PL212928B1 - Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego i komórka gospodarz Bacillus - Google Patents

Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego i komórka gospodarz Bacillus

Info

Publication number
PL212928B1
PL212928B1 PL375190A PL37519002A PL212928B1 PL 212928 B1 PL212928 B1 PL 212928B1 PL 375190 A PL375190 A PL 375190A PL 37519002 A PL37519002 A PL 37519002A PL 212928 B1 PL212928 B1 PL 212928B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
acid sequence
nucleic acid
sequence encoding
polypeptide
Prior art date
Application number
PL375190A
Other languages
English (en)
Other versions
PL375190A1 (pl
Inventor
Alan Sloma
Regine Behr
William Winder
Maria Tang
David Sternberg
Stephen Brown
Original Assignee
Novozymes Biopolymer As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes Biopolymer As filed Critical Novozymes Biopolymer As
Publication of PL375190A1 publication Critical patent/PL375190A1/pl
Publication of PL212928B1 publication Critical patent/PL212928B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kwasu hialuronowego oraz komórki gospodarza Bacillus.
Najpowszechniejszymi heteropolisacharydami w organizmie są glikozaminoglikany. Glikozaminoglikany są nie rozgałęzionymi polimerami węglowodanowymi, składającymi się z powtarzających się jednostek dwucukrowych (tylko siarczan keratanu jest rozgałęziony w regionie rdzeniowym węglowodanu). Jednostki dwucukrowe zazwyczaj zawierają, jako pierwszą jednostkę cukrową, jeden z dwóch modyfikowanych cukrów - N-acetylogalaktozaminę (GalNAc) lub N-acetyloglukozaminę (GlcNAc). Drugą jednostką jest zazwyczaj kwas uronowy, taki kwas glukuronowy (GlcUA) lub iduronian.
Glikozaminoglikany są cząsteczkami naładowanymi ujemnie i mają wydłużoną konformację, która nadaje dużą lepkość w roztworze. Glikozaminoglikany są umiejscowione głównie na powierzchni komórek lub w macierzy zewnątrzkomórkowej. Glikozaminoglikany wykazują także niską ściśliwość w roztworze oraz, w wyniku tego, są idealnym fizjologicznym płynem smarującym np. stawów. Sztywność glikozaminoglikanów nadaje komórce strukturalną integralność i zapewnia kanały między komórkami, co pozwala na migrację komórek. Glikozaminoglikanami o najważniejszym znaczeniu fizjologicznym są hialuronan, siarczan chondroityny, heparyna, siarczan heparanu, siarczan dermatanu oraz siarczan keratanu. Większość glikozaminoglikanow wiąże się kowalencyjnie z proteoglikanowym białkiem rdzeniowym przez specyficzne struktury oligosacharydowe. Hialuronan tworzy duże agregaty z pewnymi proteoglikanami, jednak jest on wyjątkowy, gdyż wolne łańcuchy węglowodanowe tworzą niekowalencyjne kompleksy z proteoglikanami.
Zidentyfikowano wiele funkcji hialuronanu w organizmie (patrz Laurent T. C. i Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; oraz Toole B. P., 1991, „Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation” w: Cell Biology of the Extracellular Matrix, str. 305-341, Hay E. D., red., Plenum, New York). Hialuronan jest obecny w chrząstce szklistej, maziowym płynie stawowym oraz tkance skórnej, zarówno w skórze właściwej, jak i naskórku. Podejrzewa się także rolę hialuronanu w wielu funkcjach fizjologicznych, takich jak przyleganie, rozwój, ruchliwość komórek, rak, angiogeneza oraz gojenie ran. Ze względu na unikalne właściwości fizyczne i biologiczne hialuronanu, stosuje się go w chirurgii oka i stawu oraz ocenia w innych procedurach medycznych. Opracowano także produkty hialuronanu do zastosowania w ortopedii, reumatologu i dermatologii.
Grzebienie kogucie są istotnym źródłem handlowym hialuronanu. Mikroorganizmy są źródłem alternatywnym. W opisie patentowym US nr 4 801 539 ujawniono metodę fermentacyjną wytwarzania kwasu hialuronowego przy zastosowaniu szczepu Streptococcus zooepidemicus z odnotowaną wydajnością około 3,6 g kwasu hialuronowego na litr. W europejskim opisie patentowym nr EP 0 694 616 ujawniono procesy fermentacyjne z zastosowaniem ulepszonego szczepu Streptococcus zooepidemicus z odnotowaną wydajnością około 3,5 g kwasu hialuronowego na litr.
Mikroorganizmy stosowane do wytwarzania kwasu hialuronowego przez fermentację są szczepami bakterii patogennych, z których głównymi jest kilka szczepów Streptococcus spp. Paciorkowce grupy A i grupy C otaczają się nieantygenową kapsułką składającą się z hialuronanu, który jest identyczny pod względem składu do tego znajdywanego w tkance łącznej i stawach. Pasteurella multocida, inna patogenna otarbiająca się bakteria, także otacza swoje komórki hialuronanem.
Syntazy hialuronanu opisano u kręgowców, patogenów bakteryjnych oraz wirusów glonów (DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci., 56: 670-682). W WO 99/23227 ujawniono syntazę hialuronanu grupy I ze Streptoeoccus equisimilis. W WO 99/51265 i WO 00/27437 opisano syntazę hialuronanu grupy II ze Pasturella multocida. Ferretti i in. ujawnili operon syntazy hialuronanu ze Streptococcus pyogenes, który składa się z trzech genów, hasA, hasB i hasC, które kodują odpowiednio syntazę hialuronanu, dehydrogenazę UDP-glukozy oraz pirofosforylazę UDP-glukozy (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 4658-4663, 2001). W WO 99/51265 opisano segment kwasu nukleinowego zawierający region kodujący syntazę hialuronanu ze Streptococcus equisimilis.
Pałeczki są dobrze znanymi systemami komórek gospodarzy do wytwarzania natywnych i rekombinowanych białek. Celem wynalazku jest dostarczenie sposobów wytwarzania hialuronanu w rekombinowanej komórce gospodarzu Bacillus.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kwasu hialuronowego, w którym:
(i) hoduje się komórkę gospodarza Bacillus w warunkach odpowiednich do wytwarzania kwasu hialuronowego, która to komórka gospodarz Bacillus zawiera konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sztuczny operon zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą syntazę hialuronanu,
PL 212 928 B1 sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z sekwencją promotora obcą względem sekwencji kodującej syntazę hialuronanu, przy czym (a) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich;
(b) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich;
(c) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich; oraz (ii) odzyskuje się kwas hialuronowy z pożywki hodowlanej.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ll) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (li) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
PL 212 928 B1
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 12' SEQ ID NO: 41' SEQ 10 NO: 97 lub SEQ ID NO: 105' lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDPglukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105.
Korzystny jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDPglukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107.
Korzystny jest sposób, w którym sztuczny operon zawiera ponadto sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA zlokalizowaną w dół od sekwencji promotora i w górę od sekwencji kodującej syntazę hialuronanu.
PL 212 928 B1
Korzystny jest sposób, w którym sztuczny operon zawiera kwas nukleinowy kodujący syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy oraz sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z krótkim „konsensusowym” promotorem amyQ mającym sekwencję TTGACA dla regionu „-35” i TATAAT dla regionu „-10”.
Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza Bacillus zawierającej konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sztuczny operon zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z sekwencją promotora obcą względem sekwencji kodującej syntezę hialuronanu, przy czym (a) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego, hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich;
(b) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich;
(c) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ 10 NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75 o identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu sta nowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85-s identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
PL 212 928 B1
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca
6-dehydrogenazę UDP- glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą poIipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sePL 212 928 B1 kwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sztuczny operon zawiera ponadto sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA zlokalizowaną w dół od sekwencji promotora i w górę od sekwencji kodującej syntazę hialuronanu.
Korzystna jest komórka gospodarz Bacillus, w której sztuczny operon zawiera kwas nukleinowy kodujący syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy oraz sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z krótkim „konsensusowym” promotorem amyQ mającym sekwencję TTGACA dla regionu „-35” i TATAAT dla regionu „-10”.
W korzystnych postaciach, konstrukt kwasu nukleinowego zawiera ponadto jeden lub większą liczbę genów kodujących enzymy biosyntezy cukru będącego prekursorem dla kwasu hialuronowego lub komórka gospodarz Bacillus zawiera ponadto jeden lub większą liczbę dalszych konstruktów kwasu nukleinowego zawierających jeden lub większą liczbę genów kodujących enzymy biosyntezy cukru będącego prekursorem.
W innej korzystnej postaci, jeden lub większa liczba genów kodujących cukier będący prekursorem jest pod kontrolą tego samego (tych samych) lub innego (innych) promotora (ów) co sekwencja kodująca syntazę hialuronanu.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia strukturę chemiczną hialuronanu.
Figura 2 przedstawia szlak biosyntetyczny syntezy hialuronanu.
Figura 3 przedstawia mapę restrykcyjną pCR2.1-sehasA.
Figura 4 przedstawia mapę restrykcyjną pCR2.1-tuaD.
Figura 5 przedstawia mapę restrykcyjną pCR2.1-gtaB.
Figura 6 przedstawia mapę restrykcyjną pCR2.1-gcaD.
Figura 7 przedstawia mapę restrykcyjną pHA1.
Figura 8 przedstawia mapę restrykcyjną pHA2.
Figura 9 przedstawia mapę restrykcyjną pHA3.
Figura 10 przedstawia mapę restrykcyjną pHA4.
Figura 11 przedstawia mapę restrykcyjną pHA5.
Figura 12 przedstawia mapę restrykcyjną pHA6.
Figura 13 przedstawia mapę restrykcyjną pHA7.
Figura 14 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT106.
Figura 15 przedstawia mapę restrykcyjną pHA8.
Figura 16 przedstawia mapę restrykcyjną pHA9.
Figura 17 przedstawia mapę restrykcyjną pHA10.
Figura 18 przedstawia mapę restrykcyjną pRB157.
Figura 19 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT084.
Figura 20 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT086.
Figura 21 przedstawia mapę restrykcyjną pCJ791.
Figura 22 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT032.
Figura 23 przedstawia mapę restrykcyjną pNNB194neo.
Figura 24 przedstawia mapę restrykcyjną pNNB194neo-oriT.
Figura 25 przedstawia mapę restrykcyjną pShV3.
Figura 26 przedstawia mapę restrykcyjną pShV2.1-amyEΔB.
PL 212 928 B1
Figura 27 przedstawia mapę restrykcyjną pShV3A.
Figura 28 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT036.
Figura 29 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT037.
Figura 30 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT041.
Figura 31 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT064.1.
Figura 32 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT068.
Figura 33 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT069.
Figura 34 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT071.
Figura 35 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT074.
Figura 36 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT120.
Figura 37 przedstawia mapę restrykcyjną pMRT122.
Figura 38 przedstawia mapę restrykcyjną pCR2.l-pel5'.
Figura 39 przedstawia mapę restrykcyjną pCR2.l-pel3'.
Figura 40 przedstawia mapę restrykcyjną pRB161.
Figura 41 przedstawia mapę restrykcyjną pRB162.
Figura 42 przedstawia mapę restrykcyjną pRB156.
Figura 43 przedstawia mapę restrykcyjną pRB164.
Figura 44 przedstawia skrót fermentacji różnych szczepów Bacillus subtilis wytwarzających kwas hialuronowy przeprowadzonych przy fermentacji uzupełnianej - porcjowanej przy około 2 g sacharozy/L0-h, 37°C.
Figura 45 przedstawia skrót szczytowej wagowych średnich mas cząsteczkowych (MDa) kwasu hialuronowego uzyskanego z fermentacji różnych szczepów Bacillus subtilis wytwarzających kwas hialuronowy przeprowadzonych przy fermentacji uzupełnianej - porcjowanej przy około 2 g sacharozy/L0-h, 37°C.
Wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania hialuronanu, obejmujących:
(a) hodowanie komórki gospodarza Bacillus w warunkach odpowiednich do wytwarzania kwasu hialuronowego, przy czym komórka gospodarz Bacillus zawiera konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję kodującą syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z sekwencją promotora obcą względem sekwencji kodującej syntazę hialuronanu oraz (b) odzyskiwanie hialuronanu z pożywki hodowlanej.
Sposoby według wynalazku stanowią udoskonalenie względem wytwarzania hialuronanu z patogennych otarbiających się bakterii. U bakterii otarbiających się duża ilość hialuronanu jest wytwarzana w otoczce. Przy obróbce i oczyszczaniu hialuronanu z takich źródeł, najpierw konieczne jest usunięcie hialuronanu z otoczki, tak jak przez stosowanie środka powierzchniowo czynnego lub detergentu, takiego jak SDS. Powoduje to obecność etapu komplikującego handlowe wytwarzanie hialuronanu, gdyż środek powierzchniowo czynny musi być dodany w celu uwolnienia dużej części hialuronanu, a następnie środek powierzchniowo czynny musi zostać usunięty przed ostatecznym oczyszczeniem.
Wynalazek pozwala wytwarzać duże ilości hialuronanu, który jest wytwarzany w nie otarbiającej się komórce gospodarzu, jako wolnego hialuronanu. W obrazie mikroskopowym brak jest widocznych otoczek związanych z rekombinowanymi szczepami Bacillus, podczas gdy patogenne szczepy tradycyjnie stosowane do wytwarzania hialuronanu zawierają otoczkę hialuronanu, która wynosi co najmniej dwukrotność średnicy samej komórki.
Ponieważ hialuronan rekombinowanej komórki Bacillus jest eksprymowany bezpośrednio do pożywki hodowlanej, można zastosować prosty proces do wyizolowania hialuronanu z pożywki hodowlanej. Najpierw komórki Bacillus i szczątki komórek fizycznie usuwa się z pożywki hodowlanej. Pożywka hodowlana może zostać najpierw rozcieńczona, jeżeli jest to wymagane, aby zmniejszyć jej lepkość. Znawcom znanych jest wiele metod usuwania komórek z pożywki hodowlanej, takich jak wirowanie lub mikrofiltracja. Jeżeli jest to wymagane, pozostały supetrnatant można przefiltrować, tak jak przy zastosowaniu ultrafiltracji, w celu zagęszczenia i oddzielenia od hialuronanu niskocząsteczkowych zanieczyszczeń. Po usunięciu komórek i szczątków komórek, przeprowadza się proste wytrącanie hialuronanu z pożywki za pomocą znanych mechanizmów. Do wytrącenia hialuronanu z filtratu można zastosować sól, alkohol lub połączenie soli i alkoholu. Po ograniczeniu do osadu hialuronan można łatwo wyizolować z roztworu za pomocą środków fizycznych. Alternatywnie, hialuronan można
PL 212 928 B1 wysuszyć lub zagęścić z przefiltrowanego roztworu przez zastosowanie znanych w dziedzinie wynalazku metod odparowywania, takich jak suszenie rozpryskowe.
Zatem sposoby według wynalazku stanowią udoskonalenie względem istniejących technik handlowego wytwarzania hialuronanu przez fermentację, nie ma potrzeby stosowania środka powierzchniowo czynnego do oczyszczania hialuronanu z komórek w hodowli.
Kwas hialuronowy „Kwas hialuronowy” definiuje się tutaj jako niesiarczanowany glikozaminoglikan składający się z powtarzających się jednostek dwucukrowych N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) i kwasu glukuronowego (GlcUA) połączonych ze sobą przez występujące na przemian wiązania β-1,4 i β-1,3 glikozydowe (fig. 1). Kwas hialuronowy jest także znany jako hialuronan, hialuronian lub HA. Określenia hialuronan i kwas hialuronowy stosuje się tutaj wymiennie.
W korzystnej postaci, kwas hialuronowy uzyskany sposobami według wynalazku ma masę cząsteczkową około 10000 do około 10000000 Da. W korzystniejszej postaci, kwas hialuronowy uzyskany sposobami według wynalazku ma masę cząsteczkową około 25000 do około 5000000 Da. W najkorzystniejszej postaci, kwas hialuronowy uzyskany sposobami według wynalazku ma masę cząsteczkową około 50000 do około 3000000 Da.
Poziom kwasu hialuronowego wytwarzanego przez komórkę gospodarza Bacillus można określić za pomocą modyfikowanej metody karbazolowej (Bitter i Muir, 1962, Anal. Biochem. 4: 33 0-334). Ponadto, średnią masę cząsteczkową kwasu hialuronowego można określić znanymi metodami, takimi jak opisane w Ueno i in., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; oraz Wyatt Technologies, 1999, „Light Scattering University DAWN Course Manual” i „Dawn Eos Manual” Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Kalifornia.
Kwas hialuronowy uzyskany sposobami według wynalazku można modyfikować różnymi znanymi technikami stosowanymi do modyfikacji kwasu hialuronowego, takimi jak sieciowanie, jak opisano w opisach patentowych US nr 5 616 568, 5 652 347 i 5 874 417. Ponadto, masę cząsteczkową kwasu hialuronowego można zmienić znanymi technikami.
Komórki gospodarze
W sposobach według wynalazku komórką gospodarzem Bacillus może być jakakolwiek komórka Bacillus odpowiednia do rekombinacyjnego wytwarzania kwasu hialuronowego. Komórką gospodarzem Bacillus może być komórka Bacillus typu dzikiego lub jej mutant. Komórki Bacillus znajdujące zastosowanie do przeprowadzania wynalazku obejmują, ale nie tylko, komórki Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, BacilIus subtilis oraz Bacillus thuringiensis. Zmutowane komórki Bacillus subtilis w szczególności dostosowane do rekombinacyjnej ekspresji opisano w WO 98/22598. Nie otarbiające się komórki Bacillus są szczególnie użyteczne w wynalazku.
W korzystnej postaci, komórką gospodarzem Bacillus jest komórka Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophiIus lub Bacillus subtilis. W korzystniejszej postaci, komórką Bacillus jest komórka Bacillus amyloliquefaciens. W innej korzystniejszej postaci, komorką Bacillus jest komorka Bacillus clausii. W innej korzystniejszej postaci, komórką Bacillus jest komórka Bacillus lentus. W innej korzystniejszej postaci, komórką Bacillus jest komórka Bacillus licheniformis. W innej korzystniejszej postaci, komórką Bacillus jest komórka Bacillus subtilis. W najkorzystniejszej postaci, komórką Bacillus jest komórka Bacillus subtilis Α164Δ5 (patrz opis patentowy US nr 5 891 701) lub Bacillus subtilis 168Δ4.
Transformację komórek gospodarzy Bacillus konstruktem kwasu nukleinowego można np. przeprowadzić przez transformację protoplastu (patrz np. Chang i Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), przez zastosowanie komórek kompetentnych (patrz np. Young i Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 lub Dubnau i Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), przez elektroporację (patrz np. Shigekawa i Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) lub koniugację (patrz np. Koehler i Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278).
Konstrukty kwasu nukleinowego „Konstrukt kwasu nukleinowego” definiuje się tutaj jako cząsteczkę kwasu nukleinowego, jednolub dwuniciową, którą wyizolowano z naturalnie występującego genu lub, którą zmodyfikowano tak, by zawierała segmenty kwasu nukleinowego, które połączono i zestawiono w taki sposób, który inaczej nie występuje w naturze. Określenie konstrukt kwasu nukleinowego może być synonimem określenia
PL 212 928 B1 kaseta ekspresyjna, gdy konstrukt kwasu nukleinowego zawiera wszystkie sekwencje kontrolne wymagane do ekspresji sekwencji kodującej.
Określenie „sekwencja kodująca” definiuje się tutaj jako sekwencję, która jest transkrybowana do mRNA i ulega translacji do interesującego enzymu pod wpływem umieszczenia jej pod kontrolą wspomnianych powyżej sekwencji kontrolnych. Granice sekwencji kodującej są ogólnie wyznaczone przez miejsce wiązania rybosomu umiejscowione zaraz obok w górę od otwartej ramki odczytu na 5'-końcu mRNA oraz sekwencję terminacji transkrypcji umiejscowioną zaraz obok w dół od otwartej ramki odczytu na 3'-końcu mRNA. Sekwencja kodująca może zawierać, ale nie tylko, DNA, cDNA oraz zrekombinowane sekwencje kwasu nukleinowego.
Techniki stosowane do wyizolowania lub klonowania sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd są dobrze znane w dziedzinie wynalazku oraz obejmują one np. wyizolowanie genomowego DNA, przygotowanie z cDNA lub połączenie obu tych możliwości. Klonowanie sekwencji kwasu nukleinowego z takiego genomowego DNA można przeprowadzić np. przez zastosowanie przeszukiwania przeciwciałami bibliotek ekspresyjnych w celu wykrycia sklonowanych fragmentów DNA o wspólnych cechach strukturalnych lub dobrze znanej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), patrz np. Innis i in., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nowy Jork. Można zastosować inne procedury amplifikacji kwasu nukleinowego, takie jak reakcja łańcuchowa ligazy, transkrypcja aktywowana ligacją oraz amplifikacja oparta na sekwencji nukleotydowej. Procedury klonowania mogą obejmować wycięcie i wyizolowanie wymaganego fragmentu kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, wstawienie fragmentu do cząsteczki wektora i wprowadzenie zrekombinowanego wektora do komórki Bacillus, w której klony sekwencji kwasu nukleinowego zostaną zreplikowane. Sekwencja kwasu nukleinowego może być pochodzenia genomowego, cDNA, RNA, półsyntetycznego, syntetycznego lub może pochodzić z połączenia tych źródeł.
Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego kodująca enzym może zostać zmodyfikowana na wiele różnych sposobów tak, aby zapewnić ekspresję enzymu. Modyfikacja sekwencji kwasu nukleinowego przed jej wstawieniem do konstruktu lub wektora może być wymagana lub potrzebna zależnie od wektora ekspresyjnego lub komórki gospodarza Bacillus. Techniki modyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego wykorzystują dobrze znane metody klonowania. Należy rozumieć, że sekwencję kwasu nukleinowego można także zmodyfikować in vivo w komórce gospodarzu stosując dobrze znane metody.
Wiele enzymów uczestniczy w biosyntezie kwasu hialuronowego. Te enzymy obejmują syntazę hialuronanu, 6-dehydrogenazę UDP-glukozy, pirofosforylazę UDP-glukozy, pirofosforylazę UDP-N-acetyloglukozaminy, izomerazę glukozo-6-fosforanu, heksokinazę, fosfoglukomutazę, amidotransferazę, mutazę oraz acetylotransferazę. Syntaza hialuronanu jest kluczowym enzymem w wytwarzaniu kwasu hialuronowego.
„Syntazę hialuronanu” definiuje się tutaj jako syntazę, która katalizuje wydłużanie łańcucha hialuronanu przez dodawanie prekursorów cukrowych GlcUA i GlcNAc. Sekwencje aminokwasowe paciorkowcowych syntaz hialuronanu, syntaz hialuronanu kręgowców oraz wirusowej syntazy hialuronanu są odmienne od syntazy hialuronanu Pasteurella i zaproponowano klasyfikację na grupę I i grupę II syntaz hialuronanu, przy czym grupa I syntaz hialuronanu obejmuje syntazy hialuronanu paciorkowców (DeAngelis, 1999). Do wytwarzania hialuronanu w komórce gospodarzu Bacillus, syntazy hialuronanu pochodzenia eukariotycznego, takie jak ssacze syntazy hialuronanu, są mniej korzystne.
Sekwencją kodującą syntazę hialuronanu może być sekwencja kwasu nukleinowego, która może być eksprymowana w komórce gospodarzu Bacillus. Sekwencja kwasu nukleinowego może być jakiegokolwiek pochodzenia. Korzystne geny syntazy hialuronanu obejmują którekolwiek z grupy I lub grupy II, takie jak geny syntazy hialuronanu grupy I ze Streptococcus equisimilis, Streptoeoccus pyogenes, Streptoeoccus uberis oraz Streptoeoccus equi podgatunek zooepidemicus lub geny syntazy hialuronanu grupy II ze Pasturella multocida.
W korzystnej postaci sekwencja kodująca syntazę hialuronanu stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO:102; lub nić komplementarną do nich.
PL 212 928 B1
W korzystniejszej postaci, sekwencja kodująca syntazę hialuronanu koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub jego fragment o aktywności syntazy hialuronanu.
W innej korzystnej postaci, sekwencja kodująca syntazę hialuronanu stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 95; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 94; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, sekwencja kodująca syntazę hialuronanu koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 95 lub jej fragment o aktywności syntazy hialuronanu.
Sposoby według wynalazku także obejmują konstrukty, w których cukry będące prekursorami hialuronanu są dostarczane do komórki gospodarza, albo z pożywki hodowlanej albo przez to, że są kodowane przez endogenne geny, przez nie endogenne geny lub przez połączenie endogennych i nie endogennych genów w komórce gospodarzu Bacillus. Cukrem będącym prekursorem może być kwas D-glukuronowy lub N-acetyloglukozamina.
W sposobach według wynalazku, konstrukt kwasu nukleinowego może zawierać ponadto jeden lub większą liczbę genów kodujących enzymy biosyntezy cukru będącego prekursorem hialuronanu. Wytwarzanie hialuronanu jest ulepszone przez zastosowanie konstruktów o sekwencji kwasu nukleinowego lub sekwencji kodujących gen lub geny kierujące etapem szlaku syntezy cukru będącego prekursorem hialuronanu.
Przez określenie „kierujący etapem szlaku syntezy cukru będącego prekursorem hialuronanu” rozumie się, że eksprymowane białko genu jest aktywne w tworzeniu N-acetyloglukozaminy lub kwasu D-glukuronowego lub cukru, który jest prekursorem któregokolwiek z N-acetyloglukozaminy i kwasu D-glukuronowego (fig. 2).
W korzystnym sposobie dostarczania cukrów będących prekursorami, dostarcza się konstrukty do ulepszenia wytwarzania hialuronanu w komórce gospodarzu zawierającej syntazę hialuronanu, przez hodowanie komórki gospodarza zawierającej zrekombinowany konstrukt z heterologicznym regionem promotorowym funkcjonalnie sprzężonym z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą gen kierujący etapem szlaku syntezy cukru będącego prekursorem hialuronanu.
W korzystnym sposobie komórka gospodarz zawiera także zrekombinowany konstrukt zawierający region promotorowy funkcjonalnie sprzężony z syntazą hialuronanu, który może wykorzystywać ten sam lub inny region promotorowy niż sekwencja kwasu nukleinowego syntazy uczestniczącej w biosyntezie N-acetyloglukozaminy.
W dalszej korzystnej postaci, komórka gospodarz może zawierać zrekombinowany konstrukt z regionem promotorowym funkcjonalnie sprzężonym z innymi sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi drugi gen związany z syntezą cukru będącego prekursorem hialuronanu.
Tak więc, wynalazek także umożliwia stosowanie konstruktów do ulepszenia wytwarzania hialuronanu przez zastosowanie konstruktów z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą gen kierujący etapem w szlaku syntezy cukru będącego prekursorem hialuronanu. Sekwencja kwasu nukleinowego dla cukru będącego prekursorem może być eksprymowana z tego samego lub innego promotora co sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu.
Geny uczestniczące w biosyntezie cukrów będących prekursorami do wytwarzania kwasu hialuronowego obejmują gen 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, gen pirofosforylazy UDP-glukozy, gen pirofosforylaza UDP-N-acetyloglukozaminy, gen izomerazy glukozo-6-fosforanu, gen heksokinazy, gen fosfoglukomutazy, gen amidotransferazy, gen mutazy i gen acetylotranserazy.
W komórce zawierającej syntazę hialuronanu można eksprymować którykolwiek z, lub połączenie dwóch lub większej liczby z, hasB, hasC i hasD, lub ich homologów, takich jak odpowiednio tuaD, gtaB i gcaD Bacillus subtilis, a także hasE, w celu zwiększenia puli cukrów będących prekursorami dostępnych dla syntazy hialuronanu. Genom Bacillus opisano w Kunst i in., Nature 390, 249-256, „The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis” (20 listopad 1997).
Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca enzymy biosyntetyczne może być natywna dla komórki gospodarza, podczas gdy w pewnych przypadkach można zastosować sekwencję heterologiczną. Gdy eksprymowane są dwa lub większa liczba genów mogą być one genami, które są związane ze sobą w natywnym operonie, tak jak geny operonu HAS Streptococcus equisimilis, który zawiera hasA, hasB, hasC i hasD. W innych przypadkach, może być wymagane zastosowanie pewnego
PL 212 928 B1 połączenia sekwencji genów prekursorów, bez włączenia każdego elementu operonu. Zastosowanie pewnych genów natywnych dla komórki gospodarza oraz innych, które są egzogenne, może być także korzystne w innych przypadkach. Wybór będzie zależeć od dostępnej puli cukrów w danej komórce gospodarzu, zdolności komórki do dostosowania się do nadprodukcji bez zaburzenia innych funkcji komórki gospodarza oraz od tego czy komórka reguluje ekspresję ze swoich genów natywnych inaczej niż z genów egzogennych.
Przykładowo, zależnie od wymagań metabolicznych oraz warunków wzrostowych komórki oraz dostępnej puli cukru będącego prekursorem, wymagane może być podwyższenie wytwarzania N-acetyloglukozaminy przez eksprymowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej pirofosforylazę UDP-N-acetyloglukozaminy, takiej jak gen hasD, gen gcaD Bacillus oraz ich homologi. Alternatywnie, cukrem będącym prekursorem może być kwas D-glukuronowy. W jednej takiej postaci, sekwencja kwasu nukleinowego koduje 6-dehydrogenazę UDP-glukozy. Takie sekwencje kwasu nukleinowego obejmują gen tuaD Bacillus, gen hasB Streptococcus oraz ich homologi. Sekwencja kwasu nukleinowego może także kodować pirofosforylazę UDP-glukozy, taką jak gen gtaB Bacillus, gen hasC Streptococcus oraz ich homologi.
W sposobach według wynalazku genem 6-dehydrogenazy UDP-glukozy może być gen hasB lub tuaD lub ich homologi.
W korzystnej postaci, gen hasB stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; lub nić komplementarną do nich.
W korzystniejszej postaci, gen hasB koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105 lub jego fragment o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy.
W innej korzystnej postaci, gen tuaD stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 12; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, gen tuaD koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 12 lub jego fragment o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy.
W sposobach według wynalazku, genem pirofosforylazy UDP-glukozy może być gen hasC lub gen gtaB, lub ich homologi.
W korzystnej postaci, gen hasC stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identytyczności z SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, gen hasC koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107 lub jego fragment o aktywności pirofosforylazy UDP-glukozy.
W innej korzystnej postaci, gen gtaB stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 22; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, gen gtaB koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 22 lub jego fragment o aktywności pirofosforylazy UDP-glukozy.
W sposobach według wynalazku genem pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy może być gen hasD lub gen gcaD, lub ich homologi.
W korzystnej postaci, gen hasD stanowi:
PL 212 928 B1 (a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 45; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 44; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, gen hasD koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 45 lub jego fragment o aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy.
W innej korzystnej postaci, gen gcaD stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 30; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 29; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, gen gcaD koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 30 lub jego fragment o aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy.
W sposobach według wynalazku, genem izomerazy glukozo-6-fosforanu może być hasE lub jego homolog.
W korzystnej postaci, gen hasE stanowi:
(a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej około 70%, około 75%, około 80%, około 85%, około 90% lub około 95% identyczności z SEQ ID NO: 101; lub (b) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach z SEQ ID NO: 100; lub nić komplementarną do nich.
W innej korzystniejszej postaci, gen hasE koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 101 lub jego fragment o aktywności izomerazy glukozo-6-fosforanu.
W sposobach według wynalazku gen syntazy hialuronanu oraz jeden lub większa liczba genów kodujących cukier będący prekursorem są pod kontrolą tego samego promotora. Alternatywnie, jeden lub większa liczba genów kodujących cukier będący prekursorem jest pod kontrolą tego samego promotora, ale inny promotor kieruje genem syntazy hialuronanu. Inną możliwością jest, że gen syntazy hialuronanu oraz każdy z genów kodujących cukier będący prekursorem są pod kontrolą różnych promotorów. W korzystnej postaci, gen syntazy hialuronanu oraz jeden lub większa liczba genów kodujących cukier będący prekursorem są pod kontrolą tego samego promotora.
Wynalazek także umożliwia stosowanie konstruktu kwasu nukleinowego zawierającego wyizolowaną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą operon syntazy hialuronanu zawierający gen syntazy hialuronanu oraz gen 6-dehydrogenazy UDP-glukozy oraz dodatkowo jeden lub większą liczbę genów wybranych z grupy obejmującej gen pirofosforylazy UDP-glukozy, gen pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy oraz gen izomerazy glukozo-6-fosforanu.
Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca większość operonu syntazy hialuronanu Streptococcus equisimilis znajduje się w SEQ ID NO: 108.
Sekwencja ta zawiera homologi hasB (SEQ ID NO: 40) oraz hasC (SEQ ID NO: 42) odpowiednio genu tuaD (SEQ ID NO: 11) i genu gtaB (SEQ ID NO: 21) Bacillus subtilis, tak jak w przypadku Streptococcus pyogenes, a także homolog genu gcaD (SEQ ID NO: 29), który nazwano hasD (SEQ ID NO: 44). Bacillus subtilis gcaD koduje pirofosforylazę UDP-N-acetyloglukozaminy, która uczestniczy w syntezie N-acetyloglukozaminy, jednego z dwóch cukrów hialuronanu. Homolog gcaD Streptococcus equisimilis, hasD, jest umieszczony u Streptoeoccus equisimilis w operonie syntazy hialuronanu. Sekwencja kwasu nukleinowego także zawiera cześć genu hasA (ostatnie 1156 pz SEQ ID NO: 1).
W niektórych przypadkach komórka gospodarz będzie zawierać rekombinowany konstrukt z heterologicznym regionem promotorowym funkcjonalnie sprzężonym z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą gen kierujący etapem szlaku syntezy cukru będącego prekursorem hialuronanu, który może być wspólny z ekspresją syntazy hialuronanu z rekombinowanego konstruktu.
Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca enzymy uczestniczące w biosyntezie cukru(ów) będącego(ych) prekursorem(ami) jest eksprymowana z tego samego promotora, co sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu. W poprzednim znaczeniu, konstruuje się „sztuczne operony”, które mogą naśladować operon Streptococcus equisimilis w posiadaniu każdego z hasA, hasB, hasC i hasD lub ich homologów, lub, alternatywnie, mogą wykorzystywać mniej niż pełen zestaw obecny w operonie Streptoeoccus equisimilis. „Sztuczne operony” mogą także zawierać gen izomera14
PL 212 928 B1 zy glukozo-6-fosforanu (hasE), a także jeden lub większą liczbę genów wybranych z grupy obejmującej gen heksokinazy, gen fosfoglukomutazy, gen amidotransferazy, gen mutazy oraz gen acetylotransferazy. W sztucznym operonie, co najmniej jeden z elementów jest heterologiczny względem innych elementów, takich jak region promotorowy heterologiczny względem kodowanych sekwencji.
W korzystnej postaci, konstrukt kwasu nukleinowego zawiera hasA, tuaD i gtaB. W innej korzystnej postaci, konstrukt kwasu nukleinowego zawiera hasA i tuaD. W innej korzystnej postaci, konstrukt kwasu nukleinowego zawiera hasA. W oparciu o powyższe korzystne postaci wymienione geny można zastąpić ich homologami.
W sposobach według wynalazku konstrukty kwasu nukleinowego zawierają sekwencje kodującą syntazę hialuronanu funkcjonalnie sprzężoną z sekwencją promotorową obcą względem sekwencji kodującej syntazę hialuronanu. Sekwencją promotorową może być np. pojedynczy promotor lub tandemowy promotor.
„Promotor” jest zdefiniowany tutaj jako sekwencja kwasu nukleinowego uczestnicząca w wiązaniu polimerazy RNA z inicjacją transkrypcji genu. „Promotor tandemowy” definiuje się tutaj jako dwie lub większą liczbę sekwencji promotorowych, z których każda jest funkcjonalnie sprzężona z sekwencją kodującą i pośredniczy w transkrypcji sekwencji kodującej na mRNA. „Funkcjonalnie sprzężony” definiuje się tutaj jako konfigurację, w której sekwencja kontrolna np. sekwencja promotorowa jest prawidłowo umiejscowiona w pozycji względem sekwencji kodującej, tak że sekwencja kontrolna kieruje wytwarzaniem polipeptydu kodowanego przez sekwencję kodującą. Jak wskazano powyżej, „sekwencja kodująca” jest zdefiniowana tutaj jako sekwencja kwasu nukleinowego, która jest transkrybowana na mRNA i ulega translacji do polipeptydu, gdy jest umiejscowiona pod kontrolą odpowiednich sekwencji kontrolnych. Granice sekwencji kodującej są ogólnie wyznaczone przez miejsce wiązania rybosomu umiejscowione zaraz obok w górę od otwartej ramki odczytu na 5'-końcu mRNA oraz sekwencję terminacji transkrypcji umiejscowioną zaraz obok w dół od otwartej ramki odczytu na 3'-końcu mRNA. Sekwencja kodująca może zawierać, ale nie tylko, genomowy DNA, cDNA, półsyntetyczne, syntetyczne i rekombinowane sekwencje kwasu nukleinowego.
W korzystnej postaci, sekwencje promotorowe można uzyskać ze źródła bakteryjnego. W korzystniejszej postaci, sekwencje promotorowe mogą być uzyskane z bakterii Gram dodatniej, takiej jak szczep Bacillus np. Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis lub Bacillus thuringiensis lub szczep Streptomyces, np. Streptomyces Iividans lub Streptomyces murinus; lub z bakterii Gram ujemnej, np. E. coli lub Pseudomonas sp.
Przykładami odpowiednich promotorów do kierowania transkrypcją sekwencji kwasu nukleinowego w sposobach według wynalazku są promotory uzyskane z operonu lac E. coli, genu agarazy (dagA) Streptomyces coelicolor, genu proteazy zasadowej (aprH) Bacillus lentus lub Bacillus clausii, genu proteazy zasadowej (gen subtilizyny Carlsberg) Bacillus licheniformis, genu e-2,6-fruktozylotransferazy (sacB) Bacillus subtilis, genu α-amylazy (amyE) Bacillus subtilis, genu α-amylazy (amyL) Bacillus licheniformis, genu amylazy maltogennej (amyM) Bacillus stearothermophilus, genu α-amylazy (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, genu penicylinazy (penP) Bacillus licheniformis, genów xylA i xylB Bacillus subtilis, genu Cry-IIIA (crylllA) Bacillus thuringiensis podgatunek tenebrionis oraz jego części, prokariotycznego genu β-laktamazy (Villa-Kamaroff i in., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731). Innymi przykładami są promotor spo1 bakteryjnego promotora fagowego oraz promotor tac (DeBoer i in., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Dalsze promotory opisano w „Useful proteins from recombinant bacteria” w Scientific American, 1980, 242: 74-94; oraz w Sambrook, Fritsch i Maniatus, 1989, MolecuIar Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor, New York.
Promotorem może być także „konsensusowy” promotor mający sekwencję TTGACA dla regionu „-35” oraz TATAAT dla regionu „-10”. Konsensusowy promotor można uzyskać z jakiegokolwiek promotora, który może działać w komórce gospodarzu Bacillus. Skonstruowanie „konsensusowego” promotora można wykonać przez ukierunkowaną mutagenezę do wytworzenia promotora, który jest lepiej dopasowany do ustalonych regionów „-10” i „-35 wegetatywnych promotorów „typu sigma A” dla Bacillus subtilis (Voskuil i in., 1995, Molecular Microbiology 17: 271-279).
W korzystnej postaci „konsensusowy” promotor uzyskuje się z promotora uzyskanego z operonu Iae E. coli, genu agarazy (dagA) Streptomyces coelicolor, genu proteazy zasadowej (aprH) Bacillus clausii lub Bacillus lentus, genu proteazy zasadowej (gen subtilizyny Carlsberg) Bacillus licheniformis,
PL 212 928 B1 genu e-2,6-fruktozylotransferazy (sacB) Bacillus subtilis, genu α-amylazy (amyE) Bacillus subtilis, genu α-amylazy (amyL) Bacillus licheniformis, genu amylazy maltogennej (amyM) Bacillus stearothermophilus, genu α-amylazy (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, genu penicylinazy (penP) Bacillus licheniformis, genów xylA i xylB Bacillus subtilis, genu Cry-IIIA (crylllA) Bacillus thuringiensis podgatunek tenebrionis oraz jego części lub prokariotycznego genu β-laktamazy spo1 bakteryjnego promotora fagowego. W korzystniejszej postaci „konsensusowy” promotor uzyskuje się z genu α-amylazy (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens.
Widner i in., opisy patentowe US nr 6 255 076 i 5 955 310, opisali tandemowe promotory i konstrukty oraz sposoby ich stosowania w ekspresji w komórkach Bacillus, włącznie z krótkim promotorem amyQ (nazywanym także scBAN). Opisano tam także zastosowanie sekwencji stabilizatora crylllA oraz konstruktów z wykorzystaniem tej sekwencji, do ulepszonego wytwarzania w Bacillus.
Każda sekwencja promotorowa tandemowego promotora może być jakąkolwiek sekwencją kwasu nukleinowego, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce Bacillus, włącznie ze zmutowanym, skróconym oraz hybrydowym promotorem i można ją uzyskać z genów kodujących zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe polipeptydy homologiczne lub heterologiczne dla komórki Bacillus. Każda sekwencja promotorowa może być natywna lub obca względem sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd oraz natywna lub obca względem komórki Bacillus. Sekwencje promotorowe mogą być tymi samymi lub różnymi sekwencjami promotorowymi.
Dwie lub większa liczba sekwencji promotorowych w promotorze tandemowym może równocześnie wywoływać transkrypcję sekwencji kwasu nukleinowego. Alternatywnie, jedna lub większa liczba sekwencji promotorowych promotora tandemowego może wywoływać transkrypcję sekwencji kwasu nukleinowego w różnych stadiach wzrostu komórki Bacillus.
W korzystnej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej promotor amyQ genu α-amylazy Bacillus amyloliquefaciens. W innej korzystnej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej promotor „konsensusowy” zawierający sekwencję TTGACA dla regionu „-35” oraz TATAAT dla regionu „-10”. W innej korzystnej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej promotor amyL genu α-amylazy Bacillus licheniformis. W innej korzystnej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej promotor crylllA lub jego części (Agaisse i Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107).
W korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej promotor amyL i promotor cryIIIA. W innej korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej promotor amyQ oraz promotor cryIIIA. W innej korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej „konsensusowy” promotor zawierający sekwencję TTGACA dla regionu „-35” oraz TATAAT dla regionu „-10” oraz promotor cryIIIA. W innej korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej dwie kopie promotora amyL. W innej korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej dwie kopie promotora amyQ. W innej korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej dwie kopie promotora „konsensusowego” zawierającego sekwencję TTGACA dla regionu „-35” oraz TATAAT dla regionu „-10”. W innej korzystniejszej postaci, promotor tandemowy zawiera co najmniej dwie kopie promotora cryIIIA.
„Sekwencja obróbki/stabilizacji mRNA” jest zdefiniowana tutaj jako sekwencja umiejscowiona w dół od jednej lub większej liczby sekwencji promotorowych oraz w górę od sekwencji kodującej z którą każda z jednej lub większej liczby sekwencji promotorowych jest funkcjonalnie sprzężona tak, że wszystkie mRNA syntetyzowane z każdej sekwencji promotorowej mogą ulegać obróbce z wytworzeniem transkryptów mRNA z sekwencją stabilizatora na 5'-końcu transkryptów. Obecność takiej sekwencji stabilizatora na 5'-końcu transkryptów mRNA wydłuża ich okres półtrwania (Agaisse i Lereclus, 1994, jak wyżej, Hue i in., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471). Sekwencja obróbki/stabilizacji mRNA jest komplementarna do 3' końca bakteryjnego RNA rybosomalnego 16S. W korzystnej postaci, sekwencja obróbki/stabilizacji mRNA wytwarza zasadniczo transkrypty o jednym rozmiarze ze stabilizującą sekwencją na 5'-końcu transkryptów. Sekwencją obróbki/stabilizacji mRNA, jest korzystnie taka, która jest komplementarna do 3' końca bakteryjnego RNA rybosomalnego 16S, patrz opisy patentowe US nr 6 255 076 i 5 955 310.
W korzystniejszej postaci, sekwencją obróbki/stabilizacji mRNA jest sekwencja obróbki/stabilizacji mRNA cryIIIA Bacillus thuringiensis ujawniona w WO 94/25612 oraz Agaisse i Lereclus, 1994, jak wyżej lub jej części, które zachowują funkcję obróbki/stabilizacji mRNA. W innej korzystniejszej postaci, sekwencją obróbki/stabilizacji mRNA jest sekwencja obróbki/stabilizacji mRNA SP82 Bacillus subtilis ujawniona w Hue i in., 1995, jak wyżej lub jej części, które zachowują funkcję obróbki/stabilizacji mRNA.
PL 212 928 B1
Gdy w sposobach według wynalazku stosuje się promotor cryIIIA i sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA, można zastosować fragment DNA zawierający sekwencję ujawnioną w WO 94/25612 oraz Agaisse i Lereclus, 1994, jak wyżej, lub jej części, które zachowują funkcję obróbki/stabilizacji mRNA. Ponadto, fragmenty DNA zawierające tylko promotor cryIIIA lub tylko sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA cryIIIIA można przygotować stosując metody dobrze znane w dziedzinie wynalazku do skonstruowania różnych połączeń tandemowego promotora i sekwencji obróbki/stabilizacji mRNA. W tej postaci, promotor cryIIIA i jego sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA korzystnie umieszcza się w dół od innej (ych) sekwencji promotorowej (ych) stanowiącej (ych) promotor tandemowy oraz w górę od sekwencji kodującej interesującego genu.
Izolowaną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wymagany (e) enzym (y) uczestniczący (e) w wytwarzaniu kwasu hialuronowego można dalej modyfikować tak by ulepszyć ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego. Ekspresję należy rozumieć jako obejmującą jakikolwiek etap związany z wytwarzaniem polipeptydu, włącznie z, ale nie tylko, transkrypcją, modyfikacją posttranskrypcyjną, translacją, modyfikacją posttranslacyjną oraz wydzielaniem. Techniki modyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego wykorzystujące metody klonowania są dobrze znane w dziedzinie wynalazku.
Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym może być funkcjonalnie sprzężony z jedną lub większą liczbą sekwencji kontrolnych zdolnych do kierowania ekspresją sekwencji kodującej w komórce Bacillus w warunkach zgodnych z sekwencjami kontrolnymi.
Określenie „sekwencje kontrolne” definiuje się tutaj jako obejmujące wszystkie składniki, które są potrzebne lub korzystne do ekspresji sekwencji kodującej sekwencji kwasu nukleinowego. Każda sekwencja kontrolna może być natywna lub obca względem sekwencji kwasu nukleinowego kodującej enzym. Dodatkowo oprócz sekwencji promotorowych opisanych powyżej, takie sekwencje kontrolne obejmują, ale nie tylko, sekwencję liderową, sekwencję sygnałową oraz terminator transkrypcji. Minimalnie sekwencje kontrolne obejmują promotor oraz sygnały stop transkrypcji i translacji. Sekwencje kontrolne mogą być dostarczone z łącznikami w celu wprowadzenia specyficznych miejsc restrykcyjnych służących do ligacji sekwencji kontrolnych z regionem kodującym sekwencji kwasu nukleinowego kodującej enzym.
Sekwencją kontrolną może także być odpowiednia sekwencja terminacji transkrypcji, sekwencja rozpoznawana przez komórkę Bacillus do zakończenia transkrypcji. Sekwencja terminatora jest funkcjonalnie sprzężona z 3'-końcem sekwencji kwasu nukleinowego kodującej enzym lub ostatni enzym operonu. W wynalazku można zastosować jakikolwiek terminator, który jest funkcjonalny w wybranej komórce Bacillus.
Sekwencją kontrolną może także być odpowiednia sekwencja liderowa, nie ulegający translacji region mRNA, który jest istotny dla translacji przez komórkę Bacillus. Sekwencja liderowa jest funkcjonalnie sprzężona z 5'-końcem sekwencji kwasu nukleinowego kodującej enzym. W wynalazku można zastosować jakąkolwiek sekwencję liderową, która jest funkcjonalna w wybranej komórce Bacillus.
Sekwencją kontrolną może być także region kodujący peptyd sygnałowy, który koduje sekwencję aminowkasową sprzężoną z N-końcem polipeptydu, która może skierować eksprymowany polipeptyd na szlak wydzielniczy komórki. Region kodujący peptyd sygnałowy może być natywny dla polipeptydu lub może być uzyskany z obcego źródła. 5'-koniec sekwencji kodującej sekwencji kwasu nukleinowego może sam z siebie zawierać region kodujący peptyd sygnałowy naturalnie łączony w ramce odczytu translacji z segmentem regionu kodującego, który koduje wydzielany polipeptyd. Alternatywnie, 5'-koniec sekwencji kodującej może zawierać region kodujący peptyd sygnałowy, który jest obcy dla tej części sekwencji kodującej, które koduje wydzielany polipeptyd. Obcy region kodujący peptyd sygnałowy może być wymagany, gdy sekwencja kodująca normalnie nie zawiera regionu kodującego peptyd sygnałowy. Alternatywnie, obcy region kodujący peptyd sygnałowy może prosto zastąpić naturalny region kodujący peptyd sygnałowy w celu uzyskania zwiększonego wydzielania polipeptydu względem naturalnego regionu kodującego peptyd sygnałowy normalnie związany z sekwencją kodującą. Region kodujący peptyd sygnałowy można uzyskać z genu amylazy lub proteazy z gatunków Bacillus. Jednakże, jakikolwiek region kodujący peptyd sygnałowy zdolny do kierowania eksprymowanego polipeptydu na szlak wydzielniczy wybranej komórki Bacillus można zastosować w wynalazku.
Skutecznym regionem kodującym peptyd sygnałowy dla komórek Bacillus jest region kodujący peptyd sygnałowy z genu amylazy maltogennej Bacillus NCIB 11837, genu α-amylazy Bacillus stearothermophilus, genu subtilizyny Bacillus licheniformis, genu β-laktamazy Bacillus licheniformis, gePL 212 928 B1 nów proteaz obojętnych (nprT, nprS, nprM) Bacillus stearothermophilus oraz genu prsA Bacillus subtilis. Dalsze peptydy sygnałowe opisano w Simonen i Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Sekwencją kontrolną może być także region kodujący propeptyd, który koduje sekwencję aminokwasową umiejscowioną na N-końcu polipeptydu. Powstały polipeptyd jest znany jako proenzym lub propolipeptyd (lub zymogen w niektórych przypadkach). Propolipeptyd jest ogólnie nieaktywny i może być przekształcony do dojrzałego aktywnego polipeptydu przez katalityczne lub autokatalityczne odszczepienie propeptydu od propolipeptydu. Region kodujący propeptyd można uzyskać z genów proteazy zasadowej (aprE) Bacillus subtilis oraz proteazy obojętnej (nprT) Bacillus subtilis.
Gdy na N-końcu polipeptydu obecne są regiony zarówno peptydu sygnałowego, jak i propeptydu, region propeptydu jest umiejscowiony zaraz za N-końcem polipeptydu, a region peptydu sygnałowego jest umiejscowiony obok N-końca regionu propeptydu.
Wymagane może być także dodanie sekwencji regulatorowych, które umożliwiają regulację ekspresji polipeptydu względem wzrostu komórki gospodarza. Przykładami układów regulatorowych, są te, które powodują włączenie lub wyłączenie ekspresji genu w odpowiedzi na bodziec chemiczny lub fizyczny, włącznie z obecnością związku regulatorowego. Układy regulatorowe w systemach prokariotycznych obejmują układy operatorów Iac, tac i trp.
Wektory ekspresyjne
W sposobach według wynalazku, do rekombinacyjnego wytwarzania enzymu związanego z wytwarzaniem kwasu hialuronowego można zastosować rekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, promotor oraz sygnały stop transkrypcji i translacji. Różne opisane powyżej sekwencje kwasu nukleinowego oraz kontrolne można połączyć ze sobą z wytworzeniem rekombinowanego wektora ekspresyjnego, który może zawierać jedno lub większą liczbę dogodnych miejsc restrykcyjnych umożliwiających wstawienie lub podstawienie w takich miejscach sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd lub enzym. Alternatywnie, sekwencja kwasu nukleinowego może być eksprymowana przez wstawienie sekwencji kwasu nukleinowego lub konstruktu kwasu nukleinowego zawierającego tę sekwencję do odpowiedniego wektora do ekspresji. Przy tworzeniu wektora ekspresyjnego, sekwencje kodująca umiejscawia się w wektorze tak, aby sekwencja kodująca była funkcjonalnie sprzężona z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi do ekspresji oraz możliwie wydzielania.
Rekombinowanym wektorem ekspresyjnym może być jakikolwiek wektor, który można dogodnie poddać procedurom rekombinacji DNA i doprowadzić do ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego. Wybór wektora będzie zazwyczaj zależeć od zgodności wektora z komórką Bacillus, do której wektor ma być wprowadzony. Wektory mogą być liniowymi lub zamkniętymi kulistymi plazmidami. Wektor może być wektorem replikującym się autonomicznie, tj. wektorem występującym jako jednostka zewnątrz chromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomu np. plazmidu, elementem zewnątrz chromosomalnym, minichromosomem lub sztucznym chromosomem. Wektor może zawierać jakiekolwiek elementy umożliwiające autoreplikację. Alternatywnie, wektor może być takim wektorem, który po wprowadzeniu do komórki Bacillus jest integrowany do genomu i replikuje się razem z chromosomem (ami) do którego (ych) został wintegrowany. System wektorowy może być pojedynczym wektorem lub plazmidem lub można zastosować dwa lub większą liczbę wektorów lub plazmidów, które razem zawierają całkowity DNA, który ma być wprowadzony komórki Bacillus lub można zastosować transpozon.
Wektory korzystnie zawierają element (y), który (e) umożIiwia(ją) integrację wektora do genomu komórki gospodarza Bacillus lub autonomicznej replikacji wektora w komórce niezależnie od genomu.
Dla integracji do genomu komórki gospodarza, wektor może być oparty na sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd lub jakimkolwiek innym elemencie wektora służący do integracji wektora do genomu przez rekombinację homologiczną lub niehomologiczną. Alternatywnie, wektor może zawierać dodatkowe sekwencje kwasu nukleinowego do skierowania integracji przez homologiczną rekombinację do genomu komórki Bacillus. Dodatkowe sekwencje kwasu nukleinowego umożliwiają integrację wektora do genomu komórki Bacillus w precyzyjnej lokalizacji w chromosomie. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo integracji w precyzyjnym miejscu, elementy integracyjne powinny korzystnie zawierać wystarczającą liczbę kwasów nukleinowych, tak jak 100 do 1500 par zasad, korzystnie 400 do 1500 par zasad, a najkorzystniej 800 do 1500 par zasad, które są wysoce homologiczne do odpowiadającej im sekwencji docelowej, aby zwiększyć prawdopodobieństwo rekombinacji homologicznej. Elementy integracyjne mogą być jakąkolwiek sekwencją, która jest homologiczna do sekwencji docelowej w genomie komórki Bacillus. Ponadto, elementy integracyjne mogą być nie kodującymi
PL 212 928 B1 lub kodującymi sekwencjami kwasu nukleinowego. Z drugiej strony, wektor może być wintegrowany do genomu komórki gospodarza przez nie homologiczną rekombinację.
Do autonomicznej replikacji wektor może zawierać ponadto miejsce startu replikacji umożliwiające autonomiczną replikację wektora w danej komórce Bacillus. Przykładami bakteryjnych miejsc startu replikacji są miejsca startu replikacji plazmidów pUB110, pE194, pTA1060 i ρΑΜβ1 umożliwiające replikację w Bacillus. Miejscem startu replikacji może być miejsce zawierające mutację, która sprawia, że jego działanie jest temperaturo-wrażliwe w komórce Bacillus (patrz np. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Wektory korzystnie zawierają jeden lub większą liczbę markerów selekcji, które umożliwiają łatwą selekcję transformowanych komórek. Markerem selekcji jest gen, którego produkt dostarcza oporność na biocyd, oporność na metale ciężkie, prototrofię auksotrofom itp. Przykładami bakteryjnych markerów selekcji są geny dal z Bacillus subtilis lub Bacillus licheniformis lub markery, które nadają oporność antybiotykową, taka jak oporność na ampicylinę, kanamycynę, chloramfenikol lub tetracyklinę. Ponadto, selekcję można przeprowadzić przez kotransformację np. jak opisano w WO 91/09129, gdzie marker selekcji jest na osobnym wektorze.
Więcej niż jedną kopię sekwencji kwasu nukleinowego można wstawić do komórki gospodarza w celu zwiększenia wytwarzania produktu genu. Zwiększenie liczby kopii sekwencji kwasu nukleinowego można uzyskać przez integrację co najmniej jednej dodatkowej kopii sekwencji do genomu komórki gospodarza lub przez dołączenie do sekwencji kwasu nukleinowego amplifikowalnego genu markera selekcyjnego, gdzie komórki zawierające zamplifikowane kopie genu markera selekcyjnego, a co za tym idzie dodatkowe kopie sekwencji kwasu nukleinowego, mogą zostać wyselekcjonowane przez hodowanie komórek w obecności odpowiedniego czynnika selekcyjnego. Dogodną metodę uzyskania amplifikacji sekwencji genomowego DNA opisano w WO 94/14968.
Procedury stosowane do ligowania elementów opisanych powyżej do skonstruowania rekombinowanych wektorów ekspresyjnych są dobrze znane znawcom (patrz np. Sambrook i in., 1989, jak wyżej).
Wytwarzanie
W sposobach według wynalazku komórki Bacillus hoduje się w pożywce odżywczej odpowiedniej do wytwarzania kwasu hialuronowego stosując znane metody. Przykładowo, komórkę może hodować w hodowli w kolbie z wytrząsaniem, fermentacji albo na małą skalę lub na dużą skalę (włącznie z fermentacjami ciągłymi, porcjowanymi, uzupełnianymi - porcjowanymi lub w stanie stałym) w laboratorium lub przemysłowych fermentorach, w odpowiedniej pożywce i w warunkach pozwalających na ekspresję enzymów uczestniczących w syntezie kwasu hialuronowego oraz wyizolowanie kwasu hialuronowego. Hodowla jest prowadzona w odpowiedniej pożywce odżywczej zawierającej źródła węgla i azotu oraz sole nieorganiczne, przy zastosowaniu znanych procedur. Odpowiednie pożywki są dostępne od handlowych dostawców lub mogą zostać przygotowane według opublikowanych składów (np. w katalogach American Type Culture Collection). Wydzielany kwas hialuronowy można odzyskiwać z pożywki.
Powstały kwas hialuronowy można wyizolować znanymi sposobami. Przykładowo kwas hialuronowy można wyizolować z pożywki odżywczej znanymi sposobami włącznie z, ale nie tylko, wirowaniem, filtracją, ekstrakcją, suszeniem rozpryskowym, odparowywaniem lub wytrąceniem. Wyizolowany kwas hialuronowy może być następnie dalej oczyszczany wieloma znanymi metodami włącznie z, ale nie tylko, chromatografią (np. jonowymienną, powinowactwa, hydrofobową, chromatoogniskowaniem i chromatografią z wykluczeniem wielkości), procedurami elektroforetycznymi (np. preparatywne izoelektroogniskowanie), na podstawie różnic w rozpuszczalności (np. wytrącenie siarczanem amonu), SDS-PAGE lub ekstrakcją (patrz np. Protein Purification, J. -C. Janson i Lars Ryden, red., VCH Publishers, New York, 1989).
W sposobach według wynalazku komórki Bacillus wytwarzają więcej niż około 4 g, korzystnie więcej niż około 6 g, korzystnie więcej niż około 8 g, korzystniej więcej niż około 10 g, a najkorzystniej więcej niż około 12 g kwasu hialuronowego na litr.
Delecje/dysrupcje
Delecję genu lub podobne techniki można zastosować do całkowitego usunięcia markera selekcyjnego lub innego niepożądanego genu. W takich metodach, delecje genu markera selekcyjnego można przeprowadzić przez rekombinację homologiczną stosując plazmid, który został skonstruowany tak, aby w sposób ciągły zawierał 5' i 3' regiony flankujące genu markera selekcyjnego. Ciągłe 5' i 3' regiony można wprowadzić do komórki Bacillus na plazmidzie temperaturo-wrażliwym np. pE194,
PL 212 928 B1 w towarzystwie drugiego markera selekcyjnego pozwalającego na przyjęcie się plazmidu w komórce w temperaturze permisywnej. Następnie, komórkę przenosi się do temperatury nie permisywnej, aby wyselekcjonować komórki, które mają plazmid wintegrowany do chromosomu w jednym z homologicznych regionów flankujących. Selekcję na integrację plazmidu przeprowadza się przez selekcję na drugi marker selekcyjny. Po integracji, zajście rekombinacji w drugim homologicznym regionie flankującym jest stymulowane przez przeniesienie komórek do temperatury permisywnej na kilka pokoleń bez selekcji. Komórki wysiewa się, aby uzyskać pojedyncze kolonie i bada pod względem utraty obydwu markerów selekcyjnych (patrz np. Perego, 1993, w A. L. Sonneshein, J. A. Hoch i R. Losick, red., Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, rozdział 42, American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1993).
Gen markera selekcyjnego można także usunąć przez rekombinację homologiczną przez wprowadzenie do zmutowanej komórki fragmentu kwasu nukleinowego zawierającego 5' i 3' regiony defektywnego genu, ale nie zawierające markera selekcyjnego, a następnie wyselekcjonować na pożywce do barwienia kontrastowego. Przez homologiczną rekombinację, defektywny gen zawierający gen markera selekcyjnego jest zastępowany fragmentem kwasu nukleinowego nie zawierającym genu markera selekcyjnego. Można także zastosować inne metody znane w dziedzinie wynalazku.
W opisie patentowym US nr 5 891 701 ujawniono techniki delecji kilku genów, włącznie z spoIIAC, aprE, nprE i amyE.
Inne niepożądane związki biologiczne można także usunąć opisanymi powyżej metodami, tak jak czerwony barwnik syntetyzowany przez cypX (nr dostępu BG 12580) i/lub yvmC (nr dostępu BG14121).
W korzystnej postaci komórka gospodarz Bacillus nie jest wyznakowana jakimikolwiek heterologicznymi lub egzogennymi markerami selekcyjnymi. W innej korzystnej postaci, komórka gospodarz Bacillus nie wytwarza czerwonego barwnika syntyzowanego przez cypX i yvmC.
Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego kodujące polipeptydy o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, aktywności pirofosforylazy UDP-glukozy lub aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy
Określenie „aktywność 6-dehydrogenazy UDP-glukozy” definiuje się tutaj jako aktywność 6-oksydoreduktazy UDP-glukoza:NAD+, która katalizuje przekształcenie UDP-glukozy w obecności 2NAD+ i wody do UDP-glukuronianu i 2NADH. Dla celów wynalazku aktywność 6-dehydrogenazy UDP-glukozy określa się zgodnie z procedurą opisaną przez Jaenicke i Rudolph, 1986, Biochemistry 25:
7283-7287. Jedną jednostkę aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy definiuje się jako 1,0 μmol UDP-glukuronianu wytworzony na minutę w 25°C, pH 7.
Określenie „aktywność pirofosforylazy UDP-glukozy” definiuje się tutaj jako aktywność urydylilotransferazy UTP:e-D-glukozo-1-fosforanu, która katalizuje przekształcenie glukozo-1-fosforanu w obecności UTP do difosforanu i UDP-glukozy. Dla celów wynalazku aktywność pirofosforylazy UDP-glukozy określa się według procedury opisanej przez Kamogawa i in., 1965, J. Biochem. (Tokyo) 57: 758-765 lub Hansen i in., 1966, Method Enzymol. 8: 248-253. Jedną jednostkę aktywności pirofosforylazy UDP-glukozy definiuje się jako 1,0 μmol UDP-glukozy wytworzony na minutę w 25°C, pH 7.
Określenie „aktywność pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy” definiuje się tutaj jako aktywność urydylilotransferazy UTP:N-acetylo-a-D-glukozamino-1-fosforanu, która katalizuje przekształcenie N-acetylo-a-D-glukozamino-1-fosforanu w obecności UTP do difosforanu i UDP-N-acetylo-a-D-glukozaminy. Dla celów wynalazku aktywność pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy określa się według procedury opisanej przez Mangin-Lecreuix i in., 1994, J. Bacteriology 176: 5788- 5795. Jedną jednostkę aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy definiuje się jako 1,0 μmol UDP-N-acetylo-a-D-glukozaminy wytworzony na minutę w 25°C, pH 7.
Określenie „izolowana sekwencja kwasu nukleinowego” w stosowanym tutaj znaczeniu dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego, która jest zasadniczo wolna od innych sekwencji kwasu nukleinowego, np. co najmniej w około 20% czysta, korzystnie w co najmniej około 40% czysta, korzystniej w co najmniej około 60% czysta, jeszcze korzystniej w co najmniej około 80% czysta, a najkorzystniej w co najmniej około 90% czysta, co określa się metodą elektroforezy agarozowej. Przykładowo, wyizolowaną sekwencję kwasu nukleinowego można uzyskać znanymi metodami klonowania stosowanymi w inżynierii genetycznej do przeniesienia sekwencji kwasu nukleinowego z jej naturalnego miejsca do innego miejsca, w którym będzie reprodukowana. Procedury klonowania mogą obejmować wycięcie i wyizolowanie wymaganego fragmentu kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, wstawienie tego fragmentu do cząsteczki wektora i wprowadzenie zre20
PL 212 928 B1 kombinowanego wektora do komórki gospodarza, w której zreplikuje się wiele kopii lub klonów sekwencji kwasu nukleinowego. Sekwencja kwasu nukleinowego może być pochodzenia genomowego, cDNA, RNA, półsyntetycznego, syntetycznego lub z połączenia tych źródeł pochodzenia.
W pierwszej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy o sekwencji aminokwasowej, która wykazuje stopień identyczności z SEQ ID NO: 41 co najmniej około 75%, korzystnie co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 85%, jeszcze korzystniej co najmniej około 90%, najkorzystniej co najmniej około 95% oraz jeszcze korzystniej co najmniej około 97%, o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy (nazywane tutaj poniżej „polipeptydami homologicznymi”). W korzystnej postaci, polipeptydy homologiczne mają sekwencję aminokwasową, która różni się o pięć aminokwasów, korzystnie o cztery aminowasy, korzystniej o trzy aminokwasy, jeszcze korzystniej o dwa aminokwasy oraz najkorzystniej o jeden aminokwas od SEQ ID NO: 41.
W innej pierwszej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy o sekwencji aminokwasowej, która wykazuje stopień identyczności z SEQ ID NO: 43 co najmniej około 90%, korzystnie co najmniej około 95% oraz korzystniej co najmniej około 97%, o aktywności pirofosforylazy UDP-glukozy (nazywane tutaj poniżej „polipeptydami homologicznymi”). W korzystnej postaci, polipeptydy homologiczne mają sekwencję aminokwasową, która różni się o pięć aminokwasów, korzystnie o cztery aminowasy, korzystniej o trzy aminokwasy, jeszcze korzystniej o dwa aminokwasy oraz najkorzystniej o jeden aminokwas od SEQ ID NO: 43.
W innej pierwszej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy o sekwencji aminokwasowej, która wykazuje stopień identyczności z SEQ ID NO: 45 co najmniej około 75%, korzystnie co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 85%, jeszcze korzystniej co najmniej około 90%, najkorzystniej co najmniej około 95% oraz jeszcze korzystniej co najmniej około 97%, o aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy (nazywane tutaj poniżej „polipeptydami homologicznymi”). W korzystnej postaci, polipeptydy homologiczne mają sekwencję aminokwasową, która różni się o pięć aminokwasów, korzystnie o cztery aminokwasy, korzystniej o trzy aminokwasy, jeszcze korzystniej o dwa aminokwasy oraz najkorzystniej o jeden aminokwas od SEQ ID NO: 45.
Dla celów niniejszego wynalazku stopień identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami aminokwasowymi określa się metodą Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) stosując pakiet oprogramowania Vector NTI AlignX (Informax Inc., Bethesda, MD) z następującymi ustawieniami domyślnymi: dopasowywanie parami, kara za otwarcie przerwy 10, kara za wydłużenie przerwy 0,1 oraz macierz źródłowa: blosum62mt2.
Korzystnie, sekwencje kwasu nukleinowego kodują polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45; lub ich warianty alleliczne; lub ich fragmenty o aktywności odpowiednio 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy. W korzystniejszej postaci, sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45.
W innej korzystnej postaci, sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45; lub jej wariant alleliczny; lub jej fragment, przy czym fragment polipeptydu wykazuje aktywność odpowiednio 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy.
W innej korzystnej postaci, sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45.
Wynalazek umożliwia stosowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45, która różni się od SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44 ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego. Wynalazek umożliwia także stosowanie subsekwencji SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44, które kodują fragmenty odpowiednio SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45, które wykazują aktywność odpowiednio 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy.
Subsekwencją SEQ ID NO: 40 jest sekwencja kwasu nukleinowego zawarta SEQ ID NO: 40 z takim wyjątkiem, że jeden lub większa liczba nukleotydów została wydeletowana z 5' i/lub 3' końca. Korzystnie, subsekwencja zawiera co najmniej 1020 nukleotydów, korzystniej co najmniej 1080 nukleotydów, a najkorzystniej co najmniej 1140 nukleotydów. Fragment SEQ ID NO: 41 jest polipeptydem
PL 212 928 B1 z delecją na N-końcu i/lub C-końcu tej sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, fragment zawiera co najmniej 340 reszt aminokwasowych, korzystniej co najmniej 360 reszt aminokwasowych, a najkorzystniej co najmniej 380 reszt aminokwasowych.
Subsekwencją SEQ ID NO: 42 jest sekwencja kwasu nukleinowego zawarta w SEQ ID NO: 42, z takim wyjątkiem, że jeden lub większa liczba nukleotydów została wydeletowana z 5' i/lub 3' końca. Korzystnie, subsekwencja zawiera co najmniej 765 nukleotydów, korzystniej co najmniej 810 nukleotydów, a najkorzystniej co najmniej 855 nukleotydów. Fragment SEQ ID NO: 43 jest polipeptydem z delecją na N-końcu i/lub C-końcu tej sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, fragment zawiera co najmniej 255 reszt aminokwasowych, korzystniej co najmniej 270 reszt aminokwasowych, a najkorzystniej co najmniej 285 reszt aminokwasowych.
Subsekwencją SEQ ID NO: 44 jest sekwencja kwasu nukleinowego zawarta w SEQ ID NO: 44, z takim wyjątkiem, że jeden lub większa liczba nukleotydów została wydeletowana z 5' i/lub 3' końca. Korzystnie, subsekwencja zawiera co najmniej 1110 nukleotydów, korzystniej co najmniej 1200 nukleotydów, a najkorzystniej co najmniej 1290 nukleotydów. Fragment SEQ ID NO: 45 jest polipeptydem z delecją na N-końcu i/lub C-końcu tej sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, fragment zawiera co najmniej 370 reszt aminokwasowych, korzystniej co najmniej 400 reszt aminokwasowych, a najkorzystniej co najmniej 430 reszt aminokwasowych.
Wariant alleliczny oznacza którąkolwiek z dwóch lub większej liczby form genu zajmujących to samo locus chromosomalne. Zmienność alleliczna powstaje naturalnie przez mutacje i może powodować polimorfizmy w populacjach. Mutacje w genach mogą być ciche (brak zmiany w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy o zmienionych sekwencjach aminokwasowych. Wariant alleliczny polipeptydu jest polipeptydem kodowanym przez wariant alleliczny genu.
W drugiej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego, które wykazują stopień homologii do SEQ ID NO: 40 co najmniej około 75%, korzystnie co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 85%, jeszcze korzystniej co najmniej około 90%, najkorzystniej co najmniej około 95% oraz jeszcze korzystniej co najmniej około 97%.
W innej drugiej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego, które wykazują stopień homologii do SEQ ID NO: 42 co najmniej około 90%, korzystnie co najmniej około 95% oraz korzystniej co najmniej około 97%.
W innej drugiej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego, które wykazują stopień homologii do SEQ ID NO: 44 co najmniej około 75%, korzystnie co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 85%, jeszcze korzystniej co najmniej około 90%, najkorzystniej co najmniej około 95% oraz jeszcze korzystniej co najmniej około 97%.
Dla celów wynalazku, stopień homologii pomiędzy dwoma sekwencjami kwasu nukleinowego określa się za pomocą pakietu oprogramowania Vector NTI AlignX (Informax Inc., Bethesda, MD) z następującymi ustawieniami domyślnymi: dopasowywanie parami, kara za otwarcie przerwy 15, kara za wydłużenie przerwy 6,6 oraz macierz punktująca: swgapdnamt.
W trzeciej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy, które hybrydyzują w bardzo łagodnych warunkach, korzystnie łagodnych warunkach, korzystniej średnich warunkach, korzystniej średnio-ostrych warunkach, jeszcze korzystniej ostrych warunkach, a najkorzystniej bardzo ostrych warunkach z:
(i) sekwencją kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44, (ii) cDNA sekwencji zawartej w SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44 lub (iii) nicią komplementarną do (i) lub (ii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, i T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor, New York).
Subsekwencją SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44 może być co najmniej 100 nukleotydów lub korzystniej co najmniej 200 nukleotydów. Ponadto, odpowiednia subsekwencja może kodować fragment polipeptydu o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy.
Sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44, lub jej subsekwencję, a także sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45 lub jej fragment, można zastosować do zaprojektowania sond kwasów nukleinowych do identyfikacji i sklonowania DNA kodującego polipeptydy o aktywności odpowiednio 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy, ze szczepów z innych rodzajów lub gatunków zgodnie z dobrze znanymi sposobami. W szczególności, takie sondy można
PL 212 928 B1 stosować do hybrydyzacji z genomowym DNA lub cDNA interesującego rodzaju lub gatunku, zgodnie ze znanymi procedurami analizy Southern blotting, w celu identyfikacji i wyizolowania odpowiadającego genu. Takie sondy mogą być znacznie krótsze niż cała sekwencja, ale powinny być długości co najmniej 15, korzystnie co najmniej 25 oraz korzystniej co najmniej 35 nukleotydów. Można stosować także dłuższe sondy. Można stosować zarówno sondy DNA, jak i RNA. Sondy są zazwyczaj znakowane do wykrycia odpowiadającego genu (np. 32P, 3H, 35S, biotyną lub awidyną).
Tak więc, bibliotekę genomowego DNA lub cDNA przygotowaną z takich innych organizmów można zbadać przesiewowo pod względem DNA hybrydyzującgo z sondami opisanymi powyżej oraz kodującego polipeptyd o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy. Genomowy lub inny DNA z takich innych organizmów można rozdzielić drogą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, lub innymi metodami rozdziału. DNA z takich bibliotek lub rozdzielony DNA można przenieść na i unieruchomić na nitrocelulozie lub innym odpowiednim materiale nośnikowym. W celu zidentyfikowania klonu lub DNA, który jest homologiczny do SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44, lub jej subsekwencji, materiał nośnikowy stosuje się w analizie Southern blot. Dla celów wynalazku, hybrydyzacja oznacza, że sekwencja kwasu nukleinowego hybrydyzuje do znakowanej sondy kwasu nukleinowego odpowiadającej sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej w SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44, jej nici komplementarnej lub jej subsekwencji w warunkach bardzo łagodnych do bardzo ostrych. Cząsteczki, z którymi hybrydyzuje sonda kwasu nukleinowego w tych warunkach wykrywa się stosując błonę rentgenowską.
W korzystnej postaci, sondą kwasu nukleinowego jest sekwencja kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45; lub jego subsekwencję. W innej korzystnej postaci, sondą kwasu nukleinowego jest SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44. W innej korzystnej postaci, sondą kwasu nukleinowego jest sekwencja kwasu nukleinowego zawarta w plazmidzie pMRT106, który znajduje się w Escherichia coli NRRL B-30536, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptydy o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy oraz pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy.
Dla długich sond o długości co najmniej 100 nukleotydów, warunki bardzo łagodne do bardzo ostrych definiuje się jako prehybrydyzację i hybrydyzację w 42°C w 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml ściętego i zdenaturowanego DNA z nasienia łososia oraz albo 25% formamidu dla bardzo łagodnych i łagodnych warunków, 35% formamidu dla średnich i średnio-ostrych warunków lub 50% formamidu dla ostrych i bardzo ostrych warunków, zgodnie ze znanymi procedurami analizy Southern blot.
Dla długich sond o długości co najmniej 100 nukleotydów, materiał nośnikowy ostatecznie przemywa się trzykrotnie za każdym razem przez 15 minut stosując 2X SSC, 0,2% SDS, korzystnie w co najmniej 45°C (bardzo łagodne warunki), korzystniej w co najmniej 50°C (łagodne warunki), korzystniej w co najmniej 55°C (średnie warunki), jeszcze korzystniej przemywa w co najmniej 60°C (średnio-ostre warunki), jeszcze korzystniej w co najmniej 65°C (ostre warunki), a najkorzystniej w co najmniej 70°C (bardzo ostre warunki).
Dla krótkich sond, które mają długość około 15 nukleotydów do około 70 nukleotydów, warunki ostrości definiuje się jako prehybrydyzację, hybrydyzację i przemycie po hybrydyzacji w temperaturze niższej o 5°C do 10°C od obliczonej Tm przy zastosowaniu obliczeń według Bolton i McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) w 0,9M NaCl, 0,09M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 x roztworze Denhardta, 1 mM pirofosforanie sodu, 1 mM jednozasadowym fosforanie sodu, 0,1 mM ATP oraz 0,2 mg drożdżowego RNA na ml zgodnie ze znanymi procedurami analizy Southern blot.
Dla krótkich sond, które mają długość od około 15 nukleotydów do około 70 nukleotydów, materiał nośnikowy przemywa się jednokrotnie w 6X SCC plus 0,1% SDS przez 15 minut i dwukrotnie za każdym razem po 15 minut stosując 6X SSC w temperaturze niższej o 5°C do 10°C od obliczonej Tm.
W czwartej postaci, wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych sekwencji kwasu nukleinowego, które kodują warianty polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45 zawierające podstawienie delecję i/lub insercję jednego lub większej liczby aminokwasów.
Sekwencje aminokwasowe wariantów polipeptydów mogą różnić się od sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 lub SEQ ID NO: 45, insercją lub delecją jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych i/lub podstawieniem jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych innymi resztami aminokwasowymi. Korzystnie, zmiany aminokwasowe mają niewielkie znaczenie, tj.
PL 212 928 B1 są to konserwatywne podstawienia aminokwasowe, które nie wpływają w znacznym stopniu na zwijanie i/lub aktywność białka; niewielkie delecje, zazwyczaj jednego do około 30 aminokwasów; niewielkie wydłużenia N- lub C-końca, takie jak o N-końcową resztę metioniny; niewielkie peptydy łącznikowe do około 20-25 reszt; lub niewielkie wydłużenia, które ułatwiają oczyszczanie przez zmianę ogólnego ładunku lub inną funkcję, taką jak trakt polihistydynowy, epitop antygenny lub domena wiążąca.
Przykładami konserwatywnych podstawień są podstawienia w obrębie grupy zasadowych aminokwasów (arginina, lizyna i histydyna), kwasowych aminokwasów (kwas glutaminowy i kwas asparaginowy), polarnych aminokwasów (glutamina i asparagina), hydrofobowych aminokwasów (leucyna, izoleucyna i walina), aromatycznych aminokwasów (fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna) oraz małych aminokwasów (glicyna, alanina, seryna, treonina i metionina). Podstawienia aminokwasowe, które ogólnie nie zmieniają specyficznej aktywności są znane i opisane przez np. H. Neurath i R. L. Hill, 1979, w The Proteins, Academic Press, New York. Najpowszechniej występującymi wymianami są Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu i Asp/Gly, a także takie same w drugą stronę.
Modyfikacja sekwencji kwasu nukleinowego może być konieczna dla syntezy polipeptydów zasadniczo podobnych do polipeptydu. Określenie „zasadniczo podobny” do polipeptydu dotyczy nie występujących naturalnie form polipeptydu. Te polipeptydy mogą różnic się w pewien zaprojektowany sposób od polipeptydu wyizolowanego z jego natywnego źródła np. warianty różniące się specyficzną aktywnością, termostabilnością, optimum pH, itp. Wariant sekwencji można skonstruować w oparciu o sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako część kodująca polipeptyd sekwencji SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44, np. jej subsekwencję i/lub przez wprowadzenie podstawień nukleotydowych, które nie powodują wytworzenia innej sekwencji aminokwasowej polipeptydu kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego, ale odpowiadają wykorzystaniu kodonów organizmu gospodarza, w którym ma być wytwarzany enzym lub przez wprowadzenie podstawień nukleotydowych, które mogą spowodować powstanie innej sekwencji aminokwasowej. Ogólny opis podstawień nukleotydowych, patrz np. Fordet i in., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Dla znawców zrozumiałe będzie, że takie modyfikacje można wprowadzić na zewnątrz regionów krytycznych dla działania cząsteczki i wytworzyć nadal aktywny polipeptyd. Reszty aminokwasowe niezbędne dla aktywności polipeptydu kodowanego przez wyizolowaną sekwencję kwasu nukleinowego, a zatem korzystnie nie podlegające podstawieniu, można zidentyfikować znanymi metodami, takimi jak ukierunkowana mutageneza lub alaninowa mutageneza przeszukująca (patrz np. Cunningham i Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). W drugiej z tych technik, mutacje wprowadza się w każdej dodatnio naładowanej reszcie w cząsteczce i powstałe zmutowane cząsteczki bada pod względem aktywności enzymatycznej w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych krytycznych dla aktywności cząsteczki. Miejsca oddziaływania enzym-substrat można także określić drogą analizy struktury trójwymiarowej określonej takimi metodami jak rezonans magnetyczny, krystalografia i znakowanie z fotopowinowactwem (patrz np. de Vos i in., 1992, Science 255: 306-312; Smith i in., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver i in., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
Polipeptydy kodowane przez wyizolowane sekwencje kwasu nukleinowego wykazują co najmniej 20%, korzystnie co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 60%, jeszcze korzystniej co najmniej 80%, jeszcze korzystniej co najmniej 90% oraz najkorzystniej co najmniej 100% aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy polipeptydu SEQ ID NO: 41, aktywności pirofosforylazy UDP-glukozy polipeptydu SEQ ID NO: 43 lub aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy polipeptydu SEQ ID NO: 45.
Sekwencje kwasu nukleinowego można uzyskać z mikroorganizmów z jakiegokolwiek rodzaju. Dla celów wynalazku, określenie „uzyskać z” stosowane tutaj łącznie z danym źródłem oznacza, że polipeptyd kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego jest wytwarzany przez źródło lub przez komórkę, do której została wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego z tego źródła. W korzystnej postaci, polipeptyd kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego jest wydzielany zewnątrzkomórkowo.
Sekwencje kwasu nukleinowego można uzyskać ze źródła bakteryjnego. Przykładowo, polipeptydy te można uzyskać z bakterii Gram dodatniej, takiej jak szczep Bacillus np. Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis lub Bacillus thuringiensis lub ze szczepu Streptomyces, np. Streptomyces lividans lub Streptomyces murinus, lub z bakterii Gram ujemnej, np. E. coli lub Pseudomonas sp.
PL 212 928 B1
W korzystnej postaci, sekwencje kwasu nukleinowego uzyskuje się ze szczepu Streptococcus lub Pastuerella.
W korzystniejszej postaci, sekwencje kwasu nukleinowego uzyskuje się ze szczepu Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis lub Streptococcus equi subs. zooepidemicus lub ze szczepu Pasteurella multocida.
W najkorzystniejszej postaci, sekwencje kwasu nukleinowego uzyskuje się z Streptococcus equisimilis, np. sekwencja kwasu nukleinowego przedstawiona w SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44. W innej najkorzystniejszej postaci, sekwencją kwasu nukleinowego jest sekwencja zawarta w plazmidzie pMRT106, który znajduje się w Escherichia coli NRRL B-30536. W kolejnej najkorzystniejszej postaci, sekwencją kwasu nukleinowego jest SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 44.
Szczepy tych gatunków są łatwo dostępne publicznie w kilku zbiorach kultur, takich jak American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZeIlkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) oraz Agrieultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
Ponadto, takie sekwencje kwasu nukleinowego można zidentyfikować i uzyskać z innych źródeł, włącznie z mikroorganizmami izolowanymi z natury (np. gleby, kompostu, wody, itd.) stosując wspomniane powyżej sondy. Techniki izolacji mikroorganizmów z naturalnych siedlisk są dobrze znane. Następnie sekwencję nukleotydową można znaleźć przez podobne przeszukanie biblioteki DNA genomowego lub cDNA innego mikroorganizmu. Gdy sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd zostanie wykryta z użyciem sondy (sond), sekwencję tą można wyizolować lub sklonować stosując techniki, które są znane znawcom (patrz np. Sambrook i in., 1989, jak wyżej).
Wynalazek umożliwia stosowanie zmutowanych sekwencji kwasu nukleinowego zawierających co najmniej jedną mutację w kodującej polipeptyd sekwencji SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 44, w której zmutowana sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający odpowiednio SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 i SEQ ID NO: 45.
Znane są techniki stosowane do wyizolowania lub sklonowania sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd i obejmują one izolację z genomowego DNA, wypreparowanie z cDNA lub ich połączenie. Klonowanie sekwencji nukleotydowych z takiego DNA genomowego można wykonać np. stosując dobrze znaną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) lub przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych za pomocą przeciwciał w celu wykrycia sklonowanych fragmentów DNA o wspólnych cechach strukturalnych, patrz np. Innis i in., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Można także zastosować inne procedury amplifikacji, takie jak reakcję łańcuchową ligazy (LCR), transkrypcję aktywowaną ligacją (LAT) oraz amplifikację opartą na sekwencji nukleotydowej (NASBA). Sekwencja nukleotydowa może zostać sklonowana ze szczepu Streptococcus lub innego lub pokrewnego organizmu i tak np. może być wariantem allelicznym lub gatunkowym regionu sekwencji nukleotydowej kodującego polipeptyd.
Wynalazek umożliwia stosowanie konstruktów kwasu nukleinowego zawierających sekwencję kwasu nukleinowego funkcjonalnie sprzężoną z jedną lub większą liczbą sekwencji kontrolnych, które kierują ekspresją sekwencji kodującej w odpowiedniej komórce gospodarzu w warunkach zgodnych z sekwencjami kontrolnymi.
Wynalazek umożliwia stosowanie rekombinowanych wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencję kwasu nukleinowego, promotor oraz sygnały stop transkrypcji i translacji.
Wynalazek umożliwia stosowanie rekombinowanych komórek gospodarzy, zawierających sekwencję kwasu nukleinowego, które korzystnie stosuje się w rekombinacyjnym wytwarzaniu polipeptydów.
Wynalazek umożliwia stosowanie sposobów wytwarzania polipeptydu o aktywności pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy obejm ujących:
(a) hodowanie komórki gospodarza w warunkach odpowiednich do wytwarzania polipeptydu;
oraz (b) odzyskanie polipeptydu.
W sposobach wytwarzania, komórki hoduje się w pożywce odżywczej odpowiedniej do wytwarzania polipeptydu stosując znane sposoby. Przykładowo komórkę może hodować w hodowli w kolbie z wytrząsaniem, fermentacji na małą skalę lub na dużą skalę (włącznie z fermentacjami ciągłymi, porcjowanymi, uzupełnianymi - porcjowanymi lub w stanie stałym) w laboratorium lub przemysłowych fermentorach, w odpowiedniej pożywce i w warunkach pozwalających na ekspresję i/lub wyizolowanie
PL 212 928 B1 polipeptydu. Hodowla jest prowadzona w odpowiedniej pożywce odżywczej zawierającej źródła węgla i azotu oraz sole nieorganiczne, przy zastosowaniu znanych procedur. Odpowiednie pożywki są dostępne od handlowych dostawców lub mogą zostać przygotowane według opublikowanych składów (np. w katalogach American Type Culture Collection). Gdy polipeptyd jest wydzielany do pożywki odżywczej, polipeptyd może być odzyskiwany bezpośrednio z pożywki. Gdy polipeptyd nie jest wydzielany, może zostać odzyskany z lizatów komórkowych.
Polipeptydy można wykrywać stosując sposoby znane w dziedzinie wynalazku, które są specyficzne dla polipeptydów. Te metody wykrywania obejmują specyficzne przeciwciała, tworzenie produktu enzymu lub zanikanie substratu enzymu. Przykładowo, test enzymatyczny można zastosować do określania aktywności polipeptydu, jak tutaj opisano.
Powstały polipeptyd można odzyskać znanymi metodami. Przykładowo, polipeptyd można odzyskać z pożywki odżywczej znanymi sposobami obejmującymi, ale nie tylko, odwirowanie, filtrację, ekstrakcję, suszenie rozpryskowe, odparowanie lub wytrącenie.
Polipeptydy można oczyszczać różnymi znanymi metodami obejmującymi, ale nie tylko, chromatografię (np. jonowymienną, powinowactwa, hydrofobową, chromatoogniskowanie i chromatografię z wykluczeniem wielkości), procedury elektroforetyczne (np. preparatywne izoelektroogniskowanie), na podstawie różnic w rozpuszczalności (np. wytrącenie siarczanem amonu), SDS-PAGE lub ekstrakcję (patrz np. Protein Purification, J. -C. Janson i Lars Ryden, red., VCH Publishers, Nowy Jork, 1989).
Wynalazek umożliwia stosowanie wyizolowanych polipeptydów o aktywności 6-dehydrogenazy UDP-glukozy, pirofosforylazy UDP-glukozy lub pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy kodowanych przez sekwencje kwasu nukleinowego opisane powyżej.
Wynalazek jest dalej opisany przez poniższe przykłady.
Przykłady
Startery i oligonukleotydy
Wszystkie startery i oligonukleotydy zakupiono (MWG Biotech Inc., High Point, NC).
P r z y k ł a d 1. Amplifikacja PCR i klonowanie genu hasA Streptococcus equisimilis oraz genów tuaD, gtaB i gcaD Bacillus subtilis
Gen syntazy hialuronanu Streptococcus equisimilis (hasA, nr dostępu AF023876, SEQ ID NO: 1 [sekwencja DNA] i 2 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) zamplifikowano metodą PCR z plazmidu pKKseD (Weigel, 1997, Journal of Biological Chemistry 272: 32539-32546) stosując startery 1 i 2:
Starter 1:
5'-GAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGAGAACATTAAAAAACCT-3' (SEQ ID NO: 3)
Starter 2:
5'-GTTAACGAATTCAGCTATGTAGGTACCTTATAATAATTTTTTACGTGT-3' (SEQ ID NO: 4)
Amplifikacje PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w 50 μΐ reakcjach zawierających 1 ng pKKseD DNA, 0,4 μΜ każdy ze starterów 1 i 2, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Reakcje prowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 3 cykle 95°C przez 1 minutę, 52°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę; 27 cykli każdy 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 720C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 5 minut. Produkt PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym z buforem 44 mM zasadowy Tris, 44 mM kwas borowy, 0,5 mM EDTA (0,5 x TBE). Oczekiwany fragment miał wielkość około 1200 pz.
Fragment PCR o wielkości 1200 pz wklonowano do pCR2.1 stosując zestaw do klonowania TA-TOPO (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) i transformowano do kompetentnych komórek E. coli One-Shot™ zgodnie z zaleceniami producenta (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty selekcjonowano w 37°C po 16 godzinach wzrostu na płytkach agarowych 2X drożdżowo-tryptonowych (YT) wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml. Plazmidowy DNA z tych transformantów oczyszczono z użyciem robota QIAGEN (QIAGEN, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję DNA wstawek potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA stosując startery do przodu M13 (-20) oraz do tyłu M13 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) oraz następujące startery wewnętrzne. Plazmid niosący fragment PCR o wielkości 1200 pz nazwano pCR2.1-sehasA (fig. 3).
Starter 3: 5'-GTTGACGATGGAAGTGCTGA-3' (SEQ ID NO: 5)
Starter 4: 5'-ATCCGTTACAGGTAATATCC-3' (SEQ ID NO: 6)
Starter 5: 5'-TCCTTTTGTAGCCCTATGGA-3' (SEQ ID NO: 7)
Starter 6: 5'-TCAGCACTTCCATCGTCAAC-3' (SEQ ID NO: 8)
PL 212 928 B1
Starter 7: 5'-GGATATTACCTGTAACGGAT-3' (SEQ ID NO: 9)
Starter 8: 5'-TCCATAGGGCTACAAAAGGA-3' (SEQ ID NO: 10)
Gen 6-dehydrogenazy UDP-glukozy Bacillus subtilis (tuaD, nr dostępu BG12691, SEQ ID NO: 11 [sekwencja DNA] i 12 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) zamplifikowano metodą PCR z Bacillus subtilis 168 (BGSC 1A1, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH) stosując startery 9 i 10:
Starter 9:
5'-GGTACCGACACTGCGACCATTATAAA-3' (SEQ ID NO: 13)
Starter 10:
5'-GTTAACGAATTCCAGCTATGTATCTAGACAGCTTCAACCAAGTAACACT-3' (SEQ ID NO: 14)
Amplifikacje PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w 30 μl reakcjach zawierających 50 ng chromosomalnego DNA Bacillus subtilis 168, 0,3 μΜ każdy ze starterów 9 i 10, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje prowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 5 cykli każdy 95°C przez 1 minutę, 50°C przez 1 minutę i 72°C przez 1,5 minuty; 32 cykle 95°C przez 1 minutę, 54°C przez 1 minutę i 72°C przez 1,5 minuty oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym z buforem 0,5X TBE. Oczekiwany fragment miał wielkość około 1400 pz.
Fragment PCR o wielkości 1400 pz wklonowano do pCR2.1 stosując zestaw do klonowania TA-TOPO i transformowano do kompetentnych komórek E. coli OneShot™ zgodnie z zaleceniami producenta. Plazmidowy DNA oczyszczono z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję DNA wstawek potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA stosując startery do przodu M13 (-20) oraz do tyłu M13 oraz następujące startery wewnętrzne. Plazmid niosący fragment PCR o wielkości 1400 pz nazwano pCR2.1-tuaD (fig. 4).
Starter 11: 5'-AGCATCTTAACGGCTACAAA-3' (SEQ ID NO: 15)
Starter 12: 5'-TGTGAGCGAGTCGGCGCAGA-3' (SEQ ID NO: 16)
Starter 13: 5'-GGGCGCCCATGTAAAAGCAT-3' (SEQ ID NO: 17)
Starter 14: 5'-TTTGTAGCCGTTAAGATGCT-3' (SEQ ID NO: 18)
Starter 15: 5'-TCTGCGCCGACTCGCTCACA-3' (SEQ ID NO: 19)
Starter 16: 5'-ATGCTTTTACATGGGCGCCC-3' (SEQ ID NO: 20)
Gen urydylilotransferazy UTP-glukozo-1-fosforanu Bacillus subtilis (gtaB, nr dostępu BG10402, SEQ ID NO: 21 [sekwencja DNA] i 22 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) zamplifikowano PCR z Bacillus subtilis 168 stosując startery 17 i 18:
Starter 17:
5'-TCTAGATTTTTCGATCATAAGGAAGGT-3' (SEQ ID NO: 23)
Starter 18:
5'-GTTAACGAATTCCAGCTATGTAGGATCCAATGTCCAATAGCCTTTTTGT-3' (SEQ ID NO: 24)
Amplifikacje PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w 30 μl eakcjach zawierających 50 ng chromosomalnego DNA Bacillus subtilis 168, 0,3 μΜ każdy ze starterów 17 i 18, 200 μΜ każdy dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje prowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 5 cykli każdy 95°C przez 1 minutę, 50°C przez 1 minutę i 72°C przez 1,5 minuty; 32 cykle 95°C przez 1 minutę, 54°C przez 1 minutę i 72°C przez 1,5 minuty oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym z buforem 0,5 x TBE. Oczekiwany fragment miał wielkość około 900 pz.
Fragment PCR o wielkości 900 pz wklonowano do pCR2.1 stosując zestaw do klonowania TA-TOPO i transformowano do kompetentnych komórek E. coli OneShot™ zgodnie z zaleceniami producenta. Plazmidowy DNA oczyszczono z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję DNA wstawek potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA stosując startery do przodu M13 (-20) oraz do tyłu M13 oraz następujące startery wewnętrzne. Plazmid niosący fragment PCR o wielkości 900 pz nazwano pCR2.1-grtaB (fig. 5).
Starter 19: 5'-AAAAAGGCTTCTAACCTGGC-3' (SEQ ID NO: 25)
Starter 20: 5'-AAACCGCCTAAAGGCACAGC-3' (SEQ ID NO: 26)
Starter 21: 5'-GCCAGGTTAGAAGCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 27)
Starter 22: 5'-GCTGTGCCTTTAGGCGGTTT-3' (SEQ ID NO: 28)
PL 212 928 B1
Gen pirofosforylazy UDP-N-acetyloglukozaminy Bacillus subtilis (gcaD, nr dostępu BG10113, SEQ ID NO: 29 [sekwencja DNA] i 30 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) zamplifikowano PCR z Bacillus subtilis 168 stosując startery 23 i 24:
Starter 23: 5'-GGATCCTTTCTATGGATAAAAGGGAT-3' (SEQ ID NO: 31)
Starter 24: 5'-GTTAACAGGATTATTTTTTATGAATATTTTT-3' (SEQ ID NO: 32)
Amplifikacje PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w 30 μΐ reakcjach zawierających 50 ng chromosomalnego DNA Bacillus subtilis 168, 0,3 μΜ każdy ze starterów 23 i 24, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje prowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 5 cykli każdy 95°C przez 1 minutę, 50°C przez 1 minutę i 72°C przez 1,5 minuty; 32 cykle 95°C przez 1 minutę, 54°C przez 1 minutę i 72°C przez 1,5 minuty oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym z buforem 0,5 x TBE. Oczekiwany fragment miał wielkość około 1500 pz.
Fragment PCR o wielkości 1500 pz wklonowano do pCR2.1 stosując zestaw do klonowania TA-TOPO i transformowano do kompetentnych komórek E. coli OneShot™ zgodnie z zaleceniami producenta. Plazmidowy DNA oczyszczono z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję DNA wstawek potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA stosując startery do przodu M13 (-20) oraz do tyłu M13 oraz następujące startery wewnętrzne. Plazmid niosący fragment PCR o wielkości 1500 pz nazwano pCR2.1-gcaD (fig. 6).
Starter 25: 5'-CAGAGACGATGGAACAGATG-3' (SEQ ID NO: 33)
Starter 26: 5'-GGAGTTAATGATAGAGTTGC-3' (SEQ ID NO: 34)
Starter 27: 5'-GAAGATCGGGAATTTTGTAG-3' (SEQ ID NO: 35)
Starter 28: 5'-CATCTGTTCCATCGTCTCTG-3' (SEQ ID NO: 36)
Starter 29: 5'-GCAACTCTATCATTAACTCC-3' (SEQ ID NO: 37)
Starter 30: 5'-CTACAAAATTCCCGATCTTC-3' (SEQ ID NO: 38)
P r z y k ł a d 2. Konstrukcja operonu hasA/tuaD/gtaB
Plazmidy pDG268Aneo-cryIIIAstab/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) i pCR2.1-tuaD (przykład 1, fig. 4) strawiono KpnI i HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE oraz większy fragment wektora (około 7700 pz) z pDG268Aneo-cryIIIAstab/Sav i mniejszy fragment tuaD (około 1500 pz) z pCR2.1-tuaD oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta (QIAGEN, Valencia, CA). Dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Applied Science; Indianapolis, IN) i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml.
Plazmidowy DNA oczyszczono z kilu transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie KpnI plus HpaI w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu Kpnl/Hpal tuaD o wielkości około 1500 pz i nazwano pHA1 (fig. 7).
Plazmidy pHA1 i pCR2.1-gtaB (przykład 1, fig. 5) strawiono XbaI i HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE i większy fragment z wektora pHA1 (około 9200 pz) oraz mniejszy fragment gtaB (około 900 pz) z pCR2.1-gtaB oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Te dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidy oczyszczono z kilu transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie XbaI plus HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu Xbal/Hpal gtaB o wielkości około 900 pz i nazwano pHA1 (fig. 8).
Plazmidy pHA2 i pCR2.1-sehasA (przykład 1, fig. 3) strawiono SacI plus KpnI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Większy fragment z wektora pHA2 (około 10000 pz) i mniejszy fragment hasA (około 1300 pz) z pCR2.1-sehasA oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Te dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli
PL 212 928 B1
SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidy oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie SacI plus KpnI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu Sacl/KpnI hasA o wielkości około 1300 pz i nazwano pHA3 (fig. 9).
P r z y k ł a d 3. Konstrukcja operonu hasA/tuaD/gtaB/gcaD
Plazmidy pHA2 (przykład 2, fig. 8) i pCR2.1-gcaD (przykład 1, fig. 6) strawiono BamHI i HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE i większy fragment z wektora pHA2 (około 10000 pz) oraz mniejszy fragment gcaD (około 1400 pz) z pCR2.1-gcaD oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Te dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidy oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie Xbal plus HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu BamHl/HpaI gcaD o wielkości około 1400 pz i nazwano pHA4 (fig. 10).
Plazmidy pHA4 i pCR2.1-sehasA (przykład 1, fig. 3) strawiono SacI i KpnI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE i większy fragment z wektora pHA4 (około 11000 pz) oraz mniejszy fragment hasA (około 1300 pz) z pCR2.1-sehasA oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Te dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidy oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie SacI plus KpnI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu Sacl/KpnI hasA o wielkości około 1300 pz i nazwano pHA5 (fig. 11).
P r z y k ł a d 4. Konstrukcja operonu hasA/tuaD/gcaD
Plazmidy pHA1 (przykład 2, fig. 7) i pCR2.1-gcaD (przykład 1, fig. 6) strawiono BamHI i HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE i większy fragment z wektora pHA1 (około 9200 pz) oraz mniejszy fragment gcaD (około 1400 pz) z pCR2.1-gcaD oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Te dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidy oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie BamHI plus HpaI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu BamHl/Hpal gcaD o wielkości około 1400 pz i nazwano pHA6 (fig. 12).
Plazmidy pHA6 i pCR2.1-sehasA (przykład 1, fig. 3) strawiono SacI plus KpnI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE i większy fragment z wektora pHA6 (około 10200 pz) oraz mniejszy fragment hasA (około 1300 pz) z pCR2.1-hasA oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Te dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidy oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie SacI plus KpnI. Trawienia rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w buforze 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu SaclIKpnI hasA o wielkości około 1300 pz i nazwano pHA7 (fig. 13).
P r z y k ł a d 5. Konstrukcja Bacillus subtilis RB161
Plazmid pDG268MCSAneo/scBAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono NotI. Największy fragment plazmidu o wielkości około 6800 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick
PL 212 928 B1
DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta (QIAGEN, Valencia, CA). Następnie, odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisaną poniżej wstawką DNA.
Plazmid pHA3 (przykład 2, fig. 9) strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono w sposób opisany powyżej i ostatecznie strawiono NotI. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 3800 bp oczyszczono z żelu w sposób opisany powyżej. Odzyskany wektor i wstawkę DNA zligowano ze sobą stosując zestaw do klonowania Rapid DNA Cloning Kit (Roche Applied Science; Indianapolis, IN) zgodnie z instrukcjami producenta. Przed transformacją do Bacillus subtilis, opisaną powyżej ligację zlinearyzowano za pomocą Scal aby zapewnić integrację do chromosomu raczej przez podwójny crossing-over niż pojedynczy crossing-over. Kompetentne komórki Bacillus subtilis 168Δ4 transformowano produktami ligacji strawionymi Scal. Bacillus subtilis 168Δ4 pochodzi ze szczepu typu Bacillus subtilis 168 (BGSC 1A1, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH) i zawiera delecje w genach spoIIAC, aprE, nprE i amyE. Delecję tych czterech genów przeprowadzono w sposób zasadniczo opisany dla Bacillus subtilis Α164Δ5, który opisano szczegółowo w opisie patentowym US nr 5 891 701.
Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis selekcjonowano w 34°C po 16 godzinach wzrostu na płytkach z pożywką agarową Tryptose blood (TBAB) wzbogaconą 5 μg chloramfenikolu na ml. Aby zbadać przesiewowo pod względem integracji plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE, pierwotne transformanty Bacillus subtilis przepikowano na płytki TBAB wzbogacone 6 μg neomycyny na ml i płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml. Integracja plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE nie wprowadza genu oporności na neomycynę, a zatem czyni szczep wrażliwym na neomycynę. Izolaty także przepikowano na płytki minimalne, aby uwidocznić, czy wytwarzały one, czy też nie wytwarzały, kwas hialuronowy. Izolaty wytwarzające kwas hialuronowy mają fenotyp „mokry” na płytkach minimalnych. Przy zastosowaniu tego badania przesiewowego na płytkach, oporne na chloramfenikol i wrażliwe na neomycynę „mokre” transformanty (ze względu na wytwarzanie kwasu hialuronowego) wyizolowano w 37°C.
Genomowy DNA wyizolowano z „mokrych”, opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis 168Δ4 z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 (QIAGEN, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikacje PCR przeprowadzono na tych transformantach stosując poniższe syntetyczne oligonukleotydy, które były oparte na sekwencjach genów hasA, tuaD i gtaB, aby potwierdzić obecność i integralność tych genów w operonie transformantów Bacillus subtilis. Reakcje amplifikacji (25 μθ zawierały około 50 μg genomowego DNA transformantów Bacillus subtilis 168Δ4, 0,5 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II, 3 mM MgCl2 oraz 0,625 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™ DNA. Reakcje inkubowano w cyklerze temperaturowym RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 30 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty oraz końcowy cykl 72°C przez 7 minut.
Startery 3 i 8 zastosowano do potwierdzenia obecności genu hasA, startery 3 i 16 do potwierdzenia obecności genu tuaD oraz startery 3 i 22 do potwierdzenia obecności genu gtaB. Integrant Bacillus subtilis 168Δ4 hasA/tuaD/gtaB nazwano Bacillus subtilis RB158.
Genomowy DNA wyizolowano z Bacillus subtilis RB158 stosując kolumnę QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i zastosowano do transformacji kompetentnych komórek Bacillus subtilis Α164Δ5 (z delecją w genach spoIIAC, aprE, nprE, amyE i srfC; patrz opis patentowy US nr 5 891 701). Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5 hasA/tuaD/gtaB zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis RB161.
P r z y k ł a d 6. Konstrukcja Bacillus subtilis RB163
Plazmid pDG268MCSAneo/scBAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono NotI. Największy fragment plazmidu wielkości około 6800 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisaną poniżej wstawką DNA.
Plazmid pHA7 (przykład 4, fig. 13) strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono w sposób opisany powyżej i ostatecznie strawiono NotI. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 4300 pz oczyszczono z żelu w sposób opisany powyżej. Odzyskany wektor i wstawkę DNA zligowano stosując zestaw do klonowania Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Przed transformacją do Bacillus subtilis, opisaną powyżej ligację zlinearyzowano za pomocą Scal, aby
PL 212 928 B1 zapewnić integrację do chromosomu raczej przez podwójny crossing-over niż pojedynczy crossing-over. Kompetentne komórki Bacillus subtilis 168Δ4 transformowano produktami Iigacji strawionymi Scal.
Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis wyselekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Aby zbadać przesiewowo pod względem integracji plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE, pierwotne transformanty Bacillus subtilis przepikowano na płytki TBAB wzbogacone 6 μg neomycyny na ml oraz płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml w celu wyizolowania opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę „mokrych” transformantów (ze względu na wytwarzanie kwasu hialuronowego).
Genomowy DNA wyizolowano z „mokrych”, opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis 168Δ4 z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikacje PCR przeprowadzono na tych transformantach stosując startery 3, 8, 16, 22 i starter 30 (przykład 1), aby potwierdzić obecność i integralność tych genów w operonie transformantów Bacillus subtilis. Reakcje amplifikacji (25 μθ zawierały około 50 ng genomowego DNA transformantów Bacillus subtilis 168Δ4, 0,5 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II, 3 mM MgCl2 oraz 0,625 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™ DNA. Reakcje inkubowano w cyklerze temperaturowym Robo-Cycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 30 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty oraz końcowy cykl 72°C przez 7 minut.
Startery 3 i 8 zastosowano do potwierdzenia obecności genu hasA, startery 3 i 16 do potwierdzenia obecności genu tuaD, startery 3 i 22 do potwierdzenia obecności genu gtaB oraz startery 3 i 30 do potwierdzenia obecności genu gcaD. Integrant Bacillus subtilis 168Δ4 hasA/tuaD/gcaD nazwano Bacillus subtilis RB160.
Genomowy DNA wyizolowano z Bacillus subtilis RB160 stosując kolumnę QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i zastosowano do transformacji kompetentnych komórek Bacillus subtilis Α164Δ5. Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml i hodowano w 37°C przez 16 godzin. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5 hasA/tuaD/gcaD zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis RB163.
P r z y k ł a d 7. Konstrukcja Bacillus subtilis TH-1
Operon syntazy hialuronanu (has) uzyskano ze Streptococcus equisimilis stosując następującą procedurę. Operon has składa się z genów hasA, hasB, hasC i hasD. Około 20 μg chromosomalnego DNA Streptococcus equisimilis D181 (Kumari i Weigel, 1997, Journal of Biological Chemistry 272: 32539-32546) strawiono HindIII i rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. DNA w zakresie 3-6 kb wycięto z żelu i oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA zligowano z opisanym poniżej DNA wektorowym.
Plazmid pUC18 (2 μg) strawiono HindIII i wystające 5'-końce defosforylowano fosfatazą zasadową z krewetek zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Applied Science; Indianapolis, IN). Defosforylowany wektor i wstawkę DNA zligowano stosując zestaw do klonowania Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Ligację zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli XL10 Gold Kan (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Komórki wysiano na płytki LB (100 μg/ml ampicyliny) i inkubowano przez noc w 37°C. Pięć płytek zawierających około 500 kolonii/płytkę zbadano oligonukleotydem 952-55-1, przedstawionym poniżej, który zawiera sekwencję o długości 54 pz identyczną z nicią kodującą w pobliżu 3'-końca genu hasA Streptococcus equisimilis D181 (nukleotydy 1098-1151 w stosunku do reszty A kodonu ATG startu translacji).
Starter 31:
5'-GTGTCGGAACATTCATTACATGCTTAAGCACCCGCTGTCCTTCTTGTTATCTCC-3' (SEQ ID NO: 39)
Sonda oligonukleotydowa była znakowana DIG z użyciem zestawu DIG Oligonucleotide 3'-end Labeling Kit zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Applied Science; Indianapolis, IN). Hybrydyzację kolonijną i wykrycie chemiluminescencji przeprowadzono w sposób opisany w „The Dig System User's Guide For Filter Hybridization”, Boehringer Mannheim GmbH.
Zidentyfikowano siedem kolonii, które hybrydyzowały z sondą. Plazmidowy DNA z tych transformantów oczyszczono z użyciem robota QIAGEN (QIAGEN, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta, strawiono HindIII i rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE. Wstawka DNA okazała się mieć wielkość około 5 kb. Ten plazmid nazwano pMRT106 (fig. 14).
PL 212 928 B1
Sekwencję DNA sklonowanego fragmentu określono stosując zestaw EZ::TN™ <TET-1> Insertion Kit zgodnie z instrukcjami producenta (Epicenter Technologies, Madison, WI). Sekwencjonowanie ujawniło, że sklonowana wstawka DNA zawierała ostatnie 1156 pz genu hasA Streptococcus equisimilis, po czym występowały trzy inne geny nazwane hasB, hasC i hasD; przypuszczalnie wszystkie cztery geny były zawarte w pojedynczym operonie, a zatem były współtranskrybowane. Gen hasB Streptococcus equisimilis obejmował nukleotydy 1411-2613 (SEQ ID NO: 40 [sekwencja DNA] i 41 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) fragmentu, a gen hasC Streptococcus equisimilis nukleotydy 2666-3565 (SEQ ID NO: 42 [sekwencja DNA] i 43 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) fragmentu, a gen hasD Streptococcus equisimilis nukleotydy 3735-5114 (SEQ ID NO: 44 [sekwencja DNA] i 45 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) fragmentu.
Polipeptydy kodowane przez geny hasB i hasC Streptococcus equisimilis wykazywały pewną homologię do tych kodowanych przez geny odpowiednio hasB i hasC z sekwencji operonu has Streptococcus pyogenes (Ferretti i in., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (8), 4658-4663). Stopień identyczności określono metodą Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) stosując oprogramowanie Vector NTI AlignX (Informax Inc., Bethesda, MD) z następującymi ustawieniami domyślnymi: dopasowywanie parami, kara za otwarcie przerwy 10, kara za wydłużenie przerwy 0,1 oraz macierz punktująca: blosum62mt2.
Porównania sekwencji aminokwasowej wykazały, że białko HasB ze Streptococcus equisimilis wykazuje 70% identyczności z białkiem HasB ze Streptococcus uberis (SEQ ID NO: 105); białko HasC ze Streptococcus equisimilis wykazuje 91% identyczności z białkiem HasC ze Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 99) ; a białko HasD ze Streptoeoccus equisimilis wykazuje 73% identyczności z białkiem GlmU (przypuszczalną pirofosforylazą UDP-N-acetyloglukozaminy) ze Streptococcus pyogenes (nr dostępu Q8P286). Gen hasD Streptococcus equisimilis koduje polipeptyd wykazujący 50,7% identyczności z enzymem pirofosforylazą UDP-N-acetyloglukozaminy kodowanym przez gen gcaD Bacillus subtilis.
Plazmid pHA5 (przykład 3, fig. 11) strawiono Hpal i BamHI. Trawienie rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE i większy fragment wektora (około 11000 pz) oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid pMRT106 strawiono HindlII i lepkie końce wypełniono fragmentem Klenowa oraz DNA strawiono BamHI. Trawienie rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE i mniejszy fragment wektora (około 1000 pz, ostatnie 2/3 genu hasD Streptococcus equisimilis) oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
Dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty wyselekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie BamHI plus NotI w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu BamUl/Notl hasD wielkości około 1100 pz i nazwano pHA8 (fig. 15). Plazmid ten strawiono HindIII i zligowano ligazą DNA T4 i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty wyselekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml. Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie HindIII w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność pojedynczego prążka wielkości około 9700 pz i nazwano pHA9 (fig. 16).
Plazmid pHA9 strawiono SacI i NotI. Trawienie rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE i mniejszy fragment wektora około 2500 pz oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
Plazmid pDG268MCSAneo/scBAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) strawiono SacI i NotI. Trawienie rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE i większy fragment wektora około 6800 pz oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty wyselekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml. Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie SalI plus HindIII w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawi32
PL 212 928 B1 dłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu Sall/HindIII wielkości około 1600 pz i nazwano pHA10 (fig. 16).
Plazmid pHA10 strawiono HindIII i BamHI. Trawienie rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE i większy fragment wektora (około 8100 pz) oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid pMRT106 strawiono HindIII i BamHI. Trawienie rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym stosując bufor 0,5X TBE i większy fragment wektora około 4100 pz oczyszczono z żelu stosując zestaw QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Dwa oczyszczone fragmenty zligowano ze sobą stosując ligazę DNA T4 i mieszaninę ligacyjną transformowano do Bacillus subtilis 168Δ4. Transformanty wyselekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Około 100 transformantów przepikowano na TBAB wzbogacone chloramfenikolem (5 μg/ml) i TBAB wzbogacone neomycyną (10 μg/ml) aby znaleźć kolonie oporne na chloramfenikol i wrażliwe na neomycynę; fenotyp ten wskazuje na zajście podwójnego crossing-over w locus amyE. Zidentyfikowano kilka takich kolonii i wszystkie one wykazywały „mokry” fenotyp oznaczający, że kwas hialuronowy był wytwarzany. Wybrano jedną kolonię i nazwano Bacillus subtilis 168Δ4::scBAN/se hasA/hasB/hasC/hasD.
Genomowy DNA wyizolowano z Bacillus subtilis 168Δ4::scBAN/se hasA/hasB/hasC/hasD stosując kolumnę QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i zastosowano do stransformowania kompetentnych Bacillus subtilis Α164Δ5. Transformanty wyselekcjonowano na płytkach TBAB zawierających 5 μg chloramfenikolu na ml i hodowano w 37°C przez 16 godzin. Integranta Bacillus subtilis Α164Δ5 hasA/hasB/hasC/hasD zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis TH-1.
P r z y k ł a d 8. Konstrukcja Bacillus subtilis RB184
Gen hasA ze Streptococcus equisimilis (przykład 1) i gen tuaD (homolog hasB Bacillus subtilis) (przykład 1) sklonowano tak, aby były pod kontrolą krótkiego „konsensusowego” promotora amyQ (scBAN) (opis patentowy US nr 5 955 310).
Plazmid pDG268MCSAneo/scBAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) strawiono SacI. Stawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono NotI. Największy fragment plazmidu wielkości około 6800 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisaną poniżej wstawką DNA.
Plazmid pHA5 (przykład 3, fig. 11) strawiono HpaI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono w sposób opisany powyżej i ostatecznie strawiono XbaI. Następnie w podwójnie strawionym plazmidzie wytworzono tępe końce najpierw inaktywując XbaI w 85°C przez 30 minut. Tępe końce wytworzono przez dodanie 0,5 μl 10 mM każdego z dNTP, 1 μl 1 U/μΙ polimerazy DNA T4 (Roche Applied Science; Indianapolis, IN) i inkubację w 11°C przez 10 minut. Ostatecznie polimerazę inaktywowano inkubując reakcję w 75°C przez 10 minut. Następnie, największy fragment plazmidu wielkości około 11000 pz oczyszczono z żelu w sposób opisany powyżej i religowano stosując zestaw Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE. Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie Scal w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu o wielkości około 11 kb i nazwano pRB157 (fig. 18).
pRB157 strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono stosując zestaw QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono Notl. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 2632 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA zligowano z opisanym powyżej wektorowym DNA.
Przed transformacją do Bacillus subtilis, opisaną powyżej ligaćję zlinearyzowano za pomocą Scal, aby zapewnić integrację do chromosomu raczej przez podwójny crossing-over niż pojedynczy crossing-over. Kompetentne komórki Bacillus subtilis 168Δ4 transformowano produktami ligacji strawionymi enzymem restrykcyjnym Scal.
Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis wyselekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml. Aby zbadać przesiewowo pod względem integracji plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE, pierwotne transformanty Bacillus subtilis przepiPL 212 928 B1 kowano na płytki TBAB wzbogacone 6 μg neomycyny na ml oraz płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml oraz płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml w celu wyizolowania opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę „mokrych” transformantów (ze względu na wytwarzanie kwasu hialuronowego).
Genomowy DNA wyizolowano z „mokrych”, opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis 168Δ4 stosując kolumnę QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikacje PCR przeprowadzono na tych transformantach stosując startery 3, 8 i 16 (przykład 1) aby potwierdzić obecność i integralność hasA i tuaD w operonie transformantów Bacillus subtilis. Reakcje amplifikacji (25 μθ zawierały około 50 ng genomowego DNA transformantów Bacillus subtilis 168Δ4, 0,5 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR, 3 mM MgCl2 oraz 0,625 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™ DNA. Reakcje prowadzono w cyklerze temperaturowym RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 30 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty oraz końcowy cykl 72°C przez 7 minut. Startery 3 i 8 zastosowano do potwierdzenia obecności genu hasA i startery 3 i 16 do potwierdzenia obecności genu tuaD. Integrant Bacillus subtilis 168Δ4 hasA/tuaD nazwano Bacillus subtilis RB183.
Genomowy DNA Bacillus subtilis RB183 DNA zastosowano także do stransformowania Bacillus subtilis Α164Δ5. Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB zawierających 5 μg chloramfenikolu na ml i hodowano w 37°C przez 16 godzin. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5 hasA/tuaD zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis RB184.
P r z y k ł a d 9. Konstrukcja Bacillus subtilis RB187
Kompetentne Bacillus subtilis RB161 transformowano plazmidem pRB115 z delecją cat (Widner i in., 2000, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 25: 204-212). Selekcję na bezpośrednią integrację do chromosomu przeprowadzono w nie permisywnej temperaturze 45°C stosując selekcję erytromycyną (5 μg/ml). W tej temperaturze, miejsce startu replikacji pE194 jest nieaktywne. Komórki są zdolne do utrzymania oporności na erytromycynę tylko przez integrację plazmidu do genu cat w chromosomie bakteryjnym. Te tak zwane „integranty” utrzymuje się w 45°C, aby zapewnić wzrost w tej temperaturze z selekcją. Aby umożliwić stratę lub „wypętlenie” plazmidu, co spowoduje delecję większości genu cat z chromosomu, integranty hodowano w pożywce Luria-Bertani (LB) bez selekcji w permisywnej temperaturze 34°C przez wiele pokoleń. W tej temperaturze miejsce startu replikacji pE194 jest aktywne i wywołuje wycięcie plazmidu z genomu (Molecular Biological Methods for Bacillus, red. C. R. Harwood i S. M. Cutting, 1990, John Wiley and Sons Ltd.).
Następnie, komórki wysiano na nie selekcyjne płytki agarowe LB i kolonie zawierające delecje w genie cat i brak replikonu opartego na pE194 zidentyfikowano stosując następujące kryteria:
(1) wrażliwość na chloramfenikol oznaczała obecność delecji cat;
(2) wrażliwość na erytromycynę oznaczała brak genu oporności na erytromycynę kodowanego przez wektor pRB115; oraz (3) PCR potwierdzał obecność delecji cat w danym szczepie.
PCR przeprowadzono, aby potwierdzić delecję genu cat w locus amyE przy zastosowaniu starterów 32 i 33:
Starter 32: 5'-GCGGCCGCGGTACCTGTGTTACACCTGTT-3' (SEQ ID NO: 46)
Starter 33: 5'-GTCAAGCTTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGG-3' (SEQ ID NO: 47)
Chromosomalny DNA z potencjalnych szczepów z delecją wyizolowano stosując zestawy RED-extract-N-Amp™ Plant PCR (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) w następujący sposób: pojedyncze kolonie Bacillus zaszczepiono do 100 μl roztworu do ekstrakcji (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), inkubowano w 95°C przez 10 minut, a następnie rozcieńczono równą objętością roztworu do rozcieńczania (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). PCR przeprowadzono stosując 4 μl wyekstrahowanego DNA razem z mieszaniną REDextract-N-Amp PCR Reaction Mix oraz wymaganymi starterami zgodnie z instrukcjami producenta, z warunkami cykli PCR opisanymi w przykładzie 5. Produkty reakcji PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Sprawdzony szczep nazwano Bacillus subtilis RB187.
P r z y k ł a d 10. Konstrukcja Bacillus subtilis RB192
Szczep Bacillus subtilis RB184 odznakowano przez usuniecie genu oporności na chloramfenikol (gen cat). Przeprowadzono to stosując metodę opisaną poprzednio w przykładzie 9. Powstały szczep nazwano Bacillus subtilis RB192.
PL 212 928 B1
P r z y k ł a d 11. Konstrukcja Bacillus subtilis RB194
Bacillus subtilis RB194 skonstruowano przez delecję regionu cypX chromosomu Bacillus subtilis RB187 (przykład 9). Region cypX obejmuje gen cypX kodujący enzym typu cytochromu P450, który uczestniczy w syntezie czerwonego barwnika podczas fermentacji. Aby wydeletować ten region chromosomu skonstruowano plazmid pMRT086.
Region chromosomu, który niesie operony cypX-yvmC i yvmB-yvmA zamplifikowano metodą PCR z Bacillus subtilis BRG-1 jako pojedynczy fragment stosując startery 34 i 35. Bacillus subtilis BRG1 zasadniczo chemicznie zmutagenizowanym izolatem wytwarzającego amylazę szczepu Bacillus subtilis, który jest oparty na tle genetycznym Bacillus subtilis Α164Δ5 opisanym w przykładzie 5. Sekwencja tego regionu jest identyczna z opublikowaną sekwencją szczepu typu Bacillus subtilis 168.
Starter 34: 5'-CATGGGAGAGACCTTTGG-3' (SEQ ID NO: 48)
Starter 35: 5'-GTCGGTCTTCCATTTGC-3' (SEQ ID NO: 49)
Reakcje amplifikacji (50 μθ zawierały 200 ng chromosomalnego DNA Bacillus subtilis BRG-1, 0,4 μΜ każdy ze starterów 34 i 35, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP oraz dTTP, 1X bufor Expand High Fidelity (Roche Applied Science; Indianapolis, IN) z 1,5 mM MgCl2 oraz 2,6 jednostki mieszaniny enzymatycznej Expand High Fidelity PCR System (Roche Applied Science; Indianapolis, IN). Chromosomalny DNA Bacillus subtilis BRG-1 uzyskano stosując kolumnę QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Reakcje amplifikacji przeprowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 3 minuty; 10 cykli 95°C przez 1 minutę, 58°C przez 1 minutę i 68°C przez 4 minuty; 20 cykli 95°C przez 1 minutę, 58°C przez 1 minutę, 68°C przez 4 minuty plus 20 sekund na cykl, a następnie 1 cykl w 72°C przez 7 minut. Produkty reakcji analizowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym stosując 0,8% żel agarozowy i 0,5X bufor TBE. Powstały fragment zawierający operony cypX-yvmC i yvmB-yvmA sklonowano do pCR2.1 stosując zestaw TA-TOPO Cloning Kit i transformowano do komórek E. coli OneShot™ zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Transformanty selekcjonowano na agarowych płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano stosując kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA stosując startery do przodu M13 (-20) i do tyłu M13 oraz przedstawione poniżej startery 36 do 51. Powstały plazmid nazwano pMRT084 (fig. 19).
Starter 36: 5'-CGACCACTGTATCTTGG-3' (SEQ ID NO: 50)
Starter 37: 5'-GAGATGCCAAACAGTGC-3' (SEQ ID NO: 51)
Starter 38: 5'-CATGTCCATCGTGACG-3' (SEQ ID NO: 52)
Starter 39: 5'-CAGGAGCATTTGATACG-3' (SEQ ID NO: 53)
Starter 40: 5'-CCTTCAGATGTGATCC-3' (SEQ ID NO: 54)
Starter 41: 5'-GTGTTGACGTCAACTGC-3' (SEQ ID NO: 55)
Starter 42: 5'-GTTCAGCCTTTCCTCTCG-3' (SEQ ID NO: 56)
Starter 43: 5'-GCTACCTTCTTTCTTAGG-3' (SEQ ID NO: 57)
Starter 44: 5'-CGTCAATATGATCTGTGC-3' (SEQ ID NO: 58)
Starter 45: 5'-GGAAAGAAGGTCTGTGC-3' (SEQ ID NO: 59)
Starter 46: 5'-CAGCTATCAGCTGACAG-3' (SEQ ID NO: 60)
Starter 47: 5'-GCTCAGCTATGACATATTCC-3' (SEQ ID NO: 61)
Starter 48: 5'-GATCGTCTTGATTACCG-3' (SEQ ID NO: 62)
Starter 49: 5'-AGCTTTATCGGTGACG-3' (SEQ ID NO: 63) starter 50: 5'-TGAGCACGATTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 64) starter 51: 5'-CATTGCGGAGACATTGC-3' (SEQ ID NO: 65)
Plazmid pMRT084 strawiono BsgI aby wydeletować większość operonów cypX-yvmC i yvmB-yvmA, zostawiając około 500 zasad na każdym końcu. DNA strawiony BsgI potraktowano polimerazą DNA T4. Plazmid pECCl (Youngman i in., 1984, Plasmid 12: 1-9) strawiono Smal. Fragment wielkości około 5100 pz z pMRT084 oraz fragment wielkości około 1600 pz z pECCl wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta, zligowano ze sobą i transformowano do komórek E. coli XLl Blue zgodnie z instrukcjami producenta (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliną na ml. Transformanty niosące prawidłowy plazmid oraz delecję większości operonów cypX-yvmC i yvmB-yvmA zidentyfikowano metodą amplifikacji PCR ze starterami 52 i 53. Amplifikację PCR przeprowadzono w 50 μl reakcjach zawierających 1 ng plazmidowego DNA, 0,4 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM
PL 212 928 B1
MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze RoboCycIer 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 10 minut; 25 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Konstrukt ten nazwano pMRT086 (fig. 20).
Starter 52: 5'-TAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATA-3' (SEQ ID NO: 66)
Starter 53: 5'-CCGTCGCTATTGTAACCAGT-3' (SEQ ID NO: 67)
Plazmid pMRT086 zlinearyzowano Scal i transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis RB128 w obecności 0,2 μg chloramfenikolu na ml. Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB zawierających 5 μg chloramfenikolu na ml po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Chromosomalny DNA oczyszczono z kilku transformantów za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Kolonie oporne na chloramfenikol przebadano metodą PCR pod względem delecji operonów cypX-yvmC i yvmB-yvmA metodą PCR stosując startery 36 i 52, 36 i 53, 37 i 52 oraz 37 i 53. Amplifikację PCR przeprowadzono w 50 μl reakcjach zawierających 50 ng chromosomalnego DNA, 0,4 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 10 minut; 25 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkty PCR uwidoczniono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Powstały szczep Bacillus subtilis RB128 z delecją cypX-yvmC i yvmB-yvmA nazwano Bacillus subtilis MaTa17.
Kompetentne komórki Bacillus subtilis RB187 (przykład 9) transformowano genomowym DNA z Bacillus subtilis MaTa17. Genomowy DNA uzyskano z tego szczepu z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Pierwotne transformanty przesiano w celu wyizolowania pojedynczych kolonii na płytki TBAB zawierające 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Powstały szczep z delecją cypX-yvmC i yvmB-yvmA nazwano Bacillus subtilis RB194.
P r z y k ł a d 12. Konstrukcja Bacillus subtilis RB197
Bacillus subtilis RB197 jest bardzo podobny do Bacillus subtilis RB194, a jedyną różnica jest to, że RB197 zawiera mniejszą delecję w regionie cypX: tylko cześć genu cypX jest wydeletowana w tym szczepie, co wytwarza fenotyp cypX-. Aby wypełnić to zadanie, pMRT122 skonstruowano w sposób opisany poniżej.
Plazmid pCJ791 (fig. 21) skonstruowano przez strawienie plazmidu pSJ2739 (WO 96/23073) EcoRl/Hindlll i ligację z fragmentem zawierającym wydeletowaną formę genu wprA (proteaza serynowa ściany komórkowej) z Bacillus subtilis. Region 5' wprA amplifikowano za pomocą przedstawionych poniżej starterów 54 i 55 oraz region 3' amplifikowano za pomocą przedstawionych poniżej starterów 56 i 57 z chromosomalnego DNA uzyskanego z Bacillus subtilis DN1885 (Diderichsen i in., 1990, Journal of Bacteriology 172: 4315-4321).
Amplifikację PCR przeprowadzono w 50 μl reakcjach zawierających 1 ng chromosomalnego DNA Bacillus subtilis DN1885, 0,4 μΜ każdy ze starterów 39 i 40, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze RoboCycIer 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 10 minut; 25 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut.
5' i 3' wprA fragmenty PCR połączono przez strawienie BglIl, a następnie ligację i amplifikację PCR przeprowadzono na fragmentach mieszaniny ligacyjnej stosując startery 54 i 57. Amplifikację PCR przeprowadzono w 50 μl reakcjach zawierających 1 ng zligowanego fragmentu, 0,4 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 10 minut; 25 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Powstały fragment PCR wklonowano do pSJ2739 jako fragment EcoRl/Hindlll, otrzymując plazmid pCJ791 (fig. 21).
Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg kanamycyny na ml inkubacji w 28°C przez 24-48 godzin. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdzono przez amplifikację PCR ze starterami 54 i 57 w powyższych warunkach.
PL 212 928 B1
Starter 54: 5'-GGAATTCCAAAGCTGCAGCGGCCGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 68)
Starter 55: 5'-GAAGATCTCGTATACTTGGCTTCTGCAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 69)
Starter 56: 5'-GAAGATCTGGTCAACAAGCTGGAAAGCACTC-3' (SEQ ID NO: 70)
Starter 57: 5'-CCCAAGCTTCGTGACGTACAGCACCGTTCCGGC-3' (SEQ ID NO: 71)
Leżącą w górę sekwencję amyL oraz 5' region kodujący z plazmidu pDN1981 (opis patentowy US nr 5 698 415) zfuzowano ze sobą przez SOE stosując pary przedstawionych poniżej starterów 58/59 i 60/61. Powstały fragment wklonowano do wektora pCR2.1 z wytworzeniem plazmidu pMRT032 w następujący sposób. Amplifikację PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w 50 μl reakcjach zawierających 1 ng DNA pDN1981, 0,4 μΜ każdy z odpowiednich starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 950C przez 9 minut; 3 cykle 95°C przez 1 minutę, 52°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę; 27 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 5 minut. Produkt PCR uwidoczniono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Oczekiwane fragmenty miały wielkość odpowiednio 530 i 466 pz. Ostateczny fragment SOE wytworzono za pomocą pary starterów 59/60 i wklonowano do wektora pCR2.1 za pomocą zestawu TA-TOPO Cloning Kit. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg/ml ampicyliny po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA ze starterami do przodu M13 (-20) i do tyłu M13. Plazmid niosący fragment fuzyjny sekwencji amyL leżącej w górę/5' sekwencji kodującej nazwano pMRT032 (fig. 22).
Starter 58:
5'-CCTTAAGGGCCGAATATTTATACGGAGCTCCCTGAAACAACAAAAACGGC-3' (SEQ ID NO: 72)
Starter 59: 5'-GGTGTTCTCTAGAGCGGCCGCGGTTGCGGTCAGC-3' (SEQ ID NO: 73)
Starter 60: 5'-GTCCTTCTTGGTACCTGGAAGCAGAGC-3' (SEQ ID NO: 74)
Starter 61: 5'-GTATAAATATTCGGCCCTTAAGGCCAGTACCATTTTCCC-3' (SEQ ID NO: 75)
Plazmid pNNB194 (pSK+/pE194; opis patentowy US nr 5 958 728) strawiono NsiI i NotI oraz plazmid pBEST501 (Itaya i in., 1989 Nucleic Acids Research 17: 4410) strawiono PstI I NotI. Fragment o wielkości 5193 pz z wektora pNNB194 oraz fragment wielkości 1306 pz niosący gen neo z pBEST501 wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizolowane fragmenty zligowano ze sobą i zastosowano do stransformowania kompetentnych komórek E. coli SURE zgodnie z instrukcjami producenta. Oporne na ampicylinę transformanty selekcjonowano na płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml. Plazmidowy DNA wyizolowano z jednego takiego transformanta za pomocą zestawu QIAGEN Plasmid Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) i plazmid sprawdzono przez trawienie NsiI i NotI. Plazmid ten nazwano pNNB194neo (fig. 23).
Plazmid pNNB194neo strawiono SacI/NotI i traktowano polimerazą DNA T4 i dNTP z wytworzeniem tępych końców zastosowaniem zwykłych protokołów. Plazmid pPL2419 (opis patentowy US nr 5 958 728) strawiono Ecl136II. Fragment wektora wielkości 6478 pz z pNNB194neo i fragment wielkości 562 pz niosący oriT z pPL2419 wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone z żelu fragmenty zligowano ze sobą i zastosowano do transformacji komórek E. coli SURE zgodnie z instrukcjami producenta. Oporne na ampicylinę transformanty selekcjonowano na płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidowy DNA wyizolowano z jednego takiego transformanta za pomocą zestawu QIAGEN Plasmid Kit i plazmid zweryfikowano przez trawienie NsiI, SacI i BscI. Ten plazmid nazwano pNNB194neo-oriT (fig. 24).
Plazmid pNNB194neo-oriT strawiono BamHI i traktowano polimerazą DNA T4 i dNTP w celu wytworzenia tępych końców stosując zwykłe protokoły. Strawiony plazmid oczyszczo no z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczony plazmid potraktowano ligazą DNA T4 i zastosowano do transformacji komórek E. coli SURE zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty oporne na ampicylinę wyselekcjonowano na płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidowy DNA wyizolowano z jednego takiego transformanta za pomocą zestawu QIAGEN Plasmid Kit i dysrupcję miejsca BamHI potwierdzono przez trawienie BamHI i Scal. Powstały plazmid nazwano pShV3 (fig. 25).
PL 212 928 B1
Plazmid pShV2.1-amyEΔ (opis patentowy US nr 5 958 728) strawiono SfiI i NotI i fragment wektora o wielkości 8696 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Aby wstawić miejsce BamHI pomiędzy miejsca SfiI i NotI pShV2.1-amyEΔ skonstruowano syntetyczny linker w następujący sposób: startery 62 i 63 shybrydyzowano przez zmieszanie 50 μΜ każdego z nich, zagotowanie mieszaniny i zostawienie jej do powolnego ochłodzenia.
Starter 62: 5'-GGGCCGGATCCGC-3' (SEQ ID NO: 76)
Starter 63: 3'-ATTCCCGGCCTAGGCGCCGG-5' (SEQ ID NO: 77)
Oczyszczony wektor pShV2.1-amyEΔ i shybrydyzowane oligonukleotydy zligowano ze sobą i zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli SURE zgodnie z instrukcjami producenta. Oporne na chloramfenikol transformanty wyselekcjonowano na płytkach LB wzbogaconych 30 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Plazmidowy DNA wyizolowano z jednego takiego transformanta za pomocą zestawu QIAGEN Plasmid Kit i wstawienie miejsca BamHI potwierdzono przez trawienie BamHI. Plazmid ten nazwano pShV2.1-amyEΔB (fig. 26).
Plazmidy pShV3 i pShV2.1-amyEΔB strawiono SalI/HindIII. Fragment wektora o wielkości 7033 pz z pShV3 oraz fragment o wielkości 1031 pz niosący amyEΔ z pShV2.1-amyEΔ oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone z żelu fragmenty zligowano ze sobą i zastosowano do transformacji komórek E. coli SURE zgodnie z instrukcjami producenta. Oporne na ampicylinę transformanty selekcjonowano na płytkach 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml. Plazmidowy DNA wyizolowano z jednego takiego transformanta za pomocą zestawu QIAGEN Plasmid Kit i plazmid sprawdzono przez trawienie SalI i HindIII. Plazmid nazwano pShV3A (fig. 27).
Plazmid pMRT032 strawiono Kpnl/Xbal, wypełniono fragmentem Klenowa polimerazy DNA w obecności dNTP i fragment wielkości około 1000 pz wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Fragment ten wklonowano do plazmidu pShV3a strawiono EcoRV i transformowano do komórek E. coli XL1 Blue zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną SacI/SphI. Powstały plazmid nazwano pMRT036 (fig. 28).
Plazmid pMRT036 strawiono SalI/HindIII, wypełniono fragmentem Klenowa polimerazy DNA w obecności dNTP, zligowano i transformowano do komórek E. coli XL1 Blue zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg/ml ampicyliny po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną Sacl/Xbal, PstI i NdeI. Powstały plazmid nazwano pMRT037 (fig. 29).
Stabilizujący fragment scBAN/crylllA z plazmidu pDG268Aneo-cryIIIAstab/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) wyizolowano z 2% żelu agarozowego - 0,5X TBE jako fragment Sfil/SacI z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta, zligowano z plazmidem pMRT037 strawionym Sfil/SacI i transformowano do komórek E. coli XL1 Blue. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną PstI. Powstały plazmid strawiono pMRT041 (fig. 30).
Plazmidy pMRT041 i pCJ791 strawiono EcoRl/Hindlll. Fragment wielkości około 1300 pz z pMRT041 oraz fragment wielkości około 4500 pz z pCJ791 wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta, zligowano i transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis 168Δ4. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 30°C przez 24-48 godzin. Plazmidowy DNA z kilku transformantów wyizolowano za pomocą kolumn QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną SacI i EcoRl/Hindlll. Powstały plazmid nazwano pMRT064.1 (fig. 31).
PL 212 928 B1
Miejsce SacI w pozycji 2666 plazmidu pMRT064.1 wydeletowano przez SOE stosując przedstawione poniżej pary starterów 64 i 65 oraz 66 i 67. Amplifikację PCR przeprowadzono w 50 μl reakcjach zawierających 1 ng DNA pMRT064.1, 0,4 μΜ każdy ze starterów, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1X bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze RoboCycIer 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 10 minut; 25 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Oczekiwane fragmenty miały wielkość odpowiednio 400 i 800 pz. Ostateczny fragment do wklonowania z powrotem do pMRT064.1 amplifikowano za pomocą starterów 64 i 67. Ten fragment wklonowano do wektora pCR2.1 za pomocą zestawu TA-TOPO Cloning Kit. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg/ml ampicyliny po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Transformanty niosące prawidłowy plazmid sprawdzono przez sekwencjonowanie DNA za pomocą starterów M13 do przodu i do tyłu oraz starterów 65, 67 i 68. Plazmid ten nazwano pMRT068 (fig. 32) i dalej transformowano go do komórek E. coli DMl (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml.
Starter 64: 5'-GGAAATTATCGTGATCAAC-3' (SEQ ID NO: 78)
Starter 65: 5'-GCACGAGCACTGATAAATATG-3' (SEQ ID NO: 79)
Starter 66: 5'-CATATTTATCAGTGCTCGTGC-3' (SEQ ID NO: 80)
Starter 67: 5'-TCGTAGACCTCATATGC-3' (SEQ ID NO: 81)
Starter 68: 5'-GTCGTTAAACCGTGTGC-3' (SEQ ID NO: 82)
Miejsca SacI w pozycjach 5463 i 6025 plazmidu pMRT064.1 wydeletowano metodą amplifikacji PCR ze starterami 69 i 70 i stosując opisane powyżej warunki PCR. Powstały fragment wklonowano do wektora pCR2.1 za pomocą zestawu TA-TOPO Cloning Kit (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Transformanty niosące prawidłowy plazmid sprawdzono sekwencjonowanie DNA za pomocą starterów M13 do przodu i do tyłu. Konstrukt ten nazwano pMRT069 (fig. 33).
Starter 69: 5'-CTAGAGGATCCCCGGGTACCGTGCTCTGCCTTTTAGTCC-3' (SEQ ID NO: 83)
Starter 70 : 5'-GTACATCGAATTCGTGCTCATTATTAATCTGTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 84)
Plazmidy pMRT068 i pMRT064.1 strawiono Bell/AccI. Fragment wielkości około 1300 pz z pMRT068 oraz fragment wielkości około 3800 pz z pMRT064.1 wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta, zligowano i transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis 168Δ4. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 30°C przez 24-48 godzin. Transformanty niosące prawidłowy plazmid zidentyfikowano na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną SacI i EcoRl/AvaI. Powstały konstrukt nazwano pMRT071 (fig. 34).
Plazmidy pMRT071 i pMRT069 strawiono Aval/EcoRI. Fragment wielkości 578 pz z pMRT069 oraz fragment wielkości 4510 pz z pMRT071 wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta, zligowano i transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis 168Δ4. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 30°C przez 24-48 godzin. Transformanty niosące prawidłowy plazmid zidentyfikowano na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną SacI. Powstały konstrukt nazwano pMRT074 (fig. 35).
Plazmid pMRT084 opisany w przykładzie 11 strawiono SacII/NdeI, potraktowano polimerazą DNA T4, zligowano i transformowano do komórek E. coli XL1 Blue zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml po inkubacji w 37°C przez 16 godzin. Transformanty niosące prawidłowy plazmid zidentyfikowano na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną DraI. Powstały plazmid nazwano pMRT120 (fig. 36).
Plazmid pMRT074 strawiono HindIII, potraktowano fragmentem Klenowa polimerazy DNA i strawiono BcoRI. Plazmid pMRT120 strawiono EcoRI/Ecl136lI. Fragment wielkości około 600 pz z pMRT120 oraz fragment wielkości około 4300 pz z pMRT074 wyizolowano z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta, zligowano i transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis 168Δ4. Transformanty selekPL 212 928 B1 cjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 30°C przez 24-48 godzin. Transformanty niosące prawidłowy plazmid zidentyfikowano na 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE przez analizę restrykcyjną SspI. Powstały konstrukt nazwano pMRT122 (fig. 37).
Plazmid pMRT122 transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis Α164Δ5. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 30°C przez 24-48 godzin. Plazmid wprowadzono do chromosomu Bacillus subtilis Α164Δ5 przez homologiczną rekombinację w locus cypX przez inkubację świeżo wysianej płytki komórek Bacillus subtilis Α164Δ5 (pMRT086) w 45°C przez 16 godzin i selekcję zdrowych rosnących kolonii. Genomowy DNA wyizolowano z tego szczepu z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta i zastosowano do transformacji Bacillus subtilis RB187 (przykład 9). Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 45°C przez 16 godzin. W tej temperaturze replikon pE194 nie jest w stanie replikować się. Komórki są w stanie zachować oporność na erytromycynę tylko przez zachowanie plazmidu w chromosomie bakteryjnym.
Plazmid usunięto z chromosomu przez homologiczną rekombinację powodującą delecję części genu cypX na chromosomie przez hodowanie transformantów w pożywce Luria-Bertani (LB) bez selekcji w permisywnej temperaturze w 34°C przez wiele pokoleń. W tej temperaturze miejsce startu replikacji pE194 jest aktywne i w rzeczywistości wywołuje wycięcie plazmidu z chromosomu (Molecular Biological Methods for Bacillus, red. C. R. Harwood i S. M. Cutting, 1990, John Wiley and Sons Ltd.).
Po kilku pokoleniach wzrostu komórki wysiano na nieselektywne płytki agarowe LB i kolonie, które utraciły plazmid i teraz zawierały delecję cypX oraz wytwarzały kwas hialuronowy zidentyfikowano w następujący sposób:
(1) komórki przesiane na płytki minimalne były „mokre”, co wskazywało na wytwarzanie kwasu hialuronowego, (2) wrażliwość na erytromycynę oznaczała utratę plazmidu opartego na pE194 oraz (3) PCR przy zastosowaniu starterów 34 i 45 potwierdziła obecność delecji cypX wielkości 800 pz w danym szczepie.
Chromosomalny DNA z potencjalnych szczepów z delecją cypX wyizolowano stosując zestawy REDextract-N-Amp™ Plant PCR Kits w następujący sposób: pojedyncze kolonie Bacillus zaszczepiono do 100 μl do roztworu do ekstrakcji, inkubowano w 95°C przez 10 minut, a następnie rozcieńczono równą objętością roztworu do rozcieńczania. PCR przeprowadzono stosując 4 μl wyekstrahowanego DNA razem z mieszaniną REDextract-N-Amp PCR Reaction Mix oraz wymaganymi starterami zgodnie z instrukcjami producenta, z warunkami cykli PCR opisanymi w przykładzie 5. Produkty reakcji PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym - 0,5 x TBE. Sprawdzony szczep nazwano Bacillus subtilis RBl97.
P r z y k ł a d 13. Konstrukcja Bacillus subtilis RB200
Gen cypX Bacillus subtilis RB192 wydeletowano stosując takie same metody, jak opisane w przykładzie 9 dla Bacillus subtilis RB187. Powstały szczep nazwano Bacillus subtilis RB200.
P r z y k ł a d 14. Konstrukcja Bacillus subtilis RB202
Bacillus subtilis Α164Δ5ΑcypX skonstruowano w następujący sposób: plazmid pMRT122 (przykład 12) transformowano do kompetentnych komórek Bacillus subtilis Α164Δ5. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych TBAB wzbogaconych 1 μg erytromycyny i 25 μg linkomycyny na ml po inkubacji w 30°C przez 24-48 godzin. Plazmid wprowadzono do chromosomu Bacillus subtilis Α164Δ5 przez homologiczną rekombinację w locus cypX i inkubację świeżo wysianej płytki komórek Bacillus subtilis Α164Δ5 (pMRT086) w 45°C przez 16 godzin i selekcję zdrowych rosnących kolonii. Plazmid usunięto z chromosomu przez homologiczną rekombinację powodującą delecję części genu cypX na chromosomie przez hodowanie transformantów w pożywce Luria-Bertani (LB) bez selekcji w permisywnej temperaturze w 34°C przez wiele pokoleń. W tej temperaturze miejsce startu replikacji pE194 jest aktywne i w rzeczywistości wywołuje wycięcie plazmidu z chromosomu (Molecular Biological Methods for Bacillus, red. C. R. Harwood i S. M. Cutting, 1990, John Wiley and Sons Ltd.). Po kilku pokoleniach wzrostu komórki wysiano na nie selektywne płytki agarowe LB i kolonie, które utraciły plazmid i teraz zawierały delecję cypX oraz wytwarzały kwas hialuronowy zidentyfikowano w następujący sposób:
(1) wrażliwość na erytromycynę oznaczała utratę plazmidu opartego na pE194 oraz
PL 212 928 B1 (2) PCR przy zastosowaniu starterów 34 i 45 potwierdziła obecność delecji cypX wielkości 800 pz w danym szczepie w sposób opisany powyżej.
Sprawdzony szczep nazwano Bacillus subtilis Α164Δ5ΔcypX.
Wytworzono kompetentne komórki Bacillus subtilis A164.-\5.-\cypX i transformowano je genomowym DNA Bacillus subtilis TH1 (przykład 7) wyizolowanym z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB zawierających 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5ΔcypX hasA/hasB/hasC/hasD zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis RB201. Gen cat wydeletowano z Bacillus subtilis RB201 stosując tą samą metodę, co opisana w przykładzie 9. Powstały szczep nazwano Bacillus subtilis RB202.
P r z y k ł a d 15. Konstrukcja Bacillus subtilis MF002 (tuaD/gtaB)
Plazmid pHA3 (przykład 2, fig. 9) strawiono Asp718. Następnie, w strawionym plazmidzie wytworzono tępe końce, najpierw inaktywując enzym restrykcyjny w 85°C przez 30 minut. Tępe końce wytworzono przez dodanie 0,5 μl 10 mM każdego z dNTP, 1 μl 1 U/μΙ polimerazy DNA T4 i inkubację w 11°C przez 10 minut. Ostatecznie polimerazę inaktywowano inkubując reakcję w 75°C przez 10 minut. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono Notl. Następnie, najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 2522 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA (tuaD/gtaB) zligowano z opisanym poniżej DNA wektorowym.
Plazmid pDG268MCSΔneo/scBAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) strawiono Ecl136II. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono Notl. Największy fragment plazmidu wielkości około 6800 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
Odzyskany wektor i DNA wstawki zligowano za pomocą zestawu Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Przez transformacją do Bacillus subtilis opisaną powyżej ligację zlinearyzowano za pomocą Scal, aby zapewnić integrację do chromosomu raczej przez podwójny crossing-over niż pojedynczy crossing-over. Kompetentne komórki Bacillus subtilis 168Δ4 transformowano produktami ligacji strawionymi Scal.
Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml. Aby zbadać przesiewowo pod względem integracji plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE, pierwotne transformanty Bacillus subtilis przepikowano na płytki TBAB wzbogacone 6 μg neomycyny na ml i płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml w celu wyizolowania transformantów opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę.
Chromosomalny DNA wyizolowano z opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis 168Δ4 stosując zestawy REDextract-N-Amp™ Plant PCR (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) w następujący sposób: pojedyncze kolonie Bacillus zaszczepiono do 100 μl roztworu do ekstrakcji, inkubowano w 95°C przez 10 minut, a następnie rozcieńczono równą objętością roztworu do rozcieńczania. PCR przeprowadzono stosując 4 μl wyekstrahowanego DNA razem z mieszaniną REDextract-N-Amp PCR Reaction Mix oraz wymaganymi starterami zgodnie z instrukcjami producenta, z warunkami cykli PCR opisanymi w przykładzie 5.
Amplifikację PCR przeprowadzono na tych transformantach z zastosowaniem opisanych poniżej syntetycznych oligonukleotydów aby potwierdzić brak obecności/obecność i integralność genów hasA, gtaB i tuaD operonu transformantów Bacillus subtilis. Startery 3 i 8 zastosowano do potwierdzenia braku genu hasA, startery 71 i 15 do potwierdzenia obecności genu tuaD, startery 20 i 71 do potwierdzenia obecności genu gtaB. Produkty reakcji PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym 0,5X TBE. Sprawdzony szczep integrant Bacillus subtilis 168Δ4 hasA/tuaD/gtaB nazwano Bacillus subtilis RB176.
Starter 71: 5'-AACTATTGCCGATGATAAGC-3' (wiąże się w górę od tuaD) (SEQ ID NO: 85)
Genomowy DNA wyizolowano z opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis RB176 stosując kolumnę QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Genomowy DNA Bacillus subtilis RB176 zastosowano do transformacji kompetentnych komórek Bacillus subtilis Α164Δ5. Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloPL 212 928 B1 ramfenikolu na ml i hodowano w 37°C. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5 hasA/gtaB zidentyfikowano nazwano Bacillus subtilis RB177.
Gen cat wydeletowano z Bacillus subtilis RB177 stosując tą samą metodę, co opisana w przykładzie 9. Powstały szczep nazwano Bacillus subtilis MF002.
P r z y k ł a d 16. Konstrukcja plazmidu integracyjnego pel pRB162
Plazmid pDG268MCSΔneo/scBAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) podwójnie strawiono SacI i AatII. Największy fragment plazmidu wielkości około 6193 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisaną poniżej wstawką DNA.
5' i 3' fragmenty geny liazy pektanu Bacillus subtilis (pel, nr dostępu BG10840, SEQ ID NO: 86 [sekwencja DNA] i 87 [wyprowadzona sekwencja aminokwasowa]) zamplifikowano PCR z Bacillus subtilis 168 (BGSC 1A1, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH) za pomocą starterów 72 (wprowadza miejsce restrykcyjne 5' SpeI) i 73 (wprowadza miejsce restrykcyjne 3' SalI) dla 5' fragmentu pel oraz 74 (wprowadza miejsca restrykcyjne 5' Sacl/BamHI) i 75 (wprowadza miejsca restrykcyjne 3' Notl/Aatll) dla 3' fragmentu pel:
Starter 72: 5'-ACTAGTAATGATGGCTGGGGCGCGTA-3' (SEQ ID NO: 88)
Starter 73: 5'-GTCGACATGTTGTCGTATTGTGAGTT-3' (SEQ ID NO: 89)
Starter 74: 5'-GAGCTCTACAACGCTTATGGATCCGCGGCCGCGGCGGCACACACATCTGGAT-3' (SEQ ID NO: 90)
Starter 75: 5'-GACGTCAGCCCGTTTGCAGCCGATGC-3' (SEQ ID NO: 91)
Amplifikację PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach w 30 μl mieszaninach reakcyjnych zawierających 50 ng chromosomalnego DNA Bacillus subtilis 168, 0,4 μΜ każdy ze starterów pary 72/73 dla 5' fragmentu pel lub starterów pary 74/75 dla 3' fragmentu pel, 200 μΜ każdy z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1 x bufor PCR II z 2,5 mM MgCl2 oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold™. Reakcje prowadzono w termocyklerze RoboCycler 40 zaprogramowanym na 1 cykl 95°C przez 9 minut; 3 cykle 95°C przez 1 minutę, 52°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę; 27 cykli 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę oraz 1 cykl 72°C przez 5 minut. Produkt PCR uwidoczniono w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Oczekiwane fragmenty miały wielkość około 53 pz dla 5' fragmentu pel i 530 pz dla 3' fragmentu pel.
Fragmenty PCR 5' pel o wielkości 530 pz i 3' pel o wielkości 530 pz wklonowano do pCR2.1 za pomocą zestawu TA-TOPO Cloning Kit i transformowano do kompetentnych komórek E. coli One-Shot™ zgodnie z instrukcjami producenta. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml inkubowanych w 37°C. Plazmidowy DNA z tych transformantów oczyszczono z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję DNA wstawek potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA za pomocą starterów opisanych powyżej (starterów 72 i 73 dla 5' pel oraz starterów 74 i 75 dla 3' pel). Plazmidy niosące fragmenty PCR o wielkości 530 pz i 530 pz nazwano odpowiednio pCR2.1-pel5' i pCR2.1-pel3' (fig. odpowiednio 38 i 39).
Plazmid pCR2.1-pel3' podwójnie strawiono SacI i AatII. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 530 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
Odzyskany wektor (pDG268MCSΔneo/scBAN) i DNA wstawki (3' pel) zligowano stosując zestaw Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2 x YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C.
Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie SacI i AatII w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu Sacl/Aatll 3' pel wielkości około 530 pz i nazwano pRB161 (fig. 40).
Plazmid pRB161 podwójnie strawiono SpeI i Sall. Największy fragment plazmidu wielkości około 5346 pz oczyszczono z 0,8% żelu zgarozowego - 0,5X TBE za pomocą zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisaną poniżej wstawką DNA.
Plazmid pCR2.1-pel5' podwójnie strawiono SpeI i SalI. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 530 pz oczyszczono z 0,8% żelu zgarozowego - 0,5X TBE za pomocą zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
PL 212 928 B1
Odzyskany wektor (pDG268MCSΔneo/scBAN/pel3') i DNA wstawki (pel5') zligowano stosując zestaw Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml.
Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie SpeI i SalI w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu SpeI/Sall pel 5' wielkości około 530 pz i nazwano pRB162 (fig. 41).
P r z y k ł a d 17. Konstrukcja pRB156
Plazmid pHA7 (przykład 4, fig. 13) strawiono HpaI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono Asp178. Następnie, w strawionym plazmidzie wytworzono tępe końce, najpierw inaktywując enzym restrykcyjny w 85°C przez 30 minut. Tępe końce wytworzono przez dodanie 0,5 μl 10 mM każdego z dNTP i 1 μl 1 U^l polimerazy DNA T4 i inkubację w 11 °C przez 10 minut. Ostatecznie polimerazę inaktywowano inkubując reakcję w 75°C przez 10 minut. Następnie, największy fragment plazmidu wielkości około 8600 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA (pDG268Δneo-cryIIIAstab/sehasA) ponownie zligowano stosując zestaw Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli SURE (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml w 37°C. Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie Scal w 0,8% żelu agarozowym stosując 0,5X bufor TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez obecność fragmentu wielkości około 8755 pz i nazwano pRB156 (fig. 42).
P r z y k ł a d 18. Konstrukcja Bacillus subtilis MF009
Gen hasA pod kontrolą promotora scBAN wprowadzono w Iocus genu liazy pektanu (pel) Bacillus subtilis MF002 z wytworzeniem Bacillus subtilis MF009.
Plazmid pRB156 strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono NotI. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 1377 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA zligowano z opisanym poniżej DNA wektorowym.
Plazmid pRB162 (przykład 16, fig. 41) strawiono NotI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono SacI. Największy fragment plazmidu wielkości około 5850 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego - 0,5X TBE z użyciem zestawu QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisanym powyżej DNA wstawki.
Mieszaninę ligacyjną transformowano bezpośrednio do kompetentnych komórek Bacillus subtilis 168Δ4. Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg chloramfenikolu na ml w 37°C. Aby przeszukać pod względem integracji plazmidu przez podwójny crossing-over w locus pel, pierwotne transformanty Bacillus subtilis przepikowano na płytki TBAB wzbogacone 6 μg neomycyny na ml i płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml. Integracja plazmidu przez podwójny crossing-over w locus pel nie wprowadza genu oporności na neomycynę, a zatem czyni szczep wrażliwym na neomycynę. Przy zastosowaniu tego badania przesiewowego na płytkach wyizolowano transformanty oporne na chloramfenikol i wrażliwe na neomycynę.
Genomowy DNA wyizolowano z opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis 168Δ4 z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Ten genomowy DNA zastosowano do transformacji kompetentnych komórek Bacillus subtilis MF002 (przykład 15). Transformanty selekcjonowano na płytkach TBAB zawierających 5 μg chloramfenikolu na ml i hodowano w 37°C. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5 hasA i tuaD/gtaB zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis MF009.
P r z y k ł a d 19. Konstrukcja Bacillus subtilis MF010
Plazmid pDG268MCSΔneo/BAN/Sav (opis patentowy US nr 5 955 310) strawiono NotI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono SfiI. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około
PL 212 928 B1
185 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA zligowano z opisanym poniżej DNA wektorowym.
Plazmid pRB162 (przykład 16, fig. 41) strawiono NotI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono SfiI. Największy fragment plazmidu wielkości około 5747 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisanym powyżej DNA wstawki.
Odzyskany wektor i DNA wstawki zligowano za pomocą zestawu Rapid DNA Cloning Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E. coli XLI Blue. Transformanty selekcjonowano na płytkach agarowych 2X YT wzbogaconych 100 μg ampicyliny na ml.
Plazmidowy DNA oczyszczono z kilku transformantów z użyciem robota QIAGEN zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano przez trawienie BamHI w 0,8% żelu agarozowym - 0,5X TBE. Prawidłowy plazmid zidentyfikowano przez linearyzacje plazmidu, która wytwarzała fragment wielkości około 7156 pz i nazwano pRB164 (fig. 43).
Plazmid pRB156 (przykład 17, fig. 42) strawiono SacI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono NotI. Najmniejszy fragment plazmidu wielkości około 1377 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskaną wstawkę DNA zligowano z opisanym poniżej DNA wektorowym.
Plazmid pRB164 strawiono NotI. Następnie, strawiony plazmid oczyszczono z użyciem zestawu QIAquick DNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta i ostatecznie strawiono SacI. Największy fragment plazmidu wielkości około 5922 pz oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego w buforze 0,5X TBE stosując zestaw QIAquick DNA Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, odzyskany DNA wektorowy zligowano z opisanym powyżej DNA wstawki.
Tę mieszaninę ligacyjną transformowano bezpośrednio do kompetentnych komórek Bacillus subtilis 168Δ4. Oporne na chloramfenikol transformanty Bacillus subtilis selekcjonowano na płytkach TBAB wzbogaconych 5 μg of chloramfenikolu na ml w 37°C. Aby zbadać przesiewowo pod względem integracji plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE, pierwotne transformanty Bacillus subtilis przepikowano na płytki TBAB wzbogacone 6 μg neomycyny na ml i płytki TBAB wzbogacone 5 μg chloramfenikolu na ml. Integracja plazmidu przez podwójny crossing-over w locus amyE nie wprowadza genu oporności na neomycynę, a zatem czyni szczep wrażliwym na neomycynę. Przy zastosowaniu tego badania przesiewowego na płytkach wyizolowano transformanty oporne na chloramfenikol i wrażliwe na neomycynę.
Genomowy DNA wyizolowano z opornych na chloramfenikol i wrażliwych na neomycynę transformantów Bacillus subtilis 168Δ4 z użyciem kolumny QIAGEN tip-20 zgodnie z instrukcjami producenta. Ten genomowy DNA zastosowano do transformacji kompetentnych Bacillus subtilis MF002 (przykład 15). Transformanty selekcjonowano na minimalnych płytkach zawierających 5 μg chloramfenikolu na ml i hodowano w 37°C przez 16 godzin. Integrant Bacillus subtilis Α164Δ5 BAN/hasA i scBAN/tuaD/gtaB zidentyfikowano przez jego „mokry” fenotyp i nazwano Bacillus subtilis MF010.
P r z y k ł a d 20. Fermentacje
Zdolność szczepów Bacillus subtilis wymienionych w tabeli 1 do wytwarzania kwasu hialuronowego oceniono w różnych warunkach wzrostowych.
T a b e l a 1
Szczep B. subtilis Promotor/zestaw genów catΔ cypXΔ
1 2 3 4
RB161 scBAN/hasA/tuaD/gtaB nie nie
RB163 scBAN/hasA/tuaD/gcaD nie nie
TH-1 scBAN/hasA/hasB/hasC/hasD nie nie
RB184 scBAN/hasA/tuaD nie nie
RB187 scBAN/hasA/ tuaD/gtaB tak nie
PL 212 928 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4
RB192 scBAN/hasA/tuaD tak nie
RB194 scBAN/hasA/tuaD/gtaB tak tak
RB197 scBAN/hasA/tuaD/gtaB tak tak
RB200 scBAN/hasA/tuaD tak tak
RB202 scBAN/hasA/hasB/hasC/hasD tak tak
MF009 scBAN/tuaD/gtaB tak nie
scBAN/hasA
MF010 scBAN/tuaD/gtaB nie nie
BAN/hasA
Szczepy Bacillus subtilis fermentowano w typowych małych fermentorach w pożywce zawierającej na litr 6,5 g KH2PO4, 4,5 g Na2HPO4, 3,0 g (NH4)2SO4, 2,0 g Na3-cytrynian-2H2O, 3,0 g MgSO4 · 7H2O, 6,0 ml Mikrosoy-2, 0,15 mg biotyny (1 ml 0,15 mg/ml etanolu), 15,0 g sacharozy, 1,0 ml SB 2066, 2,0 ml P2000, 0,5 g CaCl2 · 2H2O. Pożywka miała pH 6,3 do 6,4 (nie ustawiane) przed autoklawowaniem. CaCl2 · 2H2O dodano po autoklawowaniu.
Pożywka do wysiewania stanowiła B-3, tj. Agar-3 bez agaru lub pożywka „S/S-1”. Pożywka Agar-3 zawiera na litr 4,0 g bulionu odżywczego, 7,5 g zhydrolizowanego białka, 3,0 g ekstraktu drożdżowego, 1,0 g glukozy i 2% agaru. pH nie ustawiano; pH przed autoklawowaniem wyniosło około 6,8; po autoklawowaniu około pH 7,7.
Pożywka w kolbie do wysiewania sacharoza/soja (S/S-1) zawierało na litr 65 g sacharozy, 35 g mąki sojowej, 2 g Na3-cytrynianu · 2H2O, 4 g KH2PO4, 5 g Na2HPO4 oraz 6 ml pierwiastków śladowych. Pożywkę doprowadzono do wartości pH około 7NaOH; po rozporcjowaniu pożywki do kolb dodano 0,2% olej roślinny, aby zahamować pienienie. Pierwiastki śladowe obejmowały na litr 100 g kwasu cytrynowego-H2O, 20 g FeSO4 · 7H2O, 5 g MnSO4 · H2O, 2 g CuSO4 · 5H2O i 2 g ZnCl2.
Wartość pH doprowadzono do 6,8-7,0 amoniakiem przed zaszczepieniem i kontolowano później, aby pozostało w zakresie pH 7,0 ± 0,2 amoniakiem i H3PO4. Temperaturę utrzymywano przy 37°C. Mieszanie maksymalnie ustawiono na częstotliwość 1300 RPM za pomocą 6-nożowych napędzanych wirników rushton o średnicy 6 cm w 3-litrowym zbiorniku o początkowej objętości 1,5 litrów. Napowietrzanie maksymalnie wynosiło 1,5 VM.
Do uzupełniania zastosowano prosty roztwór sacharozy. Uzupełnianie rozpoczęto po około 4 godzinach od zaszczepienia, gdy rozpuszczony tlen (D.O.) nadal spadał (tj. przed wyczerpaniem sacharozy). Tempo uzupełniania przebiegało stopniowo liniowo od 0 do około 6 g sacharozy/L0-h przez 7 godzin. W niektórych fermentacjach zastosowano także powolniejsze tempo uzupełniania przebiegające stopniowo liniowo od 0 do około 2 g sacharozy/L0-h.
Lepkość można było zauważyć po około 10 godzinach i po 24 godzinach lepkość była bardzo wysoka, powodując spadek D.O. do najniższego poziomu. Lepkość w punkcie końcowym osiągnęła 3220 cP. Rozwój masy komórek osiągnął poziom bliski do maksymalnego (12 do 15 g/litr) przez 20 godzin. Komórki usuwano przez rozcieńczenie jednej części hodowli trzema częściami wody, dokładne zmieszanie i odwirowanie przy około 30000 x g z wytworzeniem czystego supernatantu i osadu komórek, który następnie można było przemyć i wysuszyć.
Testy na stężenie kwasu hialuronowego przeprowadzano metodą ELISA, w oparciu o białko wiążące hialuronan (białko i zestawy są dostępne w handlu z Seikagaku America, Falmouth, MA).
Bacillus subtilis RB161 i RB163 hodowano w fermentacjach porcjowanych i uzupełnianychporcjowanych. W procesach uzupełnianych-porcjowanych tempo uzupełniania różniło się pomiędzy hodowlami szczepów Bacillus subtilis RB163 i RB161. Testy na stężenia kwasu hialuronowego ponownie przeprowadzono stosując metodę ELISA. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.
PL 212 928 B1
T a b e l a 2
Szczep i warunki hodowli HA (względna wydajność) mierzona metodą ELISA
RB-161 (hasA/tuaD/gtaB) proste porcjowanie 0,7 ± 0,1
RB-163 (hasA/tuaD/gcaD) porcjowane-uzupełniane ~ 6 g sacharozy/L0-h 0,9 ± 0,1
RB 161 (hasa/tuaD/gtaB) porcjowane-uzupełniane ~ 6 g sacharozy/L0-h 0,9 ± 0,1
RB-163 (hasa/tuaD/gcaD) porcjowane-uzupełniane ~ 2 g sacharozy/L0-h 1,0 ± 0,2
RB 161 (hasa/ tuaD/gtaB) porcjowane-uzupełniane ~ 2 g sacharozy/L0-h 1,0 ± 0,1
Wyniki z testów hodowli dla tego samego szczepu przy porcjowanym uzupełnianiu 2 g/L sacharozy/L0-h porównane z uzupełnianiem 6 g/L sacharozy/L0-h wykazały, że szybsze tempo uzupełniania nie poprawiło istotnie mian. Podsumowanie wyników dla szczepów Bacillus hodowanych w takich samych warunkach (porcjowane uzupełnianie przy około 2 g sacharozy/L0-h, 37°C) przedstawiono na fig. 44. Na fig. 44 ± wartości wskazują odchylenia standardowe danych z kilku powtórzeń w tych samych warunkach. Dane bez ± wartości pochodzą z pojedynczych doświadczeń. Stężenia kwasu hialuronowego oznaczano stosując zmodyfikowaną metodę karbazolową (Bitter i Muir, 1962, Anal. Biochem. 4: 330-334). Podsumowanie wagowych średnich mas cząsteczkowych (MDa) kwasu hialuronowego uzyskanych z fermentacji rekombinowanych szczepów Bacillus subtilis w tych samych warunkach (porcjowane uzupełnianie przy około 2 g sacharozy/L0-h, 37°C) przedstawiono na fig. 45. Masy cząsteczkowe oznaczono stosując test GPC MALLS. Dane zebrano z testów GPC MALLS stosując następującej procedury. GPC-MALLS (chromatografia żelowo-permeacyjna lub z wykluczeniem wielkości) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła lasera) szeroko stosuje się do charakteryzacji mas cząsteczkowych (MW) polimerów. Rozdział polimerów osiąga się przez GPC, w oparciu różnicowy podział cząsteczek o różnych MW pomiędzy fazą ruchomą a złożem. Średnią masę cząsteczkową poszczególnych polimerów oznacza się przez MALLS w oparciu o różnicowy stopień/kąt rozpraszania cząsteczek o różnej MW. Zasady GPC-MALLS oraz protokoły dostosowane do kwasu hialuronowego opisano w Ueno i in., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; oraz Wyatt Technologies, 1999, „Light Scattering University DAWN Course Manual” I „DAWN EOS Manual” Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California). Zastosowano izokratyczną HPLC Agilent 1100, kolumnę Tosoh Biosep G6000 PWx1 do GPC i Wyatt Down EOS do MALLS. Detektor współczynnika załamania Agilent G1362A podłączono za MALLS aby mierzyć stężenie eluatu. Różne handlowe produkty kwasu hialuronowego o znanej masie cząsteczkowej zastosowano jako wzorce.
Zdeponowanie materiału biologicznego
Poniższy materiał biologiczny zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604 i nadano mu następujący numer dostępu:
Depozyt Nr dostępu Data depozytu
E. coli XL10 Gold kan (pMRT106) NRRL B-30536 12 grudzień 2001
Szczep zdeponowano na zasadach umożliwiających dostęp do osobie wyznaczonej przez Komisarza Patentów i Znaków Towarowych upoważnionego do tego na podstawie 37 C.F.R. §1.14 i 35 U.S.C. 122. Depozyt stanowi zasadniczo czystą hodowlę zdeponowanego szczepu. Depozyt jest dostępny, gdy jest to wymagane przez prawa patentowe innych państw w krajach, w których złożono odpowiedniki tego zgłoszenia lub jego pochodne. Jednakże, należy zdawać sobie sprawę, że dostępność do depozytu nie stanowi zezwolenia na realizację wynalazku z naruszeniem praw patentowych nadanych przez władze. Zakres wynalazku tutaj opisanego i zastrzeganego nie jest ograniczony przez specyficzne ujawnione tutaj postaci, gdyż postaci te zamieszczono tylko w celu zilustrowania kilku aspektów wynalazku. Jakiekolwiek równoważne postaci są objęte zakresem wynalazku. W rzeczywistości różne modyfikacje wynalazku dodatkowe względem tutaj przedstawionych i opisanych będą oczywiste dla specjalistów w dziedzinie wynalazku z powyższego opisu. Takie modyfikacje są także objęte zakresem dołączonych zastrzeżeń. W przypadku konfliktu ograniczenie będzie wynikać z niniejszego ujawnienia, włącznie z definicjami. Zacytowano tutaj różne publikacje, których ujawnienia wprowadza się jako pozycje literaturowe w całości.
PL 212 928 B1
Wykaz sekwencji <110» Ncwozymes Biopharma DK A/S <12O> Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego i komórka gospodarz Bacillus <130» 10241.204-WO <15Q> OS 50/342,544 <1S1> 2001-12-21 <160> 108 <170» Patentin wersja 3.1 <210» 1 <211» 1251 <212> DNA <213> Streptococcus eguisimilis <220» <221» CDS <222» (1)..(1251) <223» <400» 1
ątg aga Met Arg 1 aca Thr tta Leu aaa Lys 5 aac Asn ctc Leu ata Ile act Thr gtt Val 10 gtg Val gcc Ala ttt Phe agt Ser att Ile- 15 ttt Phe 48
tgg gta ctg ttg att tac gtc aat gtt tat ctc ttt ggt get aaa gga 96
Trp Val Leu Leu Ile Tyr Val Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Gly
20 25 30
agc ttg tea att tat ggc ttt ttg ctg ata get tac eta tta gtc aaa 144
Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Val Lys
35 40 45
atg tcc tta tcc ttt ttt tac aag cca ttt aag gga agg get 9S3 caa 192
Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lye Pro Phe Lys Gly Arg Ala Gly Gin
50 55 60
tat aag gtt gca gcc att att ccc tet tat aac gaa gat get gag tea 240
Tyr Lys Val Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser
65 70 7Ξ 60
ttg eta gag acc tta aaa agt gtt cag cag caa acc tat ccc eta gca 283
Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gin Gin Gin Thr Tyr Pro Leu Ala
85 SO 95
gaa att tat gtt gtt gac gat gga agt get gat gag aca ggt att aag 336
Glu Ile Tyj- val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asp Glu Thr siy Ile Lys
100 105 110
ege att gaa gac tat gtg cgt gac act ggt gac eta tea agc aat gtc 384
Arg- Ile Glu Asp Tyr val Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn Val
115 120 125
att gtt cac cgg tea gaa aaa aat caa aag cgt cat gca cag gcc 432
Ile Val His Arg Ser Glu Lys Asn Gin Gly Lys Arg His Ala Gin Ala
130 135 140
PL 212 928 B1 tgg gcc ttt gaa aga tca gac gct gat gtc ttt ttg acc gtt gac tca 4B0
Trp Ala Phe Glu Arg Sar Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser
145 150 155 160
gat Asp act Thr tat Tyr atc Ile tac Tyr 165 cct Pro gat Asp gct tta Ala Leu gag gag ttg tta 3.3-3. Lys acc Thr 175 ttt Phe 523
Glu Glu 170 Leu Leu
aat gac cca act gtt ttt gct gcg ćlc<3 ggt C3C ctt sst gtc aga aat 576
Asn Asp Pro Thr val Phe Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn
130 135 190 aga caa acc aat etc tta aca ege ttg ara gat att ege tat gat aat 624
Arg Gin Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn
195 200 205 gct ttt ggc gtt gaa ega gct gcc caa tcc gtt aca ggt aat att etc 672
Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Git Sar Val Thr Gly Asn Ile Leu
210 215 220
gtt tgc tca gg^. ccg ctt age gtt tac aga ege gag 9^3 gtt gtt cct 720
Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val Pro
225 230 235 240
aac ata gat aga tac atc aac cag acc ttc ctg ggt att cct gta agt 768
Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gin Thr Phe Łeu Gly Ile Pro Val Ser
245 250 255
atc ggt gat gac agg tgc ttg acc aac tat gca act gat tta gga aag 816
Ile Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys
260 255 270
act gtt tat caa tcc act gct aaa tgt att aca gat gtt cct gac aag 864
Thr Val Tyr Gin Ser Thr Ala Lys Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys
273 280 285
atg tet act tac ttg aag cag caa aac ege tgg aac aag tcc ttc ttt 912
Met Ser Thr Tyr Leu Lys Gin Gin Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe
290 295 300
aga gag tcc att att tet gtt aag Seta atc atg aac aat cct ttt gta 960
Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val
305 310 315 320
gcc eta tgg acc ata ctt gag gtg tet atc ttt atg atg ctt gtt tat 1008
Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr
325 330 335
tet Stg gtg gat ttc ttt gta gac aat gtc aga gaa ttt gat tgg ctc 1056
Ser Val Val Asp Phe Phe Val Asp Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu
340 345 350
agg gtt ttg gcc ttt ctg gtg att atc ttc att gtt gct ctt tgt cgt 1104
Arg Val Łeu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg
355 360 365
aat att cac tat atg ctt aag cac ccg ctg tcc ttc ttg tta tet ccg 1152
Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Łeu Ser Phe Leu Leu Ser Pro
370 375 380
PL 212 928 B1
ttt Phe 385 tat ggg gta ctg cat ttg His Leu 390 ttt gtc eta cag ccc ttg aaa ttg tat 1200
Tyr Gly Val Leu Phe Val Leu Gin 395 Pro Leu Lys Leu Tyr 400
tct ett ttt act att aga aat get gac tgg gga aca cgt aaa aaa tta 124S
Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Aza, Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu
405 410 415 tta 1251
Leu <210> 2 <211> 417 <212> PRT <213> Streptococcus eguisimilis <400> 2
Met Arg Thr Leu Lys Asn Leu Ile Thr Val Tal Ala Phe Ser Ile Phe 1 S 10 15
Trp Tal Leu Leu Ile Tyr Tal Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys 51 y 20 25 30
Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Tai Lys 35 40 45
Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lys Pro ~he Lys Gly Arg Ala Gly Gin S0 55 60
Pyr Lys Tal Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn, Glu Asp Ala Glu Ser S5 70 75 80
Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gin Gin Gin Thr Tyr Pro Leu Ala 85 90 95
Glu Ile Tyr Tal Tal As? As? Gly Ser Ala Asę Glu Thr Gly Ile Lys 100 105 110
Arg Ile Glu Asp Tyr Tal Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn. Tal 115 * 120 125
Ile Tal His Arg Ser Glu Lys Asn Gin Gly Lys Arg His Ala Gin Ala 130 135 140
Trp Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Tal Phe Leu Thr Val Asp Ser 145 150 155 160
Asp Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe
PL 212 928 B1
165
170
175
Asu Asp Pro Thr Val Pli© Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn 130 185 190
Arg Gin Thr Asn Len Leu Thr Arg Len Thr As? Ile Arg Tyr As? Asn 195 200 205
Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gin Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu 210 215 220
Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val Pro 225 230 235 240
Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gin Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Ser 245 250 255
Ile Gly Asp Asp Arg Cys Len Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys 260 265 270
Thr Val Tyr Gin Ser Thr Ala Lys Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys . 275 280 285
Met Ser Thr Tyr Len Lys Gin Gin Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe 290 295 300
Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val 305 310 315 320
Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr 325 330 335
Ser Val Val Asp Phe Phe Val Asp Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu 340 345 350
Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg 355 360 365
Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Leu Ser Phe Leu Leu Ser Pro 370 375 380
Phe Tyr Gly Val Leu His Leu Phe Val Leu Gin Pro leu Lys Leu Tyr 395 390 395 400
Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu 405 410 415
PL 212 928 B1
Leu <210> 3 <211> 49 <2X2> DMA <2I3> straptococcus eąuisimilis <400> 3 gagctctata aaaatgagga gggaaccgaa tgagaacatt aaaaaacct 49 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> streptococcus eguiaimilis <400> 4 gttaacgaat fccagctatgt aggtacctta taataatttt ttacgtgt 43 <210> 5 <211> 20 <2X2> DMA _ <213> Straptococcus eąulsimiiis <400> S gttgacgatg gaagtgctga 20 <2X0> S <2X1> 20 <212> DNA <21?> Streptococcus eąuisimilis <400> S afcccgttaca ggtaatatec 20 <210> 7 <211>’ 20 <212> DMA <213> straptococcus eguisimilis <4QQ3> 7 tccttttgfca gccctafcgga 20 <2l0> a <211> 20 <212> DNA <213 > Streptococcus eguisimilis <400> S tcagcacttc catcgtcaac 20 <210> 9
PL 212 928 B1 <211> 20 <212s DNA <213> Streptococcus eąuisimilis <400> 9 ggatattacc tgtaacggat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Streptococcus ecuisimilis
<4C0> 10
tccatagggc tacaaaagga 20 <210> 11 <211> 1333 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (1),.(1333) <223>
<400> 11
Stg Val 1 aaa aaa ata get gtc att gga aca ggt tat gta gga ccc gta cca 43
Lys Lys Ile Ala 5 Val Ile Gly Thr Gly 10 Tyr Val Gly Leu Val Ser 15
ggc act tgc ttt gcg gag atc gg= aat aaa gtt gtt tgc tgt gat atc 95
Gly Thr Cys Phe Ala Glu Ile Gly Asn Lys Val Val Cys Cys Aso Ile
20 25 30
gat gaa tea aaa atc aga age ctg aaa aat ggg gta atc cca atc tat 144
Asp Glu Ser Lyg Ile Arg Ser Leu Lys Asn Gly Val Ile Pro Ile Tyr
35 40 45
CJclcl cca ggs ctt gca gac tta gtt gaa aaa aat □tg ctg gat cag ege 192
Glu Pro Gly Leu Ala Asp Leu Val Glu Lys Asn Val Leu Asp Gln Arg
50 55 so
ctg acc ttt acg aac gat atc ccg tet gee att ega gee tea gat att 240
Leu Thr Phe Thr Asn Asp Ile Pro Ser Ala Ile Arg Ala Ser Asp Ile
S5 70 75 80
att fcat att gca gtc gga acg cct atg tcc aaa aca ggt gaa get gat 238
Ile Tyr Ile Ala Val Gly Titr Pro Met Ser Lys Thr Gly Glu Ala Asp
35 SC 95
tta a cg tac gtc aaa gcg gcg gcg aaa aca atc ggt gag cat ctt aac 335
Leu Thr Tyr Val Lys Ala Ala Ala Lys Thr Ile Gly Glu His Leu Asn
100 105 110
ggc tac aaa gtg atc gta aat aaa age aca gtc ccg gtt gga aca ggg 384
Gly rpy-£. Lys Val Ile Val Asn Lya Ser Thr Val Pro Val Gly Thr Gly
115 120 125
aaa Cta 3tg caa tet atc gtt caa aaa gee tea aag ggg aga tac tea 432
PL 212 928 B1
Lys Leu Val 130 Gin Ser Ile Val 135 Gin Lys Ala Ser Lys 140 Gly Arg Tyr Ser
ttt gat gtt gta tcfc aac cct gaa ttc ctt cgg gaa ggg tca gcg att
Phe Asp Val Val Ser Asn Pro Glu Phe Leu Arg G3.U Gly Ser Ala Ile
145 150 155 ISO
cat gac acg atg aat atg gag cgt gcc gtg att ggt tca aca agt cat
His Asp Thr Met Asn Met Glu Arg Ala Val Ile Gly Ser Thr Ser His
165 170 175
aaa gcc gct Lys Ala Ala gcc Ala 180 atc Ile att gag gaa ctt Leu 135 cat His cag cca ttc cat gct Phe His Ala ISO cct Pro 576
Ile Glu Glu Gin Pro
gtc att aaa aca aac eta gaa agt gca gaa atg att aaa tac gcc gcg 624
Val Ile Lys Thr Asn Leu Glu Ser Ala Glu Met Ile Lys Tyr Ala Ala
195 200 205 aat gca ttt ctg gcg aca aag att tcc ttt atc aac gat atc gca aac 672
Asn Ala Phe Leu Ala Thr Lys Ile Ser Phe Ile Asn Asp Ile Ala Asn
210 215 220
att tgt gag ega gtc ggc gca gac gtt tca aaa gtt gct gat ggt gtt 72 0
Ile Cys Glu Arg Val Gly Ala Asp Val Ser Lys val Ala Asp Gly Val
225 230 235. 24 0
ggt ctt gac agc cgt atc ggc sga aag ttc ctfc aaa gct 9®t att gga 768
Gly Leu Asp Ser Arg Ile Gly Arg Lys Phe Leu Lys Ala Gly ile Gly
245 250 255
ttc ggc ggt tca tgt ttt cca aag gat aca acc gcg ctt caa atc SIS
Phe Gly Gly Ser Cys Phe Pro Lys Asp Thr Thr Ala Leu Leu Gin ile
260 255 270
gca aaa tcg gca ggc tat cca ttc aag ctc atc gaa gct gtc att gaa a £4
Ala Lys Ser Ala Gly Tyr Pro Phe Lys Leu Ile Glu Ala Val Ile Glu
275 280 285
acg aac gaa aag cag cgt gtt cat att gta gat aaa ctt ttg act gtt 912
Thr Asn. Glu Lys Gin Arg Val His Ile Val Asp Lys Leu Leu Thr Val
290 295 300
atg gga agc gtc aaa ggg aga acc att tca gtc ctg gga tta gcc ttc 960
Met Gly Ser Val Lys Gly Arg Thr Ile Ser Val Leu Gly Leu Ala Phe
305 310 315 320
aaa ccg aat acg aac gat gtg aga tcc gct cca gcg ctt gat att atc 1008
Lys Pro Asn Thr Asn Asp Val Arg Ser Ala Pro Ala Leu Asp Ile Ile
325 330 335
cca atg ctg cag cag ctg ggc gcc cat gta aaa gca tac gat ccg att 1056
Pro Met Leu Gin Gin Leu Gly Ala His Val Lys Ala Tyr Asp Pro Ile
340 345 350
gct att cct gaa gct tca gcg atc ctt ggc gaa cag gtc gag tat tac 1104
Ala Ile Pro Glu Ala Ser Ala Ile Leu Gly Glu Gin Val Glu Tyr Tyr
355 360 3S5
aca gat gtg tat gct gcg atg caa gac act gat gca tgc ctg att tta 1152
Thr Asp Val Tyr Ala Ala Met Glu Asp Thr Asp Ala Cys Leu Ile Leu
PL 212 928 B1
370
375
380 acg gat tgg ccg gaa gtg aaa gaa atg gag ctt gta aaa gtg aaa acc Thr Asp Trp Pro Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Val Lys Val Lys Thr 385 350 355 400
1200
Ctc tta aaa cag cca gtc atc att gac ggc aga aat tta ttt tca ctt Leu Leu Lys Gin Pro Val Ile Ile Asp Gly Arg Asn Łeu Phe Ser Leu
405 410 415
1243 gaa gag atg cag gca gcc gga tac att tat cac tcfc atc ggc cgt ccc Glu Glu Met Gin Ala Ala Gly Tyr Ile Tyr His Ser Ile Gly Arg Pro
420 425 430
1296 gct gtt cgg gga acg gaa ccc tct gac aag tat ttt ccg ggc ttg ccg Ala Val Arg Gly Thr Glu Pro Ser Asp Lys Tyr phe Pro Gly Leu Pro
435 440 445
1344 ctt gaa gaa ttg gct aaa gac ttg gga agc gtc aat tta Leu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Leu Gly Ser Val Asn Leu 450 455 460
1383
<2I0> 12
<211> 461
<212>
<213> Bacillus
<400> 12
Val Lys Lys Ile
Gly Thr Cys Phe Ala Glu Ile Gly Asn Lys Val Val Cys Cys Asp Ile 20 25 30
Asp Glu Ser Lys Ile Arg Ser Leu Lys Asn Gly Val Ile Pro Ile Tyr 35 40 45
Glu Pro Gly Leu Ala Asp Leu Val Glu Lys Asn Val Leu Asp Gin Arg
S5 ' 60 *
Leu Thr Phe Thr Asn Asp Ile Pro Ser Ala Ile Arg Ala Sar Asp 11« 95 70 75 80
Ile Tyr Ile Ala Val Gly Thr Pro Met Ser Lys Thr Gly Glu Ala Asp 35 90 95
3eu Thr Tyr Val Lys Ala Ala Ala Lys Thr Ile Gly Glu His Leu Asn 100 105 110
Gly Tyr Lys 7=1 Ile Val Asn Lys Ser Thr Val Pro 7al Gly Thr Gly 115 120 125
PL 212 928 B1
Lys Leu Val Gin Ser Ile Val Gin Lys Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ser 130 135 140
Phe Asp Tal Val Ser Asn Pro Glu Phe Leu Arg Glu Gly Ser Ala Ile 145 150 155 ISO
His Asp Thr Met Asn Met Glu Arg Ala Val Ile Gly Ser Thr Ser His 155 170 175
Lys Ala Ala Ala Ile Ile Glu Glu Leu His Gin Pro Phe His Ala Pro 180 185 190
Val Ile Lys Thr Asn Leu Glu Ser Ala Glu Met Ile Lys Tyr Ala Ala 195 200 205
Asn Ala Phe Leu Ala Thr Lys Ile Ser Phe Ile Asn Asp Ile Ala Asn 210 215 220
Ile Cys Glu Arg val Gly Ala Asp Val Ser Lys. Val Ala Asp Gly Val 22S 230 235 240
Gly Leu Asp Ser Arg Ile Gly Arg Lys Phe Leu lys Ala Gly Ile Gly 245 250 255
Phe Gly Gly Ser Cys Phe Pro Lys Asp Thr Thr Ala Leu Leu Gin Ile 250 26S 270
Ala Lys Ser Ala Gly Tyr Pro Phe Lys Leu Ile Glu Ala Val Ile Glu 275 280 285
Thr Asn Glu Lys Gin Arg Val His Ile Val Asp Lys Leu Leu Thr Val 290 295 300
Met Gly Ser Val Lys Gly Arg Thr Ile Ser Val Leu Gly Leu Ala Phe 305 310 315 320
Lys Pro Asn Thr Asn Asp Tal Arg Ser Ala Pro Ala Leu Asp Ile Ile 325 330 335
Pro Met Leu Gin Gin Leu Gly Ala His Val Lys Ala Tyr Asp Pro Ile 340 345 350
Ala Ile Pro Glu Ala Ser Ala Ile Leu Gly Glu Gin Val Glu Tyr Tyr 355 360 365
PL 212 928 B1
Thr Asp Val Tyr Ala Ala Met Glu 375 Asp Thr Asp Ala Cys 380 Leu Ile Leu
370
Thr Asp Trp Pro Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Tal Lys Val Lys Thr
385 330 3 95 400
Leu Leu Lys Gin Pro Tal Ile Ile Asp Gly Arg Asn Leu Phe Ser Leu
405 41G 415
Glu Glu Met Glu Ala Ala Gly Tyr Ile Τντ His Ser Ile Gly Arg Pro
420 425 430
Ala Val Arg Gly Thr Glu Pro Ser Asp Lys Tyr Phe Pro Gly Leu Pro
435 440 445
Leu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Leu Gly Ser Tal Asn Leu
450 455 460
<210> 13 <211> 26 <212 > DNA <213> Sacillue subtilis <400> 13 ggtaccgaca ctgcgaccat tataaa <210> 14 <211> 49 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 14 gttaacgaat tccagctatg tatctagaca gcttcaacca agtaacact <21O> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 15 agcatcttaa cggctacaaa <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> sacillus subtilis <400> 16 tgtgagcgag tcggcgcaga <210s 17
PL 212 928 B1
<210> 21 <211> 376 <212 > DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> ί1)..!376) <223>
<400> 21
atg aaa aaa gta Val cgt aaa gcc Alu ata Ile att Ile cca gca gca gcc tta gga aca 4B
Met Lys 1 Lys Arg 5 Lys Pro 10 Ala Ala Gly Leu Gly 15 Thr
cgt ttt ctt ccg gct acg aaa gca atg ccg aaa aaa atg ctt cct atc 96
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Met Prc Lys Glu Met Leu Pro Ile
20 25 30
gtt gat aaa cct acc att caa tac ata att gaa aaa gct gtt gaa gcc 144
Val Asp Lys Pro Thr Ile Gin Tyr Ile Ile Glu Glu Ala Val Glu Ala
35 40 45
ggt att gaa gat att att atc gta aca gga aaa agc aag cgt gcg att 192
Gly Ile Glu Asp Ile Ile Ile Val Thr Gly Lys Ser Lys Arg Ala Ile
50 55 50
PL 212 928 B1
gag gat cat ttt gat tac Asp Tyr 70 tet cct gag ctt gaa aga aac eta Leu gaa gaa Glu Glu ao 240
Glu Asp 65 His Phe Ser Pro Glu Leu Glu 75 Arg Asn
aaa gga aaa act gag ctg ctt gaa aaa gtg aaa aag get tet aac ctg 2S3
Lys Gly lys Thr Glu Leu Leu Glu Lys Val Lys Lys Ala Ser Asn Leu
85 90 95
get gac att cac tat atc ege caa aaa gaa cct aaa ggt ctc gga cat 336
Ala Asp Ile His Tyr Ile Arg Gin Lys Glu Pro Lys Gly Leu Gly His
100 105 110
get gtc tgg tgc gca ege aac ttt atc ogc gat Sag ccg ttt gcg gta 384
Ala Val Trp Cys Ala Arg Asn Phe Ile Gly Asp Glu Pro Phe Ala Val
115 120 125
ctg ctt ggt gac gat att gtt cag get gaa aefc cca ggg ttg ege caa 432
Leu Lsu Gly Asp Asp Ile Val Gin Ala Glu Thr Pro Gly Leu Arg Gin
130 135 140
tta atg gat gaa tat gaa aaa aca ctt tet tet att atc ggt gtt cag 480
Leu Met Asp Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Ser Ser Ile Ile Gly Val Gin
145 150 155 160
cag gtg CCC gaa gaa gaa aca cac ege tac ggc att att gac ccg ctg E28
Gin Val Pro Glu Glu Glu Thr His Arg Tyr Gly Ile Ile Asp Pro Leu
165 170 175
aca agt gaa ggc ege cgt tat cag gtg aaa aac ttc gtt gaa aaa ccg 576
Thr Ser Glu Gly Arg Arg Tyr Gin Val Lys Asn Phe Vai Glu Lys Pro .
180 185 190
cct ggc aca gca cct tet aat ctt gcc atc tta ggc cgt tac gta 624
Pro Lys Gly Thr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ile Leu Gly Arg Tyr Val
195 200 205
ttc acg cct gag atc ttc atg tat tta gaa gag cag cag gtt ggc gcc 672
Phe Thr Pro Glu Ile Phe Met Tyr Leu Glu Glu Gin Gin Val Gly Ala
210 21S 220
ggc gga gaa att cag ctc aca gac gcc att caa aag ctg aat gaa att 720
Gly Gly Glu Ile Gin Leu Thr Asp Ala Ile Gin Lys Leu Asn Glu Ile
225 230 235 240
caa aga gtg ttt get tac gat ttt gaa ggc aag cgt tat gat gtt ggt 768
Gin Arg Val Phe Ala Tyr Asp Phe Glu Gly Lys Arg Tyr Asp Val Gly
245 250 255
gaa aag· ctc ggc ttt atc aca aca act ctt gaa ttt gcg atg cag gat 616
Glu Lys Leu Gly Phe Ile Thr Thr Thr Leu Glu Phe Ala Met Gin Asp
260 265 270
aaa gag ctt ege gat cag ctc gtt cca ttt atg gaa ggt tta eta aac 864
Lys Glu Leu Arg Asp Gin Leu Val Pro Phe Met Glu Gly Leu Leu Asn
275 280 2S5 aaa gaa gaa atc 37s
Lys Glu Glu Ile
290
PL 212 928 B1
<210> <211> <212 > <213 > 22 292 PRT Sacillus subtilis
<400> 22
Met Lys Lys Val Arg Lys Ala Ile Ile Pro Ala Ala Gly Leu Gly Thr
5 10 15
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Met Pro Lys Glu Met Leu Pro Ile 20 25 30
Val Asp Lys Pro Thr Ile Gin Tyr Ile Ile Glu Glu Ala Val Glu Ala 35 40 45
Gly Ile Glu Asp Ile Ile Ile Val Thr Gly Lys Ser Lys Arg Ala Ile 50 55 60 '
Glu Asp His Phe Asp Tyr Ser Pro Glu Leu Glu Arg Asn Leu Glu Glu 65 70 75 30
Lys Gly Lys Thr Glu Leu Leu Glu Lys Val Lys Lys Ala Ser Asn Leu S5 90 95
Ala Asp Ile His Tyr Ile Arg Gin Lys Glu Pro Lys Gly Leu Gly His ΪΟ0 105 110
Ala Val Trp Cys Ala Arg Asn Phe Ile Gly Asp Glu Pro Phe Ala Pal 115 120 125
Leu Leu Gly Asp Asp Ile Val Gin Ala Glu Thr Pro Gly Leu Arg Gin 130 135 140
Leu Met Aap Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Ser Ser Ile Ile Gly Val Gin 145 150 155 160
Gin Val Pro Glu Glu Glu Thr His Arg Tyr Gly Ile Ile Asp Pro Leu 165 170 175
Thr Ser Glu Gly Arg Arg Tyr Gin 7a_ Lys Asn Phe Val Glu Lys Pro 180 185 190
Pro Lys Gly Thr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ile Leu Gly Arg Tyr Val 195 200 205
Phe Thr Pro Glu Ile Phe Met Tyr Leu Glu Glu Gin Gin Val Gly Ala
PL 212 928 B1
210 2X5 220
Gly Gly Glu Ile Gin Leu Thr Asp Ala Ile Gin Lys Leu Asn Glu Ile 225 230 235 240
Gin Arg Val Phe Ala Tyr Asp Phe Glu Gly Lys Arg Tyr Asę Val Gly 245 250 255
Glu Lys Leu Gly Phe Ile Thr Thr Thr Leu Glu Phe Ala Met Gin Asp 260 265 270
Lys Glu Leu Arg Asp Gin Leu Val Pro Phe Met Glu Gly Leu Leu Asn 275 280 235
Lys Glu Glu Ile 290 <210? 23 <211? 27 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 23 tctagatttt tcgatcataa ggaaggt 27 <210? 24 <211? 49 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 24 gttaacgaat tccagctatg taggatccaa tgtccaatag cctttttgt 49 <210? 25 <211? 20 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 25 aaaaaggctt ctaacctggc 20 <210? 26 <211? 20 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 26 aaaccgccta aaggcacagc 20 <210? 27 <211? 20
PL 212 928 B1 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 27 gccaggttag aagccttttt 20 <210> 23 <211> 20 <212 > DNA <213> Bacillus subtilis <400> 28 gctgtgcctt taggcggttt 20
<210> 29
<211> 1368
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1) , . (1368)
<223>
<400> 25
atg Met 1 gat aag cgg ttt gca gtt gtt tta gcg get gga caa gga acg aga Thr Arg 15 48
Asp Lya Arg Phe Ala 5 Tal Tal Leu Ala Ala 10 Gly Gin Gly
atg aaa teg aag ett tat aaa gtc ett cat cca gtt tgc ggt aag cct 36
Met Lys Ser Lys Leu Tyr Lys Tai Leu His Pro Val Cys Gly Lys Pro
20 25 30
atg gta gag cac gtc gtg gac gaa gee tta aaa tta tct tta tea aag 144
Met Val Glu Hi s Val Val Asp Glu Ala Leu Lys Leu Ser Leu Ser Lys
35 40 45
ett gtc acg att gtc gga cat ggt g=g gaa gaa gtg aaa aag cag ett 192
Leu Val Thr Ile Tal Gly His Gly Ala Glu Glu Val Lys Lys Gin Leu
50 55 60
ggt gat SI cl ci age gag tac gcg ett caa gca aaa cag ett ggc act get 240
Gly Asp Lys Ser Glu Tyr Ala Leu Gin Ala Lys Gin Leu Gly Thr Ala
65 70 75 80
cat get gta aaa cag gca cag cca ttt ett get gac gaa aaa ggc gtc 288
His Ala Tal Lys Gin Ala Gin Pro Phe Leu Ala Asp Glu Lys Gly Tal
35 90 35
aca att gtc att tgc gga gat acg ccg ett ttg aca gca gag acg atg 336
Thr Ile Tal Ile Cys Gly Asp Thr Pro Leu Leu Thr Ala Glu Thr Met
100 105 110
gaa cag atg ctg aaa gaa cat aca caa aga gaa gcg aaa get acg att 384
Glu Gin Met Leu Lys Glu His Thr Gin Arg Glu Ala Lys Ala Thr Ile
115 120 125
tta act gcg gtt gca gaa gat cca act gga tac ggc ege att att ege 432
Leu Thr Ala Tal Ala Glu Asp Pro Thr C-ly Tyr Gly Arg Ile Ile Arg
PL 212 928 B1
130 135
agc gaa aac gga gcg gtt caa aaa ata
Ser 145 Glu Asn Gly Ala Val 150 Gin Lys Ile
gaa gaa gaa cgt ctt gta act gag atc
Glu Glu Glu Arg Leu 165 Val Thr Glu Ile
gac aat gaa gcg eta ttt cgg gct att
Asp Asn Glu Ala 180 Leu Phe Arg Ala Ile 185
gca caa ggc gag tat tat ttg ccg gat
Ala Gin Gly 195 Glu Tyr Tyr Leu Pro 200 Asp
gaa gaa act gtt gcc gct tac cag
Glu Gly 210 Glu Thr Val Ala Ala 215 Tyr Gin
ctc gtt aat gat aga gtt gct ctt
Leu 225 Gly Val Asn Asp Arg 230 Val Ala Leu
aaa gag ego att aat aaa cgg cat atg
Lys Glu Arg Ile Asn 245 Lys Arg His Met
gac ccg atg aat acg tat att tct cct
Asp Pro Met Asn 260 Thr Tyr Ile Ser Pro 265
act gtg att tac cct gga act gtg att
Thr Val Ile 275 Tyr Pro Gly Thr Val 280 Ile
gaa gat acg att att ggc cct cat acg
Glu Asp 290 Thr Ile Ile Gly Pro 295 His Thr
ggc agc cgt acg gtt att aaa caa teg
Gly 305 Ser Arg Thr Val Ile 310 Lys Gin Ser
ggg aat gat gta aac ata gga cct ttt
Gly Asn Asp Val Asn 325 Ile Gly Pro Phe
gtc atc ggg aat gaa gtg aag atc ggg
Val Ile Gly Asn 340 Glu Val Lys Ile Gly 345
act caa fcte gga gac ega agc aag gca
Thr Gin Phe 335 Gly Asp Arg Ser Lys 360 Ala
gat gct gag gta ggc act gat gta aac
Asp Ala 370 Glu Val Gly Thr Asp 375 val Asn
14 0
gtt gag cat aag gac gcc tct
Val Glu 155 His Lys Asp Ala Ser 160
aac acc ggt acg tat tgt ttt
Asn 170 Thr Gly Thr Tyr Cys 175 Phe
gat cag gtg tct aat gat aat
Asp Gin Val Ser Asn 190 Asp Asn
gtc ata gag att ctt aaa aat
Val He Glu Ile 205 Leu Lys Asn
act ggt aat ttc caa gaa acg
Thr Gly Asn 220 Phe Gin Glu Thr
tct cag gca caa ttt atg
Ser Gin 235 Ala Glu Gin Phe Met 240
caa aat ggc gtg acg ttg att
Gin 250 Asn Gly Vai Thr Leu 25S Ile
gac gct gtt atc gga agc gat
Asp Ala Val Ile Gly 270 Ser Asp
aaa SSft gag gtg caa atc gga
Lys Gly Glu Val 2SS Gin Ile Gly
gag att atg aat agt gcc att
Glu Ile Met 300 Asn Ser Ala Ile
gta gtc aat cac agt aaa gtg
Val Val 315 Asn His Ser Lys Val 320
g=t cac atc aga cct gat tct
Ala 330 His Ile Arg Pro Asp 335 Ser
aat ttt gta gaa att aaa aag
Asn Phe Val Glu Ile 350 Lys Lys
tct cat eta agc tat gtc ggc
Ser His Leu Ser 3S5 Tyr Val Gly
ctc ggc tgc ggt fcea att act
Leu Gly Cys G1y Ser Ile Thr
330
PL 212 928 B1
gtc aat tafc Tyr gat gga aag aat aag tat Asn Lys Tyr ttg aca aaa att gaa gat ggc Ile Glu Asp Gly 400 1200
Val 385 Asn Asp Gly Lys 390 Leu Thr 395 Lys
gcg ttt atc ggc tgc aat aac ttg gtt gcc cct gtc aca gtc gga 1248
Ala Phe Ile Gly Cys Asn Ser Asn Leu Val Ala Pro Val Thr Val Gly
405 410 415
gaa ggc gct tat gtg gcg gca ggt tca act gtt acg gaa gat gta cct 1296
Glu Gly Ala Tyr Val Ala Ala Gly Ser Thr Val Thr Glu Asp Val Pro
420 425 430
gga aaa gca ctt gct att gcc aga gcg aga caa gta aat aaa gac gat 1344
Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Arg Ala Arg Gin Val Asn Lys Asp Asp
435 44Q 445
tat gtg aaa aat att cat aaa aaa 1363
Tyr Val Lys Asn Ile His Lys Lys
450 455 <210> 30 <2Ι1> 456 <212> PRT
<213 ,? Bacillus subtilis
<40t !> 2 10
Met Asp Lys Arg Phe Ala Val Val Leu Ala Ala Gly Gin Gly Thr Arg
1 5 10 15
Met Lys Ser Lys Leu Tyr Lys Val Leu His Pro Val Cys Gly Lys Pro
20 25 30
Met Val Glu His Val Val Asp Glu Ala Leu Lys Leu Ser Leu Ser Lys
3 5 40 45
Leu Val Thr Ile Val Gly His Gly Ala Glu Glu Val Lys Lys Gin Leu
50 55 so
Gly Asp Lys Ser Glu Tyr Ala Leu Gin Ala Lys Gin Leu Gly TżiZ Ala
65 70 75 80
His Ala Val Lys Gin Ala Gin Pro Phe leu Ala Asp Glu Lys Gly Val
as 90 95
Thr ile Val Ile Cys Gly Asp Thr Pro Leu Leu Thr Ala Glu Thr Met
100 105 110
Glu Gin Met Leu Lys Glu His Thr Gin Arg Glu Ala Lys Ala Thr Ile
115 . 120 125
PL 212 928 B1
Leu Thr 130 Ala Val Ala Glu ASp 135
Ser 145 Glu Asn Gly Ala Val 150 Gln
Glu Glu GlU Arg Leu 165 Val Thr
ASp Asn GlU Ala 180 Leu Phe Arg
Ala Gln Gly 195 Glu Tyr Tyr Leu
Glu Gly 210 Glu Thr Val Ala Ala 215
Leu 22S Gly Val Asn Asp Arg 230 Val
Lys Glu Arg Ile Asn 245 Lys Arg
Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Ile Arg 140
Ile Val Glu His Lys Asp Ala Ser 155 ISO
Ile Asn Thr Gly Thr Tyr Cys Phe 170 175
Ile Asp Gln Vał Ser Asn Asp Asn 135 190
Asp Val Ile Glu Ile Leu Lys Asn 205
Gln Thr Gly Asn Phe Gln Glu Thr 220
Leu Ser Gln Ala Glu Gln Phe Met 235 240
Met Gln Asn Gly Val Thr Leu Ile 250 255
Αερ Pro Mec Asn Thr Tyr Ile Ser 260
Pro Asp Ala Val Ile Gly Ser Asp 265 270
Thr Val Ile Tyr Pro Gly Thr Val 275 230
Ile Lys Gly Glu Val Gln Ile Gly 285
Glu Asp Thr Ile Ile Gly Pro His 290 235
Thr Glu Ile Met Asn Ser Ala Ile 300
Gly Ser Arg Thr Val Ile Lys Gln 305 310
Ser Val Val Asn His Ser Lys Val 315 320
Gly Asn. Asp Val Asn Ile Gly Pro 325
Phe Ala His Ile Arg Pro Asp Ser 330 33S
Val Ile Gly Asn Glu Val Lys Ile 340
Gly Asn Phe Val Glu Ile Lys Lys 345 350
Thr Gln Phe Gly Asp Arg Ser Lys 355 360
Ala Ser His Leu Ser Tyr Val Gly 355
Asp Ala Glu Val Gly Thr Asp Val
Asn Leu Gly Cys Gly Ser Ile Thr
PL 212 928 B1
370 375 330
Val Asn Tyr Asp Gly Lys Aan. Lys Tyr Leu Thr Lys Ile Glu Asp Gly 335 390 395 400
Ala Phe Ile Gly Cys Asn Ser Asn Leu Val Ala Pro Val Thr Val Gly 405 410 415
Glu Gly Ala Tyr Val Ala Ala Gly Ser Thr Val Thr Glu Asp Val Pro 420 425 430
Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Arg Ala Arg Gin Val Asn Lys Asp Aap 435 440 445
Tyr Val Lys Asn Ile His Lys Lys 450 455 <210> 31 <211> 26 <212> DNA · <2I3> Bacillus subtilis <400? 31 ggatcctttc tatggataaa agggat 2S <210? 32 <211> 31 <212> OKA <213> Bacillus subtilis <400> 32 gttaacagga ttatttttta tgaatatttt t 31 <210> 33 <211> 20 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 33 cagagacgat ggaacagatg 20 <2I0> 34 <211> 20 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 34 ggagttaatg atagagttgc 20 <210? 35 <211> 20
PL 212 928 B1 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 35 gaagatcggg aattttgtag 20 <210» 36 <211» 20 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 35 catctgttcc atcgtctctg 20 <210» 37 <211» 20 <212» DNA <213» Sacillus subtilis <400» 37 gcaactctat cattaactcc 20 <210» 38 <211» 20 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 38 ctacaaaatt cccgatcttc 20 <210» 39 <211» 54 <212» DNA <213» Streptococcus eąuisiisilis <400» 39 gtgtcggaac attcattaca tgcttaagca cccgctgtcc ttcttgttat ctcc 54 <210> 40 <211» 1203 <212» DNA <213» Streptococcus eguisimilis <220» <221» CDS <222» ¢1)..(1203) <223» <400» 40
gtg aaa att tet gta gca ggc tea gga tat gtc ggc eta tcc ttg agt Ser 48
Val Lys 1 Ile Ser Val Ala Gly Ser S Gly Tyr Val Gly Leu Ser Leu
10 15
tta Ctg gca caa cat aat gac gtc act gtt gtt gat att att gat 96
Ile Leu Leu Ala Glu His Asn Asp Val Thr Val Val Asp Ile Ile Asn
20 25 30
PL 212 928 B1
gaa Glu aag gtg aga Arg ttg atc aat Leu Ile Asn caa ggc ata tet cca atc aag gat Asp gct Ala 144
Lys Val 35 Gin 40 Gly He Ser Pro Ile 45 Lys
gat att gag gag tat tta aaa aat gcg ccg eta aat Ctc aca 3<=g acc 192
Asp Ile Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ala Pro Leu Asn Leu Thr Ala Thr
50 55 60
ctt gat ggc gca agc gct tat agc aat gca gac ctt att atc att gct 240
Leu Asp Gly Ala Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Asp Leu Ile Ile Ile Ala
65 70 75 80
act ccg aca aat tat gac agc gaa cgc aac tac ttt gac aca agg cat 238
Thr Pro Thr Asn Tyr Asd Ser Glu Arg Asn Tyr Phe ASP Thr Arg His
85 90 S5
gtt gaa gag gtc att gag cag gtc eta gac eta aat gcg tca gca acc 336
Val Glu Glu Val Ile Glu Gin Val Leu Asp Leu Asn Ala Ser Ala Thr
100 105 110
att att atc aaa tca acc ata cca eta ggc ttt atc aag cat gtt agg 384
Ile Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Leu Gly Phe Ile Lys His Val Arg
115 120 125
gaa aaa tac cag aca gat cgt att att ttt agc cca gaa ttt tta aga 432
Glu Lys Tyr Gin Thr Asp Arg Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg
130 135 140
gaa tca aaa gcc tta tac gat aac ctt tac cca agt cgg atc att gtt 480
Glu Ser Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile Val
14S 150 155 ISO
Cct tat gaa aag gac gac tca cca agg gtt att cag gct gct aaa gcc 528
Ser Tyr Glu Lys Asp Asp Ser Pro Arg Val Ile Gin Ala Ala Lys Ala
165 170 175
ttt gct ggt ctt tta aag gaa gga gcc aaa agc aag gat act ccg gtc 57S
Phe Ala Gly Leu Leu Lys Glu Gly Ala Lys Ser Lys Asp Thr Pro Val
180 185 190
tta ttt atg ggc tca cag gag gct gag gcg gtc aag eta ttt Scg aat 624
Leu Phe Met Gly Ser Gin Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ala Asn
195 200 205
acc ttt ttg gct atg cgg gtg tet tac ttt aat gaa tta gac acc tat 672
Thr Phe Leu Ala Met Arg Val Ser Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Tyr
210 215 220
tcc gaa agc aag ggt eta gat gct cag cgc gtg att gaa gga gtc tgt 720
Ser Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ala Gin Arg Val Ile Glu Gly Val Cys
225 230 235 240
cat gat cag cgc att sgt aac cat tac aat aac cct tcc ttt gga tat 768
His Asp Glu Arg Ile Gly Asn His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr
245 250 255
sg= ggc tat tgc ctg cca aag gac agc aaa cag =tg ttg gca aat tat SIS
Gly Gly Tyr Cys Leu Pro Lys Aso Ser Lys Gin Leu Leu Ala Asn Tyr
260 265 270
PL 212 928 B1
aga Arg ggc att ccc cag tcc ttg Leu atg tca gcg att gtt gag tcc aac aacr Lys 364
Gly Ile 275 Pro Gin Ser Met 280 Ser Ala He Val Glu 285 Ser Asn
ata ega aaa tcc tat tta gct gaa caa ata tta gac aga 9cc tet agt 912
Ile Arg Lys Ser Tyr Leu Ala Glu Gin Ile Leu Asp Arg Ala Sar Ser
290 295 300
caa aag cag gct ggt gta cca tta acg att ggc ttt tac ege ttg att 960
Gin Lys Gin Ala Gly Val Pro Leu Thr Ile Gly Phe Tyr Arg Leu Ile
305 310 315 ' 320
atg aaa age aac tet gat aat ttc ega gaa age gcc att aaa gat att 1008
Met Lys Ser Asn Ser Asp Asn Phe Arg Glu Ser Ala Ile Lys Asp Ile
325 330 335
att gat atc atc aac gac tat ggg gtt aat att gtc att tac gaa ccc 1056
Ile Asp Ile Ile Asn Asp Tyr Gly Val Asn ±le Val Ile Tyr Glu Pro
340 345 350
atg ctt ggc gag gat att ggc tac agg gtt gtc aag gac tta gag cag 1104
Met Leu Gly Glu Asp Ile Gly Tyr Arg Val Val Lys Asp Leu Glu Gin
355 360 365
ttc aaa aac gag tet aca atc att gtg tca aat ege ttt gag gac gac 1152
Phe Lys Asn Glu Ser Thr Ile Ile Val Ser Asn-Arg Phe Glu Asp Asp
370 375 380
eta gga gat gtc att gat aag gtt tat acg aga gat gtc ttt gga aga 1200
Leu Gly Asp Val Ile Asp Lys Val Tyr Thr Arg Asp Val Phe Gly Arg
3S5 330 395 400
gac 1203
Asp
<210? 41 <211? 401 <212? PRT <213? Streptococcus eguisimilis <400? 41
Val Lys Ile Ser Val Ala Gly Ser Gly Tyr Val Gly Leu Ser Leu Ser 15 10 15
Ile Leu Leu Ala Gin His Asn Asp Val Thr Val Val Asp Ile Ile Asp 20 25 30
Glu Lys Val Arg Leu Ile Asn Gin Gly Ile Ser Pro Ile Lys Asp Ala 35 40 45
Asp Ile Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ala Pro Leu Asn Leu Thr Ala Thr 50 55 60
Leu Asp Gly Ala Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Asp Leu Ile Ile Ile Ala
PL 212 928 B1
75 80
Thr Pro Thr Asn Tyr Asp Ser Glu Arg Asn Tyr Phe Asp Thr Arg His 85 30 95
Val Glu Glu Val Ile Glu Gln Val Leu Asp Leu Asn Ala Ser Ala Thr 100 105 110
Ile Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Leu Gly Phe Ile Lys His Val Arg 115 120 125
Glu Lys Tyr Gln Thr Asp Arg Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg 130 135 140
Glu Ser Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile Val 145 150 155 150
Ser Tyr Glu Lys Asp Asp Ser Pro Arg Val I-le Gln Ala Ala Lys Ala 1S5 170 175
Phe Ala Gly Leu Leu Lys Glu Gly Ala Lys Ser Lys Asp Thr Pro Val 180 185 190
Leu Phe Met Gly Ser Gln Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ala Asn 195 200 205
Thr Phe Leu Ala Met Arg Val Ser Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Tyr 210 21S 220
Ser Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ala Gln Arg Val Ile Glu Gly Val Cys 225 230 235 240
Bis Asp Gln Arg Ile Gly Asn His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr 245 250 255
Gly Gly Tvr Cys Leu Pro Lys Asp Ser Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr ‘ 250 265 270
Arg Gly Ile Pro Gln Ser Leu Met Ser Ala Ile Val Glu Ser Asn Lys 275 280 285
Ile Arg Lys Ser Tyr Leu Ala Glu Gln Ile Leu Asp Arg Ala Ser Ser 290 295 300
Gln Lys Gln Ala Gly Val Pro Leu Thr Ile Gly Phe Tyr Arg Leu 305 310 315
Ile
320
PL 212 928 B1
Met Lys Ser Asn Ser ASp Asn Phe Arg Glu Ser Ala Ele Lys Asp Ile
325 330 335
Ile Asp Ile Ile Asn Asp Tyr Gly Val Asn Ile Val Ile Tyr Glu Pro
340 345 350
Met Leu Gly Glu Asp Ile Gly Tyr Arg Val Val Lys Asp Leu Glu Gin
355 360 365
Phe Lys Asn Glu Ser Thr Ile Ile Val Ser Asn Arg Phe Glu Asp Asp
370 375 380
Leu Gly Asp Val Ile Asp Lys Val Tyr Thr Arg Asp Val Phe Gly Arg
385 390 395 400
Asp <210> 42 <211? 900 <212> DNA <213 > Streptcccccus eąuisimilis <220>
<221> CDS <222> (1)..(9005 <223>
<400> 42
atg aca aag Lys gtc Val aga aaa gcc att atc cca gcc gcc ggc eta ggc act 48
Met 1 Thr Arg 5 Lys Ala Ile Ile Pro Ala 10 Ala Gly Leu Gly 15 Thr
ego ttc eta ccc gcc acc aag gca ctg gcc aag gaa atg ctc cca atc 96
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Leu Ala Lys Gm Met Leu Pro Ile
20 25 30
gtc gat aag cca acc att caa ttc atc gtc gag gaa gct eta aag gcc 144
Val Asp Lys Pro Thr Ile Gin Phe Ile Val Glu Glu Ala Leu Lys Ala
35 40 45
ggt atc Gly Ile gag Glu gag Glu att ctt Ile Leu gtc gtc acc ege aag gcc aaa ege tet Ala Lys Arg Ser 50 att Ile
Val 55 Val Thr Gly lys
50
gaa gac cac ttt gac tcc aac ttc gag ctc gaa tac aat ctc caa gcc
Glu Asp His Phe Asp Ser Asn Phe Glu Leu Glu Tyr Asn Leu Gin Ala
65 70 75 30
aag ggc aaa acc gag ctg ctc aag ctc gtt gat gag acc act gcc atc
Lys Gly Lys Thr Glu Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Thr Thr Ala Ile
85 90 95
PL 212 928 B1
aac ctg cac Asn Leu His ttc att cgt cag age cac cct aga gga eta ggg gac get Ala 336
Phe 100 Ile Arg Gln Ser His 105 Pro Arg Gly Leu Gly 110 Asp
gtc ctc cag gee aag gee ttt gtg ggc aat gag ccc ttt gtg gtc atg 334
Val Leu Gln Ala Lys Ala Phe Val Gly Asn Glu Pro Phe Val Val Met
115 120 125
ctg ggg gat gac ctc atg gat att acc aat cct agt gee aag ccc ttg 432
Leu Gly Asp Asp Leu Met Asp Ile Thr Asn Pro Ser Ala Lys Pro Leu
130 135 140
gcc aag cag ctc att gag gat tat gat tgc aca cac gee tea acg att 480
Ala Lys Gln Leu Ile Glu Asp Tyr Asp Cys Thr His Ala Ser Thr Ile
145 ISO 155 ISO
gca gtg atg agg gtg ccg cat gag gag gtt tcc aat tat ggc gtg att 528
Ala Val Met Arg Val Pro His Glu Glu Val Ser Asn Tyr Gly Val He
165 170 175
gca ccg caa 999 aag get gtt aag ggc ttg tat agt gtg sag acc ttt 576
Ala Pra Gln Gly Lys Ala Val Lys Gly Leu Tyr Ser Val Glu Thr Phe
180 185 190
gtt gag aag cca agt cca gat gag gca ccg age gac tta gcg att att S24
Val Glu Lys Pro Ser pro Asp Glu Ala Pro Ser-Asp Leu Ala Ile Ile
195 200 205
ggt ega tat ttg ttg acg cct gag att ttt gee ata ttg gag aat cag 672
Gly Arg Tyr Leu Leu Thr Pro Glu Ile Phe Ala Ile Leu Glu Asn Gln
210 215 220
gcg cct ggg get esc aat gag gta cag eta gee gat gcg att gac aag 720
Ala Pro Gly Ala Gly Asn Glu Val Gln Leu Ala Asp Ala Ile Asp Łys
225 230 235 240
ctc aac aag act cag cgg gtt ttt gcg aS9 gag ttt aag gga gag cgg 768
Leu Asn Lys Thr Gln Arg Val Phe Ala Arg Glu Phe Lys Gly Glu Arg
245 250 255
tat gat gtt 999 gac aag ttt ggc ttt atg aag acc tea Ctt gac tat 816
Tyr Asp Val Gly Asp Lys Phe Gly Phe Met Lys Thr Ser Leu Asp Tyr
260 265 270
gcfc ctc aag cac cct cag gtc aag gac gac ctc act gac tac att ata 864
Ala Leu Lys His Pro Gln Val Lys Asp Asp Leu Thr Asp Tyr· Ile Ile
275 280 285
aag ctc agt aag caa ctg aac aag gac gtt aaa aaa 900
Lys Leu Ser Lys Gln Leu Asn Lys Asp Val Lys Lys
290 295 300
<210» 43
<211» 300
<212» PRT
<213» Streptococcus eguisirailis
<400> 43
Met Thr Lys Val Arg Lys Ala Ile Ile Pro Ala Ala Gly Leu Gly Thr
PL 212 928 B1
PL 212 928 B1
Tyr Asp Val Gly Asp Lys Phe Gly Phe Met iys Thr Ser Leu Asp Tyr
260 265 270
Ala Leu Lys His Pro Gin Val Lys Asp Asp Leu Thr Asp Tyr Ile Ile
275 280 295
Lys Leu Ser Lys Gin Leu Asn Lys Asp Val Lys Lys
290 295 300
<210 > 4 A
<211 > 1380
<212 » DNA
<213 > Streptococcus eguisimilis
<220 >
<221 .» CDS
<222 > 1 !13 - - (138 10)
<223 >
<400 i> 44
atg aaa aac tac gcc att atc eta gca get gga< aag gga acc ege atg 48
Met Lys Asn Tyr Ala Ile Ile Leu Ala Ala Gly Lys Gly Thr Arg Met
1 5 10 15
aat tea ggg ctt tcc aag gtg ctg cac aag gta tea ggc eta agc atg 96
Asn Ser Gly Leu Sar Lys Val Leu His Lys Val Ser Gly Leu Ser Met
20 25 30
ctg gag cat gtc ctc aag agc gtc tea gcc eta get cct caa aag caa 144
Leu Glu His Val Leu Lys Ser Val Ser Ala Leu Ala Pro Gin Lys Gin
35 40 45
ctc aca gtg atc ggt cat cag gca gag caa gta cgt gcc gtc eta ggt 152
Leu Thr val Ile Gly His Gin Ala Glu Gin Val Arg Ala Val Leu Gly
50 55 60
gat caa tta ctg aca gtg gtg caa gag gag cag eta gga aca ggc cat 240
Asp Gin Leu Leu Thr Val Val Gin Glu Glu Gin Leu Gly Thr Gly His
ss 70 75 80
gca gtc atg atg CjCcŁ gaa gag gag tw 3 tet ggc tta gaa ggg cag acc 2S3
Ala Val Met Met Ala Glu Glu Glu Leu Ser Gly Leu Glu Gly Gin Thr
85 90 95
eta gtg att gca ggt gac acc ccc ttg atc aga gga gaa agc ctc aag 33S
Leu Val Ile Ala Gly Asp Thr Pro Leu Ile Arg Gly Glu Ser Leu Lys
100 105 110
get ctg eta gac tat cat atc aga gaa aag aat gtg gca acc att ctc 384
Ala Leu Leu Asp Tyr His Ile Arg Glu Lys Asn Val Ala Thr Ile Leu
115 120 125
aca gcc aat gcc aag gat ccc ttt ggc tac ggc ega atc att ege aat 432
Thr Ala Asn Ala Lys Asp Pro Phe Gly Tyr Gly Arg Ile Ile Arg Asn
13 0 135 140
PL 212 928 B1
gca gca gga gag gtg gtc aac atc gtt gaa caa aag gac get aat gag 480
Ala Ala 145 Gly Glu Val Tal 150 Asn Ile Tal Glu Gin Lys Asp Ala Asn Glu
155 160
gca gag caa gag gtc aag gag atc aac aca ggg acc tat atc ttt gac E2S
Ala Glu Gin Glu Tal Lys Glu Ile Asn Thr Gly Thr Tyr Ile Phe Asp
165 170 175
aat aag ege etc ttt gag get eta aag cat etc acg act gat aat gcc 576
Asn Lys Arg Leu Phe Glu Ala Leu Lys His Leu Thr Thr Asp Asn Ala
180 185 190
caa ggg gaa tat tac eta acc gat gtg atc agt att ttc aag gcc age 624
Gin Gly Glu Tyr Tyr Leu Thr Asp Vał Ile Ser Ile Phe Lys Ala Ser
195 200 205
caa gaa aag gtt gga get tac ctg ctg aag gat ttt gat gaa age eta 672
Gin Glu Lys Tal Gly Ala Tyr Leu Leu Lys Asp Phe Asp Glu Ser Leu
210 215 220
ggg gtt aat gat ege eta get eta gcc cag get gag gtg atc atg cag 720
Gly Tal Asn Asp Arg Leu Ala Leu Ala Giń Ala Glu Val Ile Met Gin
225 230 235 240
gag cgg atc asc aag cag CSC atg ett aat ggg gtg acc ctg caa aac 768
Glu Arg Ile Asn Lys Gin His Met Leu Asn Gly..Val Thr Leu Gin Asn
245 250 255
cct gca get acc tat atc gaa age agt gta gag att gcg ccg gac gtc 816
Pro Ala Ala Thr Tyr Ile Glu Ser Ser Tal Glu Ile Ala Pro Asp Tal
260 265 270
ttg att gaa get aat gtg acc eta aag gga cag act aga att ggc age 864
Leu Ile Glu Ala Asn Val Thr Leu Lys Gly Gin Thr Arg Ile Gly Ser
275 280 2S5
aga agt gtt ata acc aat ggg age tat atc ett gat tea agg ett ggt 912
Arg Ser Tal Ile Thr Asn Gly Ser Tyr Ile Leu Asp Ser Arg Leu Gly
290 295 300
gag ggc gta gtg gtg age cag tea gtg att gag ggc tea gtc eta gca 960
Glu Gly Tal Val Val Ser Gin Ser Tal Ile Glu Gly Ser Val Leu Ala
305 310 315 320
gat ggt gtg aca gta ggg ccc tat gca cac att ege ccg gac tct cag 1008
Asp Gly Tal Thr Tal Gly Pro Tyr Ala His Ile Arg Pro Asp Ser Gin
325 330 335
ctc gat gag tgt gtt cat att ggg aac ttt gta gag gtt aag ggg tct 1056
Leu Asp Glu Cys Tal His Ile Gly Asn Phe Val Glu Tal Lys Gly Ser
340 345 350
cat eta ggg gcc aat acc aag gca sgg cat ttg act tat ctg ggg aat 1104
His Leu Gly Ala Asn Thr Lys Ala Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly Asn
355 360 365
gcc gag att ggc tea gag gtt aat att ggt gca gga age att acg gtt 1152
Ala Glu Giy Ser Glu Val Asn Ile Gly Ala Gly Ser Ile Thr Tal
370 375 330
aat tat gat ggt caa cgg aaa tac cag aca gtg att ggc gat cac get 1200
PL 212 928 B1
Aan Tyr Asp Gly Gin Arg Lys Tyr Gin Thr Val ile Gly Asp His Ala
3S5 390 395 400
•ctt. att ggg agt cat teg act fctg ata gct ccg gta gag gtt ggg gag 1243
Phe 11© dy Ser His Ser Thr Leu Ile Ala Pro val Glu val Gly Glu
405 410 415
aat gct tta aca gca gca ggg tct acg ata gcc cag teg gtg cca gca 1296
Asn Ala Leu Thr Ala Ala Gly Ser Thr Ile Ala Gin Ser Val Pro Ala
420 425 430
gac agt gtg gct ata ggg cgt agc cgt cag gtg gtg aag gaa ggc tat 1344
Asp Ser Val Ala Ile Gly Arg Ser Arg Gin Val Val Lys Glu Gly Tyr
435 440 445
gcc aag agg eta cca cat cac ccg gat cag ccc cag 1330
Ala Lys Arg Leu Pro His His Pro Asp Gin Pro Gin
450 455 4S0 <210> 45 <211> 460 <212> PRT <213> Sbreptococeus eguisirailis
<400> 45
Met 1 Lys Asn Tyr Ala 5 Ile Ile Leu Ala Ala 10 Gly Lys Gly Thr Arg 15 Met
Asn. Ser Gly Leu 20 Ser Lys Val Leu His 25 Lys Val Ser Gly Leu 30 Ser Met
Leu Glu His 35 Val Leu Lys Ser Val 40 Ser Ala Leu Ala Pro 45 Gin Lys Gin
Leu Thr 50 Val Ile Gly His Gin 55 Ala Glu Gin Tal Arg SO Ala Val Leu Gly
Asp 65 Gin Leu Leu Thr Val 70 Val Gin Glu Glu Gin 75 Leu Gly Thr Gly His 80
Ala Val Met Met Ala 35 Glu Glu Glu Leu Ser 90 Gly Leu Glu Gly Gin 95 Thr
Leu Val Ile Ala 100 Gly Asp Thr Pro Leu 105 Ile Arg Gly Glu Ser 110 Leu Lys
Ala Leu Leu 115 Asp His Ile Arg 120 Glu Lys Asn Val Ala 125 Thr Ile Leu
Thr Ala Asn Ala Lys Asp Pro Phe Gly Tyr Gly Arg Ile Ile Arg Asn
130 135 140
PL 212 928 B1
Ala Ala Gly Glu Val Val Aan Ile Val Glu Gin Lys Asp Ala Asn Glu
14 5 150 155 160
Ala Glu Gin Glu Val Lys Gin Ile Asn Thr Gly Thr Tyr Ile Phe Asp
165 170 175
Asn Lys Arg Leu Phe Glu Ala Leu Lys His Leu Thr Thr Asp Asn Ala
iao 185 190
Gin Gly Glu Tyr Tyr Len Thr Asp val Ile Ser Ile Fhe Lys Ala Ser
195 200 205
Gin Glu Lys Val Qiy Ala Tyr Leu Leu Lys Asp Phe Asp Glu Ser Leu
210 215 220
Gly Val Asn Asp Arg Leu Ala Leu Ala Gin Ala Glu Val Ile Met Gin
225 230 235 240
Glu Arg Ile Asn Lys Gin His Met Leu Asn Gly Val Thr Leu Gin Asn
245 250 255
Pro Ala Ala Thr Tyr ile Glu Ser Ser Vai Glu Ile Ala Pro Asp Val
260 2S5 270
Leu Ile Gin Ala Asn Val Thr Leu Lys Gly Gin Thr Arg Ile Gly Ser
275 280 235
Arg Ser Val Ile Thr Asn Gly Ser Tyr Ile Leu Asp Ser Arg Leu Gly
290 295 300
Glu oiy Val Val Val Ser Gin Ser Val Ile Glu Gly Ser val Leu Ala
305 310 315 320
Asp Gly Val Thr Val Gly Pro Tyr Ala His Ile Arg Pro Asp Ser Gin
325 330 335
Leu Asp GłU Cys Val His Ile Gly Asn Phe Val Glu Val Lys Gly Ser
340 345 350
His Leu Gly Ala Asn Thr Lys Ala Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly Asn
355 360 365
Ala Gin Ile Gly Ser Glu Val Asn Ile Gly Ala Gly Ser Ile Thr Val
370 375 380
PL 212 928 B1
Asn Tyr Asp Gly Gin Arg Lys Tyr Gin Thr Val Ile Gly Asp Hia Ala 335 390 395 400
Phe Ile Gly Ser His Ser Thr Leu Ile Ala Pro Val Glu Val Gly Glu 405 410 415
Asn Ala Leu Thr Ala Ala Gly Ser Thr Ile Ala Gin Ser Val Pro Ala 420 425 430
Asp Ser Val Ala Ile Gly Arg Ser Arg Gin Val Val Lys Glu Gly Tyr 435 440 445
Ala Lys Arg Leu Pro His His Pro Asp Gin Pro Gin 450 455 4S0 <210? 46 <2U> 29 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 46 gcggccgcgg tacctgtgtt acacctgtt 29 <210? 47 <211? 38 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 47 gtcaagctta attctcatgt ttgacagctt atcatcgg 38
<210? 48
<211? 18
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 43 catgggagag acctfctgg 13
<210? 49
<211? 17
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 49
gtcggtcttc catttgc
<210? <211? <212? < 213 ?
DNA
Bacillus subtilis
PL 212 928 B1
<210> 57 <211> 18
PL 212 928 B1 <212» <213»
DNA
Bacillus subtilis <400> 57 gctaccttct ttcttagg <400>
<210» 53 <211» 13 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400> 58 cgtcaatatg atctgtgc la <210» 59 <211» 17 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 59 ggaaagaagg tctgtgc 17 <210> 60 .
<211» 17 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 60 cagctatcag ctgacag 17 <210.» 61 <211» 20 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» <400» €1 gctcagctat gacatattcc <210» 62 <211» 17 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 62 gatcgtcttg attaccg 17 <210> 63 <211» 1S <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» S3 agctttatcg gtgacg
PL 212 928 B1 <210? 64 <211? 16 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 64 tgagcacgat tgcagg <210? 55 <211? 17 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 65 cattgcggag acattgc
<210? 66
<211? 26
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 66
tagacaattg gaagagaaaa gagafca <210? 67 <211? 20 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 67 ccgtcgctat tgtaaccagt <210? SS <211? 29 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 63 ggaattccaa agctgcagcg gccggcgcg <210? 69 <211? 32 <212? DNA _ <213? Bacillus subtilis <400? 69 gaagatctcg tatacttggc ttctgcagct cc <210? 70 <211? 31 <212? DNA <213? Bacillus subtilis <400? 70 gaagatctgg tcaacaagct ggaaagcact c
PL 212 928 B1 <210» 71 <211» 33 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 71 cccaagcttc gtgacgtaca gcaccgttcc ggc <210» 72 <211» 50 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 72 ccteaagggc cgaatattta tacggagotc cctgaaacaa caaaaacggc <210» 73 <211» 34 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 73 ggtgttctcfc acagcgcccg cggttgcggt cagc <210» 74 <211» 27 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 74 gtcctfccfctg gtacctggaa gcagagc <210» 75 <211» 39 <212» <213»
DNA
Bacillus subtilis <400» 75 gtataaatat tcggccctta aggccagtac cattttcec
<210» 76
<211» 2,3
<212» DNA
<213» Sacillus subtilis
<4 00» 76
gggccggatc cgc
<210»
<211» 20
<212» DNA
<213» Bacillus subtilis
PL 212 928 B1 <400? 77
attcccggcc taggcgccgg 20
<210? 73
<211? 19
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 78
ggaaattatc gtgatcaac 19
<210? 79
<211? 21
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 79
gcacgagcac tgataaatat g 21
<210? SO
<211? 21
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis '
<400? 30
catatttatc agtgctcgtg c 21
<210? 81
<211? 17
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 81
tcgtagacct catatgc 17
<210? 32
<211? 17
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<400? 82
gtcgttaaac cgtgtgc 17
<210? 83
<211? 39
<212? DNA
<213? Bacillus subtilis
<40Q? 83
ctagaggatc cccgggtacc gtgctctgcc ttttagtcc 39
<210? 84
<211? 37
<212? DNA
PL 212 928 B1 <213> Bacillus subtilis <400> 34 gtacatcgaa ttcgtgctca ttattaatct gttcagc 37 <210> 95 <211> 20 <212 > DNA <213> Bacillus subtilis <400> 05 aaetattgcc gatgataagc 20 <210> 86 <211> 1260 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CTS <222> (1).,(1260} <223?
<400> 86
atg aaa aaa gtg atg tta gct acg gct ttg ttt tta gga ttg act cca Pro 43
Met 1 Lys Lys Val Met 5 Leu Ala Thr Ala Leu 10 Phe Leu Gly Leu Thr 1S
gct ggc gcg aac gca gct gat tta ggc cac cag acg ttg gga tcc aat 96
Ala Gly Ala Asn Ala 20 Ala Asp Leu Gly 25 His Gin Thr Leu Gly 30 Ser Asn
gat ggc tgg ggc gcg tac tcg acc ggc acg aca ggc gga tca aaa gca 144
Asp Gly Trp Gly Ala 35 Tyr Ser Thr 40 Gly Thr Thr Gly Gly 45 Ser Lys Ala
tcc tcc tca aat gtg tat acc gtc agc aac aga aac cag ctt gtc tcg 192
Ser Ser 50 Ser Asn Val Tyr Thr 55 Val Ser Asn Arg Asn 60 Gin Leu Val Ser
gca tta ggg aag gaa acg aac aca acg cca aaa atc att tat atc aag 240
Ala 65 Leu Gly Lys Glu Thr 70 Asn Thr Thr Pro Lys Ile 75 Ile Tyr Ile Lys 80
gga acg att gac atg aac gtg gat gac aat ctg aag ccg ctt ggc eta 288
Gly Thr Ile Asp Met 35 Asn val Asp Asp Asn 90 Leu Lys Pro Leu Gly 95 Leu
aat gac tat aaa gat ccg gag tat gat ttg gac aaa tat ttg aaa gcc 336
Asn Asp 'Tyr Lys Asp 100 Pro Glu Tyr Asp 105 Leu Asp Lys Tyr Leu 110 Lys Ala
tat gat cct agc aca tgg ggc aaa aaa gag ccg tcg 993 aca caa gaa 384
Tyr Asp Pro Ser Thr 115 Trp dy Lys 120 Lys Glu Pro Ser Gly 125 Thr Gin Glu
gaa gcg aga gca cgc tet cag aaa aac caa aaa gca cgg gtc atg gtg 432
Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gin Lys Asn Gin Lys Ala Arg Val Met Val
.30 135 140
PL 212 928 B1
gat atc cct Asp Ile Pro 145 gca Ala aac Asn acg Thr 3,50 acg Thr atc gtc ggt tea ggg act aac get aaa Lys ISO 430
Ile Val Gly Ser 155 Gly Thr Asn Ala
gtc gtg gga 39^ aac ttc caa atc aag agt gat aac gtc att att ege 528
Val val Gly Gly Aan 155 Phe Gln Ile Lys Ser 170 Asp Asn Val Ile Ile 175 Arg
aac att gaa ttc cag gat gee tat gac tat ttt ccg caa tgg gat ccg 575
Asn Ile Glu Phe 180 Gln Asp Ala Tyr Asp 185 Tyr Phe Pro Gln Trp 190 Asp Pro
act gac gga age tea ggg aac tgg aac tea caa tac gac aac atc acg 624
Thr Asp Gly 135 Ser Ser Gly Asn Trp Asn 200 Ser Gln Tyr Asp 205 Asn Ile Thr
ata aac ggc ggc aca cac atc tgg att gat cac tgt aca ttt aat gac 672
Ile Asn Gly 210 Gly Thr His Ile 215 Trp Ile Asp His Cys 220 Thr Phe Asn Asp
ggt tcg cgt ccg gac age aca tea ccg aaa tat tat gga aga ζδΐ3, cŁ tat 720
Gly Ser Arg 225 Pro Asp Ser 230 Thr Ser Pro Lys Tyr 235 Tyr Gly Arg Lys Tyr 240
cag cac cat gac sgc caa acg gat get tcc aac ggt get aac tat atc 763
Gln His His Asp Gly 245 Gln Thr Asp Ala Ser 230 Asn Gly Ala Asn Tyr 255 Ile
acg atg tcc tac aac tat tat cac gat cat gat aaa age tcc att ttc 816
Thr Met Ser Tyr 260 Asn Tyr Tyr His Asp 255 His Asp Lys Ser Ser 270 Ile Phe
gga tea agt gac age aaa acc tcc gat gac ggc aaa tta aaa att acg 864
Gly Ser Ser 27S Asp Ser Lys Thr Ser Asp 280 Asp Gly Lys Leu 285 Lys Ile Thr
ctg cat cat aac ege tat aaa aat att gtc cag ege gcg ccg aga gtc 912
Leu His His 230 Asn Arg Tyr Lys 295 Asn Ile Val Gln Arg 300 Ala Pro Arg Val
ege ttc ggg caa gtg cac gta tac aac aac tat tat gaa gga age aca 950
Arg Phe Gly 305 Gln Val His 310 Val Tyr Asn Asn Tyr 315 Tyr Glu Gly Ser Thr 320
age tet tea agt tat cct ttt age tat gca tgg gga atc gga aag tea 1008
Ser Ser Ser Ser Tyr 325 Pro Phe Ser Tyr Ala 330 Trp Gly Ile Gly Lys 335 Ser
tet aaa atc tat gee caa aac aat gtc att gac gta ccg gga ctg tea 1056
Ser Lys Ile Tyr 340 Ala Gln Asn Asn Val 343 Ile Asp Val Pro Gly 350 Leu Ser
get get aąa acg atc age gta ttc age ggg gga acg get tta tat gac 1104
Ala Ala Lyg 355 Thr Ile Ser Val Phe Ser 360 Gly Gly Thr ^42, 355 Leu Tyr Asp
tcc ggc acg ttg ctg aac ggc aca cag atc aac gca tcg get gca aac 1152
Ser Gly Thr Leu Leu Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn
370 375 380
PL 212 928 B1
ggg ctg agc tct tct gtc ggc tgg acg ccg tct ctg cat gga teg att 1200
Gly 38S Leu Ser Ser Ser Val 390 Gly Trp Thr Pro Ser leu His Gly Ser Ile
335 400
gat gct tct gct actt gtg aaa fcea aat gtt ata aat caa gcg ggt gcg X2=4S
Asp Ala Ser Ala Asn Val Lys Ser Asn Val Ile Asn Gin Ala Gly Ala
405 4X0 415 ggt aaa tta aat 1260
Gly Lys Leu Asn
420 <210> 27 <211> 420 <212 > PRT <213> Bacillus subtilis <400> 87
Met Lys 1 Lys Val Met Leu Ala Thr Ala Leu Phe Leu Gly Leu Thr 13 Pro
5 10
Ala Gly Ala Asn Ala Ala Asp Leu Gly Gin Thr Leu Gly Ser Asn
20 25 30
Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala
35* 40 45
Ser Ser Ser Asn Val Tyr Thr Tał Ser Asn Arg Asn Gin Leu Tal Ser
50 55 60
Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys
65 70 75 80
Gly Thr Ile Asp Mat Asn Val Asp Asp Asa Leu Lys Pro Leu Gly Leu
85 90 35
Asn. Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala
100 105 110
Tyr Asp Px*o Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Gin Glu
113 120 125
Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gin Lys Asn Gin Lys Ala Arg Val Met Val
130 13 S 140
Asp Ile Pro Ala Asn Thl* Thr Ile Tal Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys
145 150 155 ISO
Val Val Gly Gly Asn Phe Gin Ile Lys Sar ASO Asn Val Ile Ile Arg
PL 212 928 B1
Pro
Thr
Aep
Tyr
240
Ile
Phe
Thr
Val
Thr
320
Ser
Ser
Asp
Asn
Tle
400
Ala
PL 212 928 B1
Gly Lys Leu Asn ’ 420 <210» Θ9 <211» 26 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» Θ3 actagtaatg atggctgggg cgcgta 26 <210» 89 <211» 26 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 39 gtcgacatgt tgtcgtattg tgagtt 25 <210» 90 <211» 52 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 90 gagctctaca acgcttatgg atccgcggcc gcggcggcac acacatctgg at 52 <210» 91 <211» 26 <212» DNA <213» Bacillus subtilis <400» 91 gacgtcagcc cgtttgcagc cgatgc 26 <210> 92 <211» 1257 <212» DNA <213» Streptococcus pyogenes <220» <221» CDS <222» (1) . . (1257) <223» <400» 92
gtg Val 1 cct att Pro Ile ttt aaa aaa Lys act Thr tta Leu att Ile gtt tta tcc Ser ttt Phe att Ile ttt Phe 15 ttg Leu 48
Phe Lys 5 Val 10 Leu
ata tet atc ttg att tat eta aat atg tat eta ttt gga aca tea act 96
Ile Ser Ile Leu Ile Tyr Leu Asn Met Tyr Leu Phe Gly Thr Ser Thr
20 25 30
PL 212 928 B1
gta Val gga Gly att Ile 35 tat gga gta Val ata Ile tta ata Leu Ile 40 acc tat eta gtt att aaa ctt Ile Lys Leu 144
Tyr Gly Thr Tyr Leu Vał 45
gga tta tct ttc ctt tat gag cca ttt aaa gga aag cca cat gac tat 192
Gly Leu Ser Phe Leu Tyr Glu Pro Phe Lys Gly Lys Pro His Asp Tyr
50 55 SO
aaa gtt gct gct 'gta att cct tct tat aat gaa gat gcc gag tca tta 240
Lys Val Ala Ala Val He Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser Leu
70 75 BO
tta gaa Leu Glu act Thr ctt aaa agt gtg tta gca cag acc tat ccg tta tca gaa 288
Leu Lys 05 Ser Val Leu Ala Gin Thr Tyr Pro Leu Ser Glu
90 95
att tat att gtt gat gat ggg agt tca aac aca gat gca ata caa tta 33S
Ile Tyr Ile Val Asp Asp Gly Ser Ser Asn Thr Asp Ala Ile Gin Leu
100 105 110
att gaa gag tat gta aat aga gaa gtg gat att tgt ega aac gtt atc 384
Ile Glu Glu Tyr Val Asn Arg Glu Val Aap Ile Cys Arg Asn Val Ile
115 120 125
gtt cac cgt tcc ctt gtc aat aaa gga aaa ege cat gct caa gcg tgg 432
Val His Arg Ser Leu Val Asn Lys Gly Lys Acg His Ala Gin Ala Trp
130 135 140
gca ttt gaa aga tct gac gct gac gtt ttt tta acc gta gat tca gat 480
Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser Asp
145 150 155 160
act tat atc tat cca aat gcc tta gaa gaa ctc eta aaa age ttc aat 528
Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ser Phe Asn
165 170 175
gat gag aca gtt tat gct gca aca gga cat ttg aat gct aga aac aga 576
Asp Glu Thr Val Tyr Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Ala Arg Aan Arg
130 135 190
caa act aat eta tta acg ega ctt aca gat atc cgt tac gat aat gcc 624
Gin Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn Ala
195 200 205
ttt ggg gtg gag cgt gct gct caa tca tta aca ggt aat att tta gtt 672
Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gin. Ser Leu Thr Gly Asn Ile Leu Val
210 215 220
tgc tca gga cca ttg agt att tat ega cgt gaa gtg att att cct aac 720
Cys Ser Gly Pro Leu Ser Ile Tyr Arg Arg Glu Val Ile Ile Pro Asn
225 230 235 240
tta gag ege tat aaa aat caa aca ttc eta ggt tta cct gtt age att 768
Leu Glu Arg Tyr Lys Asn Gin Thr Phe Leu Gly Leu Pro Val Ser Ile
245 250 255
ggg gat gat ega tgt tta aca aat tat gct att gat tta gga ege act 816
ciy Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Ile Asp Leu Gly Arg Thr
260 265 270
gtc tac caa tca aca gct aga tgt gat act gat gta cct ttc caa tta 864
PL 212 928 B1
Val Tyr Gin Ser Thr Ala Arg Cys Asp Thr Asp Val Pro 285 Phe Gin Leu
275 280
aaa agt tat tta aag caa caa aat ega tgg aat aaa tet ttt ttt aaa 912
Lys Ser Tyr Leu Lys Gin Gin Aan Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe Lys
290 295 300
gaa tet att att tet gtt aaa aaa att ctt tet aat ccc atc gtt gcc 9S0
Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Leu Ser Asn Pro Ile Val Ala
305 310 315 320
tta tgg act att ttc gaa gtc atg ttt atg atg ttg att gtc gca 1008
Leu Trp Thr Ile Phe Glu Val val Met Phe Met Met Leu Ile Val Ala
325 330 335
att ggg aat ctt ttg ttt aat caa gct att caa tta gac ctt att aaa 1056
Ile Gly Asn Leu. Leu Phe Asn Gin Ala Ile Gin Leu Asp Leu Ile Lys
340 345 350
ctt ttt gcc ttt tta tcc atc atc ttt atc gtt gct tta tgt cgt aat 1104
Leu Phe Ala Phe Leu Ser Ile Ile Phe Ile Val Ala ijSii Cys Arg Asn
355 360 365
gtt cat tat atg atc aaa cat cct gct agt ttt ttg tta tet cct ctg 1152
Val His Tyr Met Ile Lys His Pro Ala Ser Phe Leu Leu Ser Pro Leu
370 375 •380
tat gga ata tta cac ttg ttt gtc tta cag ccc eta aaa ctt tat tet 1200
Tyr Gly Ile Leu His Leu Phe Val Leu Gin Pro Leu Lys Leu Tyr Ser
385 390 395 400
tta tgc acc att aaa aat acg gaa tgg ega aca cgt aaa aag gtc act 1243
Leu Cys Thr Ile Lys Asn Thr Glu Trp Gly Thr Arg Lys Lys Val Thr
405 410 415 att ttt aaa 2257
Ile Phe Lys <210? 93 <211> 419 <212> PRT <213? Streptococcus pyogenes <400> 93
Val Pro Ile Phe Lys Lys Thr Leu Ile Val Leu Ser Phe Ile Phe Leu 15 10 15
Ile Ser Ile Leu Ile Tyr Leu Asn Met Tyr Leu Phe Gly Thr Ser Thr 20 25 30
Val Gly Ile Tyr Gly Val Ile Leu Ile Thr Tyr Leu Val Ile Lys Leu 35 40 45
Gly Leu Ser Phe Leu Tyr Glu Pro Phe Lys Gly Lys Pro His Asp Tyr 50 55 60
PL 212 928 B1
PL 212 928 B1
Glu 305 Ser Ile Ile Ser Val 310 Lys Lys Ile Leu Ser 315 Asn Pro Ile Val Ala 320
Leu -P Thr Ile Phe 325 Glu Val Val Het Phe 330 Met Met Leu Ile Val 335 Ala
Ile giy Asn Leu 340 Leu Phe Asn Gin Ala 345 Ile Gin Leu Asp Leu 350 He Lys
Leu Phe Ala 35S Phe Leu Ser Ile Ile 360 Phe Ile Val Ala Leu 365 Cys Arg Asn
Val His 370 Tyr Met Ile Lys His 375 Pro Ala Ser Phe Leu 300 Leu Ser Pro Leu
Tyr 385 Gly Ile Leu His Leu 390 Phe val Leu Gin Pro 395 Leu Lys Leu Tyr Ser 400
Leu cys Thr Ile Lys 405 Asn Thr Glu Trp Gly 410 Τή*»*· Arg Lys Lys Val 415 Thr
Ile Phe Lys <210> 94 <211> 2916 <212 > DNA <213 > Pasteurella multocida <220>
<221> CDS <222> (1)..(2916) <223>
<400> 94
atg Met 1 aat Asn aca Thr tta Leu tea Ser 5 caa gca ata aaa gca tat aac age aat Tyr Asn Ser Asn gac Asp 15 tat Tyr 48
GXn Ile Lys Ala 10
caa tta gca ctc aaa tta ttt gaa aag teg gcg gaa atc tat gga cgg 96
Gin Łeu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Lys Ser Ala Glu Ile Tyr Gly Arg
20 25 30
aaa att gtt gaa ttt caa att acc aaa tgc caa gaa aaa ctc tea gca 144
Lys Ile Val Glu Phe Gin Ile Thr Lys Cys Gin Glu Lys Leu Ser Ala
35 40 45
cat cct tct gtt aat tea gca cat ett tct gta aat aaa gaa gaa aaa 192
His Pro Ser Val Asn Ser Ala His Leu Ser Val Asn Lys Glu Glu Lys
50 55 60
gtc aat gtt tgc gat agt ccg tta gat att gca aca caa ctg tta ett 240
PL 212 928 B1
Val 65 Asn Val Cys Asp Ser 70 Pro Leu Asp Ile Ala 75 Thr Gin Leu Leu Leu 80
tcc aac gta aaa aaa tta gta ctt tet gac teg gaa aaa aac acg tta 288
Ser Asn Val Lys Lys 35 Leu Val Leu Ser Asp 90 Ser Glu Lys Asn Thr 95 Leu
aaa aat aaa tgg aaa ttg ctc act gag aag aaa tet gaa aat gcg gag 33S
Lys Asn Lys Trp 100 Lys Leu Leu Thr Glu los Lys Lys Ser Glu Asn 110 Glu
gta aga gcg gtc gcc ctt gta cca aaa gat ttt ccc aaa gat ctg gtt 384
Val Arg Ala 115 Val Ala Leu Val Pro 120 Lys Asp Phe Pro Lys 125 Asp Leu Val
tta gcg cct tta cct gat cat gtt aat gat ttt aca tgg tac aaa aag 432
Leu Ala 130 Pro Leu Pro Asp His 13 S Val Asn Asp Phe Thr 140 Trp Tyr Lys Lys
ega aag aaa aga ctt ggc ata aaa cct gaa cat caa cat gtt ggt ctt 480
Arg 145 Lys Lys Arg Leu Gly ISO Ile Lys Pro Glu His 155 Gin His Val Gly Leu 160
tet att atc gtt aca aca ttc aat ega cca gca att tta teg att aca 528
Sar Ile Ile Val Thr 165 Thr Phe Asn Arg Pro 170 Ala Ile Leu Ser Ile 175 Thr
tta gcc tgt tta gta aac caa aaa aca cat tac ccg ttt gaa gtt atc 576
Leu Ala Cys Leu ISO Val Asn Gin Lys Thr 185 His Tyr Pro Phe Glu 190 Val Ile
gtg aca gat gat 59t agt cag gaa gat eta tea =cg atc att cgc caa 624
Val Thr Asp 195 Asp Gly Ser Gin Glu 200 Asp Leu Ser Pro Ile 205 Ile Arg Gin
tat gaa aat aaa ttg gat att cgc tac gtc aga caa aaa gat aac ggt 672
Tyr Glu 210 Asn Lys Leu Asp Ile 215 Arg Tyr Val Arg Gin 220 Lys Asp Asn Gly
ttt caa gcc agt gcc get cgg aat atg gca ł“ J3 v L-CX cgc ł a u να gca aaa tat 720
Phe 225 Gin Ala Ser Ala Ala 230 Arg Asn Met Gly Leu 235 Arg Leu Ala Lys Tyr 240
gac ttt att ggc tta ctc gac tgt gat atg gcg cca aat cca tta tgg 768
Asp Phe Ile Gly Leu 245 Leu Asp Cys Asp Met 250 Ala Pro Asn Pro Leu 255 Trp
gtt cat tet tat gtt gca gag eta tta gaa gat gat gat tta aca atc 816
Val His Ser Tyr 260 Val Ala Glu Leu Leu 265 Glu Asp Asp Asp Leu 270 Thr ile
att ggt cca aga aaa tac atc gat aca caa cat att gac cca aaa gac 864
Ile Gly Pro 275 Arg Lys Tyr Ile Asp 280 Thr Gin His Ile Asp 285 Pro Lys Asp
ttc tta aat aac gcg agt ttg Ctt gaa tea tta cca gaa gtg aaa acc 912
Phe Leu 290 Asn Asn Ala Ser Leu 295 Leu Glu Ser Leu Pro 300 Glu Val Lys Thr
aat aat agt gtt gcc gca aaa ggg gaa gga aca gtt tet ctg gat tgg 960
Asn Asn Ser Val Ala Ala Lys Gly Glu Gly Thr vai Ser Leu Asp Trp
PL 212 928 B1
305 31θ 335 320 cgc tta gaa caa ttc gaa aaa aca gaa aat ctc cgc tta tcc gat teg 100Θ
Arg Leu Glu Gin Phe Glu Lys Thr Glu Asn Leu Arg Leu Ser Asp Ser
325 330 335 cct ttc cgt ttt ttt gcg gcg ggt aat gtt gct ttc gct aaa aaa tgg 1056
Pro Phe Arg Phe Phe Ala Ala Gly Asn Tal Ala Phe Ala Lys Lys Trp
340 34S 350
eta aat aaa tcc ggt ttc ttt gat sag gaa ttt 33. fc cac tgg ggt gga 1104
Leu Asn Lys Ser Gly Phe Phe Asp Glu Glu Phe Asn His Trp Gly Gly
355 360 365
gaa gat gtg gaa ttt gga tat cgc tta ttc cgt tac ggt agt ttc ttt 1152
Glu Asp Val Glu Phe Gly Tyr Arg Leu Phe Arg Tyr Gly Ser Phe Phe
370 375 330
aaa act att gat gg= att atg gcc tac cat caa gag cca cca ggt aaa 1200
Lys Thr Ile Asp Gly Ile Met Al a Tyr His Gin Glu Pro Pro Gly Lys
385 390 395 400
gaa aat acta acc gat cgt gaa gga aaa aat att acg ctc gat att 1243
Glu Asn Glu Thr Asp Arg Glu Ala Gly Lys Asn Ile Thr Leu Asp Ile
405 410 415
atg aga gaa aag gtc cct tat atc tat aga aaa ctt tta cca ata gaa 1296
Met Arg Glu Lys Val Pro Tyx Ile Tyr Arg Lys Leu Leu Pro Ile Glu
420 425 430
gat teg cat atc aat aga gta cct tta gtt tea att tat atc cca gct 1344
Aap Ser His Ile Asn Arg Tal Pro Leu Tal Ser Ile Tyr Ile Pro Ala
435 440 445
tat aac tgt gca aac tat att caa cgt tgc gta gat agt gca ctg aat 1392
Tyr Asn Cys Ala Asn Tyr Ile Gin Arg Cys Val Asp Ser Ala Leu Asn
450 455 450
cag act gtt gtt gat ctc gag gtt tgt att tgt aac gat ggt tea aca 1440
Gin Thr Val Tal Asp Leu Glu Tal Cys Ile Cys Asn Asp Gly Ser Thr
465 470 475 480
gat aat acc tta gaa gtg atc aat aag ctt tat ggt aat aat cct agg 148 8
Asp Aan Thr Leu Glu Val Ile Asn Lys Leu Tyr Gly Asn Asn Pro Arg
485 490 495
gta cgc atc atg tct aaa cca aat ggc gga ata gcc tea gca tea aat 1536
Tal Arg Ile Met Ser Lys ?ro Asn Gly Gly Ile Ala Ser Ala 3er Asn
500 505 510
gca gcc gtt tct ttt gct aaa ggt tat tac att ggg cag tta gat tea 1564
Ala Ala Val Ser Phe Ala Lys Gly Tyr Tyr Ila Gly Gin Leu Asp Ser
515 520 525
gat gat tat ctt aag cct gat gca gtt gaa ctg tgt tta aaa gaa ttt 1632
Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Aso Ala Val Gjlu Leu Cys Leu Lys Glu Phe
530 535 540
tta aaa gat aaa acg eta gct tgt gtt tat acc act aat aga aac gtc 1S8 0
Leu Lys Asp Lys Thr Leu Ala Cys Val Tyr Tiir Thr Asn Arg Asn Val
545 S50 5S5 560
PL 212 928 B1
aat ccg gat ggt agc tta atc gct aat ggt tac aat tgg cca gaa ttt 1728
Asn Pro Asp Gly Ser 565 Leu Ile Ala Asn Gly Tyr 570 Asn Trp Pro Glu 575 Phe
tca ega gaa aaa ctc aca acg gct atg att gct cac cac ttt aga atg 1775
Ser Arg Glu Lys Leu Thr Thr Ala Met Ile Ala His His Phe Arg Met
SSO 58S 590
ttc acg att aga gct tgg cat tta act gat gga ttc aat gaa aaa att 1824
Phe Th-r Ile Arg Ala Trp His Leu Thr Asp Giy Phe Asn Glu Lys Ile
59S 600 605
gaa aat gcc gta gac tat gac atg ttc ctc aaa ctc agt gaa gtt sga 1872
Glu Asn Ala Val Asp Tyr Asp Met Phe Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly
SIO 615 620
aaa ttt aaa cat ctt aat aaa atc tgc tat aac cgt gta tta cat ggt 1920
Lys Phe Lys His Leu Asn Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Val Leu His Gly
625 630 635 64 0
gat aac aca tca att aag aaa ctt ggc att caa aag aaa aac cat ttt 1968
Asp Asn Thr Ser Ile Lys Lys Leu Gly Ile Gin Lys Lys Asn His Phe
545 650 655
gtt gta gtc aat cag tca tta aat aga caa ggc ata act tat tat aat 2016
Val Val Val Asn Gin Ser Leu Asn Arg Głn Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn
ssc 6S5 S70
tat gac gaa ttt gat gat tta gat gaa agt aga aag tat att ttc aat 2064
Tyr Asp Glu Phe Asp Asp Leu Asp Glu Ser Arg Lys Tyr Ile Phe Asn
575 680 SSE
aaa acc gct gaa tat caa gaa gag att gat atc tta aaa gat att aaa 2112
Lya Thr Ala Glu Tyr Gin Glu Glu Ile Asp Ile Leu Lys Asp Ile Lys
690 695 700
atc atc cag aat aaa gafc gcc aaa atc gca gcc agt att ttt tat ccc 2160
Ile Ile Gin Asn Lys Asp Ala Lys Ile Ala Val Ser Ile Phe Tyr Pro
705 710 715 720
aat aca tta aac ggc tta gtg aaa aaa eta aac aat att att gaa tat 2208
Asn Thr Leu Asn Gly Leu Val Lys Lys Leu Asn Asn Ile Ile Glu Tyr
725 730 735
aat aaa aat ata ttc gtt att gtt eta cat gat aag aat cat ctt 2256
Asn Lys Asn Ile Phe vał Ile Val Leu His Val Asp Lys Asn His Leu
740 745 750
aca cca gat atc aaa aaa gaa ata eta gcc ttc tat cat aaa cat caa 2304
Thr Pro Asp Ile Lys Lys GlU Ile Leu Ala Phe Tyr His Lys His Gin
755 760 765
Shg aat att tta eta aat aat gat atc tca tat tac acg agt aat aga 2352
Val Asn Ile Leu Leu Asn Asn Asp Ile Ser Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg
770 775 780
tta ata aaa act gag gcg cat tta agt aat att aat aaa tta agt cag 2400
Leu Ile Lys Thr Glu Ala His Leu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Ser Gin
735 790 735 300
PL 212 928 B1
tta aat eta aat tgt gaa tac atc att ttt gat aat cat gac age eta 2448
Lsu Asn Leu Asn Cys Glu Tyr Ile Ile Phe Asp Asn His Asp Ser Leu
805 810 815
ttc gtt aaa aat gac age tat gct tat atg aaa aaa tat gat gtc ggc 2456
Phe Val Lys Asn Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Lys Lys Ty*r Asp Val Gly
820 825 830
atg aat ttc tca gca tta aca cat gat tgg atc gag aaa atc aat gcg 2544
Met Asn Phe Ser Ala Leu Thr His Asp Trp Ile Glu Lys Ile Asn Ala
835
840
345 cat cca cca ttt aaa aag ctc att aaa act tat ttt aat gac aat gac His Pro Pro Phe bys Lys Leu Ile Lys Thr Tyr Phe Asn Asp Asn Asp
350 855 360
2592
tta aaa agt atg aat gtg aaa ggg gca tca caa ggt atg ttt atg acg
Leu Lys Ser Met Asn Val Lys Gly Ala Ser Gin Gly Met Phe Met Thr
865 870 875 880
tat gcg Cta gcg cat gag ctt ctg acg att att aaa gaa gtc atc aca
Tyr Ala Leu Ala His Glu Leu Leu Thr Ile Ile Lys Glu Val Ile Thr
890
395
2640
2688
385
tet tgc cag tca att gat agt gtg cca gaa tat aac act gag gat att 2736
Ser Cys Gin Ser Ile Asp Ser Val Pro Glu Tyr· Asn Thr Siu Asp Ile
900 90S 910
tgg ttc caa ttt gca ctt tta atc tta gaa aag aaa acc ggc cat gta 2784
Trp Phe Gin Phe Ala Leu Leu Ile Leu Glu Lys Lys Thr Gly His Val
915
920
925 ttt aat aaa aca tcg acc ctg act tat atg cct tgg gaa ega aaa tta Phe Asn Lys Thr Ser Thr Leu Thr Tyr Met Pro Trp Glu Arg Lys Leu
930 935 940
2832
caa tgg aca aat gaa caa att gaa agt gca aaa aga gga gaa aat ata
Gin Trp Thr Asn Glu Gin Ile Glu Ser Ala Lys Arg Gly Glu Asn Ile
945 950 955 960
cct gtt aac aag ttc att att aat agt ata act cta
Pro Val Asn Lys Phe Ile He Asn Ser Ile Thr Leu
965 970
2880
2516
<210? 95
<211? 372
<212? PRT
<213? Pasteurella raultocida
<400? 95
Met Asn Thr Leu Ser Gin Ala '
Gin Leu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Lys Ser Ala Glu Ile Tyr Gly Arg 20 25 30
Lys Ile Val Glu Phe Gin Ile Thr Lys Cys Gin Glu Lys Leu Ser Ala
PL 212 928 B1
40 45
His Pro Ser Val Asn Ser Ala His Leu Ser Val Asn Lys Glu Glu Lys Ξ0 55 60
Val Asn Val Cys Asp Ser Pro Leu Asp Ile Ala Thr Gin Leu Leu Leu S5 70 75 80
Ser Asn Val Lys Lys Leu Val Leu Ser Asn Ser Glu Lys Asn Thr Leu 55 90 95
Lys Asn Lys Trp Lys Leu Leu Thr Glu Lys Lys Ser Glu Asn Ala Glu 100 105 110
Val Arg Ala Val Ala Leu Val Pro Lys Asp Phe Pro Lys Asp Leu Val lis 120 125
Leu Ala Pro Leu Pro Asp His Val Asn Asp Phe Thr Trp Tyr Lys Lys 130 135 140
Arg Lys Lys Arg Łeu Gly Ile Lys Pro Glu His Gin His Val Gly Leu 145 150 155 160
Ser Ile Ile Val Thr Thr Phe Asn Arg Pro Ala Ile Leu Ser Ile Thr 155 170 175
Leu Ala Cys Leu Val Asn Gin Lys Thr His Tyr Pro Phe Glu Val Ile 130 185 190
Val Thr Asp Asp Gly Ser Gin Glu Asp Leu Ser Pro Ile Ile Arg Gin 195 200 205
Tyr Glu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Tyr Val Arg Gin Lys Asp Asn Gly 210 215 220
Phe Gin Ala Ser Ala Ala Arg Asn Met Gly Leu Arg Leu Ala Lys Tyr 225 230 235 240
Asp Phe Ile Gly Leu Leu Asp Cys Asp Met Ala Pro Asn Pro Leu Trp 245 250 255
Val His Ser Tyr Val Ala Glu Leu Leu Glu Asp Asp Asp Leu Thr Ile 260 2S5 270
Ile Gly Pro Arg Lys Tyr Ile Asp Thr Gin His Ile Asp Pro Lys Asp 275 280 285
PL 212 928 B1
Phe Leu 290
Asn Asn Ala Ser
Leu Leu Glu Ser 295
Leu Pro Glu Val Lys Thr 300
Asn Asn 305
Ser Val Ala Ala 310
Lys Gly Glu Gly
Thr Val Ser Leu Asp Trp 315 320
Arg Leu
Glu Gln Phe Glu 325
Lys Thr Glu Asn 330
Leu Arg Leu Ser Asp Ser 335
Pro Phe
Arg Phe Phe Ala 340
Ala Gly Asn Val 345
Ala Phe Ala Lys Lys Tm 350
Leu Asn
Lys Ser Gly Phe 355
Phe Asp Glu Glu 350
Phe Asn His Trp Gly Gly 365
Glu Asp 370
Val Glu Phe Gly
Tyr Arg Leu Phe 375
Arg Tyr Gly Ser Phe Phe 380
Lys Thr 3SS
Ile Asp Gly Ile 390
Met Ala Tyr His
Gln Glu Pro Pro Gly Lys 395 400
Glu Asn
Glu Thr Asp Arg 405
Glu Ala Gly Lys 410
Asn Ile Thr Leu Asp Ile 415
Met Arg
Glu Lys Val Pro 420
Tyr Ile Tyr Arg 425
Lys Leu Leu Pro Ile Glu 430
Asp Ser
His Ile Asn Arg 435
Val Pro Leu Val 440
Ser Ile Tyr Ile Pro Ala 445
Tyr Asn 450
Cys Ala Asn Tyr
Ile Gln Arg Cys 45S
VaL Asn Ser Ala Leu Asn 460
Gln Thr 465
Val Val Asp Leu 470
Glu Tal Cys Ile
Cys Asn Asp Gly Ser Thr 475 430
Asp Asn
Thr Leu Glu Val 435
Ile Asn Lys Leu 490
Tyr Gly Asn Asn Pro Arg 495
Val Arg
Ile Met Ser Lys 500
Pro Asn Gly Gly 505
Ile Ala Ser Ala Ser Asn 510
Ala Ala
Val Ser Phe Ala 515
Lys Gly Tyr Tyr 520
Ile Gly Gln Leu Asp Ser 525
PL 212 928 B1
Asp . Asp Tyr Leu Glu Pro Asp Ala Val Glu . Leu Cys Leu. Lys Glu Phe
530 540
Leu Lys Asp Lys Thr Leu Ala Cys Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Val
545 550 555 560
Asn Pro ASp Gly Ser Leu Ile Ala Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Glu Phe
565 570 575
Ser Arg GlU Lys Leu Thr Thr Ala Met Ile Ala His His Phe Arg Met
530 535 590
Phe Thr Ile Arg Ala Trp His Leu Thr Asp Gly Phe Asn Glu Lys Ile
595 600 605
Glu Asn Ala Val Asp Tyr Asp Met Phe Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly
610 615 620
Lys Phe Lys His Leu Asn Lys Ile Cys Tyr Asn- Arg Val Leu His Gly
625 63 0 635 640
Asp Asn Thr Ser Ile Lys Lys Leu Gly Ile Gin Lys Lys Asn His Phe
645 650 655
Val Vał Val Asn Gin Ser Leu Asn Arg Gin Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn
660 665 670
Tyr Asp Glu Phe Asp Asp Leu Asp Glu Ser Arg Lys Tyr Ile Phe Asn
675 630 685
Lys Thr Ala Glu Τντ Gin Glu Glu Ile Asp Ile Leu Lys Asp Ile Lys
690 69S 700
Ile Ile Gin Asn Lys Asp Ala Lys Ile Ala 7al Ser Ile Phe Tyr Pro
705 710 715 720
Asn. Thr Leu Asn Gly Leu Val Lys Lys Leu Asn Asn Ile Ile Glu Tyr
725 730 735
Asn Lys Asn Ile Phe Val Ile Val Leu His Val Asp Lys Asn His Leu
740 745 750
Thr 1 Pro Asp Ile Lys Lya Glu Ile Leu Ala Phe Tyr His Lys His Gin
755 760 765
PL 212 928 B1
Val Asn Ile Leu Leu Asn Asn Asę Ile Ser Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg 770 775 780
Leu Ile Lys Thr Glu Ala His Leu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Ser Gin 785 790 795 000
Leu Asn Leu Asn Cys Glu Tyr Ile Ile Phe Asp Asn His Asp Ser Leu 805 810 015
Phe Val Lys Asn Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Lys Lys Tyr Asp Val Gly 320 S25 330
Met Asn Phe Ser Ala Leu Thr His Asp Trp Ile Glu Lys Ile Asn Ala 835 840 845
His Pro Pro Phe Lys Lys Leu Ile Lys Thr Tyr Phe Asn Asp Asn Asp 850 855 360
Leu Lys Ser Met Asn Val Lys Gly Ala Ser Gin Gly Met Phe Met Thr 865 870 375. 880
Tyr Ala Leu Ala His Glu Leu Leu Thr Ile Ile Lys Glu Val Ile Thr 835 390 895
Ser Cys Gin Ser Ile Asp Ser Val Pro Glu Tyr Asn Thr Glu Asp Ile 900 905 910
Trp Phe Gin Phe Ala Leu Leu Ile Leu Glu Lys Lys Thr Gly His Val 915 920 925
Phe Asn Lys Thr Ser Thr Leu Thr Tyr Met Pro Trp Glu Arg Lys Leu 330 935 940
Gin Trp Thr Asn Glu Gin Ile Glu Ser Ala Lys Arg Gly Glu Asn Ile 945 950 955 960
Pro Val Asn Lys Phe Ile Ile Asn Ser Ile Thr Leu 965 970
<210? SS
<211? 1206
<212? DNA
<213 > Streptococcus pyogenes
<220>
<221? CDS
<222> (1)..(1206)
<223>
PL 212 928 B1 <400> 96
atg aaa ata gca gtt gct gga tea gga tat gtt gga tta tea eta Gly Tyr Val Gly Leu Ser Leu gga Gly 48
Met Lys 1 Ile Ala Val 5 Ala Gly Ser
10 15
gtt ctt fcea ctt caa aac gaa gtc act att gtt gat att ctt ccc 96
Val Leu Leu Ser Leu Gin Asn Glu Val Thr Ile Val Asp Ile Leu Pro
20 23 30
tct aaa gtt gat aag att aat aat ggc tta tea cca att caa gat gaa 144
Ser Lys Val Asp Lys Ile Asn Asn Gly Leu Ser Pro Ile Gin Asp Glu
35 40 45
tat att gaa tat tac tta aaa agt aaa caa tta tct att aaa gca act 192
Tyr Ile Glu Tyr Tyr Leu Lys Ser Lys Gin Leu Ser Ile Lys Ala Thr
50 55 50
tta gat agc aaa gca gct tat aaa gaa gcg gaa ctg gtc att att gcc 240
Leu Asp Ser Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Glu Leu Val Ile Ile Ala
65 7Q 75 80
aca cct aca aat tac aac agt aga att aat tat ttt gat aca cag cat 238
Thr Pro Thr Asn Tyr Asn Ser Arg 11© Aan Tyr Phe Asp Thr Gin His
8 5 90 95
gtt gaa aca gtt atc aaa gag gta eta agc gtt aat agc cat gca act 336
val Glu Thr Val Ile Lys Glu Val Leu Ser Val Asn Ser His Ala Thr
100 105 110
ctt atc atc aaa tea aca att cca ata ggt ttc att act gaa atg aga 384
Leu Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Ile Thr Glu Met Arg
115 120 125 cag aaa ttc caa act gat cgt att atc ttc agc cct gaa ttt tta aga 432
Gin Lys Phe Gin Thr Asp Arg Ile Ile Phe Ser Pro Glu phe Leu Arg
130 135 140
gaa tct aaa gct Lys Ala tta tat gac aac tta tat cca agc ega att att gtt 480
Glu 145 Ser Leu Tyr 150 Aap Asn L©U Tyr Pro Ser 155 Arg Ile Ile Val 160
tct tgt gaa gaa aac gat tct cca aaa gta aag gca gac gca gaa aaa 528
Ser Cya Glu Glu Asn Aap Ser Pro Lys Val Lys Ala Asp Ala Glu Lys
165 170 17S
ttt gca ctt tta Leu 180 tta aag tct gca gct aaa aaa aat aat gta cca gta 576
Phe Ala Leu Leu Lys Ser Ala Ala Lys Lys Asn Asn Val Pro Val
135 190
ctt att atg gga gct tea gaa gct gaa gca gta aaa eta ttt gcc aat S24
Leu Tle Met Gly Ala Ser Glu Ala Glu Ala Tal Lys Leu Phe Ala Asn
195 200 205
act Thr tat tta gcg tta agg Arg gta gct tat ttt Phe aat gag Asn Glu 220 tta gac Leu Asp act Thr tac Tyr
Tyr 210 Leu Ala Leu Val Ala 215 Tyr
gca gaa teg aga aaa tta aat agt cac atg att act caa gga att tct
Ala Glu Ser Arg Lys Leu Asn Ser His Met Ile Ile Gin Gly Ile Ser
225 230 235 240
672
720
100
PL 212 928 B1
tat Tyr gat gat ega ata gga atg cat Gly Met His tat aat aac cca tea ttt ggt tat 768
Asp Asp Arg Ile 245 Tyr Asn Asn 250 Pro Ser Phe Gly 255 Tyr
gga ggt tat tgt ΟΐΧ-ęŁ cct aaa gat acg aag caa tta ttg gca aat tac 816
Gly Gly Tyr Cys Leu Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr
260 265 270
aat aat att cct caa acg eta att gaa get atc gtt tea tea aat aat 864
Asn Asn Ile Pro Gln Thr Leu Ile Glu Ala Ile Val Ser Ser Asn Asn
275 230 285
gtg cgc aag tcc tat att get aag caa att atc aac gtc tta gaa gag 912
Val Arg Lys Ser Tyr Ile Ala Lys Gln Ile Ile Asn Val Leu Glu Glu
290 295 300
cgg gag tcc cca gta aaa gta gtc ggg gtt tac cgt tta att atg aaa 960
Arg Glu Ser Pro Val Lys Val Val Gly Val Tyr Arg Leu Ile Met Lys
305 310 315 320
agt aac tea gat aat ttt aga gaa agt get atc aaa gat gtt att gac 1008
Ser Asn Ser Asp Asn Phe Arg Glu Ser Ala Ile Lys Asp Val Ile Asp
325 330 335
att ctt aaa agt aaa gac att aag ata att att tat gag cca atg tta 1056
Ile Leu Lys Ser Lys Asp Ile Lys Ile Ile Ile Tyr Glu Pro Met Leu
340 345 350
aac aaa ctt gaa tet gaa gat caa tet gta ctt gta aat gat tta gag 1104
Asn Lys Leu Glu Ser Glu Asp Gln Ser Val Leu Val Asn Asp Leu Glu
355 360 365
aat ttc aag aaa caa gca aat att atc gta act aat cgc tat gat aat 1152
Asn Phe Lys Lys Gln Ala Asn Ile Ile Val Thr Asn Arg Tyr Asp Asn
370 375 380
gaa tta caa gat gtt aaa aat 3.ĆL3 gtt tac agt aga gat att ttt aat 1200
Glu Leu Gln Asp Val Lys Asn Lys Val Tyr Ser Arg Asp Ile Phe Asn
385 390 395 400 aga gac 1206
Arg Asp <210» 97 <211» 402 <212» PRT <213» Streptococcus pyogenes <400» 97
Met Lys Ile Ala Val Ala Gly Ser Gly Tyr Val Gly Leu Ser Leu Gly 15 10 15
Val Leu Leu Ser Leu Gln Asn Glu Val Thr Ile Val Asp Ile Leu Pro 20 25 30
PL 212 928 B1
101
Ser Lys Val Asp Lys Ile Asn. Asn Gly Leu Ser Pro Ile Gin Asp Glu 35 40 45
Tyr Ile Glu Tyr Tyr Leu Lys Ser Lys Gin Leu Ser Ile Lys Ala Thr 50 55 60
Leu Asp Ser Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Glu Leu Val Ile Ile Ala 65 70 75 80
Thr Pro Thr Asn Tyr Asn Ser Arę Ile Asn Tyr Phe Asp Thr Gin His 35 90 95
Val Glu Thr Val Ile Lys Glu Val Leu Ser Val Asn Ser His Ala Thr 100 105 110
Leu Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Ile Thr Glu Met Arg 115 120 125
Gin Lys Phe Gin Thr Asp Arg Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg 130 135 ' 140
Glu Ser Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile 7si 145 150 15S 160
Ser Cys Glu Glu Asn Asp Ser Pro Lys Val Lys Ala Asp Ala Glu Lys 165 170 17S
Phe Ala Leu Leu Leu Lys Ser Ala Ala Lys Lys Asn Asn Val Pro Val ISO 195 190
Leu Ile Met Gly Ala Ser Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ala Asn 195 200 205
Thr Tyr Leu Ala Leu Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Tyr 210 215 220
Ala Glu Ser Arg Lys Leu Asn Ser His Met Ile Ile Gin Gly Ile Ser 225 230 235 240
Tyr Asp Asp Arg Ile Gly Met His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr 245 2S0 255
Gly Gly Tyr Cys Leu Pro Lys Asp Thr Lys Gin Leu Leu Ala Asn Tyr 260 265 270
Asn Asn Ile Pro Gin Thr Leu Ile Glu Ala Ile Val Ser Ser Asn Asn
102
PL 212 928 B1
275 230 235
Val Arg Lys Ser Tyr Ile Ala Lys Gla Ile Ile Asn Val Leu Glu Glu 290 295 300
Arg Glu Ser Pro Val Lys Val Val Gly Val Tyr Arg Leu Ile Met Lys 305 310 315 320
Ser Asn Ser Asp Asn Phe Arg Glu 3er Ala Ile Lys Asp Val Ile Asp 325 330 335
Ile Leu Lys Ser Lys Asp Ile Lys Ile Ile Ile Tyr Glu Pro Met Leu 340 345 350
Asn Lys Leu Glu Ser Glu Asp Gin Ser Val Leu Val Asn Asp Leu Glu 355 360 365 '
Asn Phe Lys Lys Gin Ala Asn Ile Ile Tal Thr Asn Arg Tyr Asp Asn 370 375 380
Glu Leu Gin Aap Val Lys Asn Lys Tal Tyr Ser Arg Asp Ile Phe Asn 3S5 390 395 400
Arg Asp <210? 93 <211? 912 <212> DNA <213? Streptococcus pycgenes <220?
<221? CDS <222? ¢1)..(912) <223?
<400? 98
atg acc aaa gtc aga Arg 5 aaa gcc Lys Ala att Ile att cct gct gca ggt eta Gly Leu gga Gly 15 aca Thr 48
Met Thr 1 Lys Val Ile Pro 10 Ala Ala
cgt ttt tta cct gct acc aaa gct ctt gcc aaa gag atg ttg ccc atc 96
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Len Ala Lys Glu Met Leu Pro Ile
20 25 30
gtt gat aaa cca acc atc cag ttt atc gtc gaa gaa gcg eta aaa tct 144
Val Asp Lys Pro Thr He Gin Phe Ile Tal Glu Glu Ala Leu Lys Ser
35 40 45
ggc atc gag gaa atc ctt gtg gtg acc gaa aaa gct aaa ege tct atc 192
Gly Ile Glu Glu Ile Leu Val Val Thr Gly Lys Ala Lys Arg Ser Ile
50 55 60
PL 212 928 B1
103
gag gac cat ttt gat tca aac ttt gaa tta gaa tac aac ctc caa gct 240
Glu Asp His 65 Phe Asp Ser Aan Phe Glu Leu Glu Tyr Asn Leu Gin Ala 30
70 75
aag ggg aaa aat gaa ctg ttg aaa tta gtg gat gaa acc act gcc att 288
Lys Gly Lys Asn Glu Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Thr Thr Ala Ile
as 90 95
aac ctt cat ttt atc cgt caa age cac cca aga ggg ctg 9Sa gat gct 336
Asn Leu His Phe Ile Arg Gin Ser His Pro Arg Gly Leu Gly Asp Ala
100 105 110
gtc tta caa gcc aaa gcc ttt gtg ggc aat gaa ccc ttt gtg gtc atg 384
Val Leu Gin Ala Lys Ala Phe Val Gly Asn Glu Pro Phe Vał Val Met
115 120 125
ctt gga gat gac tta atg gac att aca aat gca tcc gct aaa cct ctc 432
Leu Giy Asp Asp Leu Met Asp Ile Thr Asn Ala Ser Ala Lys Pro Leu
130 135 140
acc aaa caa ctc atg gag gac tat gac aag acg cat gca tcc act atc 480
Thr Lys Gin Leu Met Glu Asp Tyr Asp Lys Thr His Ala Ser Thr Ile
145 150 155 160
gct gtg atg aaa gtt cct cat gaa gat gtg tet age tat ggg gtt atc 528
Ala Val Met Lys Val Pro His Glu Asp Val Ser Ser Tyr Gly Val Ile
165 170 175
gct cct caa ggc aag gct gtc aag ggc ctt tac agt gta gac acc ttt 576
Ala Pro Gin Gly Lys Ala Val Lys siy Leu Tyr Ser Val Aap Thr Phe
130 185 190
gtt gaa aaa cca caa cca gaa gat gcg cct agt gat ttg gct att att S24
Val Glu Lys Pro Gin Pro Glu Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ala Ile Ile
195 200 205
ggt cgt tac ctc cta acc cct gaa att ttt ggt att ttg gaa aga cag 672
Gly Arg Tyr Leu Leu Thr Pro Glu Ile Phe Gly Ile Leu Glu Arg Gin
210 215 220
acc cct gga gca ggt aac gaa gtg caa ctc aca gat 9rct atc gat acc 720
Thr Pro Gly Ala Gly Asn Glu Val Gin Leu Thr Asp Ala Ile Asp Thr
225 230 235 240
ctc aat aaa act cag cgt gtc ttt gca ega gaa ttt aaa ggc aat cgt 763
Leu Asn Lys Thr Gin Arg Val Phe Ala Arg Glu Phe Lys Gly Asn Arg
245 250 255
tac gat gtt ggg gat aaa ttt gga ttc atc aaa aca tet atc gac tat 816
Tyr Asp Val Gly Asp Lys Phe Gly Phe Met Lys Thr Ser Ile Asp Tyr
260 265 270
gcc tta gaa cac cca cag gtc aaa gag gac ttg aaa aat tac att atc 864
Ala Leu Glu His Pro Gin Val Lys Glu Asp Leu Lys Asn Tyz? Ile Ile
275 230 2S5
aaa ata gga aaa gct ttg gaa aaa agt aaa gta cca aca cat tca aag 912
Lys Leu Giy i.jVS Ala Leu Glu Lys Ser Lys Val Pro Thr His Ser Lys
290 295 300
104
PL 212 928 B1 <210> 99 <21Χ> 304 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 99
Met Thr Lys Val Arg Lys Ala Ile Ile Pro Ala Ala Gly Leu 15 10
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Leu Ala Lys Glu Met Leu 20 25 30
Val Asp Lys Pro Thr Ile Gin Phe Ile Val Glu Glu Ala Leu 35 40 45
Gly Ile Glu Glu Ile Leu Val Val Thr Gly Lys Ala Lys Arg S0 55 S0
Gly Thr 15
Pro Ile
Lys Ser
Ser Ile
Glu Asp His Phe Asp Ser Asn Phe Glu Leu Glu Tyr Asn Leu 65 * 70 75
Gin Ala 80
Lys Gly Lys Asn Glu Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Thr Thr 85 90
Ala Ile 9S
Asn Leu His Phe Ile Arg Gin Ser His Pro Arg Gly Leu Gly 100 105 110
Asp Ala
Vai Leu Gin Ala Lys Ala Phe Val Gly Asn Glu Pro Phe al 115 120 125
Val Met
Leu Gly Asp Asp Leu Met Asp Ile Thr Asn Ala Ser Ala Lys 130 135 140
Pro Leu
Thr Lys Gin Leu Met Glu' Asp Tyr Asp Lys Thr His Ala Ser 145 150 155
Thr Ile ISO
Ala Val Met Lys Val Pro His Glu Asp Val Ser Ser Tyr Gly
165 170
Val Ile 175
Ala Pro Gin Gly Lys Ala Pal Lys Gly Leu Tyr Ser Val Asp 180 135 190
Thr Phe
Val Glu Lys Pro Gin Pro Glu Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ala 195 200 205
Ile Ile
Gly Arg Tyr Leu Leu Thr Pro Glu Ile Phe Gly He Leu Glu
Arg Gin
PL 212 928 B1
105
210 215 220
Thr Pro Gly Ala Gly Asn Siu Val Gin Leu Thr Asp Ala Ile Asp Thr 225 230 235 240
Leu Asn Lys Thr Gin Arg Val Phe Ala Arg Glu. Phe Lys Gly Asn Arg 245 250 255 ”
Tyr Asp Val Gly Asp Lys Phe Gly Phe Met Lys Thr Ser Ile Asp Tyr 260 265 270
Ala Len Glu His Pro Gla. Val Lyg Glu Asp Len Lys Asn Tyr Ile Ile 275 2S0 235
Lys Leu Gly Lys Ala Leu Glu Lys Ser Lys Val Pro Thr His Ser Lys 290 295 300 <210? 100 <211? 1347 <212? DNA <213? Streptococcus ecui zooepidetnicus <220?
<221? CDS <222? (1)..(1347) <223?
<400? 100
atg tca cat att aca ttt gat tat tca aag gtt ctt sag caa ttt gcc 48
Met Ser His Ile Thr Phe Asp Tyr Ser Lys Val Leu Glu Gin Phe Ala
1 5 10 15
gga cag cat gaa att gac ttt tta caa ggt cag gta aca gag gct gat 96
Gly Gin His Glu Ile Asp Phe Leu Gin Gly Gin Val Thr Glu Ala Asp
20 26 30
cag gca eta cgt cag ggc act gga cct gga tca gat ttc ttg ggc tgg 144
Gin Ala Leu Arg Gin Giy Thr Glv Pro Gly Ser Asp Phe Leu Gly Trp
35 40 45
ctt gag tta cct gaa aac tat gac aaa gaa gaa ttt gct cgt atc ctt 192
Leu Glu Leu Pro Glu Asn Tyr Asp Lys Glu Glu Phe Ala Arg Ile Leu
50 55 60
aaa gca gct gag aag att aag gct gac agt gac gtt Ctt gtt gtg att 240
Lys Ala Ala Glu Lys Ile Lys Ala Asp Ser Asp Val Leu Val Val Ile
65 70 7S BO
ggt att ggt ggc tct tac ctt ggt gct aag gct gca att gac ttt ttg 283
Gly Ile Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Lys Ala Ala Ile Asp Phe Leu
35 90 95
aac agc cat ttt gcc aac eta caa aca gca aaa gag ege aaa gca cca 336
Asn Ser His Phe Ala Asn Leu Gin Thr Ala Lys Glu Arg Lys Ala Pro
100 105 110
106
PL 212 928 B1
caa att ctt tat get ggt aac tcc atc tea tea agc tat ctt get gat 384
Gin Ile Leu 115 Tyr Ala Gly Asn Ser 120 Ile Ser Ser Ser Ty2r 125 Leu Ala Asp
ctt gtg gac tat gtt caa gat aaa gat ttc tet gtt aac gtg att tet 432
Leu val Asp Tyr Val Gin Asp Lys Asp Phe Ser Val Asn Val Ile Ser
130 135 140
aag tet ggt aca a ch aca gag cct gca atc gcc ttt cgt gtc ttt aaa 480
Lys Ser Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ala Ile Ala Phe Arg Val Phe Lys
145 150 155 ISO
gaa tta ctt gtt aaa aag tac ggt caa gaa gag gcc aac aag cgt atc 52S
Glu Łeu Leu Val Lys Lys Tyr Gly Gin Glu Siu Ala Asn Lys Arg He
165 170 175
tat gca acg act gat aag gtc aag ggt get gtt aag gtt gag get gat 576
Tyr Ala Thr Thr Asp Lys Val Lys Gly Ala Val Lys Val Glu Ala Asp
ISO 185 190
gca aat cat tgg gaa acc ttt gtt gtg cca gat aat gtt ggt ggc cgt 624
Ala Asn His Trp Glu Thr Phe Val Val Pro Asę Asn Val Gly Gly Arg
195 200 205
ttc tea gtg ctg aca get gtg gg= ttg eta cca att gca gca tea ggg 672
Phe Ser Val Leu Thr Ala Val Gly Leu Leu Pro He Ala Ala Ser Gly
210 215 220
get gat att acc gcg ctg atg gaa gga gca aat gca get cgt aag gac 720
Ala Asp Ile Thr Ala Leu Met Glu Gly Ala Asn Ala Al. et Arg Lys Asp
225 230 235 240
ctg tea tea gat aaa atc tea gaa aac atc get tac udd tat get gtg 768
Leu Ser Ser Asp Lys Ha Ser Glu Asn He Ala Tyr Gin Tyr Ala Val
245 250 255
gtc cgc aat atc ctc tat cgc aaa ggc tat gta act gaa att ttg gca 816
Val Arg Aan Ile Leu Tyr Arg Lys Gly Tyr Val Thr Glu Ile Leu Ala
260 265 270
aac tat gag cca tea ttg cag tat ttt agc gaa tgg tgg aag caa ctg 864
Asn Tyr Głu Pro Ser Leu Gin Tyr Phe Ser Glu Trp Trp Lys Gin Leu
27S 280 285
get ggt gag tet gaa gga aag gac caa aag ggt att tac cca act tea 912
Ala Gly Glu Ser Glu Gly Lys Asp Gin Lys Gly Ile Tyr Pro Thr Ser
290 295 300
cct aat ttc teg aca gac ctg cat tet ctt ggt caa ttt atc caa gaa 960
Ala Asn Phe Ser Thr Asp Leu His Ser Leu Gly Gin Phe He Gin Glu
305 310 315 320
gg= tac cgt aac ctc ttt gag aca gtg att cgt gtg gac aag cca cgt 1008
Gly Tyr Arg Asn Leu Phe Glu Thr Val Ile Arg val Asp Lys Pro Arg
325 330 335
caa aat gtg att atc cca gaa atg get gag gac ctt gat QCC ctt ggc 1056
Gin Asn Val Ile Ile Pro Glu Met Ala Glu Asp Leu Asp Gly Leu Gly
340 345 350
PL 212 928 B1
107
tac eta caa gga aaa gac gtt val gac ttt gtc aac aaa aaa gca aca gat 1104
Tyr Leu Gin 355 Gly Lys Asp Asp Phe 3S0 Val Asn Lya Lys 355 Ala Thr Asp
ggt gtc Ctt ctt gcc cat aca gat ggt ggt gtg cca aat atg ttt atc 1152
Gly Val 370 Leu Leu Ala His Thr 375 Asp Gly Gly Val Pro 380 Asn Met Phe Ile
acg ett cca gag caa gac gaa ttt aca eta ggc tat acg atc tac ttc 1200
Thr 38S Leu Pro Glu Gin Asp 390 Glu Phe Thr Leu Gly Tyr 395 Thr Ile Tyr Phe 400
ttt gag ctt get att gcc ctt tea ggc tac efce aac ggg gtc aat cca 1248
Phe Glu Leu. Ala Ile 405 Ala Leu Ser Gly Tyr Leu 410 Asn Gly Val Asn 415 Pro
ttt gat cag cca ggc gtt gag get tac aag aaa aac atg ttt gcc ctt 1236
Phe Asp Gin Pro Gly 420 Val Glu Ala Tyr 425 Lya Lys Asn Met Phe 430 Ala Leu
ett ggt aag cca ggc ttt gaa gag eta gga gca gcg ctc aac gca ege 1344
Leu Gly Lys Pro Gly Phe Glu Glu Leu Gly Ala Ala Leu Asn Ala Arg
435 440 445 ttg 1347
Leu <210> 101 <211> 449 <212> PRT <213> Streptococcus ecui. scoepidemicus <400> 101
Met ser His Ile Thr Phe Asp Lyr Ser Lys al Leu Glu Gin Phe Ala
1 5 10 15
Gly Gin His Glu Ile Asp Phe Leu Gin Giy Gin Val Thr Glu Ala Asp
20 25 30
Gin Ala Leu Arg Gin Gly Thr Gly Pro Giy Ser Asp Phe Leu Gly Trn
35 40 45
Leu Glu Leu Pro Glu Asn Tyr Asp Lys Glu Glu Phe Ala Arg Ile Leu
50 55 50
Lys Ala Ala Glu Lys Ile Lys Ala Asp Ser Asp Val Leu Val Val Ile
65 70 75 80
Gly Ile Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Lys Ala Ala Ile Asp Phe Leu
85 90 95
Asn Ser His Phe Ala Asn Leu c-m Thr Ala Lys Glu Arg Lys Ala Pro
108
PL 212 928 B1
PL 212 928 B1
109
Tvx Leu Gin Gly Lys Asp Val Asp Phe Val Asn Lys Lys Ala Thr Asp
355 360 3 65
Gly Val 370 Leu Leu Ala His Thr 375 Asp Gly Gly Val Pro Asn Met Phe Ila 380
Thr Leu 335 Pro Glu Gin Asp Glu 390 Phe Thr Leu Gly Tyr Thr Ile Tyr Phe 395 400
Phe Glu Leu Ala Ile 405 Ala Leu Ser Gly Tyr Leu Asn Gly Val Asn Pro 410 415
Phe Asp Gin. Pro Gly 420 val Glu Ala Tyr Lys Lys Asn Met Phe Ala Leu 425 430
Leu Gly Leu Lys Pro Gly 435 Phe Glu Glu 440 Leu Gly Ala Ala Leu Asn Ala Arg 445
<210> 102 <211> 1251 <2Ι2> DNA · <213> Streptocoecus uberis <220>
<221> CDS <222> ¢1)..(1251) <223>
<400> 102 atg gaa aaa eta aaa aat ttc att aca ttt atg act ttt att ttc ctg 43
Met Glu Lys Leu Lys Asn Leu Ile Thr Phe Met Thr Phe Ile Phe Leu 15 10 15 tgg ctc ata att att ggg ctt aat gtt ttt gta ttt gga act aaa gga 96
Trp Leu Ile Ile Ile Gly Leu Asn Val Phe Val Phe Gly Thr Lys Gly
25 30 agt eta aca gtg tat ggg att att eta tta acc tat ttg teg ata aaa 144
Ser Leu Thr Val Tyr Gly Ile Ile Leu Leu Thr Tyr Leu Ser Ile Lys
40 4S atg gga tta tct ttt ctt tat cgt ccc tat aaa gga agt gta ggt caa 192
Met Gly Leu Ser Phe Phe Tyr Arg Pro Tyr Lys Gly Ser Val Gly Gin
55 60 tat aag gta gca gct att atc cca tct tat aat gag gat ggt gtc ggt 240
Tyr Lys Val Ala Ala Ile Ile Prc Ser Tyr Asn Glu Asp Gly Val Gly
70 75 30
110
PL 212 928 B1
tta. eta gaa act eta aag agt gtt caa aaa caa aca tat cca att gca 2S3
Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gin Lys Gin Thr Tyr Pro Ile Ala
35 90 95
gaa att ttc gta att gac gat ggg tca gta gat aaa aca ggt ata aaa 336
Glu Ile Phe Val Ile Asp Asp Gly Ser Val Asp Lys Thr Gly Ile Lys
100 105 110
ttg gtc gaa gac tat gtg aag tta aat ggc ttt gga gac caa gtt atc 394
Leu val Glu Asp Tyr Val Lys Leu Asn Gly Phe Gly Asp Gin Val Ile
115 120 125
gtt cat cag atg cct gaa aat gtt ggt aaa aga cat gct cag gct tgg 432
Val His Gin Met Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg His Ala Gin Ala Trp
130 135 140
gca ttt gaa agg tet gat gct gat gtt ttc tta aca gtg gat tca gat 4S0
Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser Asp
145 150 155 ISO
acc tac atc tat cct gat gct ctt gaa gaa tta tta aag aca ttt aat 528
Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lya Thr Phe Asn
165 170 175
gat cca gag gtc tac gct gca act gst cat tta aat gca aga aat aga 576
Asp Pro Glu Val Tyr Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Ala Arg Asn Arg
ISO 135 190
caa act aat ctc tta act aga ctg act gat att cgt tac gat aat gca 624
Gin Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asa Ala
195 200 205
ttt ggt gta gaa cgt gct gct cag tet gtt acg gga aat att ttg gtt 672
Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gin Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu Val
210 215 220
tgt tcc gga cct tta agt att tat aga cgt tcc gtc ggt att cca aat 720
Cys Ser Gly Pro Leu Ser Ile Tyr Arg Arg Ser Val Gly Ile Pro Asn
225 230 235 240
ctt gaa cgc tat acc tca caa aca ttt ctt ggt gtc cct gta agc ata 768
Leu Glu Arg Tyr Thr Ser Gin Thr Phe Leu Gly Val Pro Val Ser Ile
245 250 255
ggg gat gac cgt tgt ttg aca aat tat gca act gat pttg gga aaa acg 816
Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys Thr
260 265 270
Gft t tat cag tca act gca aga tgt gat act gac gtt cca gat aag ttt 864
Val Tyr Gin Ser Thr Ala Arg Cys Asp Thr Asp Val Pro Asp Lys Phe
275 2S0 285
aag gtt ttc atc aaa caa caa aat cgt tgg aat aag tca ttt ttt agg 912
Lys Val Phe Ile Lys Gin Gin Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe Arg
290 295 300
gag tet att atc tet gtt aag aag tta tta gcc aca CCS agt gtt gct 960
Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Leu Leu Ala Thr Pro Ser Val Ala
305 310 315 320
gtt tgg act att aca gaa gtt tcc atg ttc atc atg eta gtt tat tet 1008
PL 212 928 B1
111
Val Trp Thr Ile Thr Glu Val Ser Met Phe Ile Met Leu Val Tyr Ser
325 330 335
atc ttt agc tta Ctg ata gga gag gct caa gaa ttt aat ctc ata aaa 105S
H e Phe Ser Leu Leu Ile Gly Glu Ala Gin Glu Phe Asn Leu Ile Lys
340 345 350
ctg gtt gct ttt tta gtt att att ttc ata gta gct ctt tgt aga aat 1104
Leu Val Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg Asn
355 350 365
gtt cat tac atg gtt aag cat cca ttt gct ttt tta ttg tca ccg ttt 1152
Val His Tyr Met val Lys His Pro Phe Ala Phe Leu Leu Ser Pro Phe
370 375 380
tat gga ttg ata cat eta ttc gtt ttg caa cct ctt aag ata tat teg 1200
Tyr Gly Leu Ile His Leu Phe Val Leu Gin Pro Leu. Lys Ile Tyr Ser
385 390 395 400
tta ttt act ata aga aat gct aca tgg gga act cgt aaa aag aca agt 1248
Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Thr Trp Gly Thr Arg Lys Lys Thr Ser
405 410 415
aaa 1251
Lys <210> 103 <211> 417 <212? PRT <213? Streptococcus uberis <400? 103
Met Glu Lys Leu Lys Asn Leu Ile Thr Phe Met Thr Phe Ile Phe Leu χ 5* 10 15
Trp Leu Ile Ile Ile Gly Leu Asn Val Phe Val Phe Gly Thr Lys Gly 20 25 30
Ser Leu Thr Val Tyr Gly Ile He Leu Leu Thr Tyr Leu Ser Ile Lys 35 40 45
Met Gly Leu Ser Phe Phe Tyr Arg Pro Tyr Lys Gly Ser Val Gly Gin 50 55 SO
Tyr Lys Tal Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Gly al Gly 65 70 75 80
Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gin Lys Gin Thr Tyr Pro Ile Ala 85 90 95
Glu Ile Phe al Ile Asę Asp Gly Ser Val Asp Lys Thr Gly Ile Lys 100 105 110
112
PL 212 928 B1
Leu Val Glu Asp Tyr Val Lys Leu. Asn Gly Phe Gly Asp Gln Val Ile 115 120 125
Val His Gln Met Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg His Ala Gln Ala Trp 130 135 140
Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser Asp 145 150 155 160
Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe Asn 165 170 175
Asp Pro Glu Val Tyr Ala Ala Thr Gly His leu Asn Ala Arg Asn Arg 180 135 ISO
Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn Ala 195 200 205
Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu Val 210 215 220
Cys Ser Gly Pro Leu Ser Ile Tyr Arg Arg Ser Val Gly Ile Pro Asn 22S 230 235 240
Leu Glu Arg Tyr Thr Ser Gln Thr Phe Leu Gly Tal Pro Val Ser Ile 245 250 255
Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys Thr 260 265 270
Val Tyr Gln Ser Thr Ala Arg Cys Asp Thr Asp Val Pro Asp Lys Phe 275 230 285
Lys Val Phe Ile Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe Arg 290 295 300
Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Leu Leu Ala Thr Pro Ser al Ala 305 310 315 320
Val Trp Thr Ile Thr Glu '.'al Ser Met Phe Ile Met Leu Val Tyr Ser 325 330 335
Ile Phe Ser Leu Leu Ile Gly Glu Ala Gln Glu Phe Asn Leu Ile Lys 340 345 350
PL 212 928 B1
113
Leu val Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg Asn
355 360 369
Val His Tyr Met Val Lys His Pro Phe Ala Phe Leu Leu Ser Pro Phe
370 375 330
Tyr Gly Leu Ile His Leu Phe Val Leu Gin Pro Leu Lys Ile Tyr Ser
335 390 395 400
Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Thr Trp Gly Thr Arg Lys Lys Thr Ser
405 410 415
Lys
<210> 104
<211> 1203
<212> DNA
<213> Streptococcus uberis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1203)
<223>
<400> 104
gtg Val aaa att gca gtt Ala Val 5 gca Ala ggt Giy tct Ser ggc tat gtt ggc eta tea tta agt 48
Lys Ile Gly Tyr 10 Val Gly Leu Ser Leu 15 Ser
gta tta tta gca cag aaa aat cct gtt aca gtt gta gat att att gag 96
Val Leu Leu Ala Gin Lys Asn Pro Val Thr Val Val Asp Ile Ile Glu
20 25 30
aag aaa gta aat ctc ata aat caa aaa caa tea cca atc cag gat gtt 144
Lys Lys Val Aan Leu Ile Asn Gin Lys Gin Ser Pro ile Gin Asp Val
35 40 45
gat att gaa aac tat tta aaa gaa aaa aag tta caa tta aga gct act 192
Asp Ile Glu Asn Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Leu Gin Leu Arg Ala Thr
50 55 60
eta gac gcc gat caa gca ttt agg gat gca gat ata eta att att gct 240
Leu Asp Ala Asp Gin Ala Phe Arg Asp Ala Asp Ile Leu Ile ile Ala
65 70 75 30
aca cca acc aat tat gat gtg gag aag aat ttt ttt gat act agt cat 288
Thr Pro Thr Asn Tyr Asp Val Glu Lys Asn Phe Phe Asp Thr Ser His
35 90 95
gtt gag act gta att gag aaa gct tta gct tta aat agt cag gct ttg 336
Val Glu Thr Val Ile Glu Lys Ala Leu Ala Leu Asn Ser Gin Ala Leu
100 105 110
eta gtt att aaa tea acg ata cca ctt ggt ttt att aaa aag atg cgt 334
114
PL 212 928 B1
Leu Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro : 115 120 Leu Gly Phe Ile : Lys : 125 Lys i Met Arg
caa aaa tat cag aca gac cgt att att ttt agt ccc gaa ttt ctt aga 432
Gln Lya Tyr Gln Thr Asp Arg Ile 130 135 Ile Phe Ser Pro 140 Glu Phe Leu Arg
gag tet aaa get tta aaa gat aat ctt tat cct agt ega ata att gtt 4S0
Glu Ser Lys Ala Lau Lys Asp Asn 145 150 Leu Tyr Pro 155 Ser Arg Ile Ile Val 160
tcc ttt gaa gat gat gat tet atg gaa gta ata 9aa gca gca aag act 523
Ser Phe Glu Asp Asp Asp Ser Met 165 Glu Vał 170 Ile Glu Ala Ala Lys 175 Thr
ttt get caa ttg tta aaa gat ggt tet ttg gat aaa gat gtt cct gta 576
Phe Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gly ISO Ser Leu 185 Asp Lys Asp Val 190 Pro Val
ctt ttt atg ggt tea gca gag get gaa gca gta aaa tta ttt gee aat 624
Leu Phe Met Gly Ser Ala Glu Ala 195 200 Glu Ala Val Lys Leu 205 Phe Ala Asn
acc tat tta get atg cgt gtc tcc tat ttt aat gag tta gat aca tat 672
Thr Tyr Leu Ala Met Arg Val Ser 210 215 Tyr Phe Asn Glu 220 Leu Asp Thr
get gaa aag aat ggt tta cgt gtg gat aat att att gag ggc gtt tgc 720
Ala Glu Lys Asn Gly Leu Arg Val 225 230 Asp Asn Ile 235 Ile Glu Gly Val Cys 240
cat gat ega cgc ata gga att cat tat aat aac cct tet ttt ggc tat 763
His Asp Arg Arg Ile Gly Tle His 245 Tyr Asn 250 Asn Pro Ser Phe Gly 255 Tyr
gga gga tac tgc tta cct aaa gat acc aaa cag ttg eta gca ggc tat 816
Gly Gly Tyr Cys Leu Pro Lys Asp 260 Thr Lys 263 Gln Leu Leu Ala 270 Gly Tyr
gat ggt att cct caa tcg ctt ata aaa gca att gtt gat tet aat aaa 864
Asp Gly Ile Pro Gln Ser Leu Ile * 275 280 Lys Ala Ile Val Asp 235 Ser Asn Lys
att cgt aaa gag tat atc gca tea caa att tta caa caa ttg agt gat 912
Ile Arg Lys Glu Tyr Ile Ala Ser 290 295 Gln Ile Leu Gln 300 Gln Leu Ser Asp
att aat gta gat cct aaa gat gca acg att ggt att tac cgc ctt atc 960
Ile Aan Val Asp Pro Lys Asp Ala 305 310 Thr Ile Gly 315 ile Tyr Arg Leu Ile 320
atg aaa agt aac tet gat aat ttc aga gag agt gca ata aaa gat att 1008
Met Lys Ser Asn Ser Asp Asn Phe 325 Arg Glu 330 Ser Ala Ile Lys Asp 335 Ile
att gat cat att aag age tat caa att aat ata gtc ttg tat gag cca 1056
Ile Asp His Ile Lys Ser Tyr Gln 340 Ile Asn 345 Ile Val Leu Tyr 350 Glu Pro
atg atg aat gaa gat ttt gat tta cca atc att gat gat tta tet gac 1104
Met Met Asn Glu Asp Phe Asp Leu . Pro Ile Ile Asp Asp Leu Ser AsP
PL 212 928 B1
115
355 360 365
ttc aaa gcc atg tca Ser cat His att atc gtt tca aat aga tat gat tta gcc 1152
Phe Lys Ala Met Ile Ile 375 Val Ser Asn Arg Tyr 330 Asp Leu Ala
370
tta gaa gat gtt aaa gaa aaa gtt tac acc aga gat att tac 9St gtg 1200
Leu Glu Asp Val Lys Gili Lys 7al Tyr Thr Arg Asp Ile Tyr Gly Val
385 390 395 400
gat 1203
Asp
<210> 105
<211> 401
<212> PR.T
<213? Streptococcus uberis
<400? 105
val Lys Ile Ala Val Ala Giy Ser Gly Tyr Val Gly Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
val Leu Leu Ala Gin Lys Asn Pro Val Thr Val Val Asp Ile Ile Glu
20 25 30
Lys Lys Val Asn Leu Ile Asn Gin Gin Ser Pro Ile Gin Asp Val
35 40 45
Asp Ha Glu Asn Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Leu Gin Leu Arg Ala Thr
50 55 60
Leu Asp Ala Asp Gin Ala Phe Arg Asp Ala Asp Ile Leu Ile Ile Ala
65 70 75 30
Thr Pro Thr Asn Tyir Asp Vał Glu Lys Asn Phe Phe Asp Thr Ser His
85 90 95
Val Glu Thr Val Ile Glu Lys Ala Leu Ala Leu Asn Ser Gin Ala Leu
100 105 110
Leu Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Leu Gly Phe Ile Lys Lys Met Ax*cr
115 120 125
Gin Lys Tyz* Gin Thr Asp Arg Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg
130 135 140
Glu Ser Lys Ala Leu Lys Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg He Ile Val
145 150 155 ISO
116
PL 212 928 B1
PL 212 928 B1
117
ASp <210? 10S <211? 912 <212? DNA <213? Streptococcus uberis <220?
<221? CDS <222? (1).,(912) <223 ?
<400? 106
atg act aaa gta aga aaa gcc att att cca gct gcc gga ctt ggc aca 48
Met Thr Lys Val Arg Lys Ala ile Ile Pro Ala Ala Gly Leu Gly Thr
T_ 5 10 15
cgt ttt tta cca gca aca aaa gct ctc gct aag gaa atg ttg ccc atc 96
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Leu Ala Lys Glu Met Leu Pro Ile
20 25 30
gtt gac cU£S cca acc att caa ttc atc gtg gaa gaa gct ttg cgt tet 144
Val Aap Lys Pro Thr Ile Gin Phe Ile Val Glu Glu Ala Leu Arg Ser
35 40 45
ggc att gaa gaa atc ttg gtc gta aca gga aaa tca aaa ege tcc att 192
Gly Ile Glu Glu Ile Leu Val Val Thr Gly Lys Ser Lys Arg Ser Ile
50 55 60
gaa gac cat ttt gat tcc aac ttt gaa ctc gaa tat aat ttg caa gaa 240
Glu Asp His Phe Asp Ser Asn Phe Glu Leu Glu Tyr Asn Leu Gin Glu
65 70 75 SO
aaa ggg aaa act gaa ctc tta aaa tta gtt gat gaa acc act tet ata 283
Lys Gly Lys Thr Glu Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Thr Thr Ser Ile
85 90 95
aac ttg cat ttc att cgt caa agt cat CCC aaa ggc tta ggg gat gct 336
Asn Leu His Phe Ile Arg Gin Ser His Pro Lys Gly Leu Gly Asp Ala
100 105 110
gtt tta caa gca aaa gct ttt gta gga aat gaa ccc ttc att gtt atg 384
Val Leu Gin Ala Lys Ala Phe Val Gly Aan Glu Pro Phe Ile Val Met
11S 120 125
ctt ggt gac gat ttg atg gac att aca aat acc aaa gct gtc cca tta 432
Leu Gly Asp Asp Leu Met Asp Ile Thr Asn Thr Lys Ala Val Pro Leu
130 135 140
acc aaa caa tta atg gac gat tat gaa aca aca cat gct tet aca ata 480
Thr Lys Gin Leu Met Asp Asp Tyr Glu Thr Thr His Ala Ser Thr Ile
145 150 155 160
gcc gta atg aaa gtt cct cac gat gac gta tcc tet tat ggt gtc att 528
Ala Val Met Lys Val Pro His Aap Asp vai Ser Ser Tyr Gly Val Ile
165 170 17S
gct cca aac ggc gŁ2cL gcc ttg aat ggc tta tat age gtg gat acc ttt 576
Ala Prc Asn Gly Lys Ala Leu Asn Gly Leu Tyr Ser Val Asp Thr Phe
118
PL 212 928 B1
ISO 135 190
att aaa aaa cca aaa cct gag gac gca cca agt gac ctt Leu 205 get atc att Ile 624
Val Glu Lys Pro Lys Pro Glu Asp 200 Ala Pro Ser Asp Ala Ile
195
gga cgt tat ctc tta aca cct gaa att ttt gac att ctt gaa aat caa 672
Gly Arg Tyr Leu Leu Thr Pro Glu Ile Phe Asp Ile Leu Glu Asn. Gin
210 215 220
gca cca ggt gcc gga aac gaa gtc caa tta act gat get atc gat acc 720
Ala Pro Gly Ala Gly Asn Glu Val Gin Leu Thr Asp Ala Ile Asp Thr
225 23 0 235 240
ctc aac aaa aca caa cgt gtt ttt get cgt gag ttt act ggc aaa ege 766
Leu Asn Lys Thr Gin Arg Val Phe Ala Arg Glu Phe Thr Gly Lys Arg
245 250 255
tac gat gtt gga gac aag ttt ggc ttc atg aaa aca tct atc gat tat 816
Tyr Asp Val Gly Asp Lys Phe Gly Phe Met Lys Thr Ser Ile Asp Tyr
260 265 270
gcc eta aaa cac cat caa gtc aaa gat gac eta aaa get tat att atc 864
Ala Leu Lys His His Gin Val Lys Asp Asp Leu Lya Ala Tyr Ile Ile
275 280 2Θ5
aag tta ggt aaa gaa tta gaa aaa gca caa gat tcc aaa gaa age aaa 912
Lys Leu Gly Lys Glu Leu Glu Lys Ala Gin Asp Ser Lys Glu Ser Lys
290 295 300 <210> 107 <211> 304 <212> PRT <213> Streptococcus uberis <400> 107
Met Thr Lya Val Arg Lys Ala Ile Ile Pro Ala Ala Gly Leu Gly Thr 1 5 10 15
Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lya Ala Leu Ala Lya Glu Met Leu Pro Ile 20 2S 30
Val Asp Lys Pro Thr Ile Gin Phe Ile Val Glu Glu Ala Leu Arg Ser 35 40 45
Gly Ile Glu Glu Ile Leu Val Val Thr Gly Lys Ser Lys Arg Ser Ile 50 35 60
Glu Asp His Phe Asp Ser Asn Phe Glu Leu Glu Tyr Asn Leu Gin Glu 55 70 75 80
Lys Gly Lys Thr Glu Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Thr Thr Ser Ile 35 ' 90 95
PL 212 928 B1
119
Asn Leu His Phe 100 Ile Arg Gin Ser His 105 Pro Lys Gly Leu Gly Asp 110 Ala
Val Leu Gin 115 Ala Lys Ala Phe Val 120 Gly Asn Glu Pro Phe 125 Ile Val Met
Len Gly Asp 13 0 Asp Leu Met Asp 135 Ile Thr Asn Thr Lys 14 0 Ala Val Pro Leu
Thr 145 Lys Gin Leu Met Asp 150 Asp Tyr Glu Thr Thr 155 His Ala Ser Thr Ile 160
Ala Val Met Lys val 155 Pro His Asp Asp Val 170 Ser Ser Tyr Gły Val 175 ile
Ala Pro Asn Gly 180 Lys Ala Leu Asn Gly 185 Leu Tyr Ser Val Asp 190 Thr Phe
Val Glu Lys 195 Pro Lys Pro Glu Asp 200 Ala Pro Ser Asp Leu 205 Ala Ile ile
Gly Arg 210 Tyr Leu Leu Thr Pro 215 Glu Ile Phe Asp Ile 220 Leu Glu Asn Gin
Ala 225 Pro Gly Ala Gly Asn 230 Glu Val Gin Leu Thr 235 Asp Ala Ile Asp Thr 240
Leu Asn Lys Thr Gin 245 Arg Val Phe Ala Arg 250 Glu Phe Thr Gly Lys 255 Arg
Tyr Asp Val Gly Asp 260 Lys Phe Gly Phe 265 Met Lys Thr Ser Ile 270 Asp Tyr
Ala Leu Lys 275 His His Gin Val Lys 2S0 Asp Asp Leu Lys Ala 285 Tyr Ile Ile
Lys Leu C-Iy Lys Glu Leu Glu Lys Ala Gin Asp Ser Lys Glu Ser Lys
230 295 300 <210> 108 <211> 5158 <212 > DNA <213 > Streptococcus ecuisirailis <400;. 108 tcaatttatg gctttttgct gatagcttac ctattagtca aaatgtcctt atcctttttt 60
120
PL 212 928 B1
tacaagccat ttaagggaag ggctgggcaa tataaggttg cagccattat tccctcttat 120
aacgaagatg ctgagtcatt gcfcagagacc ttaaaaagtg tfccagcagea aacctatccc 180
ctagcagaaa tttatgttgt tgacgatgga agtgctgatg agacaggtat taagcgcatt 240
gaagactatg tgcgtgacac tggtgaccta tcaagcaatg tcattgttca tcggtcagag 300
aaaaatcaag gaaagcgtca tgcacaggcc tgggcctttg aaagatcaga cgctgatgtc 360
tttttgaccg ttgactcaga fcacttatatc tacccfcgatg ctttagagga gttgttaaaa 420
acctctaatg acccaactgt ttttgctgcg acgggtcacc ttaatgtcag aaatagaeaa 480
accaatctct taacacgctt gacagatatt cgctatgata atgcttttgg cgttgaacga 340
gctgcccaat ccgttacagg taatatcctt gtttgctcag gtccgcttag cgtttacaga 600
cgcgaggtgg ttgttcctaa catagataga tacatcaacc agaccttcct gggtattcct 660
gtaagtattg gtgatgacag gtgcttgacc aactatgcaa ctgatttagg aaagactgtt 720
tatcaatcca ctgctaaatg tattacagat gttcctgaca agatgtctac ttacttgaag 730
cagcaaaacc gctggaacaa gtccttcttt agagagtcca ttatttctgt taagaaaatc 840
atgaacaatc cttttgtagc cctatggacc atacttgagg tgtctatgtt tatgatgctt SCO
gtttattctg tggtggattt ctttgtaggc aatgtcagag aatttgattg gctcagggtt 960
ttagcctttc tggtgattat cttcattgtfc gccctgtgtc ggaacafctca ttacatgctt 1020
aagcacccgc tgtccttctt gttatctccg ttttatgggg tgctgcattt gtttgtccta 1030
cagcccttga aattatattc tctttctact attaoaaatg ctgactgggg aacacgtaaa 1140
aaattattat aaaccaacta gacctaggtt ctgacaaggg agctaagcta gggataaaca 1200
aagagttttg atccgactcg agcagctcat aaac^aaagc tatcccactt gtaattgaag 1250
ctaagagctt ttagcetgca gcfcctataaa gacgaaccag aggctgagtg tcagctttgg 1320
tgtgagggct aggtcattat gatccttcag gtgtggcacc tgagctccgg eagtagctaa 1380
ctgtactaag gtatcaaagg aaaaaatgaa gtgaaaattt ctgtagcagg ctcagcacat 1440
gccggcctat ccttgagtat tttactggca caacataatg acgtcactgt tgttgacatt 1500
attgatgaaa aggtgagatt gatcaatcaa ggcatatcgc caatcaagga tgctgatatt 1560
gaggagtatt taaaaaatgc gccgctaaat ctcacagcga cgcttgafcgg cgcaagcgct 1620
tatagcaatg cagaccttat tatcattgct actccgacaa attatgacag cgaacgcaac 1630
tactttgaca caaggcatgt tgaagaggtc atcgagcagg tcctagacct aaatgcgtca 1740
gcaaccatta ttatcaaatc aaccatacea ctaggcttta tcaagcatgt tagggaaaaa 1800
taccagacag atcgtattat ttttagccca gaatttttaa gagaatcaaa ageefctatac 1360
gataaccttt acccaagtcg gatcattgtt tcttatgaaa aggacgactc accaagggtt 1920
PL 212 928 B1
121
attcaggctg ctaaagcctt tgctggtctt ttaaaggaag gagccaaaag caaggatact 1980
ccggfccttat ttatgggctc acaggaggct gaggcggtca agctatttgc gaataccttt 2040
ttggctatgc gggtgtctta ctttaatgaa fctagacacct attccgaaag caagggtcta 2100
gatgctcagc gcgtgattga aggagtctgt catgatcagc gcattggtaa ccattacaat 2160
aacccttcct ttggatatgg cggctattgc ctgccaaagg acagcaagca gctgttggca 222 0
aattatagag gcattcccca gtęcttgatg tcagcgattg ttgaatccaa caagatacga 2280
aaatcttatt tggctgaaca aatattagac agagccteta gtcaaaagca ggctggtgta 2340
ccattaacga ttggctttta ccgcttgatt atgaaaagca actctgataa tttccgagaa 2400
agcgccatta aagatattat tgatatcatc aacgactatg gggttaatat tgtcatttac 2460
gaacceatgc ttggcgagga tattggctac agSSttgtcs aggacttaga gcagttcaaa 2520
aacgagecta caatcattgt gtcaaatcgc tttgaggacg acctaggaga tgfccattgat 2580
aaggtttata cgagagatgt ctttggaaga gactagtcag aaaacgaatg gcactcataa 2640
ggaaceacaa atcaaggagg aactcatgac aaaggtcaga aaagccatta tceeagecge 2700
cggcctaggc actcgcttcc tgcecgccac eaaggcactg gccaaggaaa tgctcccaat 2760
cgtcgataag ccaaccattc aatfccatcgt cgaggaagcc ctaaaggcag gtatcgagga 2320
gattcttgtc gtcaccggca aggccaaacg ctctatcgag gaccactttg actccaactt 2830
cgagctcgaa tacaatctcc .aagccaaggg caaaaccgag ctactcaagc tcgfctgatga 2940
gaccactgcc atcaacctgc acttcattcg tcagagccac cetagaggac taggggacgc 2000
tgtcctccaa gccaaggcct ttgttggcaa tgagcccttt gtggtcafcgc fcgggggatga 3060
cefceatggat attaccaatc ctagtgccaa gcccttgacc aagcagctta ttgaggatta 3120
tgattgcaca cacgcctcaa cgattgcagt gatgagggtg ccgcatgagg aggtttccaa 3180
ttatggtgfcg attgcaccgc aagggaaggc tgtŁaagggc ttgtatagtg tggagacctt 3240
tgttgagaag ccaagtccag atgaggcacc gagtgaetta gcgattattg gtcgatattt 3300
gttgacgcct gagatttttg ccatattgga gaagcaggcg cctggagctg gcaatgaggt 3360
acagctgacc gatgcgattg acaagctcaa taagacacag cgggtttttg cgagggagtt 3420
taagggagag cggtatgatg ttggggacaa gćttggcttt atgaagacct cacttgacta 3480
tgctcteaag caccctcagg tcaaggacga cctcactgac tacattataa agctcagtaa 3540
gcaactgaac aaggacgtca agaaataggc gtttattgat cagctattge agagctattt 3600
aaaagcattt agagctttaa ggfcgggatac tagaggattg gtatctcact ttttaggctg 3660
acttgtatta ataccaaaag ccaaaactag gcagataagc ataaggaatt agattaaaaa 3720
122
PL 212 928 B1
taaggaacca aaacatgaaa aactacgcca ttatcctagc agctggaaag ggaacgcgca 3780
tgaagtcagc gcttcccaag gtgctgcaca aggtatcagg cctaagcatg ctggagcatg 3840
tcctcaagag tgtctcagcc ctagccccfcc aaaagcagct caęagtgatc ggtcatcagg 3900
cagagcaggt gcgtgctgte ctaggagagt aatcgętaac agfcggtgcaa gaggagcagc 3980
tagggacagg ccatgcagtc atgatggcag aagaggagct atctggctta S^ggggcaaa 4020
ccctagtgat tgcaggtgac acccccttga tcagaggaga aagcctcaag gctctgctag 4080
actatcatat cagagaaaag aatgtggcaa ccattctcac agccaatgcc aaggatccct 4140
ttggctatgg acgaatcatt cgcaatgcag caggagaggt ggtcaacatc gttgagcaaa 4200
aggatgctaa tgaggeagag c&agaggfcts aggagatcaa cacagggact tatatctttg 4260
acaataagcg cctttttgag gctctaaagc atctcacgac fcgafcaatgcc caaggggagt 4320
actacctaac cgatgtgatc agtattttca aggctggcca agaaagggtt ggcgcttacc 4380
tgctgaagga ctttgatgag agccfcagggg ttaatgatcg cttagctcfca gcccaggccg 4440
aggtgatfcat gcaagagcgg atcaacaggc agcacatgct taatggggtg accctgcaaa 4500
acccggcagc fcacctatatt gaaagcagtg tagagattgc accagacgtc ttgafctgaag 4560
ccaatgtgac cttaaaggga cagactagaa t tggcagcag aagfcgfccata agcaatggga 4620
gctatatcct fegatecgagg cttggtgagg gtgtagtggt tagccagtcg gtgattgagg 4680
ctfccagtctt ageagatgga gtgacagtag ggccatatgc acacattcgc ccggactccc 4740
agctcgatga gtgtgttcat attgggaact ttgtagaggt taaggggtct catctagggg 4800
ccaataccaa ggcagggcafc ttgacttacc tgggcraatgc cgagattggc tcagaggfcfca 4060
acattggfcgc aggaagcatt acggttaatt atgatggtca acggaaatac cagacagtga 4920
ttggcgatca cgcttttatt gggagtcatt cgactttgat agctccggta gaggfctgggg 4980
agaatgcttt aacagcagea gggtctacga fcageecagtc agfcgccggca gacagtgtgg 5040
cfcatagggeg cagccgtcag gfcggtgaagg aaggctatgc easgaggctg ccgcsecacc 5100
caaatcaagc ctaatcgctc aaccaaaaga ggcaggtgag aaaacctagg ccattaaa 5158
PL 212 928 B1

Claims (42)

1. Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego, znamienny tym, że:
(i) hoduje się komórkę gospodarza Bacillus w warunkach odpowiednich do wytwarzania kwasu hialuronowego, która to komórka gospodarz Bacillus zawiera konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sztuczny operon zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z sekwencją promotora obcą względem sekwencji kodującej syntazę hialuronanu, przy czym (a) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich;
(b) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich;
(c) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich;
oraz (ii) odzyskuje się kwas hialuronowy z pożywki hodowlanej.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
124
PL 212 928 B1
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sePL 212 928 B1
125 kwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sztuczny operon zawiera ponadto sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA zlokalizowaną w dół od sekwencji promotora i w górę od sekwencji kodującej syntazę hialuronanu.
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sztuczny operon zawiera kwas nukleinowy kodujący syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDPglukozy oraz sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z krótkim „konsensusowym” promotorem amyQ mającym sekwencję TTGACA dla regionu „-35” i TATAAT dla regionu „-10”.
22. Komórka gospodarz Bacillus zawierająca konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sztuczny operon zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z sekwencją promotora obcą względem sekwencji kodującej syntazę hialuronanu, przy czym (a) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich;
(b) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich;
(c) sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 70% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
23. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
24. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 23, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
25. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 24, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95,
126
PL 212 928 B1
SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
26. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 25, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
27. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 26, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 92 lub SEQ ID NO: 102; albo nić komplementarną do nich.
28. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
29. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 28, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
30. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 29, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
31. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 30, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
32. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 31, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 96 lub SEQ ID NO: 104; albo nić komplementarną do nich.
33. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 75% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
34. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 33, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą
PL 212 928 B1
127 w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
35. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 34, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 85% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
36. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 35, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
37. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 36, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy stanowi (i) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107; lub (ii) sekwencję kwasu nukleinowego hybrydyzującą w ostrych warunkach z SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 42 lub SEQ ID NO: 98 lub SEQ ID NO: 106; albo nić komplementarną do nich.
38. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca syntazę hialuronanu koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 93 lub SEQ ID NO: 103.
39. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca 6-dehydrogenazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 97 lub SEQ ID NO: 105.
40. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca pirofosforylazę UDP-glukozy koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 99 lub SEQ ID NO: 107.
41. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sztuczny operon zawiera ponadto sekwencję obróbki/stabilizacji mRNA zlokalizowaną w dół od sekwencji promotora i w górę od sekwencji kodującej syntazę hialuronanu.
42. Komórka gospodarz Bacillus według zastrz. 22, w której sztuczny operon zawiera kwas nukleinowy kodujący syntazę hialuronanu, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą 6-dehydrogenazę UDP-glukozy oraz sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pirofosforylazę UDP-glukozy funkcjonalnie połączone z krótkim „konsensusowym” promotorem amyQ mającym sekwencję TTGACA dla regionu „-35” i TATAAT dla regionu „-10”.
PL375190A 2001-12-21 2002-12-20 Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego i komórka gospodarz Bacillus PL212928B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34264401P 2001-12-21 2001-12-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL375190A1 PL375190A1 (pl) 2005-11-28
PL212928B1 true PL212928B1 (pl) 2012-12-31

Family

ID=23342668

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL399352A PL399352A1 (pl) 2001-12-21 2002-12-20 Sposoby wytwarzania hialuronanu w rekombinowanej komórce gospodarzu
PL375190A PL212928B1 (pl) 2001-12-21 2002-12-20 Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego i komórka gospodarz Bacillus

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL399352A PL399352A1 (pl) 2001-12-21 2002-12-20 Sposoby wytwarzania hialuronanu w rekombinowanej komórce gospodarzu

Country Status (18)

Country Link
US (5) US7811806B2 (pl)
EP (1) EP1572895B1 (pl)
JP (1) JP2005525091A (pl)
KR (2) KR100885163B1 (pl)
CN (1) CN1636052B (pl)
AT (1) ATE502115T1 (pl)
AU (1) AU2002366711C1 (pl)
BR (1) BR0215220A (pl)
CA (2) CA2471148C (pl)
CZ (1) CZ2004765A3 (pl)
DE (1) DE60239495D1 (pl)
DK (1) DK1572895T3 (pl)
ES (1) ES2362354T3 (pl)
HU (2) HU228693B1 (pl)
IL (2) IL162302A0 (pl)
PL (2) PL399352A1 (pl)
RU (1) RU2346049C2 (pl)
WO (1) WO2003054163A2 (pl)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7091008B1 (en) * 1994-07-01 2006-08-15 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronan synthase genes and expression thereof in Bacillus hosts
CN1322121C (zh) * 1997-10-31 2007-06-20 俄克拉何马大学董事会 透明质酸合酶基因及其应用
ATE470708T1 (de) * 2001-06-13 2010-06-15 Univ Oklahoma State Hyaluronansynthase-gene und expression davon
DK1572895T3 (da) * 2001-12-21 2011-07-11 Novozymes Biopharma Dk As Fremgangsmåder til fremstilling af hyaluronan i en rekombinant værtscelle
MXPA04011011A (es) * 2002-05-14 2005-02-14 Novozymes As Variantes de pectato liasa.
ES2280749T3 (es) * 2002-06-20 2007-09-16 Novozymes Biopolymer A/S Floculacion con sal bivalente.
US7476516B2 (en) * 2002-07-26 2009-01-13 Novozymes, Inc. Methods for producing biological substances in pigment-deficient mutants of Bacillus cells
EP1706721A4 (en) * 2004-01-09 2008-11-19 Novozymes Inc BACILLUS LICHENIFORMIS CHROMOSOME
CA2563173A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Novozymes Biopolymer A/S Methods for producing hyaluronic acid in a bacillus cell
US7002007B2 (en) * 2004-05-28 2006-02-21 Calcigen Corporation Production of high molecular weight hyaluronates
WO2005123915A1 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
EP1640457A1 (de) * 2004-09-23 2006-03-29 Bayer CropScience GmbH Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan
SI1805312T1 (sl) 2004-09-23 2009-12-31 Bayer Cropscience Ag Postopki in sredstva za izdelavo hialuronana
PL1817347T3 (pl) * 2004-11-24 2017-10-31 Albumedix As Sposób sieciowania kwasu hialuronowego za pomocą diwinylosulfonu
WO2006069578A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Novozymes Biopolymer A/S Hyaluronic acid linked with a polymer of an alpha hydroxy acid
EP1696032A1 (de) * 2005-02-23 2006-08-30 Bayer CropScience GmbH Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan in Pilzen
JP4639904B2 (ja) 2005-03-30 2011-02-23 チッソ株式会社 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法
JP4609177B2 (ja) 2005-04-28 2011-01-12 チッソ株式会社 カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法
US20060287512A1 (en) * 2005-05-04 2006-12-21 Novozymes Biopolymer A/S Method of controlling the content of selected component(s) from polymer(s) using molecular sieve(s)
EP1932909A4 (en) * 2005-08-25 2009-04-08 Toyo Boseki VEGETABLE PRODUCING HYALURONIC ACID
EP1772052A1 (de) 2005-10-05 2007-04-11 Bayer CropScience GmbH Verbesserte Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan
WO2007039314A2 (en) * 2005-10-05 2007-04-12 Bayer Cropscience Ag Plants with increased hyaluronan production
JP2007174957A (ja) * 2005-12-27 2007-07-12 Toyobo Co Ltd ヒアルロン酸生産酵母
US20080038780A1 (en) * 2006-02-15 2008-02-14 Novozymes Biopolymer A/S Production of low molecular weight hyaluronic acid
BRPI0708776A2 (pt) * 2006-03-14 2011-06-14 Novozymes Biopolymer As produto de Ácido hialurânico acrilado, e, processo para preparaÇço e mÉtodo para polimerizaÇço/reticulaÇço do mesmo
CN101501075B (zh) 2006-08-04 2013-07-10 诺维信生物制药丹麦公司 支化透明质酸和制造方法
CN101595214B (zh) 2006-11-29 2013-06-12 诺维信股份有限公司 改进向细菌细胞中导入dna的方法
DK2104739T3 (da) 2006-12-21 2013-10-07 Novozymes Inc Modificerede messenger-RNA-stabiliseringssekvenser til ekspression af gener i bakterieceller
EP2031053A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-04 The University Of Queensland Production of HA
WO2009026635A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 The University Of Queensland Production of hyaluronic acid
EP2036983A1 (de) * 2007-09-12 2009-03-18 Bayer CropScience AG Pflanzen, die erhöhte Mengen an Glucosaminglycanen synthetisieren
EP2222715B1 (en) * 2007-12-19 2019-07-24 Evonik Degussa GmbH Crosslinked hyaluronic acid in emulsion
US9045737B2 (en) * 2008-12-13 2015-06-02 Dnamicroarray, Inc. Artificial three-dimensional microenvironment niche culture
EP2213315A1 (en) 2009-01-30 2010-08-04 Mero S.r.L. Antibacterial hydrogel and use thereof in orthopedics
CN102021213B (zh) * 2009-09-17 2014-07-09 上海佰加壹医药有限公司 一种发酵生产透明质酸发酵液的方法
CA2791353A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Novozymes, Inc. Xylanase variants and polynucleotides encoding same
IT1401498B1 (it) 2010-07-30 2013-07-26 Mero Srl Idrogelo a base di acido ialuronico e suo uso in ortopedia
IT1402384B1 (it) 2010-09-09 2013-09-04 Fidia Farmaceutici Processo per la produzione di acido ialuronico in escherichia coli o bacillus megaterium
IT1402385B1 (it) * 2010-09-09 2013-09-04 Fidia Farmaceutici Processo per la produzione di acido ialuronico in escherichia coli o bacillus subtilis
KR20140034853A (ko) 2011-05-30 2014-03-20 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 고분자량 히알루론산의 분무 건조
CN102911887A (zh) * 2011-08-02 2013-02-06 山东省生物药物研究院 一种利用毕赤酵母基因调控发酵生产不同分子量透明质酸的方法
KR20140058581A (ko) 2011-09-02 2014-05-14 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 지연된 약물 방출용 히알루론산 함유 경구 제형
DE102012201297A1 (de) * 2012-01-31 2013-08-01 Basf Se Expressionsverfahren
CN102559559A (zh) * 2012-02-21 2012-07-11 山东福瑞达生物医药有限公司 一种芽孢杆菌及采用该菌种生产透明质酸酶的方法
CN103255187B (zh) * 2012-02-21 2015-02-18 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种低分子透明质酸盐、其制备方法及用途
JP6306519B2 (ja) * 2012-02-22 2018-04-04 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 高度発酵制御
WO2014100837A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 Bui The Duy Computer aided implantation of body implants
AU2014352672B2 (en) 2013-11-25 2018-11-29 Deuteria Biomaterials, Llc Deuterium-enriched hyaluronan
CA2896038C (en) 2015-07-03 2022-08-09 Glycobiosciences Inc. Polymer matrix compositions comprising a high concentration of bio-fermented sodium hyaluronate and uses thereof
CN106755022B (zh) * 2015-11-25 2020-08-04 中国科学院大连化学物理研究所 乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶AtAGM编码基因及其酶、制备、应用与酶活性检测方法
WO2018007435A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Novozymes A/S Pectate lyase variants and polynucleotides encoding same
CN107653280B (zh) * 2016-07-25 2021-05-04 安琪酵母股份有限公司 透明质酸发酵用的组合物、培养基和方法及其应用
CN106381279B (zh) * 2016-08-29 2019-11-05 中国药科大学 一种细菌胞外多糖、其制备方法及其应用
WO2020122429A1 (ko) * 2018-12-10 2020-06-18 대화제약 주식회사 히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법
WO2020122430A1 (ko) * 2018-12-10 2020-06-18 대화제약 주식회사 비병원성 세균을 이용하여 히알루론산 생산을 위한 발현 시스템 및 상기 발현 시스템을 이용한 히알루론산 생산방법
KR102135044B1 (ko) * 2018-12-10 2020-07-17 대화제약 주식회사 히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법
CN110055201B (zh) * 2019-03-05 2021-05-28 江南大学 一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
RU2723722C1 (ru) * 2019-07-26 2020-06-17 Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР ТРАНСФЕРА БИОТЕХНОЛОГИЙ ОКА-Биотех" ТАНДЕМНЫЙ ПРОМОТОР, ФУНКЦИОНИРУЮЩИЙ В БАКТЕРИИ РОДА Bacillus, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ БАКТЕРИЯ РОДА Bacillus - ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПРОМОТОР, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОЙ БАКТЕРИИ
RU2719140C1 (ru) 2019-07-26 2020-04-17 Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР ТРАНСФЕРА БИОТЕХНОЛОГИЙ ОКА-Биотех" Бактерия рода bacillus, продуцирующая гиалуроновую кислоту, и способ получения гиалуроновой кислоты с использованием указанной бактерии
CN111518825B (zh) * 2020-04-30 2022-10-11 浙江工业大学 一种多基因组合表达制备蛹虫草多糖的方法
WO2022178432A1 (en) * 2021-02-22 2022-08-25 Danisco Us Inc. Methods and compositions for producing proteins of interest in pigment deficient bacillus cells

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60251898A (ja) 1984-05-25 1985-12-12 Shiseido Co Ltd 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法
US6951743B2 (en) 1997-10-31 2005-10-04 University Of Oklahoma Board Of Regents Hyaluronan synthase genes and expression thereof in bacillus hosts
US6455304B1 (en) 1994-07-01 2002-09-24 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronate synthase gene and uses thereof
IT1271001B (it) 1994-07-26 1997-05-26 Poli Ind Chimica Spa Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus
CN1322121C (zh) 1997-10-31 2007-06-20 俄克拉何马大学董事会 透明质酸合酶基因及其应用
US5955310A (en) * 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
CN101275143A (zh) * 1998-04-02 2008-10-01 俄克拉何马大学董事会 编码透明质酸合酶的核酸及其应用方法
EP1129209B1 (en) 1998-11-11 2009-01-21 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Polymer grafting by polysaccharide synthases
AU2002306849A1 (en) 2001-03-21 2002-10-08 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
ATE470708T1 (de) * 2001-06-13 2010-06-15 Univ Oklahoma State Hyaluronansynthase-gene und expression davon
DK1572895T3 (da) * 2001-12-21 2011-07-11 Novozymes Biopharma Dk As Fremgangsmåder til fremstilling af hyaluronan i en rekombinant værtscelle

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003054163A3 (en) 2005-10-27
US20110189737A1 (en) 2011-08-04
PL399352A1 (pl) 2012-10-08
AU2002366711A1 (en) 2003-07-09
US8137951B2 (en) 2012-03-20
CN1636052B (zh) 2014-07-02
KR20080018965A (ko) 2008-02-28
AU2002366711C1 (en) 2009-01-22
BR0215220A (pt) 2007-01-09
CZ2004765A3 (cs) 2004-12-15
PL375190A1 (pl) 2005-11-28
KR20040085142A (ko) 2004-10-07
EP1572895A2 (en) 2005-09-14
JP2005525091A (ja) 2005-08-25
ES2362354T3 (es) 2011-07-04
AU2002366711B2 (en) 2007-11-29
US20120149067A1 (en) 2012-06-14
RU2004122420A (ru) 2005-10-10
EP1572895A4 (en) 2007-07-25
RU2346049C2 (ru) 2009-02-10
DE60239495D1 (de) 2011-04-28
ATE502115T1 (de) 2011-04-15
US8574886B2 (en) 2013-11-05
CA2471148A1 (en) 2003-07-03
CA2803931A1 (en) 2003-07-03
DK1572895T3 (da) 2011-07-11
IL162302A (en) 2011-01-31
CN1636052A (zh) 2005-07-06
KR100885163B1 (ko) 2009-02-23
KR100879908B1 (ko) 2009-01-21
CA2471148C (en) 2013-04-09
US8093036B2 (en) 2012-01-10
US20140038235A1 (en) 2014-02-06
HUP0700154A2 (en) 2007-05-29
IL162302A0 (en) 2005-11-20
HU228693B1 (hu) 2013-05-28
US20030175902A1 (en) 2003-09-18
WO2003054163A2 (en) 2003-07-03
HU1300136D0 (hu) 2007-05-29
EP1572895B1 (en) 2011-03-16
US7811806B2 (en) 2010-10-12
US20110014662A1 (en) 2011-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL212928B1 (pl) Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego i komórka gospodarz Bacillus
AU2007214856B2 (en) Production of low molecular weight hyaluronic acid
US20050221446A1 (en) Methods for producing hyaluronic acid in a Bacillus cell
US20060276636A1 (en) Hyaluronate synthase gene and uses thereof
AU2008200910B2 (en) Methods for producing hyaluronan in a recombinant host cell

Legal Events

Date Code Title Description
DISD Decisions on discontinuance of the proceedings of a derived patent or utility model

Ref document number: 399352

RECP Rectifications of patent specification
RECP Rectifications of patent specification