CN105873955A - 富氘透明质酸 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及富氘透明质酸d‑HA、含有该富氘透明质酸的组合物、使用该富氘透明质酸的方法、以及用于制备该富氘透明质酸的方法。

Description

富氘透明质酸
技术领域
本发明总体上涉及富氘透明质酸、含有该富氘透明质酸的组合物、使用该富氘透明质酸的方法、以及用于制备该富氘透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(也称为玻璃酸或玻尿酸或者缩写为HA)是一种天然发生的阴离子型非硫酸化糖胺聚糖，其重复二糖由β-(1,3)-D-葡糖醛酸(以下左侧部分)(葡糖醛酸)(GlcUA)和β-(1,4)-N-乙酰基-D-葡糖胺(以下右侧部分)(N-乙酰基葡糖胺)(GlcNAc)组成。
HA可见于人类和动物中的许多部位，这些部位包括眼睛的玻璃体液、皮肤、几乎所有组织的细胞外基质、以及关节(例如，膝关节)的滑液。HA的存在在胚胎发育过程中对于合适的器官发生和胎儿的无疤痕愈合是至关重要的。天然发生的HA的分子量(MW)根据其位置而显著变化并且可以是从约0.200至10MDa(百万道尔顿)。HA的半衰期也根据其位置而显著变化并且可以持续从滑液中的几个小时至细胞外基质中的几周。
HA及其许多化学衍生物具有典型地依赖于HA的MW的多种商业用途。高MW HA(例如，>0.5MDa)用于白内障手术后的伤口愈合(例如，经由眼科注射)，并且作为一种粘性补充剂以提供缓冲和润滑，并且以减小膝关节或其他关节中的骨关节炎疼痛(例如，经由关节内注射)。HA及其化学衍生物的其他用途包括一般伤口愈合、手术后的粘连预防、细胞工程、以及在化妆品(例如，皮肤保湿剂)中。
虽然高MW HA的粘滞弹性为关节提供润滑并且在手术过程中和手术之后保护敏感组织，但当HA在体内降解(例如，酶或自由基降解)后这些特性丧失。较低MW HA实际上可能是炎性的或血管生成的，而不是抗炎性或抗血管生成的。高MW和较低MW HA的降解由天然发生的透明质酸酶引起。此外，大量的降解还由氧化引起，最有可能通过可能作为炎性疾病的一部分病理产生的羟基和多种活性氧(ROS)引起。这已在例如G.高根(G.Kogan)、L.索提斯(L.Soltes)、R.施特恩(R.Stern)以及R.Mendichi，“透明质酸：一种具有通用型物理化学和生物学特性的生物聚合物(Hyaluronic acid:a biopolymer withversatile physico-chemical and biological properties)”，在：聚合物研究手册中：单体、低聚物...(Handbook of Polymer Research:Monomers,Oligomers...)(R.A.佩瑟里克(R.A.Pethrick)等人编著),第393-439页(2007)诺瓦科学出版社(NovaScience Publishers))中综述。
已经设计了许多解决方案来减缓HA的体内降解并且修饰其化学、物理和生物学特性。这些解决方案典型地涉及HA的化学修饰，包括例如通过化学或光化学手段进行交联。交联剂的实例包括硫醇(具有硫醇和亲电试剂诸如丙烯酸酯)、甲基丙烯酸酯、酪胺、甲醛(Hylan-A)、二乙烯砜(Hylan-B)、双碳化二亚胺(Monovisc)、以及肉桂酸二聚体(Gel-One)。其他解决方案包括用大基团(诸如多肽)修饰HA以诱导细胞粘附或自组装成一种水凝胶。遗憾的是，化学修饰经常导致在未修饰HA中未观察到的副作用和异物反应，该未修饰HA具有天然低免疫原性和低毒性。HA的化学和生物学、HA的医疗用途、以及在研究和医疗产品中所采用的化学修饰范围是最近评论的主题，包括：J.W.郭(J.W.Kuo)和G.D.普雷斯特维奇(G.D.Prestwich)，在生物学来源的材料-材料分析和植入物用途中的“第73章，透明质酸”(“Chapter 73.Hyaluronic Acid”inMaterials of Biological Origin-Materials Analysis and Implant Uses)，综合生物材料(Comprehensive Biomaterials)，第2卷(编著P.达契尼(P.Ducheyne)、K.希利(K.Healy)、D.哈特曼彻(D.Hutmacher)、J.柯克帕特里克(J.Kirkpatrick))，爱思维尔(Elsevier)第239-259页(2011)和J.博迪克(J.Burdick)、G.D.普雷斯特维奇，“用于生物医学应用的透明质酸水凝胶(Hyaluronic Acid Hydrogels forBiomedical Applications)”，先进材料(Advanced Materials)23，H41-H56(2011)。
鉴于其许多用途以及其对于降解的已知敏感性，需要一种改进的HA和含HA组合物。
发明内容
在一个方面中，本发明提供新型富氘HA(d-HA)和含有该富氘HA的组合物。
在另一个方面中，本发明提供一种制备d-HA的新型方法。
在另一个方面中，本发明提供使用d-HA例如治疗骨关节炎的新型方法。
在以下详细说明中将变得明显的这些方面和其他方面已通过发明者的以下发现来实现：HA可以用氘富集并且稳定。
附图说明
图1：G、Gl和G6起始材料的HA4的质谱。示出衍生自未富集葡萄糖(G)和富集葡萄糖(Gl和G6)的HA4(4HA单糖单元)的分子量。
图2：天然和[2H]葡萄糖HA的氧化攻击。将根据本发明的富氘HA的稳定性与未富集HA进行比较。
图3：天然和[2H]葡萄糖HA的氧化攻击。将根据本发明的富氘HA的稳定性与未富集HA进行比较。
图4：天然和[2H]葡萄糖HA的氧化攻击。将根据本发明的富氘HA的稳定性与未富集HA进行比较。
具体实施方式
氘(D或2H)是一种稳定的非放射性氢同位素并且具有2.0144的原子量。氢作为一种同位素1H(氢或氕)、D(2H或氘)、以及T(3H或氚)的混合物而天然发生。氘的天然丰度是0.015％。本领域普通技术人员将认识到，在具有H原子的所有化合物中，该H原子实际上代表一种H和D的混合物，其中约0.015％是D。具有富集至大于其天然丰度0.015％的一定水平的氘的化合物应当被认为是非自然的，并且因此，比它们的非富集对应物更加新颖。因此，本发明涉及一种富氘化合物或其中其氘水平大于天然发生的未富集化合物的化合物。
对于存在的氘的量给出的所有百分比均是摩尔百分比。
当一个变量未附带一个定义时，则对照该变量之前的定义。
通过活性氧衍生物进行的解聚作用是发炎组织中的HA令人希望的粘滞弹性丧失的主要原因。解聚作用还可以作为通过羟基和/或ROS衍生物进行的链断裂的结果而发生。在不受任何具体机制束缚的情况下，解聚作用还可以包括归因于二糖单元糖分子之一内的键裂的链断裂，这通常通过夺取碳附接的氢原子(例如，端基异构氢和附接至多糖主链中的碳的其他氢)来启动。
与天然发生的HA或未富集HA相比，在此提供的富氘HA(d-HA)具有增加的稳定性(例如，减小的解聚作用程度或减慢的解聚作用速率)。在不受具体理论限制的情况下，当HA的至少一些(并且可能全部)碳附接氢(例如，端基异构氢和附接至多糖主链中的碳的其他氢)被氘替换时，最可能出现这种增加的稳定性。端基异构位置是在缩酮或半缩酮连接键的每个糖的还原端的那些位置，并且在不受任何具体机制束缚的情况下，当在这些位点处形成自由基时最可能发生断链。用氘替换HA的碳附接氢(包括端基异构氢和沿着多糖主链的其他易于夺取的氢)提供在氘化位点处更耐自由基形成的更强键，由此减少降解；因此d-HA比未富集HA更耐降解(例如，通过自由基诱导的解聚作用)。
本发明的更稳定的HA不仅使得组合物具有更长保存期限(例如，眼用配制品、骨关节炎配制品、以及婴儿乳配制品)，还提供一种将使其体内特性保持更久的HA。这些更稳定的HA分子是有利的，因为该稳定性不是通过化学交联获得的。因此，本发明的富氘HA分子不仅具有所希望的天然HA生物学特性，而且它们不存在由因交联剂而产生的对非天然化学品的过敏或异物反应引起的脱靶炎性特性。
(A)在一个方面中，本发明提供一种具有以下化学式的新型富氘透明质酸d-HA：
或其药学上可接受的盐；
其中：
d-HA具有选自约15kDa(千道尔顿)至约10MDa(百万道尔顿)的分子量；
每个非RD/D1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD和RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的RD和RD1基团的总数的至少1％是D。
(A1)在另一个方面中，本发明提供一种具有以下化学式的新型富氘透明质酸d-HAB：
或其药学上可接受的盐；
其中：
d-HA具有选自约15kDa(千道尔顿)至约10MDa(百万道尔顿)的分子量；
每个非RD/D1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD和RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的RD1基团的总数的至少1％是D。
(A2)在另一个方面中，本发明提供一种具有化学式d-HAB1的新型富氘透明质酸d-HA：
或其药学上可接受的盐；
其中：
每个非RD1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的RD1基团的总数的至少1％是D。
(B)在另一个方面中，本发明提供一种具有化学式d-HA1的新型富氘透明质酸d-HA：
或其药学上可接受的盐；
其中：
每个非RD1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的RD1基团的总数的至少1％是D。
(C)在另一个方面中，本发明提供一种具有化学式d-HA2的新型富氘透明质酸d-HA：
或其药学上可接受的盐；
其中：
每个非RD H独立地是氢或氘；并且，
每个RD独立地是氢或氘，其条件是所存在的RD基团的总数的至少1％是D。
(D)在另一个方面中，本发明提供条款(A)-(C)的d-HA，其中d-HA的分子量MW是选自(a)约0.1MDa至约5MDa、(b)约0.5MDa至约3MDa、(c)约1MDa至约2.5MDa、(d)约15kDa至约100kDa、以及(e)约15kDa至约35kDa。
(E)在另一个方面中，本发明提供条款(A)-(C)(无论何时提到“(A)-”，它都包括Al至A2)的d-HA，其中d-HA的分子量是选自：约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、至约100kDa，以及约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9至约10MDa。
(F)在另一个方面中，本发明提供条款(A)-(E)的d-HA，其中作为D存在于d-HA中的RD和/或RD1基团总数的％是选自(a)1％-50％、(b)5％-90％、(c)10％-90％、(d)20％-90％、(e)30％-90％、(f)40％-90％、(g)50％-90％、(h)10％-50％、以及(i)25％-50％。
(G)在另一个方面中，本发明提供条款(A)-(E)的d-HA，其中作为D存在于d-HA中的RD和/或RD1基团总数的％是选自1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％至100％。
(H)在另一个方面中，本发明提供一种新型药用组合物，该药物组合物包含：根据本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))和一种药学上可接受的赋形剂。
(I)在另一个方面中，本发明提供一种用于治疗患者的骨关节炎的新型组合物，该新型组合物包含：治疗有效量的本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))和一种药学上可接受的赋形剂，其中该组合物适用于注射到患者的关节中。该关节是一种诸如膝、臀、肩、肘、腕、踝、手指、或椎间关节等的关节。
(J)在另一个方面中，本发明提供一种d-HA(例如，条款(A)-(G))的新型骨关节炎组合物。该骨关节炎组合物被装在一个预填充型无菌包装注射器中，该注射器含有0.5mL至12mL在无菌磷酸盐缓冲液(可替代地可以使用一种本领域中已知适用于关节内注射的类似无菌水溶液)中的d-HA。d-HA的浓度是从0.2％w/w至5％w/w。d-HA的大小是从约50kDa至约5MDa。
(K)在另一个方面中，d-HA的浓度是从1％w/w至3％w/w。d-HA的大小是从约250kDa至约2.5MDa。
(I)在另一个方面中，本发明提供一种新型眼用组合物，该眼用组合物包含：本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))和一种药学上可接受的赋形剂，其中该组合物适用于应用或注射到患者的眼睛中。眼用组合物的一个方面是改善眼睛的环境或改善眼睛的感觉。眼用组合物的另一个方面是延迟HA在眼睛中的解聚作用以保持眼睛的物理结构和眼睛内的生理环境。眼用组合物的另一个方面是使d-HA充当眼睛内玻璃体液的补充或更换。眼用组合物的又一个方面是在眼科手术过程中使用d-HA代替HA。又一个方面是通过玻璃体注射递送药物。预期这种注射类型将使患有年龄相关性黄斑变性(AMD)的人受益。
(M)在另一个方面中，本发明提供一种新型的人工泪液组合物，该组合物包含：根据本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))和一种适用于滴眼剂的赋形剂。此类赋形剂可以包括水、盐和缓冲液以及另外的润滑剂(例如，聚乙二醇400)、防腐剂(例如，亚氯酸钠和过硼酸钠)、以及另外的酸和盐(例如，硼酸、硼酸钠、氯化钙、氯化镁、以及氯化钾)。这种类型的组合物可以用于治疗患者的干眼或其他来源的眼部刺激或角膜损伤的症状。
(N)在另一个方面中，本发明提供一种新型d-HA眼用组合物。本发明(例如，条款(A)-(G))的d-HA被配制成在本领域技术人员已知的无菌眼用溶液中的浓度从0.05％至1％w/w的滴眼剂。所存在的d-HA的量的附加实例包括从0.1％w/w-0.5％w/w以及从0.15％w/w-0.25％w/w。
(O)在另一个方面中，本发明提供一种新型乳组合物(例如，婴儿配制品)，该乳组合物包含本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))，其中d-HA的重量是从约15kDa至约100kDa。
(P)在另一个方面中，本发明被配制成一种新型局部抗皱和抗衰老保湿霜、软膏、凝胶、精华液、水凝胶贴剂、或脂质体制品，它包含：根据本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))、水以及化妆品可接受的赋形剂和活性物。如果使用一种d-HA盐，那么该d-HA盐可以是一种化妆品可以接受的盐。
(Q)用于本发明的组合物(例如，条款(H)-(P))的赋形剂的实例是典型地用于未富集(天然发生的)HA的那些赋形剂，并且包括水(例如，当使用d-HA的钠盐或甲盐时)、生理盐水、氯化钠、柠檬酸、以及缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液，包括酸式磷酸盐、二碱式磷酸盐、二碱式磷酸盐十二水合物)。
(R)在另一个方面中，本发明的组合物(例如，条款(H)-(Q))的pH是从6.0-8.0。该pH的附加实例包括从6.8-7.8。另外的实例包括6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9至8。
(S)存在于本发明的组合物(例如，条款(H)-(R))中的d-HA的重量将取决于其用途(例如，骨关节炎或眼用的)。实例包括0.1至100mg。附加实例包括(a)0.1-10mg、(b)10-50mg、以及(c)10-25mg。另外的实例包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95至100mg。
(T)存在的d-HA的重量还可以存在的重量百分比表示。存在于本发明的组合物(例如，条款(H)-(R))中的d-HA的重量％的实例包括从0.1％-99％。附加实例包括(a)0.1重量％-5重量％、(b)0.1重量％-1重量％、以及(c)1重量％-50重量％。另外的实例包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90至95重量％。
(U)用于本发明的d-HA(例如，条款(A)-(T))的药学上或化妆品可接受的盐的实例包括例如钠盐、钾盐、铵盐、烷基铵盐、钙盐、锂盐、锰盐、镁盐、锌盐、以及钴盐。
(V)在另一个方面中，本发明提供一种新型预填充容器，该预填充容器包括本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))或本发明的d-HA组合物(例如，条款(H)-(U))。预填充容器的实例包括注射器(例如，用于骨关节炎或眼科适应症)、滴眼剂瓶(例如，用于人工泪液)、以及一种霜剂容器、凝胶、水凝胶贴剂、或其他化妆品可用的容器或装置(例如，用于一种化妆品组合物)。注射器容积的实例包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45至50mL。注射器容积的实例还包括0.1、0.2、0.3、0.4.、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9至1mL。滴眼剂瓶容积的实例包括0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450至500mL。滴眼剂瓶容积的实例还包括0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9至1mL。
(W)在另一个方面中，本发明可以包括一种用于将本发明的d-HA离子(例如，条款(A)-(G))电渗递送到皮肤内的水凝胶贴剂、或一种具有用于将d-HA递送到皮肤内的皮肤穿透肽的脂质体配制品、或一种具有其他化妆品可接受的肽的组合物、或一种具有本领域已知将HA递送至真皮和表皮内以减少老化或晒伤皮肤皱纹的深度和严重性的经皮递送促进剂。
(X)本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))可以在用于治疗患者的应用中代替HA或交联HA，这些应用包括：(a)治疗骨关节炎；(b)防止术后组织手术粘连；(c)人类和动物(例如，马、犬和猫)两者中的粘性补充剂；(d)有助于眼科手术，诸如白内障摘除术、人工晶体植入术、青光眼滤过术、角膜移植术、玻璃体切除术、以及视网膜脱离复位术；(e)用于体外组织工程化或指导体内组织再生或增加的支架；(f)用作医疗器械(例如，导管、导丝和支架)的涂层；(g)促进体外受精胚胎附接至子宫壁；(h)诱导术后组织愈合；(i)诱导或加速伤口愈合；(j)用作一种皮肤填充剂；(k)用作一种控制释放介质(例如，用作一种基体或肠胃外贮库)；(1)用于眼用配制品的赋形剂；(m)眼用保湿剂或玻璃体液更换；(n)保护软骨细胞使其免受氧化损伤，其中这些损伤由活性氧导致；(o)减缓、衰减、减轻和/或改善脊椎动物患者的骨矿质密度损失；(o)减缓、衰减、减轻和/或改善脊椎动物患者的骨赘形成；(g)一种局部抗皱和抗衰老保湿霜、水凝胶贴剂、脂质体或其他化妆品制品的一种组分；(q)在疾病治疗、特别是化疗中作为一种药物预敏化剂和化学敏化剂给药；(r)调节具有涉及血管通透性增加的疾病或病症的症状或诊断患有该疾病或病症(例如，急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、动脉粥样硬化、黄斑变性、毛细血管渗漏综合征、以及败血症)的患者的血管通透性；(s)通过静脉注射或瘤内给药来传输和递送化疗药物，由此在减小不希望的副作用的同时，增加细胞毒性药物至肿瘤或转移位点的递送；(t)促进伤口修复或防止鼓膜修复、耳科手术、或鼻内窥镜手术中的粘连；(u)通过注入声带中来预防或修复声带损伤；(v)通过注入尿道括约肌来提供一种用于尿失禁的膨胀剂；(w)用于药物递送至眼睛内的媒介物；(x)用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)；以及(y)作为一种玻璃体补充和/或更换进行玻璃体内注射。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗骨关节炎的新型方法，该新型方法包括：向有需要的患者给予治疗有效量的本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))或其药学上可接受的盐。
在另一个方面中，经由关节内注射给予该d-HA。
在另一个方面中，将该d-HA给药至患者的至少一个膝、臀、肩、肘、腕、踝、手指、或椎间关节。
d-HA(单独)或在一种组合物中给药的频率将取决于其用途。在骨关节炎情况中，限制治疗次数是有益的。因此，在此情况中的给药可以每周、每两周、每月、每两月、每季度、每半年、或甚至每年给予一次。
给药途径的实例包括：静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、鼻内、鞘内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部(topically)、瘤内、肌内、眼内、皮下、结膜下、膀胱内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部(topically)、局部(locally)、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、经由导管、经由喷雾器、以及经由灌洗。
在另一个方面中，本发明提供一种减缓、衰减、减轻和/或改善脊椎动物患者的骨矿质密度损失的新型方法，该新型方法包括：口服给予治疗有效量的本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))。
在另一个方面中，本发明提供一种减缓、衰减、减轻和/或改善脊椎动物患者的骨赘形成的新型方法，该新型方法包括：给予治疗有效量的本发明的d-HA(例如，条款(A)-(U))。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗癌症的新型方法，该新型方法包括：在给予至少一种癌症化疗剂之前，向有需要的患者静脉内给予治疗有效量的本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))。本发明还提供使用本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))作为一种夹带和靶向递送媒介物以运输所述化疗剂供患者瘤内或静脉内注射之用。
在另一个方面中，本发明提供一种用于调节具有涉及血管通透性增加的疾病或病症的症状或诊断患有该疾病或病症的患者的血管通透性的新型方法，该新型方法包括：给予治疗有效量的本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))。
在另一个方面中，本发明提供一种防止患者术后组织手术粘连的新型方法，该新型方法包括：向涉及手术的组织表面提供一种可水解涂层，该可水解涂层包含：本发明的d-HA(例如，条款(A)-(G))。该涂层可以是呈选自下组的形式，该组由以下各项组成：凝胶、膜、泡沫、以及纤维。该涂层可以进一步包含：一种药理学活性剂。
本发明还涉及分离或纯化的d-HA。该分离或纯化的d-HA是氘水平高于天然发生水平的一组分子(即，一种分离的化合物)。该分离或纯化的d-HA可以通过本领域技术人员已知的技术获得。
分离意味着非天然发生的d-HA被纯化(例如，从其中制备它的发酵反应混合物中纯化)。相对于存在的非d-HA组分，该分离的d-HA(可以多于一种类型的化合物)的纯度实例包括至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以及99.9％。
本发明还涉及d-HA组合物的混合物，这意味着存在多于一种类型的d-HA。
在另一个方面中，本发明提供一定量的d-HA。该一定量的d-HA可以与其他组分和/或非富氘HA分离，或可以存在此类其他组分。量的实例包括(a)至少0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5至1摩尔、(b)至少0.1摩尔、以及(c)至少1摩尔的化合物。量的实例还包括(a)至少一克d-HA；(b)至少一千克；以及(c)至少一公吨。本发明的量还涵盖实验室规模(例如，克规模)、千克实验室规模(例如，千克规模)、以及工业或商业规模(例如，数千克或以上规模)数量，因为这些量将更适用于实际生产用于患者的d-HA组合物。工业/商业规模是指将在为了现场测试、配制、向公众销售/分销等所设计的批次中生产的产品的量。
在另一个方面中，本发明的组合物通常将包含至少6×1019个分子，并且可以例如包含至少6×1020个分子、6×1021个分子、6×1022个分子、或6×1023个分子。
在另一个方面中，本发明的组合物包含至少0.1摩尔的至少一种d-HA。d-HA的量的其他实例包括至少0.2、0.5、1、2、3、4、5、10至20摩尔。
在另一个方面中，本发明的组合物包含至少一毫克的至少一种d-HA。存在的d-HA量的其他实例包括至少1、5、10、20、30、40、50、100、500至1,000克。
在本发明的另一个方面中，在先前的每个方面中“包含”被“由……组成”代替。
在本发明的另一个方面中，在先前的每个方面中“包含”被“基本上由……组成”代替。
本发明可以在不脱离其精神或实质属性的情况下以其他具体形式来实施。本发明涵盖在此指出的本发明的方面的所有组合。应当理解，本发明的任何以及所有方面连同任何其他一个方面或多个方面可以被拿来描述另外的方面。还应当理解，这些方面的每个单独的要素旨在作为其本身独立的方面而被单独地拿出来。此外，一个方面的任何要素意味着与来自于任何方面的任何以及所有其他要素相结合来描述另外的方面。
定义
这里提供的所有实例不旨在为限制性的。
使用的“H”是指氢原子的属，任何同位素组成的属(即1H、2H或以任何比例的其任意组合)。使用的“D”或2H”特定地是指氘同位素。除非另外说明，否则在此描述的比例百分比都是按重量计的％。天然丰度是约0.0156％；需要人工实现显著较高的比例(例如，大于1％)。
除非另外指明，否则当D被具体列举在一个位置或示出在公式中时，此D表示一种氢和氘的混合物，其中氘的量是约100％(例如，氘的丰度是从90％至100％)。在某些方面中，氘的丰度是从97％至100％。在某些方面中，氘的丰度是从35％至100％。通用术语“d-HA”描述一种具有高于天然丰度的水平的氘的HA聚合物。
化合物是指分子足以称重、测试其结构特性并且足以具有可验证用途的量(例如，可以在一个测定中显示具有活性的量，或可以应用于人的化妆品情况中或动物和人类患者的治疗情况中的量)。
除非另外指明，否则d-HA的分子量是指重量平均分子量(即，Mw)。HA的分子量可以通过使用多角度静态光散射(MALS)检测器(例如，WyattTechnology’sII)结合尺寸排阻色谱柱来获得。可替代地，凝胶电泳(具有琼脂糖或聚丙烯酰胺基质)，尤其使用校准MALS标准的凝胶电泳，可以用于评估HA的Mw。
患者是指人类或动物(例如，犬、猫、马、牛、羊、鸟、山羊、骆驼、鼬、以及外来种)。
“治疗”(“treating”或“treatment)涵盖治疗患者的疾病状态并且包括：(a)预防患者发生疾病状态，具体地是当此患者易患该疾病状态但是尚未诊断患有该疾病时；(b)抑制该疾病状态，例如阻碍它发展；和/或(c)缓解该疾病状态，例如，引起疾病状态的消退直到达到所希望的终结点。治疗还包括疾病症状的改善(例如，减轻疼痛或不适)，其中此类改善可以或可以不直接影响该疾病(例如，起因、传染、表达等)。
实例
以下合成富氘d-HA的实例旨在说明，而不是限制本发明。
实例1
富氘HA(例如，d-HA、d-HAB、d-HAB1、d-HA1、以及d-HA2)可以由预先存在的氘标记的葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺结构单元合成，或由在细菌或真菌发酵过程中被转换为这些结构单元的常见糖源合成。例如，HA合成酶根据以下方程由UDP-糖(尿苷二磷酸)体外合成HA：
nUDP-GlcUA+nUDP-GlcNAc→2nUDP+[GlcUA-GlcNAc]n。
对于在端基异构或其他非端基异构位置中标记的d-HA，UDP-糖前体已经具有由氘标记的这些位置。这些标记的UDP-糖结构单元通过在发酵过程中将氘-标记的葡萄糖(或其他碳源)生物合成转化成UDP-N-乙酰基葡糖胺(UDP-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)来产生。
对于用于生产HA(以及在氘化原料诸如富氘碳源诸如葡萄糖或蔗糖时用于富氘HA，诸如d-HA、d-HAB、d-HAB1、d-HA1以及d-HA2)的不同发酵方法的综述，参见Boeriu,C.G.等人，碳水化合物化学国际期刊(InternationalJournal of Carbohydrate Chemistry)2013，文章编号627967(http:dx.doi.org/10.1155/2013/624967)，该文献的内容通过引用以其全文结合于此。
实例2
富氘HA(例如，d-HA、d-HAB、d-HAB1、d-HA1、以及d-HA2)可以经由使用已知微生物菌种的发酵过程形成，这些微生物菌株包括源自天然分离株的那些菌株，包括C组链球菌(例如，兽疫链球菌、马链球菌、似马链球菌、乳房链球菌等)或A组链球菌(化脓链球菌)、或多杀性巴氏杆菌(或相关禽杆菌属类)或病毒感染小球藻以及其人工改造的衍生菌后代、或具有外源宿主(诸如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肠球菌、乳杆菌某种、或土壤杆菌某种(Agwbacterium sp)、酵母、真菌或藻类)中的HA合成酶基因的重组变型。HA的来源不是本发明的重要方面，重要的是HA链中的同位素氘标记。通过在氘化原料(例如，氘化葡萄糖或其他碳源)存在下发酵，可以产生富氘HA。能够以商业上有用的量生产HA的其他真菌和细菌菌株也是本领域技术人员已知的。
适合于HA发酵的枯草芽孢杆菌菌株可购自美国诺维信生物医药公司(Novozymes Biopharma US)(或DK A/S)。此类菌株的实例包括美国专利号7,811,806中描述的那些菌株，该专利的内容通过引用以其全文结合于此。例如，参见菌株TH1、RB161、RB 163、RB187、RB197、以及RB200，所有这些菌株均是使用蔗糖发酵的。产生HA的马链球菌菌株的选择通过金,J.-H.(Kim,J.-H.)等人，酶与微生物技术(Enzyme and Microbial Technology)1996,19,440-5进行描述，该文献的内容通过引用以其全文结合于此。产生HA的重组大肠杆菌菌株的使用通过余,H.(Yu,H.)等人，代谢工程学(Metabolic Engineering)2008,10,24-32进行描述，该文献的内容通过引用以其全文结合于此。产生HA的土壤杆菌(ATCC 31749)某种的修饰通过毛,Z.(Mao,Z.)等人，生物技术进展(Biotechnology Progress)2007,23,1038-42进行描述，该文献的内容通过引用以其全文结合于此。
使用氘化碳源(诸如氘化蔗糖)将提供富氘HA。氘化蔗糖的实例包括(β-D-[6,6’-2H2]呋喃果糖α-D-吡喃葡萄糖苷)([6,6’-2H2 果糖]蔗糖)和(β-D-[UL-2H7]呋喃果糖α-D-[UL-2H7]吡喃葡萄糖苷)([UL-2H14]蔗糖)，这两者均可购自奥米龙生化有限公司(Omicron Biochemicals Inc)。还可以使用氘化葡萄糖作为碳源。实例包括可购自西格马阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)的D-葡萄糖-6,6-d2。可以使用其他氘化葡萄糖，包括也可购自西格马阿德里奇或Isotec公司的D-葡萄糖-l-d1D-葡萄糖-1,2,3,4,5,6,6-d7或D-葡萄糖-d12。氘化果糖也可以用作碳源。
最后，认为将来自6-氘化葡萄糖的氘并入HA是经由三碳片段(例如，氘化甘油醛3-磷酸盐和/或二羟丙酮磷酸)来实现的，该三碳片段在发酵过程中由D-葡萄糖产生。葡糖异生也可以使用丁酮二酸盐(一种四碳片段)作为一种用于转化成磷酸烯醇丙酮酸的中间体。因此，技术人员可以将氘标记的三碳片段或四碳片段或适合葡糖异生的其他氘标记的原料引入发酵以产生制备d-HA所需要的氘标记的UDP-糖结构单元。可以通过氘交换，例如使甘油醛3-磷酸盐和/或二羟丙酮磷酸和/或丁酮二酸盐与D2O中的NaOD(可替代地Et3N、或其他合适的碱)接触来实现这三种起始材料的氘化。
实例3：
富氘HA产生和稳定性测试
菌株和培养基
菌株：多杀性巴氏杆菌亚种，多杀性巴氏杆菌(#15742)
板培养基：5％绵羊血琼脂(Teknova B0142)
液体培养基：杜伯克改进的伊格尔培养基(DMEM)(康宁#90-113-PB)，具有：
NaHCO3：2.2g/L
L-谷氨酰胺：200mg/L
在生长时，添加以下各项：
FeSO4：5mg/L
葡萄糖：2g/L
使用以下葡萄糖：
D-葡萄糖(G)(Amresco#0188)(天然丰度对照；无额外的氘)
D-葡萄糖-l-d1(G1)(奥德里奇#310816，98原子％D)(预期富氘HA具有各自氘化的GlcUA和GlcNAc，每个重复单元有2个氘)
D-葡萄糖-6,6-d2(G6)(奥德里奇#282650，98原子％D)(预期富氘HA具有二氘化GlcNAc，每个重复单元有2个氘；由于6,6氢在葡萄糖生物合成转化为葡萄糖醛酸过程中失去，因此预期在GlcUA上没有氘)
D-葡萄糖-1,2,3,4,5,6,6-d7(G7)(奥德里奇#552003，97个原子％D)(预期HA二糖具有七氘化GlcNAc和四氘化GlcUA—每个重复单元有10个氘)
产HA细菌的生长
将多杀性巴氏杆菌P1059划线到血琼脂板上并且在37℃下孵育过夜。用来自血琼脂板的若干菌落接种具有所有附加物和D-葡萄糖(G)的DMEM小型起子培养物，并且在37℃下振荡孵育约7小时。将这些起子培养物用于以1:500的接种比例接种含有DMEM液体培养基的锥形瓶，每个锥形瓶具有无标记或不同标记的葡萄糖(G、G1、G6或G7)。培养物可以在37℃下震荡孵育约16小时。
HA纯化
通过离心去除微生物细胞(10,000×g，30分钟)。将乙醇(3x体积)添加到澄清上清液中，从而导致HA聚合物沉淀。通过离心收获HA聚合物。用70％乙醇洗涤所得的沉淀并且使其干燥过夜。通过轻轻涡旋使沉淀在水中再悬浮。进行水溶液的丁醇萃取(1:1)，随后进行氯仿萃取(1:1)。将具有HA聚合物的水部分在-20℃下储存。可以采用任何其他HA多糖纯化方法，包括使用离子交换或切向流过滤步骤的那些方法，以及使用任何以上方法的重复或序贯疗法。
通过琼脂糖凝胶分析进行HA大小分析
使用长度为10cm的1％琼脂糖IX TAE缓冲凝胶和Select-HiLadder和LoLadder大小标准(Hyalose公司)进行所有琼脂糖凝胶分析。将凝胶在40V下跑样直到橙黄G(西格玛)染料前沿距离该凝胶端部大约1cm。为可视化HA，在黑暗中将凝胶浸泡在含有50％乙醇中的0.005％全染色剂(Stains-All)(西格玛)中(2-16小时)，并且在黑暗中用水脱色。HA聚合物菌株遇此染料变蓝。
结果
用于聚合物特性的链霉菌属HA裂解酶消化试验
使用睾丸透明质酸酶进行聚合物的消化(西格玛缓冲液50mM乙酸铵，pH5.5，37℃过夜，将聚合物消化成4、6、8等个单糖单元＝分别是HA4、HA6、HA8等)。通过3kDa MWCO超滤器(Amicon)过滤反应物，并且通过液相色谱法结合电喷射傅里叶变换质谱法(LC-FTMS)来分析穿透流(见参考文献：L.李(L.Li)等人，分析化学(Analytical Chemistry)，84,8822-8829.2012)。
HA寡糖产生以及用于氘结合水平的LC-FTMS
使用睾丸透明质酸酶进行聚合物的消化(西格玛缓冲液50mM乙酸铵，pH5.5，37℃过夜，将聚合物消化成4、6、8等个糖单元)。通过3kDa MWCO超滤器(Amicon)过滤反应物，并且通过LC-FTMS来分析穿透流(见参考文献：L.李(L.Li)等人，分析化学(Analytical Chemistry)，84,8822-8829.2012)。与天然丰度“G”对照相比，对于“G1”、“G6”、和“G7”补料培养物观察到归因于氘添加的预期附加质量。
基本上，使酶消化产物中的HA寡糖经受LC分离，然后电喷射到FT质谱仪中。作为一个实例，在图1中示出HA4峰的数据。不同的同位素分布取决于在微生物生长步骤中采用的碳源(即，天然、1-d1、或6,6-d2葡萄糖)。观察到-2离子(z＝2)(因此需要乘以2以得到该四糖的实际质量)。对于该四聚物(HA4)，如所预测的，观察到G1和G6两者均增加4道尔顿。确切地说，天然HA“G”具有776.236的质量，而d-HA变型“G1”和“G6”分别具有780.261和780.262的较高质量，这证实合成了本发明的d-HA。类似地，由于其富集有氘，因此观察到的所有其他较长d-HA寡糖(HA6、HA8、HA10)均具有比天然HA寡糖对应物更高的质量。
在下表中列出低聚物的保留时间(分钟)。
样品 HA4 HA6 HA8 HA10
G＝D-(+)-葡萄糖 5.22 5.59 5.77 5.98
G1＝D-葡萄糖-1-d1 5.24 5.58 5.78 5.92
G6＝D-葡萄糖-6,6-d2 5.22 5.58 5.78 5.93
基于在质谱图中观察到的最丰富离子峰，将HA4和其他较长低聚物的MW列出在下表中。与天然丰度“G”对照相比，对于“G1”、“G6”、和“G7”补料培养物观察到归因于氘添加的预期附加质量。
样品 HA4 HA6 HA8 HA10
G＝D-(+)-葡萄糖 776.236 1155.351 1534.465 1913.578
G1＝D-葡萄糖-1-d1 780.261 1161.387 1542.512 1923.637
G6＝D-葡萄糖-6,6-d2 780.262 1163.399 1544.524 1925.65
HA聚合物的氧化攻击
基本攻击条件(最初取决于魏斯贝格尔(Weissberger)氧化系统；神经内分泌通讯(Neuro Endocrinol Lett)2012.33增刊3:151-4“通过魏斯贝格尔氧化系统诱导的高摩尔质量透明质酸进行自由基降解：布西拉明的潜在抗氧化作用(Free-radical degradation of high-molar-mass hyaluronan induced byWeissberger’s oxidative system:potential antioxidative effect of bucillamine)”。巴纳索瓦M(Banasova M)、萨辛科娃V(Sasinkova V)、Mendichi R、PereckoT、瓦拉霍娃K(Valachova K)、尤拉内克I(Juranek I)、索提斯L，药物与生物医学分析杂志(J Pharm Biomed Anal.)2007.44(5)：1056-63“通过包含抗坏血酸盐、Cu(II)和过氧化氢的氧化系统进行高摩尔质量透明质酸的降解：抗炎药--萘普生和乙酰水杨酸的抑制作用(Degradation of high-molar-mass hyaluronanby an oxidative system comprising ascorbate,Cu(II),and hydrogen peroxide:inhibitory action of antiinflammatory drugs--naproxen and acetylsalicylic acid)”；索提斯L、StankovskáM、科根G(Kogan G)、Mendichi R、沃尔皮N(VolpiN)、萨辛科娃V、格迈纳尔P(Gemeiner P))如下：
a.0.1μM CuCl2
b.100μM抗坏血酸
c.25mM H2O2
所有储备液均以0.15M NaCl制备。
图2示出使用该基本攻击条件的过夜测试的结果。在此实例中，琼脂糖凝胶电泳可以根据大小分离HA；与进一步迁移到凝胶中的较小聚合物(即，具有低分子量的链)相比，长聚合物(即，具有高分子量的链)在凝胶顶部跑样。在微生物HA中观察到条纹或条带，因为大范围的聚合物长度存在于这些样品中并且该凝胶图像示出所存在的全部聚合物物种的总和。观察到“G”和“G6”HA的明确降解(对应于凝胶上的着色聚合物的条纹仅示出在氧化攻击后剩余的低分子量HA)，但“Gl”和“G7”经得住该攻击(条纹示出高分子量HA，类似于起始“Gl”和“G7”HA)。此发现最可能是因为这些d-HA变型提高了这些糖之间将聚合物连在一起的键(称为糖苷键)的稳定性。经由氘富集改变在碳1处的行为(如在“G1”和“G7”)防止由攻击引起的破碎。在另一方面，d-HA的“G6”变型在糖苷键处没有氘，因此不受保护。
在图2(和图3-图4)中使用以下缩写：
L：HA梯标准；
G：葡萄糖(天然)；
Gx：在氧化攻击后；
G1：葡萄糖-1-d1；
G1x：在氧化攻击后的葡萄糖-l-d1；
G6：葡萄糖-6,6-d2；
G6x：在氧化攻击后的葡萄糖-6,6-d2；
G7：葡萄糖-1,2,3,4,5,6,6-d7；以及
G7x：在氧化攻击后的葡萄糖-1,2,3,4,5,6,6-d7。
图3示出使用以下攻击条件的过夜测试的结果：
a：0.1μM CuCl2、100μM抗坏血酸、75mM H2O2；
b：0.1μM CuCl2、100μM抗坏血酸、250mM H2O2；
c：1μM CuCl2、1μM抗坏血酸、250mM H2O2；以及
d：0.1μM CuCl2、100μM抗坏血酸、1.3mM H2O2。
当“G”HA降解(低MW条纹)时，“G1”和“G7”HA经受住这些攻击条件(高MW条纹)。
图4示出在0.5μM CuCl2、500μM抗坏血酸、125mM H2O2中的过夜攻击测试的结果。当“G”HA降解(低MW条纹)时，“G1”和“G7”HA再一次经受住这些攻击条件(高MW条纹)。
实例4
骨关节炎组合物：
组合物A：含有0.5-12mL在无菌磷酸盐缓冲液中的d-HA的预填充型无菌包装注射器。d-HA的浓度是从0.2％w/w-5％w/w。d-HA的大小是从约50kDa至约5MDa。
组合物B：含有0.5-12mL在无菌磷酸盐缓冲液中的d-HA的预填充型无菌包装注射器。d-HA的浓度是从1％w/w-3％w/w。d-HA的大小是从约250kDa至约2.5MDa。
组合物C：以上A或B的组合物，其中该d-HA是一种化学交联d-HA。
组合物D：以上A或B或C的组合物，其中该d-HA与其他生物材料(例如，甲壳素、胶原、聚乳酸、塑料、陶瓷、聚合物、和/或细胞)混合或组合。
实例5
眼用组合物。
组合物A：一种d-HA组合物被配制成在本领域技术人员已知的无菌眼用溶液中浓度为0.05％至1％w/w的滴眼剂。
组合物B：一种d-HA组合物被配制成在本领域技术人员已知的无菌眼用溶液中浓度为0.1％至0.5％w/w的滴眼剂。
组合物C：一种d-HA组合物被配制成在本领域技术人员已知的无菌眼用溶液中浓度为0.15％至0.25％w/w的滴眼剂。
组合物D：一种d-HA组合物被配制用于在本领域技术人员已知的注射用无菌眼用溶液中浓度为0.1％至4％w/w的玻璃体内注射。
实例6
实例A-E是本发明的d-HA，其中这些氢(示出或未示出)是未富集的氢(即，氘的天然丰度)并且示出的氘D是约100％D。
实例7
实例F是本发明的d-HA，其中这些氢(示出或未示出)是未富集的氢(即，氘的天然丰度)并且示出的氘D是约100％D。
根据以上传授内容，本发明的很多修改和变化都是可能的。因此，应该理解在所附权利要求范围内，本发明可以不同于在此特定说明的方式来实践。

Claims (15)

1.一种具有以下化学式的富氘透明质酸d-HA：
或其一种药学上可接受的盐，其中：
该d-HA具有选自约15kDa至约10MDa的分子量；
每个非RD/D1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD和RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的RD和RD1基团的总数的至少1％是D。
2.如权利要求1所述的d-HA，其中该d-HA具有化学式d-HA1：
或其药学上可接受的盐；
其中：
每个非RD1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的该RD1的至少1％是D。
3.如权利要求1所述的d-HA，其中该d-HA具有化学式d-HAB1：
或其药学上可接受的盐；
其中：
每个非RD1H独立地是氢或氘；并且，
每个RD1独立地是氢或氘，其条件是所存在的该RD1基团的至少1％是D。
4.如权利要求1所述的d-HA，其中该d-HA具有化学式F：
或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求1所述的d-HA，其中该d-HA具有化学式d-HA2：
或其药学上可接受的盐；
其中：
每个非RD H独立地是氢或氘；并且，
每个RD独立地是氢或氘，其条件是所存在的该RD基团的至少1％是D。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的d-HA，其中该分子量是选自(a)约0.1-5MDa；(b)约0.5-3MDa；(c)约1-2.5MDa；(d)约15-100kDa；以及(e)约15-35kDa。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的d-HA，其中所存在的RD和/或RD1基团的总数的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％是D。
8.一种用于治疗骨关节炎的组合物，包含：治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的d-HA和一种药学上可接受的赋形剂，其中该组合物适用于注射到患者的关节中。
9.如权利要求8所述的组合物，其中该关节是选自膝、臀、肩、腕、踝、肘、手指、以及椎间关节。
10.如权利要求9所述的组合物，其中该关节是膝关节。
11.一种眼用组合物，包含：根据权利要求1至7中任一项所述的d-HA和一种药学上可接受的赋形剂，其中该组合物适用于注射到患者的眼睛中。
12.如权利要求11所述的组合物，其中该组合物适用于治疗年龄相关性黄斑变性。
13.如权利要求11所述的组合物，其中该组合物适用于作为一种玻璃体补充和/或更换进行注射。
14.一种治疗骨关节炎的方法，包括：向有需要的患者给予治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的d-HA。
15.如权利要求14所述的方法，其中该d-HA是经由关节内注射给予至患者的膝关节。
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