CZ303722B6 - Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití - Google Patents
Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303722B6 CZ303722B6 CZ20120024A CZ201224A CZ303722B6 CZ 303722 B6 CZ303722 B6 CZ 303722B6 CZ 20120024 A CZ20120024 A CZ 20120024A CZ 201224 A CZ201224 A CZ 201224A CZ 303722 B6 CZ303722 B6 CZ 303722B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- labeled
- tritium
- range
- mol
- Prior art date
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 83
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 82
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 80
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims abstract 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 claims description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 abstract description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 11
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 abstract description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 9
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 abstract description 4
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 10
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 7
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 6
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N methyl-cyclopentane Natural products CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 3
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 3
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102100039285 Hyaluronidase-2 Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229940072322 hylan Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000003608 radiolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004436 sodium atom Chemical group 0.000 description 1
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001694 thigh bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Resení se týká kyseliny hyaluronové znacené tritiem a zpusobu její prípravy. Postup je zalozen na oxidacne-redukcní strategii, kde k oxidaci na aldehyd a redukci zpet na alkohol dochází v poloze 6-glukosaminové cásti polysacharidu. Výsledkem je nativní derivát o molekulové hmotnosti v rozsahu 800 az 1 000 000 g.mol.sup.-1.n. vykazující vysokou stabilitu a specifickou aktivitu, která je omezená jenom specifickou aktivitou pouzitého redukcního cinidla. Postup prípravy je rychlý, levný a produkuje minimum radioaktivního odpadu v podobe balastu. Znacená kyselina hyaluronová byla testována pri studiích biodistribuce u potkanu, kde byla overena její stabilita detekcí kyseliny hyaluronové po intravenózním podání v moci. Znacená kyselina hyaluronová se muze pouzít v biomedicínských aplikacích.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká kyseliny hyaluronové značené tritiem, způsobu značení kyseliny hyaluronové tritiem pomocí oxidačně-redukční strategie a použití kyseliny hyaluronové značené tritiem. Výsledkem tohoto značení je výměna vodíku na uhlíku primární hydroxylové skupiny gluko10 saminové části polysacharidů -CHH-OH za radioaktivní tritium -CHT-OH, přičemž zůstává zachována primární i sekundární struktura polysacharidů, což znamená, že polysacharid neztrácí svůj nativní charakter. Transformaci vystihuje následující schéma:
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je významným polysacharidem složeným ze dvou opakujících se jednotek 20 [3-(l,3)-D-glukuronové kyseliny a 3-(l,4)-V-acetyl-D-glukosaminu. Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5.104 až 5.106 g.moT1, která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu. Kyselina hyaluronová, respektive její sodná sůl hyaluronan, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Tento znač25 ně hydrofilní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.
Schéma 1. Kyselina hyaluronová
Radioaktivní značení kyseliny hyaluronové
Příprava radioaktivně značené HA v nativní podobě zahrnuje výměnu vodíku nebo uhlíku za 35 jejich radioaktivní analogy. Nativní forma je definována tak, že jedinou změnou ve struktuře molekuly je záměna příslušného atomu kyseliny hyaluronové (nativní obsahuje atomy C, Η, O, N a Na) za jejich radioaktivní analog beze změn primární struktury polysacharidů a bez přídavku dalších substancí typu linker nebo chelatační činidlo (Cožikova D., Laznickova A., HermannoCZ 303722 B6 va M., Svanovsky E., Pálek L., Buffa R., Sedova, P., Koppova R., Petrik M., Smejkalová D., Laznicek M., and Velebný V., J. of Pharm. and Biomed. Analysis, 2010, 52, 517 až 24). Důležitým parametrem je hydrolytická stabilita značení, která závisí především na charakteru vázání radioaktivní značky na polymer. Tak například deriváty, kde je tritium vázané na kyslíku (Wilzbach K. E., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79 1012), nejsou stabilní a ve vodě podléhají výměně tritia za vodík. Radioaktivně značená HA se používá například při studiu biodistribuce, kde se sledují nepatrné koncentrace polymeru, a tudíž je žádané, aby stabilita radioaktivního značení byla co nejvyšší. V opačném případě by se mohlo stát, že je místo polymeru sledována jenom samotná nenavázaná radioaktivní značka.
Značení kyseliny hyaluronové pomocí tritia
Kyselina hyaluronová značená tritiem může být ve formě nativní nebo nenativní. Většina příkladů nalezených v literatuře připravuje nativní kyselinu hyaluronovou značenou tritiem cestou biosyntetickou. Je to postup, při kterém se mikroorganismům produkujícím kyselinu hyaluronovou přidá nízce molekulový radioaktivní prekurzor typu octan sodný (Fraser E. a kol.: Uptake and degradation of hyaluronan in lymphatic tissue, Biochem. J. 256, 156 až 8, 1988), glukóza (Čožikova D., Laznickova A., Hermannova M., Svanovsky E., Pálek L., Buffa R., Sedova, P., Koppova R., Petrik M., Smejkalová D., Laznicek M., and Velebný V., J. of Pharm. and Biomed. Analysis, 2010, 52, 517 až 24) nebo glukosamin (Smedsrod B. a kol.: Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells, Biochem. J. 223, 617 až 26, 1984). Finální značený polymer se pak separuje z extraktu získaného z hrubé biomasy. Výhodou tohoto řešení je možnost připravit nativní značený polymer s vyšší molekulovou hmotností. Nevýhodou je komplikovanější izolace, obyčejně nízká aktivita finálního materiálu a vysoká cena, protože většina přidané radioaktivity končí v balastu.
Oproti tomu chemické značení je daleko účinnější, avšak připravit značenou kyselinu hyaluronovou o molekulové hmotnosti nad 500 000 g.moF1 kvůli degradačním procesům způsobeným chemickou modifikací je velmi obtížné. Jednou z možností, kteréjsou svojí filozofií blízké řešením popsaným v této akci, je redukce kyseliny hyaluronové oxidované na aldehyd pomocí [3H] NaBH4 (Allard, S. and O'Regan, M., The role of elastoviscosity in the efficacy of viscosupplementation for osteoarthritis of the knee: a comparison of Hylan G-F 20 and a lower-molecularweight hyaluronan, Clin. Ther., 22, 792 až 795 (2000)). Rekci vystihuje následující schéma.
Nevýhodou tohoto řešení je fakt, že oxidací a redukcí dochází k trvalé změně struktury polysacharidu, takže derivát nemůžeme považovat za nativní.
Kyselinu hyaluronovou lze také jednoduše převést na [3H]~HA izotopovou výměnou vodíků za tritium ve vodném roztoku za katalýzy Pd/CaCO3 (Wilzbach K. E. a kol.: J. Am. Chem. Soc. 79, 1012, 1957).
O
O
Nevýhodou tohoto způsobu značení je lokalizace tritia v hydroxylových skupinách, které podléhají rychlé radiolýze vedoucí k neustálému poklesu radioaktivity značené kyseliny hyaluronové.
Značenou kyselinu hyaluronovou v nativní podobě lze připravit také deacetylací polymeru a rea5 cetylací se značeným acylačním činidlem (Kerry V. a kol.: Process for preparing 3H or 14Chyaluronic acid or salts there of having a defined molecular weight and specific radioactivity, SK
280150, PozoM. A., Balasz E. A., Belmonte C.: Reduction of sensory responses to passive movements of inflamed knee joints by Hylan, Exp. Brain. Res., 116, 3 až 9, 1997). Postup vystihuje následující schéma.
O
Nevýhodou tohoto postupu značení je degradace polymeru ve stupni deacetylace, takže výsledná molekulová hmotnost se pohybuje pod 200 000 g.moE1. V případě, že by deacetylace proběhla jenom v nepatrném měřítku, lze molekulovou hmotnost zvýšit nad 200 000 g.moE1. V tom případě, je ale nutné řešit selektivitu radioaktivní reacylace, protože při tak velkém nadbytku hydroxylových skupin oproti aminovým skupinám lze předpokládat, že nezanedbatelná část acylačního činidla se bude vázat na hydroxy skupinu jako hydrolyticky labilní ester.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nevýhody překonává řešení podle vynálezu. Předmětem vynálezu je kyselina hyaluronová značená tritiem a postup, při kterém dochází ke stabilnímu radioaktivnímu značeni kyseliny hyaluronové se zachováním jejích nativních vlastností. Navržený postup je vhodný pro přípravu materiálu o škále molekulových hmotností od 800 g.moE1 (tautomer) až po 1000 000 g.mor1.
Konkrétně se vynález týká kyseliny hyaluronové mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mor1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mor1 značené tritiem (T) na uhlíku v poloze 6 glukosaminové části podle vzorce I:
(I),
Dále se vynález týká způsobu přípravy kyseliny hyaluronové mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mor1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mol 1 značené tritiem, kde se nejprve oxiduje kyselina hyaluronová na aldehyd v poloze 6 glukosaminové části (dále v textu označováno jako Krok 1), a potom se oxidovaná kyselina hyaluronová redukuje pomocí značeného borohydridu sodného [3H] NaBH4 (dále v textu označováno jako Krok 2).
Tyto dva kroky jsou detailněji rozebrány níže:
Krok 1: Selektivní oxidace primární hydroxylové skupiny kyseliny hyaluronové v poloze 6 glukosaminové části polysacharidů na aldehyd. Reakce probíhá při použití oxidačního systému 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxyl radikálu R-TEMPO / NaClO ve vodě, kde R je vodík nebo skupina N-acetyl:
Krok 2: Redukce aldehydu pomocí radioaktivně značeného borohydridu [ H]NaBH4 ve vodném bazickém rozpouštědle:
V případě, že je nutné významně snížit molekulovou hmotnost polymeru, proběhne následně ještě enzymatická degradce polymeru pomocí hyaluronidázy (dále v textu označováno jako Krok 3):
Krok 1 probíhá s výhodou ve vodě při teplotě -5 až 10 °C, molární množství NaClO je v rozmezí 0,05 až 0,2 eq. a molární množství R-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové. Výchozí kyselina hyaluronová může mít molekulovou hmotnost v rozsahu 10 000 g.mor1 až 5 000 000 g.mol”1.
Krok 2, kde dochází k redukci a ke značení oxidované kyseliny hyaluronové, probíhá s výhodou β
v bazickém vodném rozpouštědle nejprve pomocí značeného borohydridu [ H]NaBH4 a následně pomocí neznačeného borohydridu NaBH4 při teplotě -5 až 20 °C, s výhodou 0 až 5 °C, kde molámí množství značeného borohydridu je v rozmezí 0,0001 až 0,1 eq. a molámí množství neznačeného borohydridu je v rozmezí 0,01 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové. Jako bazické vodné rozpouštědlo se s výhodou použije roztok hydroxidu sodného nebo uhličitanu sodného o koncentraci 0,01 až 0,5 mol.dm’.
V případě, že po kroku 2 následuje krok 3, dochází k degradaci značené kyseliny hyaluronové pomocí enzymu bovinní testikulámí hyaluronidázy BTH při 37 °C po dobu 2 až 72 hodin, s výhodou 48 hodin, kde aktivita přidaného enzymu je v rozmezí 10 až 30 U/mg, s výhodou 20 U/mg.
Vynález se dále týká použití kyseliny hyaluronové značené tritiem pro biomedicínské aplikace.
Oproti analogům zmíněným v části „Dosavadní stav techniky“ je navržený způsob vynálezu výhodnější v tom, že produkuje kyselinu hyaluronovou v nativní podobě, je vhodný pro přípravu široké škály molekulových hmotností a je levný (efektivní). Nejnákladnější části procesu je pochopitelně cena radioaktivního činidla, takže efektivnost (levnost) tohoto procesu je dána samotnou chemickou podstatou kroku 2, při kterém je značná část přidané radioaktivity ve formě triciovaného borohydridu převedena na polymer. To je velký rozdíl oproti biosyntetickým metodám, které sice vedou k nativní značené kyselině hyaluronové, ale kde značná část drahého radioaktivního činidla končí v balastu. To také značně omezuje výslednou aktivitu produktu, kteráje v případě biosyntézy nízká. Dalším parametrem, který je důležité porovnat, je rozsah molekulových hmotností produktu. V tomto porovnání jsou v nevýhodě metody, které obsahují krok významně degradující polymer, jako například deacetylaci.
Porovnání známých metod se způsobem podle vynálezu vystihuje následující tabulka:
| metoda | Efektivnost procesu | Nativnost produktu | Mol. hmotnost produktu g.mor | Stabilita značení |
| Způsob podle vynálezu | + | + | Oligo až 1 000 000 | + |
| Oxidace s NaIO4 + redukce | + | 10 000 až 1 000 000 | + | |
| Izotopová výměna s [JÍT|ITO | + | + | Oligo až 2000 000 | |
| biosyntéza | + | Oligo až 2000 000 | ||
| Deacetylace na DS vyšší 10% + reacetylace | + | + | Oligo až 100 000 | |
| Deacetylace na DS nižší 1% + reacetylace | - | + | Oligo až 300 000 | + |
| Metody používající radioaktivní kovy nebo jód | + | - | 10 000 až 1 000 000 | + |
DS = stupeň substituce = 100 % * molární množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidů
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje chromatogram, kde je zachycena aktivita jednotlivých frakcí moči potkanů z příkladu 5 po SEC (Size exclusion chromatography). CPMB = aktivita (counts per minuté), S# = retenční čas (min).
Příklady provedení vynálezu
DS = stupeň substituce = 100 % * molární množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidu
Zde používaný výraz ekvivalent (eq) se vztahuje na dimer kyseliny hyaluronové, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozí kyseliny hyaluronové (zdroj: CPN spol. sr.o., Dolní Dobrouč, ČR) byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Tritium je zde uváděno jako [3H] nebo zkráceně (T)Příklad 1 Příprava triciované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 1 000 000 g.moE1. Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 2 000 000 g.moT1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,1 eq.). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml ethanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3—krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně) při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 3 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 1 100 000 g.moE1 (stanoveno SEC-MALLS) 'H NMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-C//(OH)2)
Krok 2. Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 1 100 000 g.moE1) s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % se přidalo 0,5 ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 2 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak filtroval přes 10 000 g.moE1 filtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
Příklad 2 Příprava triciované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 800 g.mol 1 (tetramer)
Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 1% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 200 000 g.mol·”1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,2 eq). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml ethanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 50 000 g.mor1 (stanoveno SEC-MALLS) 'HNMR(D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-CA(OH)2)
Krok 2. Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 50 000 g.mor1) s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % se přidal 0,5ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 3 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak fdtroval přes 10 000 g.moE1 fdtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
Krok 3 Enzymatická degradace
Roztok z kroku 2 se podrobil degradaci pomocí bovinní testikulární hyaluronidázy BTH (EC 3.2.1.35) v 0,lM octanu sodném s přídavkem 0,15M NaCl, pH se upravilo na hodnotu 5,3 použitím ledové kyseliny octové. Kyselina hyaluronová se rozpustila v uvedeném rozpouštědle (c= 10 g/1) a následně se přidalo 20 U/mg BTH. Kyselina hyaluronová se enzymaticky degradovala při 37 °C 48 hodin. Reakce se ukončila krátkým povařením (zhruba 3 min) degradovaného roztoku. Po vychladnutí se směs oligomerů SH přefdtrovala přes 0,2mm filtr a separovala se pomocí ionexové chromatografie na jednotlivé oligomery. Radiochemická stabilita separovaných oligomerů byla potvrzena opětovným měřením radioaktivit frakcí získaných po ionexové chromatografii po 60 dnech stání při 5 °C.
Příklad 3 Příprava triciované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 35 000 g.moE1 Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 1% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 200 000 g.mol1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaCIO (0,2 eq). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml ethanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 50 000 g.moE1 (stanoveno SEC-MALLS) 'HNMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-CH(OH)2)
Krok 2 Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 50 000 g.moE1) s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % se přidalo 0,5 ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 3 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak filtroval přes 10 000 g.mor1 filtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
DS aldehydu 0 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 35 000 g.moE1 (stanoveno SEC-MALLS)
Příklad 4 Příprava tricionované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 35 000 g.mor1 Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 1% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 200 000 g.mor1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,2 eq). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml etanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 50 000 g.mor1 (stanoveno SEC-MALLS) ’H NMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-Ctf(OH)2)
Krok 2 Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 50 000 g.mor1) s obsahem Na2CO3 0,1 hmotn. % se přidalo 0,5 ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem Na2CO3 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 3 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak filtroval přes 10 000 g-mol1 filtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
DS aldehydu 0 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 35 000 g.mof1 (stanoveno SEC-MALLS)
Příklad 5 Studium biodistribuce tritiované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 35 000 g.mof1 u potkanů po intravenózní aplikaci až 24 hodin před začátkem experimentu byla potkanům odebrána potrava, voda jim byla ponechána ad libitum. Zvířata byla před aplikací uvedena do éterové anestezie. Přípravek byl potkanům aplikován do povrchové stehenní žíly (véna saphena) o objemu 0,2 ml na zvíře (0,5 mg/zvíře). Poté byli potkani umístěni jednotlivě volně v klecích. Za 5 min, 1 h, a 24 h po aplikaci byla potkanům v navozené éterové anestezii odebrána krev z vypreparované a. carotis a po usmrcení vykrvácením byly ihned odebrány slinivka břišní, játra, nadledviny, ledviny, plíce, srdce, slezina, žaludek, duodenum, jejunum, ileum, tlusté střevo, varlata, vzorek kůže ze stehenní části, vzorek stehenního svalu, štítná žláza, mozek, vzorek tuku ze stehenní části, kost stehenní a kloub pánevní. Plazma byla získávána centrifugací při 4 000 ot/min po dobu 5 min na centrifuze Z 200A (Hermle). Hmotnost orgánů a tkání byla stanovena na elektronických vahách Scaltec SBC41
Vzorky pro měření aktivity 3H byly zpracovány následovně: k cca 0,1 g tkáně o stanovené hmotnosti byl přidán lml solubizéru SOLVABLE. Vzorky byly rozpuštěny po dobu 3 dnů při 60 °C. Po ochlazení na pokojovou teplotu bylo ke vzorku přidáno 10 ml scintilačního roztoku ULT1MA GOLD (PerkinElmer).
Aktivita 3H byla měřena kapalnou scintilací na analyzátoru Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer), přičemž aktivita vzorků byla srovnávána s aktivitou standardních vzorků připravených následovně:
0,2 ml přípravku se injekční stříkačkou převedlo do lOOml odměrné baňky, objem se doplnil na 100,0 ml a po promíchání se odpipetoval 1,0 ml + 1 ml SOLVABLE + 10 ml scintilačního roztoku ULTIMA GOLD k měření aktivity.
Výsledky biodistribuce shrnuje následující tabulka 1:
3 — I
Tabulka 1 Distribuce aktivity H po intravenózní aplikaci H-HA (35 000 g.mol ) potkanům (výsledky vyjádřeny v % dávky na orgán a v % dávky/g).
| % dávky/orgán | 5 min | 60 min | 120 min | 24 h |
| Játra | 12,319 ±0,772 | 23,680 ±2,540 | 15,177 ±0,890 | 7,075 ± 0,746 |
| Nadledviny | 0,037 ±0,005 | 0,014 ±0,001 | 0,013 ± 0,002 | 0,014 ±0,001 |
| Ledviny | 9,278 ±0,211 | 2,355 ± 2,691 | 0,738 ±0,148 | 0,589 ±0,057 |
| Plíce | 0,997 ±0,226 | 0,338 ± 0,086 | 0,354 ±0,018 | 0,337 ±0,037 |
| Srdce | 0,482 ± 0,089 | 0,165 ±0,014 | 0,179 ±0,044 | 0,193 ±0,006 |
| Slezina | 0,357 ±0,073 | 0,884 ±0,276 | 0,687 ± 0,203 | 0,449 ± 0,067 |
| Žaludek | 0,234 ± 0,056 | 0,587 ±0,141 | 0,527 ± 0,097 | 0,574 ±0,118 |
| Duodenum | 0,406 ±0,077 | 0,217 ±0,015 | 0,190 ±0,047 | 0,214 ±0,011 |
| Jejunum | 1,726 ±0,287 | 2,097 ±0,289 | 2,622 ±0,671 | 1,580 ±0,088 |
| Ileum | 0,100 ±0,017 | 0,149 ±0,015 | 0,235 ± 0,243 | 0,141 ±0,010 |
| Tlusté střevo | 0,390 ± 0,053 | 0,675 ± 0,053 | 1,190 ±0,217 | 1,394 ±0,231 |
| Varlata | 0,145 ±0,014 | 0,446 ± 0,029 | 0,695 ± 0,064 | 0,797 ± 0,068 |
| Štítná žláza | 0,034 ±0,015 | 0,027 ± 0,003 | 0,029 ± 0,005 | 0,024 ± 0,002 |
| Mozek | 0,245 ±0,019 | 0,275 ± 0,060 | 0,405 ± 0,073 | 0,424 ± 0,028 |
| Krev celá | 58,377 ±2,639 | 4,426 ±2,018 | 2,920 ±0,178 | 3,059 ±0,059 |
| % dávky/g | ||||
| Krev | 3,719 ±0,656 | 0,250 ± 0,083 | 0,174 ±0,030 | 0,180 ±0,004 |
| Plasma | 9,134 ± 1,013 | 0,504 ± 0,222 | 0,278 ± 0,062 | 0,319 ±0,000 |
| Slinivka | 0,412 ±0,039 | 0,345 ± 0,028 | 0,224 ± 0,059 | 0,245 ± 0,009 |
| Játra | 1,547 ±0,243 | 2,918 ±0,172 | 1,843 ±0,252 | 0,870 ± 0,099 |
| Nadledviny | 0,576 ±0,061 | 0,202 ± 0,032 | 0,209 ± 0,044 | 0,200 ±0,014 |
| Ledviny | 4,472 ± 0,465 | 1,008 ± 1,161 | 0,327 ± 0,106 | 0,289 ±0,014 |
| Plíce | 0,734 ±0,192 | 0,221 ±0,041 | 0,216 ±0,053 | 0,240 ± 0,004 |
| Srdce | 0,619 ±0,123 | 0,191 ±0,023 | 0,207 ± 0,047 | 0,224 ±0,015 |
| Slezina | 0,490 ±0,097 | 1,023 ±0,167 | 0,820 ± 0,262 | 0,389 ±0,298 |
| Žaludek | 0,094 ± 0,066 | 0,240 ± 0,037 | 0,165 ±0,050 | 0,260 ± 0.022 |
| Duodenum | 0,477 ±0,048 | 0,295 ±0,015 | 0,203 ± 0,056 | 0,273 ± 0,003 |
| Jejunum | 0,245 ± 0,034 | 0,316 ±0,025 | 0,344 ±0,103 | 0,269 ±0,004 |
| Ileum | 0,229 ± 0,093 | 0,236 ±0,092 | 0,486 ±0,506 | 0,254 ±0,010 |
| Tlusté střevo | 0,045 ±0,014 | 0,072 ± 0,008 | 0,129 ±0,024 | 0,175 ±0,058 |
| Varlata | 0,057 ±0,015 | 0,161 ±0,027 | 0,228 ± 0,054 | 0,285 ±0,010 |
| Kůže | 0,112 ± 0,015 | 0,164 ±0,021 | 0,172 ±0,045 | 0,220 ± 0,007 |
| Sval | 0,068 ±0,019 | 0,146 ±0,036 | 0,195 ±0,049 | 0,242 ±0,010 |
| Štítná zláza | 0,359 ±0,153 | 0,255 ±0,016 | 0,255 ± 0,052 | 0,248 ± 0,009 |
| Mozek | 0,129 ±0,009 | 0,146 ±0,034 | 0,212 ±0,049 | 0,232 ± 0,025 |
| Tuk | 0,172 ±0,031 | 0,162 ±0,040 | 0,190 ±0,022 | 0,097 ± 0,037 |
| Kost stehenní | 0,474 ±0,271 | 0,290 ±0,019 | 0,211 ±0,012 | 0,120 ±0,090 |
| Kloub pánev | 0,139 ±0,065 | 0,157 ±0,007 | 0,168 ±0,027 | 0,128 ±0,014 |
Vzhledem ktomu, že studované látky radioaktivně značené 3H jsou v organismu postupně metabolizovány a konečným produktem tohoto metabolismu může být pro tritium 3H-H2O, bylo provedeno orientační stanovení obsahu 3H ve formě vody (nebo dalších metabolitů, které přecházejí ío při odpařování do plynné fáze) ve zvolených biologických vzorcích po intravenózní aplikaci 3HHA 35 000 g.mof1 potkanům. Zkouška byla provedena u těch biologických vzorků, u nichž aktivita 3H byla dostatečná a které jsou zásadní pro hodnocení farmakokinetiky studovaných látek, jmenovitě u plasmy, jater a moče. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.
Tabulka 2 Orientační stanovení podílu 3H ve formě 3H-H2O (případně dalších těkavých forem) ve vybraných biologických vzorcích po aplikaci 3H-HA(35 000 g.mol”1) potkanům. V tabulce je uveden podíl aktivity odparku a nativního vzorku (100 % odpovídá nepřítomnosti HÍEO ve vzorku).
/3H/HA 35 000 g.mol i.v. podání:
Moč za 2 h: 97,9 ±1,3%
Moč za 24 h: 99,1 ±2,0%
Játra za 24 h: 84,6 ± 0,4%
U vzorku moče bylo uskutečněno měření aktivity jednotlivých frakcí po SEC (Size exclusion chromatography) (i.v. podání, 3H-HA 35 000 g.mol”1 po 2h). Výsledky jsou zachyceny na chromatogramu na obr. 1.
Z výsledků vyplývá, že většina radioaktivity je v oblasti výskytu kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti cca 30 000 g.moE1 (22 min). Radioaktivní voda by měla retenční čas kolem 25 minut. Toto měření jednak potvrzuje závěry získané experimenty s odpařováním popsanými v tabulce 2 a také díky podobnosti křivky s výchozím materiálem, významně zvyšuje pravděpodobnost, že naměřená radioaktivita v moči je způsobena kyselinou hyaluronovou.
Příklady 1 až 5 ukazují, že navrhovaný způsob značení vede ke stabilním produktům vhodným například na studium biodistribuce in vivo.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kyselina hyaluronová mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mol“1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mol”1, značená tritiem (T) na uhlíku v poloze 6 glukosaminové části podle vzorce I:
- 2. Způsob přípravy kyseliny hyaluronové mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mol 1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mol”1, značené tritiem podle vzorce I (I), vyznačující se tím, že se nejprve oxiduje kyselina hyaluronová na aldehyd v poloze 6 glukosaminové části, a potom se oxidovaná kyselina hyaluronová redukuje pomocí značeného borohydridu sodného [3H] NaBH4.
- 3. Způsob přípravy kyseliny hyaluronové značené tritiem podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále se ještě upraví molekulová hmotnost značené kyseliny hyaluronové enzymatickou degradací.
- 4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 a 3, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová se chemoselektivně oxiduje v pozici C-6 systémem R-TEMPO/NaClO ve vodě při teplotě -5 až 10 °C, kde R je vodík nebo skupina N-acetyl, molámí množství NaClO je v rozmezí 0,05 až 0,2 eq. a molámí množství R-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.
- 5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 4, vy z n a č uj íc í se tím, že oxidovaná kyselina hyaluronová se redukuje v bazickém vodném rozpouštědle nejprve značeným borohydridem [Ή] NaBH4 a následně neznačeným borohydridem NaBH4 při teplotě -5 až 20 °C, s výhodou 0 až 5 °C, kde molární množství značeného borohydridu je v rozmezí 0,0001 až 0,1 eq. a molámí množství neznačeného borohydridu je v rozmezí 0,01 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.
- 6. Způsob přípravy podle nároku 5, vyznačující se tím, že jako bazické vodné rozpouštědlo se použije roztok hydroxidu sodného o koncentraci 0,01 až 0,5 mol.dm
- 7. Způsob přípravy podle nároku 3, vyznačující se tím, že značená kyselina hyaluronová se degraduje pomocí enzymu bovinní testikulámí hyaluronidázy BTH při 37 °C po dobu 2 až 72 hodin, s výhodou 48 hodin, kde aktivita přidaného enzymu je v rozmezí 10 až 30 U/mg, s výhodou 20 U/mg.
- 8. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že výchozí kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozsahu 10 000 g.moE1 až 5 000 000 g.mol1.
- 9. Použití kyseliny hyaluronové značené tritiem podle nároku 1 pro biomedicínské aplikace.1 výkres
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120024A CZ303722B6 (cs) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120024A CZ303722B6 (cs) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ201224A3 CZ201224A3 (cs) | 2013-04-03 |
| CZ303722B6 true CZ303722B6 (cs) | 2013-04-03 |
Family
ID=47989620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20120024A CZ303722B6 (cs) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ303722B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105873955A (zh) * | 2013-11-25 | 2016-08-17 | 杜特里亚生物材料有限责任公司 | 富氘透明质酸 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987005517A1 (en) * | 1986-03-14 | 1987-09-24 | Bio-Technology General Corp. | Heavy metal salts of hyaluronic acid useful as antimicrobial agents |
| CS178890A3 (en) * | 1990-04-10 | 1992-02-19 | Ustav Ex Farmakologie Sav | Method of proof of hyaluronic acid, its salts or radiolabelled derivatives |
| CS667890A3 (en) * | 1990-12-27 | 1992-07-15 | Eduard Ing Orvisky | Process for preparing (3h) or (14c)-hyaluronic acid or salts thereofhaving a defined molecular weight and specific radioactivity |
| US5772982A (en) * | 1994-08-10 | 1998-06-30 | Coward; Roderick T. | Method of using hyaluronic acid for the detection, location and diagnosis of tumors |
| CZ302504B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace |
| CZ302503B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd a zpusob jeho modifikace |
-
2012
- 2012-01-16 CZ CZ20120024A patent/CZ303722B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987005517A1 (en) * | 1986-03-14 | 1987-09-24 | Bio-Technology General Corp. | Heavy metal salts of hyaluronic acid useful as antimicrobial agents |
| CS178890A3 (en) * | 1990-04-10 | 1992-02-19 | Ustav Ex Farmakologie Sav | Method of proof of hyaluronic acid, its salts or radiolabelled derivatives |
| CS667890A3 (en) * | 1990-12-27 | 1992-07-15 | Eduard Ing Orvisky | Process for preparing (3h) or (14c)-hyaluronic acid or salts thereofhaving a defined molecular weight and specific radioactivity |
| US5772982A (en) * | 1994-08-10 | 1998-06-30 | Coward; Roderick T. | Method of using hyaluronic acid for the detection, location and diagnosis of tumors |
| CZ302504B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace |
| CZ302503B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd a zpusob jeho modifikace |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Orlando P. a kol.: Tritium-labeled hyaluronic-acid derivate, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 22 (9), 1985 * |
| Stefan Highsmith, David M. Chipman : Preparation of tritium-labeled hyaluronic acid oligomers and their use in enzyme studies, Analytical Biochemistry 61 (2), 1974, str. 557-566 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105873955A (zh) * | 2013-11-25 | 2016-08-17 | 杜特里亚生物材料有限责任公司 | 富氘透明质酸 |
| CN105873955B (zh) * | 2013-11-25 | 2019-03-15 | 杜特里亚生物材料有限责任公司 | 富氘透明质酸 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ201224A3 (cs) | 2013-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wessels et al. | Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus. A revised structure for the type III group B streptococcal polysaccharide antigen. | |
| Patra et al. | Chemical approach to positional isomers of glucose–platinum conjugates reveals specific cancer targeting through glucose-transporter-mediated uptake in vitro and in vivo | |
| EP0493622B1 (en) | Phospholipid- or lipid-combining glycosaminoglycan, production thereof, and cancer metastasis inhibitor | |
| Piller et al. | UDP-GlcNAc: Gal beta 1-4Glc (NAc) beta 1-3N-acetylglucosaminyltransferase. Identification and characterization in human serum. | |
| CA1307525C (en) | Sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates, of dermatan sulfate and hyaluronic acid and their pharmacological properties | |
| US7005426B2 (en) | Folic acid-polysaccharide complex, its preparation method and pharmaceutical composition containing the same as active component | |
| Kurup et al. | Characterization of anti-heparan sulfate phage display antibodies AO4B08 and HS4E4 | |
| US6878819B1 (en) | Fucosylated oligosaccharides and process for their preparation | |
| JPH06506685A (ja) | 新規な非抗凝固剤ヘパリン誘導体 | |
| Stocker et al. | Chemical tools for studying the biological function of glycolipids | |
| Jansson et al. | Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 5 | |
| CZ305153B6 (cs) | Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití | |
| Bailleul et al. | Adducts from the reaction of O, O′-diacetyl or O-acetyl derivatives of the carcinogen 4-hydroxyaminoquinoline 1-oxide with purine nucleosides | |
| Oscarsson et al. | Location of the antithrombin-binding sequence in the heparin chain | |
| Kuhnast et al. | Synthesis, radiolabeling with fluorine-18 and preliminary in vivo evaluation of a heparan sulphate mimetic as potent angiogenesis and heparanase inhibitor for cancer applications | |
| Šimek et al. | How the molecular weight affects the in vivo fate of exogenous hyaluronan delivered intravenously: A stable-isotope labelling strategy | |
| Ohsumi et al. | Mannose-receptor ligands stimulate secretion of lysosomal enzymes from rabbit alveolar macrophages. | |
| CZ303722B6 (cs) | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití | |
| Aich et al. | Development of delivery methods for carbohydrate-based drugs: controlled release of biologically-active short chain fatty acid-hexosamine analogs | |
| JP2997018B2 (ja) | 燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン | |
| Singh et al. | Synthesis and preliminary evaluation of a 99m Tc labelled deoxyglucose complex {[99m Tc] DTPA-bis (DG)} as a potential SPECT based probe for tumor imaging | |
| JP2986518B2 (ja) | 癌転移抑制剤 | |
| WO1994008595A1 (en) | Use of non-anticoagulant heparin for treating ischemia/reperfusion injury | |
| CN111902149B (zh) | 透明质酸合成促进剂、促进透明质酸合成的方法和细胞评价方法 | |
| JP5344783B2 (ja) | サメ軟骨のコンドロイチン硫酸由来の硫酸化八糖 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20170116 |