacharidu2 obecného vzorce III polysacharid2-CH=O (111), kde stupeň substituce polysacharidu2 na aldehyd jev rozsahu 1 až 50 %, a na takto vytvořenou směs se působí elektromagnetickým zářením za současné deoxygenace směsi.
  2. 2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že stupeň substituce polysacharidul je v rozsahu 3 až 10 % a jeho molekulová hmotnost je 10 až 400 kDa, s výhodou 20 až 300 kDa, výhodněji 20 až 100 kDa.
  3. 3. Způsob přípravy podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že stupeň substituce polysacharidu2 je v rozsahu 3 až 25 % a jeho molekulová hmotnost je 10 až 800 kDa, s výhodou 50 až 250 kDa.
  4. 4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr polysacharidů! k polysacharidu2 je v rozsahu 1:2 až 2:1.
  5. 5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se na směs působí elektromagnetickým zářením po dobu 0,25 až 2 hodiny, s výhodou 0,5 až 1 hodinu, při teplotě 10 až 50 °C s výhodou 20 až 35 °C.
  6. 6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že vodné roztoky polysacharidů 1 a 2 dále obsahují ve vodě rozpustné pomocné látky vybrané ze skupiny obsahující anorganické soli, nebo pufry, s výhodou fosfátový pufr, přičemž pH roztoku je v rozsahu 6,5 až 7,5, s výhodou 7,0.
  7. 7. Způsob přípravy podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se použije elektromagnetické záření o vlnové délce 320 až 400 nm, s výhodou 330 až 370 nm.
    - 18 CZ 306479 B6
  8. 8. Způsob přípravy podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že reakce je časově řízena pomocí spínače zdroje elektromagnetického záření nebo pomocí pulzujícího zdroje elektromagnetického záření nebo pomocí stínění reakce.
  9. 9. Způsob přípravy podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že reakce je prostorově řízena použitím fotomasky, fokusovaného elektromagnetického záření nebo paprskem elektromagnetického záření.