Způsob přípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukos aminové části polysacharidu selektivně na aldehyd a způsob jeho modifikace s Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu přípravy derivátu kyseliny hyaluronové, který obsahuje místo primární hydroxylové skupiny -CH2-OH skupinu aldehydickou CTfrO. Oxidaci lze provést v protických rozpouštědlech pomocí systému 4-substituovaný-TEMPO (2,2,6,6-tetramethylio piperidinyloxyl) / ko-oxidant:
TEMPO kde Rje vodík nebo libovolný substituent a ko-oxidant je chlornan sodný (NaClO).
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je významným polysacharidem složeným ze dvou opakujících se jednotek, 20 p-(l,3)-D-giukuronové kyseliny a p-(l,4)-jV-acetyl-D-glukosaminu. Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5,104 až 5.106 g.mol která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu, Kyselina hyaluronová, respektive její sodná sůl hyaluronan, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogeneze. Tento značně hydrofilní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.
.to Schéma 1: Kyselina hyaluronová Oxidace kyseliny hyaluronové
Oxidace polysacharidů je proces, ve kterém dochází ke změně oxidačního stupně funkčních sku35 pin polysacharidu. Nejčastěji dochází ke vzniku karboxylových kyselin nebo aldehydů, jejichž přítomnost může výrazně změnit vlastnosti polysacharidů. Reakce se nejcastěji provádí působením činidel, které obsahují atomy ve vyšších oxidačních stupních.
Selektivní oxidace sacharidů na primární hydroxylové skupině byla popsána Angelinem v článku 40 (European Journal of Organic Chemistry 2006, 19, 4323 až 4326). Autoři použili systém 2.2.6.6 tetramethy 1-1-piperidinyloxyl radikálu TEMPO / TCC v DMF při teplotě 0 °C. Hlavním produktem byl příslušný aldehyd.
- 1 CZ 302503 B6
TEMPO je relativně stabilní radikál, který v reakci může existovat ve třech redox formách. Jenom oxidovaná forma TEMPO je účinná na oxidaci alkoholů nebo geminálních diolů.
|
R
1 |
|
|
R
Ϊ |
|
|
R |
|
h3c. |
Λ |
.ch3 |
oxidant |
H3C\ Γ ] ^CH3 |
oxidant |
h3c. |
Λ |
.CH |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H3Cz |
j |
ch3 |
|
h3c ch3 |
|
h3c- |
1 1 |
CH, |
|
OH |
|
|
έ
|
|
|
H
0 |
|
|
TEMPO |
|
|
TEMPO |
|
|
TEMPO |
|
|
Red. forma |
|
|
|
|
|
Oxid. forma |
|
|
t |
|
|
+ RCH2OH nebo + RCH(OH)2 |
|
| |
|
- RCHO nebo - RCOOH
Do reakcí se přidává v katalytickém množství a tudíž je nutné použít ko-oxidant, který obnovuje přítomnost oxidované formy TEMPO.
io Oxidace primární hydroxylové skupiny hyaluronanu na karboxylovou kyselinu byla uskutečněna pomocí 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxyl radikálu (TEMPO) a NaOCl při pH 10,2 a teplotě 0 °C (Schéma 2) (Carbohydr Res 2000, 327, (4), 455 až 61).
!5
TEMPO
NaOCl
CO2Na NaO?C
OH
O
HO
NH' /
ch3co
Schéma 2: Oxidace na karboxylovou kyselinu
Podobně jako u jiných polysacharidů byla pozorována vysoká regioselektivita a mírná degradace 20 polymeru. Zvýšení koncentrace solí (NaBr, NaCl, Na2SO4) v roztoku vedlo ke snížení rychlosti oxidace. Aldehydy jako produkty této oxidace ale nejsou v tomto článku zmíněné.
Oxidace hyaluronanu na karboxylovou kyselinu pomocí systému TEMPO/NaClO byla zachycena v patentu (WO 02/18448 A2). Autoři se zabývali také interakcemi perkarboxylovaných poly25 sacharidů za vzniku biologických komplexů.
Rychlost oxidace HA a různých polysacharidů pomocí jodistanu sodného studoval Scott a kol. (Schéma 3) (Histochemie 1969, 19, (2), 155 až 61).
-2CZ 302503 B6
Schéma 3: Oxidace na díaldehyd
Faktory jako délka řetězce, substituce, konfigurace polymerů a teplota byly studovány a kvantifikovány. Použití NalO4 na oxidaci hyaluronanu bylo také popsáno v patentech (US 6 683 064 a
US 6 953 784).
Modelové reakce nízce-molekulových analogů HA ve fysiologickém pufru byly podrobně studovány v článku (Carbohydr Res 1999, 321, (3 až 4), 228 až 34). Pomocí GC-MS byly identifikovány produkty oxidace glukuronové a glukosám i nové části. Výsledky také naznačují, že oxidace io probíhá primárně na glukuronové části, přičemž kyseliny meso-vinná je hlavní produkt a může sloužit jako biomarker oxidace hyaluronanu.
Ve spise WO 99/57158 autoři popisují oxidaci primárních alkoholů, zejména v karbohydrátech, při které dochází k selektivní oxidaci na aldehydy a karboxylové kyseliny. Ačkoli je v anotaci is zmíněna přítomnost aldehydu jako produktu, aldehyd není uvedený ani v nárocích, ani v příkladech, a některé příklady dokonce explicitně uvádí, že po reakci nebyl detekován aldehyd. V příkladech je mj. uvedena také oxidace kyseliny D-glukuronové. Výsledkem je zrušení sacharidického cyklu za vzniku kyseliny glukarové, což je pro způsob podle vynálezu nežádoucí. Dále spis vysloveně uvádí, že proces vede k selektivnímu vzniku kyseliny, zatímco aldehyd, pokud je pří20 tomen, tak jen jako vedlejší produkt
Glenn D, Prestwich v internetovém článku Biomaterials from Chemically-Modified Hyaluronan,
29.3.2001 http://glycoforum.gr.ip/science/hyaluronan/HA18/HA18E.html popisuje využití derivátů hyaluronanu k vázání nukleofilů, ale oxidovaných v poloze 2.3 glukuronové části poly- sacharidu. Nevýhodou je výše uvedené štěpení cyklu a následná nalomená struktura spojených sacharid ických cyklů.
V článku (Tetrahedron Lett. 34, 46, (1995), 8371) je popsaná oxidace cyklodextrinu v aprotických rozpouštědlech s použitím činidla známého pod názvem Dess-Martin periodinane, přičemž produktem reakce je selektivně aldehyd. Toto činidlo je známé pro oxidaci nízkomolekulových primárních alkoholů na aldehydy, ale jen v bezvodých podmínkách, protože ve vodních prostředích hydrolyzuje. Proto jeho použití na oxidaci hydrofilních polysacharidu není nasnadě. Využití HA oxidované na aldehyd v síťovacích reakcích
Využití oxidované HA na přípravu síťovaných hydrogelu popsal Weng a kol. (schéma 4) (J Biomed Mater Res A 2008, 85, (2), 352 až 65). V tomto případě byly použity dva prekurzory, částečně oxidovaný hyaluronan a želatina.
+ nh2 želatin
želatin:
- j CZ 302503 B6
Schéma 4: Síťovací reakce oxidovaného hyaluronanu a želatiny
Fyzikálně-chemické vlastnosti výsledných hydrogelů byly objasněny pomocí instrumentálních metod FT-1R, SEM (skenovací elektronová mikroskopie) a reometrií. Zvýšení oxidačního stupně hyaluronanu vedlo ke zvýšení kompaktnosti materiálu a ke snížení schopnosti absorbovat vodu. Na studium interakce buňka- hydrogel byly použity dermální fibroblasty. Studovaný hydrogel ί jeho degradační produkty byly biokompatibilní, jak se ukázalo po stanovení dlouhodobé viabílity. Hydrogel, který byl osazen buňkami, podléhal během 4 týdnů degradaci spojené se ztrátou soudržnosti materiálu. Dobrá biokompatibilita a biodegradabilita byla demonstrována při použití io těchto hydrogelů jako podkožních implantátů u myší. Nakonec, in vitro a invivo uložení extracelulámího matrixu v hydrogelu bylo prokázáno pomocí SEM analýzy.
V dalším článku Wenga a kol (Biomaterials 2008, 29, (31), 4149 až 56) byla popsána metoda přípravy síťované HA z oxidovaného hyaluronanu a želatiny metodou water-in-oil-emulsion, kde se tvoří 3D hydrogel bez přítomnosti externího linkeru. V této práci se pomocí HPLC studovalo také zachycení modelových látek do struktury hydrogelu (encapsulation) a jejich uvolňování pomocí makrofágů.
Přípravu elastických hydrogelů spojením HA oxidované na HA-aldehyd pomocí jodistanu sod2o ného, a HA modifikované s dihydrazidem kyseliny adipové, popsal Sahiner a kol. (Schéma 5) (J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2008, 19, (2), 223 až 43).
Schéma 5: Příprava síťovaného hyaluronanu
Jak ukázalo MTT stanovení, výsledné deriváty neměly pozorovatelný efekt na proliferaci fibroblastů.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je postup, při kterém dochází k oxidaci primární hydroxylové skupiny kyse35 líny hyaluronové v poloze 6 glukosám i nové části polysacharidu selektivně na aldehyd ve vodě.
Reakce probíhá při použití oxidačního systému 2,2,6,6-tetramethyl—1—piperidinyloxyI radikálu TEMPO ί ko oxidant. Podobné přístupy, které byly doposud popsané, zavádí buď aldehydickou skupinu do poloh 2 a 3 glukuronové části hyaluronanu, přičemž dochází k otevření sacharidového
-4CZ 302503 B6 cyklu (schéma 6, struktura 2), nebo zavádí do polohy 6 glukosáminové části hyaluronanu skupinu karboxy lovou (schéma 6, struktura 1).
s
Schéma 6: Oxidace hyaluronanu, reakční produkty
Způsob podle vynálezu je výhodnější v tom, že příslušný produkt oxidace (struktura 3, schéma 6) io má zachovanou strukturu spojených sacharidových cyklů. U produktu oxidovaného na dialdehyd (struktura 2, schéma 6) je cyklus zrušen, což má za následek „nalomení“ linearity řetězce, a tím pádem výraznou změnu 3D struktury polysacharidu v porovnání s nemodifikovaným hyaluronanem. U produktu oxidovaného na karboxy lovou kyselinu (struktura 1, schéma 6) sice nedochází k „nalomení“ linearity řetězce, ale vzniklá karboxylová skupina neumožňuje takové rozmanité možnosti modifikace (vázání) jako skupina aldehydická. Protože karboxylová skupina už součástí nemodifikovaného polysacharidu je, dochází při oxidaci na strukturu 1 (schéma 6) jenom k zvýšení polarity polysacharidu, ale ne ke vzniku nové kvality využitelné pro vázání jiných substituentů.
2o Je známo, že aldehydická skupina s navázaným alkylem ve vodě existuje ve formě tzv. geminálního diolu HA-CH(OH)2, který reaguje s nukleofily podobně jako aldehyd. Pomocí NMR spektroskopie bylo prokázáno, že hyaluronan oxidovaný v poloze 6 glukosaminové části (produkt 3) existuje ve vodných roztocích z více než 95 procent ve formě geminálního diolu.
Ve způsobu podle vynálezu se kyselina hyaluronová rozpustí ve vodě v přítomnosti solí, pak se přidá oxidační činidlo a směs se míchá pri teplotě -10 až 20 °C, po dobu 1 až 150 h, s výhodou 0 °C po dobu 24 h.
Připravený oxidovaný hyaluronan lze použít na vázání sloučenin, které obsahují například amino 30 skupinu. Vázání lze provést buď ve formě iminů, nebo po redukci ve formě aminu (reduktivní aminace) (schéma 7).
redukce
-5CZ 302503 B6
Schéma 7 Vázání aminů na oxidovaný hyaluronan
Oba stupně této modifikace probíhají ve vodě, na redukci se používá například NaBH3CN. Oba stupně reakce popsané ve schématu 7 lze provést v jednom stupni najednou.
Modifikace derivátu kyseliny hyaluronové se dosáhne reakcí oxidovaného derivátu s aminem obecného vzorce H2N-R nebo hyaluronanem substituovaným skupinou -R-NH2, kde R je alkylový, lineární nebo rozvětvený řetězec Cl až C30 volitelně s obsahem aromatických nebo heteroaromatických skupin. Tímto aminem může být alkylamin, například butylamin nebo hexandiio amin, aminokyselina, peptid nebo polysacharid obsahující volnou amino skupinu. V případě použití diaminu nebo sloučenin s obsahem tri nebo víc aminoskupin, je možné připravit síťované deriváty hyaluronanu. Síťované deriváty lze připravit i reakcí aldehydu s hyaluronanem substituovaným aminoalkylovou skupinou HA-alkyl-NH2.
Příklady provedení vynálezu
DS - stupeň substituce = 100 % * molámí množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidu
Zde používaný výraz ekvivalent (eq) se vztahuje na dimer kyseliny hyaluronové, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozího hyaluronanu (zdroj: CPN spol. s r.o.. Dolní Dobrouč, ČR) byla 25 stanovena metodou SEC-MALLS.
Příklad I Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaClO.
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (0,1 g, 20k Da) (s obsahem NaCI 10 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a NaHCO3 (30 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě -5 °C. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCI, 0,1% NaHCO3) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 10 % (stanoveno z NMR) 'HNMR(D2O) HSQC (D2O) FT-IR(KBr) δ 5,25 (s, IH, polymer-C//(OH)2) cross signál 5,26 ppm('H) - 90ppm(l3C) (polymer-C7/(OH)2) 1740 cm ' CH-O
Příklad 2 Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaClO.
Do 0,5% vodného roztoku hyaluronanu (0,1 g, 2000 kDa) (s obsahem NaCI 10 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a NaHCO3 (30 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 eq). Směs se míchala 24 h pri teplotě -5 °C. Roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCI, 0,1% NaHCO.Ó 3 krát 51itrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 10 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 1)
Příklad 3 Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaClO.
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (0,1 g, 20 kDa) (s obsahem NaCI 10 hmotn. %), 4-acetamido-TEMPO (0,01 eq) a NaHCO3 (30 eq.) se postupně přidával vodný
-6CZ 302503 B6 roztok NaClO (0,5 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě -5 °C. Roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCOJ 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 10 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 1)
Příklad 4 Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaClO.
io Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (OJg, 20 kDa), 4-acetamido-TEMPO (0,1 eq) aNaHCO3 (30 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,3 eq). Směs se míchala 1 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCOJ 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 5 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 1)
Příklad 5 Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaClO
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (OJg, 20 kDa), 4-acetamido-TEMPO (OJ eq) a NaHCO3 (30 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,3 eq). Směs se míchala 1 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCOJ 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 5 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 1)
Příklad 6 Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaBrO.
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (OJ g, 20 kDa) (s obsahem NaBr 5% hmotn.), 4-acetamido-TEMPO (0,5 eq) a NaHCO3 (30 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 0 °C. Roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0J% NaHCOJ 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 14 % (stanoveno z NMR, podrobně příklad 1)
Příklad 7 Oxidace kyseliny hyaluronové systémem TEMPO/NaClO.
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (OJg, 200 kDa) (s obsahem NaBr 10% hmotn.), TEMPO (0,5 eq) a NaHCO3 (5 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 eq). Směs se míchala 24 h pří teplotě 0 °C. Roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0J% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 18 % (stanoveno z NMR. podrobně příklad 1).
Příklad 8 Reakce oxidovaného hyaluronanu s aminem.
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (OJ g, stupeň oxidace DS=18%, příklad 7) ve vodě se přidal butylamin (0,4 eq). Směs se míchala 24 b pri teplotě 20 °C. Roztok pak byl srážen dvojnásobným množstvím acetonu a OJ ml nasyceného vodného roztoku NaCl, filtrován a sušen ve vakuu. Výsledný žlutý materiál byl pak analyzován.
-7 CZ 302503 B6
UV-V1S 328nm, η^π* přechod -Cl f-NPříklad 9 Reakce oxidovaného hyaluronanu s butylaminem a následná redukce.
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS=18 %, příklad 7) ve vodě se přidal butylamin (0,4 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN v 0,5 ml vody (3 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyžován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCCC) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 15 % (stanoveno z NMR) 'HNMR (D2O) 5 3,05 (m, 2H, polymer-Clh-NH^C/C-), 1,60 (m, 2H, polymer-CH2NH-CH2-C//2-), 1,35 (m, 2H, polymer-CH2-NH-CH2-CH2-C//2-), 0,85 (m, 3H, -CIC-C/A)
DOSY NMR (D2O) logD (0,85 ppm,-CH2-C//3) ~-10,3 m2/s logD (1,35 ppm, polymer-CH2-NH^CH2-CH2C772-) ~ 10,3 m2/s logD (1,60 ppm, polvmer-ClL-NH-CIC-CAC) ~ 10,3 m2/s logD (3,05 ppm, polymer-CH2-NH-C//2-) - 10,3 m2/s logD (2,03 ppm, polymer-C//3-CO-NH-polymer) - 10,3 m2/s logD (HO) - -8,6 m2/s
Příklad 10 Reakce oxidovaného hyaluronanu s diaminem a následná redukce.
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS-18 %, příklad 7) ve vodě se přidal hexandiamin (0,4 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN (3 eq) v 0,5 ml vody. Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO?) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně).
Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 16% (stanoveno z NMR) 'H NMR (D2O) δ 3,12 (m, 2H, polymer-CH2~NH-Cř/2-), 3,02 (m, 2H, CHNH2), 1,7 (m, 4H, -NH-CH2-C//2-CH2-C//2-), 1,45 (m, 4H, -NHCH2-CH2-C//2-C//2-CH2-)
DOSY NMR (D2O) logD (1,45 ppm, -NH-CH2-CH2<:tf2-C//-H3H2-) - 10,5 m2/s logD (1,7 ppm, -NH-CH2C//2-CH2-CH?-C7/2-) ~ 10,5 m2/s logD (3,02 ppm, -CH2-NH2) - 10,5 m2/s logD (2,03 ppm, C7/3-CO-NH-polymer) ~ 10,5 m2/s logD (tf2O)~-8,7 m2/s
Příklad 11 Reakce oxidovaného hyaluronanu s amino-hyaluronanem.
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS=18 %, příklad 7) ve vodě se přidal jednoprocentní vodný roztok derivátu hyaluronanu substituovaného hexandiaminem (1 eq, DS=16 %, příklad 16) pří teplotě 20 °C. Po několika minutách vypadla nerozpustná kompaktní gumovitá sraženina, která byla mechanicky rozbitá na malé kousky, které byly odfiltrovány a sušeny při sníženém tlaku.
FT-IR(KBr) 1700 cm’1
-8CZ 302503 B6
Příklad 12 Reduktivní aminace oxidovaného hyaluronanu s lysinem.
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS=18 %, příklad 7) ve vodě se přidal lysin (0,3 eq). Směs se míchala 24 h pří teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN (3 eq) v 0,5 ml vody. Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO-O 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně).
Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 14 % (stanoveno z NMR) 'H. HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D2O): δ 1,33 (m, 2H, -CH-CH2-C//2-), 1,48 (m, 2H, -CHCH2-CH2-C/Í2-), 1,55 (m, IH, -CH-C7/H-). 1,63 (m, IH, -CH-ČH/Z-), 2,62 (m, 2H, -CHCH2-CH2-CH2-CH2~), 2,65 (m, IH, polymer-C//H-NH-), 2,99 (m, IH, polymer-CH//-NH-), 3,l6(m, IH,-Ctf-CH2-).
Příklad 13 Reduktivní aminace oxidovaného hyaluronanu s lysinem.
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS=18%, příklad 7) ve vodě se přidal lysin (20 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN (10 eq) v 0,5 ml vody. Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně).
Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 17 % (stanoveno z NMR, Příklad 1)
Příklad 14 Reduktivní aminace oxidovaného hyaluronanu se serinem
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS=18 %, příklad 7) ve vodě se přidal lysin (0,3 eq). Směs se míchala l minutu při teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN (3 eq) v 0,5 ml vody. Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO?) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně).
Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 14 % (stanoveno z NMR) *H, HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D3O): δ 2,74 (m, IH, polymer-C//H-NH-), 3,08 (m, IH, polymer-CJ/H-NH-), 3,21 (m, IH, -C//-CH2-OH), 3,72 (m, IH, CH-C/7H-OH), 3,78 (m, IH, -CH-CH/7—OH).
Příklad 15 Reduktivní aminace oxidovaného hyaluronanu s arginem,
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupeň oxidace DS=18 %, příklad 7) ve vodě se přidal lysin (0,3 eq). Směs se míchala 100 h při teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN (3 cq) v 0,5 ml vody. Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litrů (2 x denně).
Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 11 % (stanoveno z NMR) ’H, HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D2O): δ 1,61 (m, 2H, -CH~CH2-C//2-), 1,63 (m, IH, -CHCHtf-), 1,70 (m, IH, -CH-CH//-), 2,65 (m, IH, polymer-C//H-NH-), 3,01 (m, IH, polymerC/7H-NH), 3,13 (m, 1H,-C//-CH2-), 3,21 (m, 2H, -CH-CH2CH2-C//2-).
-9 CZ 302503 Β6
Příklad 16 Reduktivní aminace oxidovaného hyaluronanu s pentapeptidem PAL-KTTK.S (palmatoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser).
Do jednoprocentního roztoku oxidované kyseliny hyaluronové (0,1 g, stupen oxidace DS=18 %, příklad 7) v systému voda/isopropanol 2/1 se přidal jednoprocentní roztok substituovaného pentapeptidu PAL-KTTKS (0,05 eq) v isopropylalkoholu. Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Do tohoto roztoku se přidal roztok NaBH3CN v 0,5 ml vody (3 eq). Směs se míchala 24 h při teplotě 20 °C. Výsledný roztok pak byl zředěn na 0,1% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCOj) 3 krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7 krát 5 litru (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 9 % (stanoveno z NMR) '11. HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D2O): δ 1,61 (ηκ 211,-CH--CH2-C//2-), 1,63 (m, 1H.-CHCHH-), 1,70 (m, IH, -CH-CHtf-), 2,65 (m, IH, polymer-42/7H-NH-), 3,01 (m, IH, polymerCH//-NH-), 3,13 (m, 1H, -C//-CH2-), 3,21 (m, 2H, CH-CH2--CHv -CÁ/?-).