CZ303722B6 - Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití - Google Patents
Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303722B6 CZ303722B6 CZ20120024A CZ201224A CZ303722B6 CZ 303722 B6 CZ303722 B6 CZ 303722B6 CZ 20120024 A CZ20120024 A CZ 20120024A CZ 201224 A CZ201224 A CZ 201224A CZ 303722 B6 CZ303722 B6 CZ 303722B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- labeled
- tritium
- range
- mol
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Resení se týká kyseliny hyaluronové znacené tritiem a zpusobu její prípravy. Postup je zalozen na oxidacne-redukcní strategii, kde k oxidaci na aldehyd a redukci zpet na alkohol dochází v poloze 6-glukosaminové cásti polysacharidu. Výsledkem je nativní derivát o molekulové hmotnosti v rozsahu 800 az 1 000 000 g.mol.sup.-1.n. vykazující vysokou stabilitu a specifickou aktivitu, která je omezená jenom specifickou aktivitou pouzitého redukcního cinidla. Postup prípravy je rychlý, levný a produkuje minimum radioaktivního odpadu v podobe balastu. Znacená kyselina hyaluronová byla testována pri studiích biodistribuce u potkanu, kde byla overena její stabilita detekcí kyseliny hyaluronové po intravenózním podání v moci. Znacená kyselina hyaluronová se muze pouzít v biomedicínských aplikacích.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká kyseliny hyaluronové značené tritiem, způsobu značení kyseliny hyaluronové tritiem pomocí oxidačně-redukční strategie a použití kyseliny hyaluronové značené tritiem. Výsledkem tohoto značení je výměna vodíku na uhlíku primární hydroxylové skupiny gluko10 saminové části polysacharidů -CHH-OH za radioaktivní tritium -CHT-OH, přičemž zůstává zachována primární i sekundární struktura polysacharidů, což znamená, že polysacharid neztrácí svůj nativní charakter. Transformaci vystihuje následující schéma:
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je významným polysacharidem složeným ze dvou opakujících se jednotek 20 [3-(l,3)-D-glukuronové kyseliny a 3-(l,4)-V-acetyl-D-glukosaminu. Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5.104 až 5.106 g.moT1, která závisí na způsobu izolace a výchozím materiálu. Kyselina hyaluronová, respektive její sodná sůl hyaluronan, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Tento znač25 ně hydrofilní polysacharid je ve vodě rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.
Schéma 1. Kyselina hyaluronová
Radioaktivní značení kyseliny hyaluronové
Příprava radioaktivně značené HA v nativní podobě zahrnuje výměnu vodíku nebo uhlíku za 35 jejich radioaktivní analogy. Nativní forma je definována tak, že jedinou změnou ve struktuře molekuly je záměna příslušného atomu kyseliny hyaluronové (nativní obsahuje atomy C, Η, O, N a Na) za jejich radioaktivní analog beze změn primární struktury polysacharidů a bez přídavku dalších substancí typu linker nebo chelatační činidlo (Cožikova D., Laznickova A., HermannoCZ 303722 B6 va M., Svanovsky E., Pálek L., Buffa R., Sedova, P., Koppova R., Petrik M., Smejkalová D., Laznicek M., and Velebný V., J. of Pharm. and Biomed. Analysis, 2010, 52, 517 až 24). Důležitým parametrem je hydrolytická stabilita značení, která závisí především na charakteru vázání radioaktivní značky na polymer. Tak například deriváty, kde je tritium vázané na kyslíku (Wilzbach K. E., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79 1012), nejsou stabilní a ve vodě podléhají výměně tritia za vodík. Radioaktivně značená HA se používá například při studiu biodistribuce, kde se sledují nepatrné koncentrace polymeru, a tudíž je žádané, aby stabilita radioaktivního značení byla co nejvyšší. V opačném případě by se mohlo stát, že je místo polymeru sledována jenom samotná nenavázaná radioaktivní značka.
Značení kyseliny hyaluronové pomocí tritia
Kyselina hyaluronová značená tritiem může být ve formě nativní nebo nenativní. Většina příkladů nalezených v literatuře připravuje nativní kyselinu hyaluronovou značenou tritiem cestou biosyntetickou. Je to postup, při kterém se mikroorganismům produkujícím kyselinu hyaluronovou přidá nízce molekulový radioaktivní prekurzor typu octan sodný (Fraser E. a kol.: Uptake and degradation of hyaluronan in lymphatic tissue, Biochem. J. 256, 156 až 8, 1988), glukóza (Čožikova D., Laznickova A., Hermannova M., Svanovsky E., Pálek L., Buffa R., Sedova, P., Koppova R., Petrik M., Smejkalová D., Laznicek M., and Velebný V., J. of Pharm. and Biomed. Analysis, 2010, 52, 517 až 24) nebo glukosamin (Smedsrod B. a kol.: Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells, Biochem. J. 223, 617 až 26, 1984). Finální značený polymer se pak separuje z extraktu získaného z hrubé biomasy. Výhodou tohoto řešení je možnost připravit nativní značený polymer s vyšší molekulovou hmotností. Nevýhodou je komplikovanější izolace, obyčejně nízká aktivita finálního materiálu a vysoká cena, protože většina přidané radioaktivity končí v balastu.
Oproti tomu chemické značení je daleko účinnější, avšak připravit značenou kyselinu hyaluronovou o molekulové hmotnosti nad 500 000 g.moF1 kvůli degradačním procesům způsobeným chemickou modifikací je velmi obtížné. Jednou z možností, kteréjsou svojí filozofií blízké řešením popsaným v této akci, je redukce kyseliny hyaluronové oxidované na aldehyd pomocí [3H] NaBH4 (Allard, S. and O'Regan, M., The role of elastoviscosity in the efficacy of viscosupplementation for osteoarthritis of the knee: a comparison of Hylan G-F 20 and a lower-molecularweight hyaluronan, Clin. Ther., 22, 792 až 795 (2000)). Rekci vystihuje následující schéma.
Nevýhodou tohoto řešení je fakt, že oxidací a redukcí dochází k trvalé změně struktury polysacharidu, takže derivát nemůžeme považovat za nativní.
Kyselinu hyaluronovou lze také jednoduše převést na [3H]~HA izotopovou výměnou vodíků za tritium ve vodném roztoku za katalýzy Pd/CaCO3 (Wilzbach K. E. a kol.: J. Am. Chem. Soc. 79, 1012, 1957).
O
O
Nevýhodou tohoto způsobu značení je lokalizace tritia v hydroxylových skupinách, které podléhají rychlé radiolýze vedoucí k neustálému poklesu radioaktivity značené kyseliny hyaluronové.
Značenou kyselinu hyaluronovou v nativní podobě lze připravit také deacetylací polymeru a rea5 cetylací se značeným acylačním činidlem (Kerry V. a kol.: Process for preparing 3H or 14Chyaluronic acid or salts there of having a defined molecular weight and specific radioactivity, SK
280150, PozoM. A., Balasz E. A., Belmonte C.: Reduction of sensory responses to passive movements of inflamed knee joints by Hylan, Exp. Brain. Res., 116, 3 až 9, 1997). Postup vystihuje následující schéma.
O
Nevýhodou tohoto postupu značení je degradace polymeru ve stupni deacetylace, takže výsledná molekulová hmotnost se pohybuje pod 200 000 g.moE1. V případě, že by deacetylace proběhla jenom v nepatrném měřítku, lze molekulovou hmotnost zvýšit nad 200 000 g.moE1. V tom případě, je ale nutné řešit selektivitu radioaktivní reacylace, protože při tak velkém nadbytku hydroxylových skupin oproti aminovým skupinám lze předpokládat, že nezanedbatelná část acylačního činidla se bude vázat na hydroxy skupinu jako hydrolyticky labilní ester.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nevýhody překonává řešení podle vynálezu. Předmětem vynálezu je kyselina hyaluronová značená tritiem a postup, při kterém dochází ke stabilnímu radioaktivnímu značeni kyseliny hyaluronové se zachováním jejích nativních vlastností. Navržený postup je vhodný pro přípravu materiálu o škále molekulových hmotností od 800 g.moE1 (tautomer) až po 1000 000 g.mor1.
Konkrétně se vynález týká kyseliny hyaluronové mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mor1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mor1 značené tritiem (T) na uhlíku v poloze 6 glukosaminové části podle vzorce I:
(I),
Dále se vynález týká způsobu přípravy kyseliny hyaluronové mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mor1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mol 1 značené tritiem, kde se nejprve oxiduje kyselina hyaluronová na aldehyd v poloze 6 glukosaminové části (dále v textu označováno jako Krok 1), a potom se oxidovaná kyselina hyaluronová redukuje pomocí značeného borohydridu sodného [3H] NaBH4 (dále v textu označováno jako Krok 2).
Tyto dva kroky jsou detailněji rozebrány níže:
Krok 1: Selektivní oxidace primární hydroxylové skupiny kyseliny hyaluronové v poloze 6 glukosaminové části polysacharidů na aldehyd. Reakce probíhá při použití oxidačního systému 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxyl radikálu R-TEMPO / NaClO ve vodě, kde R je vodík nebo skupina N-acetyl:
Krok 2: Redukce aldehydu pomocí radioaktivně značeného borohydridu [ H]NaBH4 ve vodném bazickém rozpouštědle:
V případě, že je nutné významně snížit molekulovou hmotnost polymeru, proběhne následně ještě enzymatická degradce polymeru pomocí hyaluronidázy (dále v textu označováno jako Krok 3):
Krok 1 probíhá s výhodou ve vodě při teplotě -5 až 10 °C, molární množství NaClO je v rozmezí 0,05 až 0,2 eq. a molární množství R-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové. Výchozí kyselina hyaluronová může mít molekulovou hmotnost v rozsahu 10 000 g.mor1 až 5 000 000 g.mol”1.
Krok 2, kde dochází k redukci a ke značení oxidované kyseliny hyaluronové, probíhá s výhodou β
v bazickém vodném rozpouštědle nejprve pomocí značeného borohydridu [ H]NaBH4 a následně pomocí neznačeného borohydridu NaBH4 při teplotě -5 až 20 °C, s výhodou 0 až 5 °C, kde molámí množství značeného borohydridu je v rozmezí 0,0001 až 0,1 eq. a molámí množství neznačeného borohydridu je v rozmezí 0,01 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové. Jako bazické vodné rozpouštědlo se s výhodou použije roztok hydroxidu sodného nebo uhličitanu sodného o koncentraci 0,01 až 0,5 mol.dm’.
V případě, že po kroku 2 následuje krok 3, dochází k degradaci značené kyseliny hyaluronové pomocí enzymu bovinní testikulámí hyaluronidázy BTH při 37 °C po dobu 2 až 72 hodin, s výhodou 48 hodin, kde aktivita přidaného enzymu je v rozmezí 10 až 30 U/mg, s výhodou 20 U/mg.
Vynález se dále týká použití kyseliny hyaluronové značené tritiem pro biomedicínské aplikace.
Oproti analogům zmíněným v části „Dosavadní stav techniky“ je navržený způsob vynálezu výhodnější v tom, že produkuje kyselinu hyaluronovou v nativní podobě, je vhodný pro přípravu široké škály molekulových hmotností a je levný (efektivní). Nejnákladnější části procesu je pochopitelně cena radioaktivního činidla, takže efektivnost (levnost) tohoto procesu je dána samotnou chemickou podstatou kroku 2, při kterém je značná část přidané radioaktivity ve formě triciovaného borohydridu převedena na polymer. To je velký rozdíl oproti biosyntetickým metodám, které sice vedou k nativní značené kyselině hyaluronové, ale kde značná část drahého radioaktivního činidla končí v balastu. To také značně omezuje výslednou aktivitu produktu, kteráje v případě biosyntézy nízká. Dalším parametrem, který je důležité porovnat, je rozsah molekulových hmotností produktu. V tomto porovnání jsou v nevýhodě metody, které obsahují krok významně degradující polymer, jako například deacetylaci.
Porovnání známých metod se způsobem podle vynálezu vystihuje následující tabulka:
| metoda | Efektivnost procesu | Nativnost produktu | Mol. hmotnost produktu g.mor | Stabilita značení |
| Způsob podle vynálezu | + | + | Oligo až 1 000 000 | + |
| Oxidace s NaIO4 + redukce | + | 10 000 až 1 000 000 | + | |
| Izotopová výměna s [JÍT|ITO | + | + | Oligo až 2000 000 | |
| biosyntéza | + | Oligo až 2000 000 | ||
| Deacetylace na DS vyšší 10% + reacetylace | + | + | Oligo až 100 000 | |
| Deacetylace na DS nižší 1% + reacetylace | - | + | Oligo až 300 000 | + |
| Metody používající radioaktivní kovy nebo jód | + | - | 10 000 až 1 000 000 | + |
DS = stupeň substituce = 100 % * molární množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidů
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje chromatogram, kde je zachycena aktivita jednotlivých frakcí moči potkanů z příkladu 5 po SEC (Size exclusion chromatography). CPMB = aktivita (counts per minuté), S# = retenční čas (min).
Příklady provedení vynálezu
DS = stupeň substituce = 100 % * molární množství navázaného substituentu / molámí množství všech dimerů polysacharidu
Zde používaný výraz ekvivalent (eq) se vztahuje na dimer kyseliny hyaluronové, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozí kyseliny hyaluronové (zdroj: CPN spol. sr.o., Dolní Dobrouč, ČR) byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Tritium je zde uváděno jako [3H] nebo zkráceně (T)Příklad 1 Příprava triciované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 1 000 000 g.moE1. Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 2 000 000 g.moT1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,1 eq.). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml ethanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3—krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně) při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 3 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 1 100 000 g.moE1 (stanoveno SEC-MALLS) 'H NMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-C//(OH)2)
Krok 2. Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 1 100 000 g.moE1) s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % se přidalo 0,5 ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 2 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak filtroval přes 10 000 g.moE1 filtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
Příklad 2 Příprava triciované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 800 g.mol 1 (tetramer)
Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 1% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 200 000 g.mol·”1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,2 eq). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml ethanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 50 000 g.mor1 (stanoveno SEC-MALLS) 'HNMR(D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-CA(OH)2)
Krok 2. Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 50 000 g.mor1) s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % se přidal 0,5ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 3 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak fdtroval přes 10 000 g.moE1 fdtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
Krok 3 Enzymatická degradace
Roztok z kroku 2 se podrobil degradaci pomocí bovinní testikulární hyaluronidázy BTH (EC 3.2.1.35) v 0,lM octanu sodném s přídavkem 0,15M NaCl, pH se upravilo na hodnotu 5,3 použitím ledové kyseliny octové. Kyselina hyaluronová se rozpustila v uvedeném rozpouštědle (c= 10 g/1) a následně se přidalo 20 U/mg BTH. Kyselina hyaluronová se enzymaticky degradovala při 37 °C 48 hodin. Reakce se ukončila krátkým povařením (zhruba 3 min) degradovaného roztoku. Po vychladnutí se směs oligomerů SH přefdtrovala přes 0,2mm filtr a separovala se pomocí ionexové chromatografie na jednotlivé oligomery. Radiochemická stabilita separovaných oligomerů byla potvrzena opětovným měřením radioaktivit frakcí získaných po ionexové chromatografii po 60 dnech stání při 5 °C.
Příklad 3 Příprava triciované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 35 000 g.moE1 Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 1% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 200 000 g.mol1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaCIO (0,2 eq). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml ethanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 50 000 g.moE1 (stanoveno SEC-MALLS) 'HNMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-CH(OH)2)
Krok 2 Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 50 000 g.moE1) s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % se přidalo 0,5 ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem NaOH 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 3 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak filtroval přes 10 000 g.mor1 filtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
DS aldehydu 0 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 35 000 g.moE1 (stanoveno SEC-MALLS)
Příklad 4 Příprava tricionované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 35 000 g.mor1 Krok 1. Oxidace kyseliny hyaluronové
Do 1% vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,2 g, 200 000 g.mor1) (s obsahem NaBr 1 hmotn. %), TEMPO (0,01 eq) a Na2HPO4 (10 eq.) se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,2 eq). Směs se míchala 10 h při teplotě -5 °C. Pak se přidal 1 ml etanolu a výsledný roztok se pak zředil destilovanou vodou na 0,2% a dialyzoval oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 3krát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě 7—krát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok se pak vysrážel použitím 5-násobku isopropylalkoholu.
DS 6 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 50 000 g.mor1 (stanoveno SEC-MALLS) ’H NMR (D2O) δ 5,26 (s, IH, polymer-Ctf(OH)2)
Krok 2 Redukce oxidované kyseliny hyaluronové
Do 0,5% vodného roztoku oxidované kyseliny hyaluronové připravené v kroku 1 (0,1 g, 50 000 g.mor1) s obsahem Na2CO3 0,1 hmotn. % se přidalo 0,5 ml vodného roztoku [3H]NaBH4 s obsahem Na2CO3 0,1 hmotn. % s aktivitou 50 mCi (1,85.109 Bq) při 0 °C. Směs se míchala 5 h při teplotě 0 °C, pak se přidaly 3 mg NaBH4 a směs se míchala 10 h při teplotě 0 °C. Výsledný roztok se pak filtroval přes 10 000 g-mol1 filtr a analyzoval na HPLC s měřením radioaktivity jednotlivých frakcí. Výsledkem byl chromatogram, kde většina radioaktivity (víc než 95 %) byla lokalizována v oblasti výskytu polymeru.
DS aldehydu 0 % (stanoveno z NMR), Mol. hmotnost 35 000 g.mof1 (stanoveno SEC-MALLS)
Příklad 5 Studium biodistribuce tritiované kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 35 000 g.mof1 u potkanů po intravenózní aplikaci až 24 hodin před začátkem experimentu byla potkanům odebrána potrava, voda jim byla ponechána ad libitum. Zvířata byla před aplikací uvedena do éterové anestezie. Přípravek byl potkanům aplikován do povrchové stehenní žíly (véna saphena) o objemu 0,2 ml na zvíře (0,5 mg/zvíře). Poté byli potkani umístěni jednotlivě volně v klecích. Za 5 min, 1 h, a 24 h po aplikaci byla potkanům v navozené éterové anestezii odebrána krev z vypreparované a. carotis a po usmrcení vykrvácením byly ihned odebrány slinivka břišní, játra, nadledviny, ledviny, plíce, srdce, slezina, žaludek, duodenum, jejunum, ileum, tlusté střevo, varlata, vzorek kůže ze stehenní části, vzorek stehenního svalu, štítná žláza, mozek, vzorek tuku ze stehenní části, kost stehenní a kloub pánevní. Plazma byla získávána centrifugací při 4 000 ot/min po dobu 5 min na centrifuze Z 200A (Hermle). Hmotnost orgánů a tkání byla stanovena na elektronických vahách Scaltec SBC41
Vzorky pro měření aktivity 3H byly zpracovány následovně: k cca 0,1 g tkáně o stanovené hmotnosti byl přidán lml solubizéru SOLVABLE. Vzorky byly rozpuštěny po dobu 3 dnů při 60 °C. Po ochlazení na pokojovou teplotu bylo ke vzorku přidáno 10 ml scintilačního roztoku ULT1MA GOLD (PerkinElmer).
Aktivita 3H byla měřena kapalnou scintilací na analyzátoru Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer), přičemž aktivita vzorků byla srovnávána s aktivitou standardních vzorků připravených následovně:
0,2 ml přípravku se injekční stříkačkou převedlo do lOOml odměrné baňky, objem se doplnil na 100,0 ml a po promíchání se odpipetoval 1,0 ml + 1 ml SOLVABLE + 10 ml scintilačního roztoku ULTIMA GOLD k měření aktivity.
Výsledky biodistribuce shrnuje následující tabulka 1:
3 — I
Tabulka 1 Distribuce aktivity H po intravenózní aplikaci H-HA (35 000 g.mol ) potkanům (výsledky vyjádřeny v % dávky na orgán a v % dávky/g).
| % dávky/orgán | 5 min | 60 min | 120 min | 24 h |
| Játra | 12,319 ±0,772 | 23,680 ±2,540 | 15,177 ±0,890 | 7,075 ± 0,746 |
| Nadledviny | 0,037 ±0,005 | 0,014 ±0,001 | 0,013 ± 0,002 | 0,014 ±0,001 |
| Ledviny | 9,278 ±0,211 | 2,355 ± 2,691 | 0,738 ±0,148 | 0,589 ±0,057 |
| Plíce | 0,997 ±0,226 | 0,338 ± 0,086 | 0,354 ±0,018 | 0,337 ±0,037 |
| Srdce | 0,482 ± 0,089 | 0,165 ±0,014 | 0,179 ±0,044 | 0,193 ±0,006 |
| Slezina | 0,357 ±0,073 | 0,884 ±0,276 | 0,687 ± 0,203 | 0,449 ± 0,067 |
| Žaludek | 0,234 ± 0,056 | 0,587 ±0,141 | 0,527 ± 0,097 | 0,574 ±0,118 |
| Duodenum | 0,406 ±0,077 | 0,217 ±0,015 | 0,190 ±0,047 | 0,214 ±0,011 |
| Jejunum | 1,726 ±0,287 | 2,097 ±0,289 | 2,622 ±0,671 | 1,580 ±0,088 |
| Ileum | 0,100 ±0,017 | 0,149 ±0,015 | 0,235 ± 0,243 | 0,141 ±0,010 |
| Tlusté střevo | 0,390 ± 0,053 | 0,675 ± 0,053 | 1,190 ±0,217 | 1,394 ±0,231 |
| Varlata | 0,145 ±0,014 | 0,446 ± 0,029 | 0,695 ± 0,064 | 0,797 ± 0,068 |
| Štítná žláza | 0,034 ±0,015 | 0,027 ± 0,003 | 0,029 ± 0,005 | 0,024 ± 0,002 |
| Mozek | 0,245 ±0,019 | 0,275 ± 0,060 | 0,405 ± 0,073 | 0,424 ± 0,028 |
| Krev celá | 58,377 ±2,639 | 4,426 ±2,018 | 2,920 ±0,178 | 3,059 ±0,059 |
| % dávky/g | ||||
| Krev | 3,719 ±0,656 | 0,250 ± 0,083 | 0,174 ±0,030 | 0,180 ±0,004 |
| Plasma | 9,134 ± 1,013 | 0,504 ± 0,222 | 0,278 ± 0,062 | 0,319 ±0,000 |
| Slinivka | 0,412 ±0,039 | 0,345 ± 0,028 | 0,224 ± 0,059 | 0,245 ± 0,009 |
| Játra | 1,547 ±0,243 | 2,918 ±0,172 | 1,843 ±0,252 | 0,870 ± 0,099 |
| Nadledviny | 0,576 ±0,061 | 0,202 ± 0,032 | 0,209 ± 0,044 | 0,200 ±0,014 |
| Ledviny | 4,472 ± 0,465 | 1,008 ± 1,161 | 0,327 ± 0,106 | 0,289 ±0,014 |
| Plíce | 0,734 ±0,192 | 0,221 ±0,041 | 0,216 ±0,053 | 0,240 ± 0,004 |
| Srdce | 0,619 ±0,123 | 0,191 ±0,023 | 0,207 ± 0,047 | 0,224 ±0,015 |
| Slezina | 0,490 ±0,097 | 1,023 ±0,167 | 0,820 ± 0,262 | 0,389 ±0,298 |
| Žaludek | 0,094 ± 0,066 | 0,240 ± 0,037 | 0,165 ±0,050 | 0,260 ± 0.022 |
| Duodenum | 0,477 ±0,048 | 0,295 ±0,015 | 0,203 ± 0,056 | 0,273 ± 0,003 |
| Jejunum | 0,245 ± 0,034 | 0,316 ±0,025 | 0,344 ±0,103 | 0,269 ±0,004 |
| Ileum | 0,229 ± 0,093 | 0,236 ±0,092 | 0,486 ±0,506 | 0,254 ±0,010 |
| Tlusté střevo | 0,045 ±0,014 | 0,072 ± 0,008 | 0,129 ±0,024 | 0,175 ±0,058 |
| Varlata | 0,057 ±0,015 | 0,161 ±0,027 | 0,228 ± 0,054 | 0,285 ±0,010 |
| Kůže | 0,112 ± 0,015 | 0,164 ±0,021 | 0,172 ±0,045 | 0,220 ± 0,007 |
| Sval | 0,068 ±0,019 | 0,146 ±0,036 | 0,195 ±0,049 | 0,242 ±0,010 |
| Štítná zláza | 0,359 ±0,153 | 0,255 ±0,016 | 0,255 ± 0,052 | 0,248 ± 0,009 |
| Mozek | 0,129 ±0,009 | 0,146 ±0,034 | 0,212 ±0,049 | 0,232 ± 0,025 |
| Tuk | 0,172 ±0,031 | 0,162 ±0,040 | 0,190 ±0,022 | 0,097 ± 0,037 |
| Kost stehenní | 0,474 ±0,271 | 0,290 ±0,019 | 0,211 ±0,012 | 0,120 ±0,090 |
| Kloub pánev | 0,139 ±0,065 | 0,157 ±0,007 | 0,168 ±0,027 | 0,128 ±0,014 |
Vzhledem ktomu, že studované látky radioaktivně značené 3H jsou v organismu postupně metabolizovány a konečným produktem tohoto metabolismu může být pro tritium 3H-H2O, bylo provedeno orientační stanovení obsahu 3H ve formě vody (nebo dalších metabolitů, které přecházejí ío při odpařování do plynné fáze) ve zvolených biologických vzorcích po intravenózní aplikaci 3HHA 35 000 g.mof1 potkanům. Zkouška byla provedena u těch biologických vzorků, u nichž aktivita 3H byla dostatečná a které jsou zásadní pro hodnocení farmakokinetiky studovaných látek, jmenovitě u plasmy, jater a moče. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.
Tabulka 2 Orientační stanovení podílu 3H ve formě 3H-H2O (případně dalších těkavých forem) ve vybraných biologických vzorcích po aplikaci 3H-HA(35 000 g.mol”1) potkanům. V tabulce je uveden podíl aktivity odparku a nativního vzorku (100 % odpovídá nepřítomnosti HÍEO ve vzorku).
/3H/HA 35 000 g.mol i.v. podání:
Moč za 2 h: 97,9 ±1,3%
Moč za 24 h: 99,1 ±2,0%
Játra za 24 h: 84,6 ± 0,4%
U vzorku moče bylo uskutečněno měření aktivity jednotlivých frakcí po SEC (Size exclusion chromatography) (i.v. podání, 3H-HA 35 000 g.mol”1 po 2h). Výsledky jsou zachyceny na chromatogramu na obr. 1.
Z výsledků vyplývá, že většina radioaktivity je v oblasti výskytu kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti cca 30 000 g.moE1 (22 min). Radioaktivní voda by měla retenční čas kolem 25 minut. Toto měření jednak potvrzuje závěry získané experimenty s odpařováním popsanými v tabulce 2 a také díky podobnosti křivky s výchozím materiálem, významně zvyšuje pravděpodobnost, že naměřená radioaktivita v moči je způsobena kyselinou hyaluronovou.
Příklady 1 až 5 ukazují, že navrhovaný způsob značení vede ke stabilním produktům vhodným například na studium biodistribuce in vivo.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kyselina hyaluronová mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mol“1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mol”1, značená tritiem (T) na uhlíku v poloze 6 glukosaminové části podle vzorce I:
- 2. Způsob přípravy kyseliny hyaluronové mající molekulovou hmotnost v rozmezí 800 g.mol 1 (tetramer kyseliny hyaluronové) až 1 000 000 g.mol”1, značené tritiem podle vzorce I (I), vyznačující se tím, že se nejprve oxiduje kyselina hyaluronová na aldehyd v poloze 6 glukosaminové části, a potom se oxidovaná kyselina hyaluronová redukuje pomocí značeného borohydridu sodného [3H] NaBH4.
- 3. Způsob přípravy kyseliny hyaluronové značené tritiem podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále se ještě upraví molekulová hmotnost značené kyseliny hyaluronové enzymatickou degradací.
- 4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 a 3, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová se chemoselektivně oxiduje v pozici C-6 systémem R-TEMPO/NaClO ve vodě při teplotě -5 až 10 °C, kde R je vodík nebo skupina N-acetyl, molámí množství NaClO je v rozmezí 0,05 až 0,2 eq. a molámí množství R-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.
- 5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 4, vy z n a č uj íc í se tím, že oxidovaná kyselina hyaluronová se redukuje v bazickém vodném rozpouštědle nejprve značeným borohydridem [Ή] NaBH4 a následně neznačeným borohydridem NaBH4 při teplotě -5 až 20 °C, s výhodou 0 až 5 °C, kde molární množství značeného borohydridu je v rozmezí 0,0001 až 0,1 eq. a molámí množství neznačeného borohydridu je v rozmezí 0,01 až 0,2 eq. vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.
- 6. Způsob přípravy podle nároku 5, vyznačující se tím, že jako bazické vodné rozpouštědlo se použije roztok hydroxidu sodného o koncentraci 0,01 až 0,5 mol.dm
- 7. Způsob přípravy podle nároku 3, vyznačující se tím, že značená kyselina hyaluronová se degraduje pomocí enzymu bovinní testikulámí hyaluronidázy BTH při 37 °C po dobu 2 až 72 hodin, s výhodou 48 hodin, kde aktivita přidaného enzymu je v rozmezí 10 až 30 U/mg, s výhodou 20 U/mg.
- 8. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že výchozí kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozsahu 10 000 g.moE1 až 5 000 000 g.mol1.
- 9. Použití kyseliny hyaluronové značené tritiem podle nároku 1 pro biomedicínské aplikace.1 výkres
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120024A CZ201224A3 (cs) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120024A CZ201224A3 (cs) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ303722B6 true CZ303722B6 (cs) | 2013-04-03 |
| CZ201224A3 CZ201224A3 (cs) | 2013-04-03 |
Family
ID=47989620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20120024A CZ201224A3 (cs) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ201224A3 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105873955A (zh) * | 2013-11-25 | 2016-08-17 | 杜特里亚生物材料有限责任公司 | 富氘透明质酸 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987005517A1 (en) * | 1986-03-14 | 1987-09-24 | Bio-Technology General Corp. | Heavy metal salts of hyaluronic acid useful as antimicrobial agents |
| CS178890A3 (en) * | 1990-04-10 | 1992-02-19 | Ustav Ex Farmakologie Sav | Method of proof of hyaluronic acid, its salts or radiolabelled derivatives |
| CS667890A3 (en) * | 1990-12-27 | 1992-07-15 | Eduard Ing Orvisky | Process for preparing (3h) or (14c)-hyaluronic acid or salts thereofhaving a defined molecular weight and specific radioactivity |
| US5772982A (en) * | 1994-08-10 | 1998-06-30 | Coward; Roderick T. | Method of using hyaluronic acid for the detection, location and diagnosis of tumors |
| CZ302503B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd a zpusob jeho modifikace |
| CZ302504B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace |
-
2012
- 2012-01-16 CZ CZ20120024A patent/CZ201224A3/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987005517A1 (en) * | 1986-03-14 | 1987-09-24 | Bio-Technology General Corp. | Heavy metal salts of hyaluronic acid useful as antimicrobial agents |
| CS178890A3 (en) * | 1990-04-10 | 1992-02-19 | Ustav Ex Farmakologie Sav | Method of proof of hyaluronic acid, its salts or radiolabelled derivatives |
| CS667890A3 (en) * | 1990-12-27 | 1992-07-15 | Eduard Ing Orvisky | Process for preparing (3h) or (14c)-hyaluronic acid or salts thereofhaving a defined molecular weight and specific radioactivity |
| US5772982A (en) * | 1994-08-10 | 1998-06-30 | Coward; Roderick T. | Method of using hyaluronic acid for the detection, location and diagnosis of tumors |
| CZ302503B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd a zpusob jeho modifikace |
| CZ302504B6 (cs) * | 2009-12-11 | 2011-06-22 | Contipro C A.S. | Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Orlando P. a kol.: Tritium-labeled hyaluronic-acid derivate, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 22 (9), 1985 * |
| Stefan Highsmith, David M. Chipman : Preparation of tritium-labeled hyaluronic acid oligomers and their use in enzyme studies, Analytical Biochemistry 61 (2), 1974, str. 557-566 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105873955A (zh) * | 2013-11-25 | 2016-08-17 | 杜特里亚生物材料有限责任公司 | 富氘透明质酸 |
| CN105873955B (zh) * | 2013-11-25 | 2019-03-15 | 杜特里亚生物材料有限责任公司 | 富氘透明质酸 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ201224A3 (cs) | 2013-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wessels et al. | Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus. A revised structure for the type III group B streptococcal polysaccharide antigen. | |
| CA2067211C (en) | Phospholipid- or lipid-linked glycosaminoglycan, process for producing the same and metastasis inhibitor | |
| Ten Dam et al. | 3-O-sulfated oligosaccharide structures are recognized by anti-heparan sulfate antibody HS4C3 | |
| Piller et al. | UDP-GlcNAc: Gal beta 1-4Glc (NAc) beta 1-3N-acetylglucosaminyltransferase. Identification and characterization in human serum. | |
| Rundell et al. | Deoxyfluoro-d-trehalose (FDTre) analogues as potential PET probes for imaging mycobacterial infection | |
| CA1307525C (en) | Sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates, of dermatan sulfate and hyaluronic acid and their pharmacological properties | |
| AU780370B2 (en) | Novel fucosylated oligosaccharides and process for their preparation | |
| Aich et al. | Development of delivery methods for carbohydrate-based drugs: controlled release of biologically-active short chain fatty acid-hexosamine analogs | |
| Stocker et al. | Chemical tools for studying the biological function of glycolipids | |
| CZ2014150A3 (cs) | Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití | |
| US7005426B2 (en) | Folic acid-polysaccharide complex, its preparation method and pharmaceutical composition containing the same as active component | |
| Jansson et al. | Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 5 | |
| Oscarsson et al. | Location of the antithrombin-binding sequence in the heparin chain | |
| Kuhnast et al. | Synthesis, radiolabeling with fluorine-18 and preliminary in vivo evaluation of a heparan sulphate mimetic as potent angiogenesis and heparanase inhibitor for cancer applications | |
| Bélot et al. | Blockwise Approach to Fragments of the O-Specific Polysaccharide of Shigella f lexneri Serotype 2a: Convergent Synthesis of a Decasaccharide Representative of a Dimer of the Branched Repeating Unit1 | |
| CZ303722B6 (cs) | Kyselina hyaluronová znacená tritiem, zpusob znacení kyseliny hyaluronové tritiem a její pouzití | |
| Šimek et al. | How the molecular weight affects the in vivo fate of exogenous hyaluronan delivered intravenously: A stable-isotope labelling strategy | |
| JP2997018B2 (ja) | 燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン | |
| JP5344783B2 (ja) | サメ軟骨のコンドロイチン硫酸由来の硫酸化八糖 | |
| WO1994008595A1 (en) | Use of non-anticoagulant heparin for treating ischemia/reperfusion injury | |
| AU2006203314A1 (en) | A complex between folic acid and polysaccharides, its preparation method and a pharmaceutical composition comprising said complex as active component | |
| Brunet-Desruet et al. | Biological evaluation of two iodine-123-labeled D-glucose acetals prepared as glucose transporter radioligands | |
| Angel et al. | A procedure for the analysis by mass spectrometry of the structure of oligosaccharides from high-mannose glycoproteins | |
| ES2893303T3 (es) | Tetrahidrofolatos marcados con 18F isoméricamente puros | |
| CN111902149B (en) | Hyaluronic acid synthesis promoter, method for promoting hyaluronic acid synthesis, and cell evaluation method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20170116 |