MXPA04011011A - Variantes de pectato liasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a variantes de pectato liasa que exhiben alteraciones con relacion a la enzima precursora que exhibe la actividad de pectato liasa como su actividad enzimatica principal; a un metodo para producir tales enzimas; y a metodos para usar tales enzimas en las industrias textil, detergente y de procedimientos de fibras de celulosa. En comparacion con la enzima precursora, las variantes de pectato liasa de la presente invencion exhiben una estabilidad mejorada en detergentes.

Description

VARIANTES DE PECTATO LIASA Campo de la Invención La presente invención se refiere a variantes de pectato liasa que muestran alteraciones relacionadas con una actividad de pectato liasa que presenta una enzima precursora como su principal actividad enzimática; a un método para producir tales enzimas y, a métodos para usar tales enzimas en la industria en la que se procesan fibras de celulosa, detergentes y textiles. A diferencia de la enzima precursora, las variantes de pectato liasa de la presente invención pueden exhibir una estabilidad mejorada en detergentes.

Antecedentes de la Invención Los polímeros de pectina son componentes importantes de las paredes celulares de las plantas. La pectina es un heteropolisacárido con una estructura compuesta de homogalacturonano alterno (regiones lisas) y ramnogalacturonano (regiones pilosas) . Las regiones lisas son polímeros lineales de ácido alfa-D-galacturónico de 1,4 enlaces. Los residuos de ácido galacturónico pueden esterificarse con metilo en el grupo carboxilo en un grado variable, usualmente en forma no aleatoria con bloques de ácido poligalacturónico que se esterifican completamente con metilo. Ref: 159701 Las enzimas pectoliticas (pectinasas) pueden clasificarse de acuerdo a su substrato preferente, pectina altamente esterificada con metilo o pectina poco esterificada con metilo y ácido poligalacturónico (pectato) , a su mecanismo de reacción, eliminación beta o hidrólisis. Las pectinasas pueden ser principalmente de efecto endógeno, que cortan al polímero en sitios aleatorios dentro de la cadena para dar una mezcla de oligómeros, o pueden ser de efecto exógeno, que ataca desde un extremo del polímero y produce monómeros y dímeros. Varias actividades de pectinasa que actúan en las regiones lisas de la pectina se incluyen en la clasificación de enzimas proporcionadas por la Nomenclatura de las Enzimas (1992) tales como la pectato liasa (EC 4.2.2.2), pectina liasa (EC 4.2.2.10), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.67), exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) y exo-poli-alfa-galacturonosidasa (EC 3.2.1.82). Las liasas han sido clonadas a partir de diferentes géneros bacterianos tales como Erwinia, Pseudomonas, Klebsiella y Xanthomonas. También a partir de Bacillus subtills (Nacer et al, (1993) FEBS 335:319-326) y especies Bacillus YA-14 (Kim et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:947-949) se ha descrito la clonación de una pectato liasa. Las pectato liasas se caracterizan generalmente por un pH alcalino óptimo y un requerimiento absoluto para cationes divalentes, el Ca2+ es el más estimulante. Es un objetivo de la presente invención proporcionar una variante de la enzima que degrada las paredes celulares, especialmente una variante de enzima pectato liasa, que exhibe un desempeño mejorado sobre la pectato liasa precursora cuando se aplica por ejemplo, en detergentes o en procesos de la industria textil.

Breve Descripción de la Invención Los inventores han descubierto recientemente que ciertas sustituciones de aminoácidos en las enzimas que degradan las paredes celulares especialmente las pectato liasas, que tienen una estructura que incluye una hélice beta que resulta en variantes de enzimas que tienen un desempeño mejorado en el rango de pH alcalino o neutral comparado con la enzima precursora. Las variantes de pectato liasa de la invención, cuando se usan en composiciones para detergentes tienen una estabilidad al almacenaje mejorada, es decir, una sensibilidad reducida para los detergentes. Asi, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una variante de pectato liasa que comprende alteraciones en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de varias posiciones: 5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91, 99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193, 194, 196,· 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397 en donde la alteración (s) son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en la dirección descendente del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una eliminación del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, y en donde cada posición corresponde a una posición de la secuencia del aminoácido de la pectato liasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y en donde la enzima precursora es la pectato liasa en la SEC ID NO: 2 o una pectato liasa que tiene al menos 65% de identidad para la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de la pectato liasa. En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión. En un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona una célula hospedadora microbiana transformada con el vector de expresión antes mencionado. En un .quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para mejorar la estabilidad del detergente de una pectato liasa, que comprende alterar uno o más aminoácidos . En un sexto aspecto de la invención, se proporcionan métodos para producir una variante de pectato liasa de acuerdo a la invención que comprende una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión como se describió antes, en donde dicha célula expresa la variante codificada por la secuencia del ácido nucleico y recobrar la variante de pectato liasa. La variante de pectato liasa de la invención es útil para el tratamiento del material celulósico, especialmente fibras que contienen celulosa, hilos, telas tejidos y no tejidas, tratamiento de pasta para elaborar papel o papel de desperdicio reciclable y para enriado de fibras . El trabamiento puede llevarse a cabo durante el proceso del material celulósico en un material preparado para elaborar una prenda o para fabricar una tela, por ejemplo, en la etapa de lavado con detergente o eliminación del apresto, o durante el lavado casero o industrial de tal tela o prenda.

Por consiguiente, en aspectos adicionales, la presente invención se refiere a una composición de detergente que comprende una variante de pectato liasa que tiene actividad considerable que degrada las paredes celulares, y al uso de la variante de la pectato liasa de la invención para el tratamiento de por ejemplo, la limpieza de fibras que contienen celulosa, hilos, tela tejida o no tejida. Además, los aspectos adicionales de la invención se refieren a una composición de enzimas que comprende la variante de pectato liasa de la invención en combinación con otras enzimas y para una composición de detergente o limpiador, preferiblemente una composición para lavar platos o para lavandería que comprende una variante de pectato liasa de la invención. La variante de pectato liasa de la invención, es muy efectiva para usarse en un proceso de lavado con detergente enzimático en la preparación de material celulósico, por ejemplo, una respuesta apropiada en las operaciones de entintado posteriores. Otro aspecto de la invención se refiere a la elaboración de vino y jugos. La enzima o preparación de enzimas puede usarse en el tratamiento de pasta de frutas y vegetales para mejorar la extractabilidad o degradabilidad de la pasta. Además, un aspecto de la invención es la aplicación como un aditivo en alimentos para animales. Cuando se añade al alimento que contiene materiales de plantas de frijol de soya, semilla de colza o tabaco, lupina, etc, la variante de pectato liasa mejora significativamente la descomposición in vivo del material de las paredes celulares de plantas, por medio de la cual el animal aprovecha mejor los nutrientes de la planta.

Definiciones Antes de discutir la invención con mayor detalle, se definirán primero los siguientes términos y convenciones. El término "enzima del tipo silvestre" denota una enzima que es endógena a un microorganismo que se presenta naturalmente tal como un hongo o bacteria encontrada en la naturaleza . El término "enzima precursora" como se usa aquí, significa una enzima en la cual las modificaciones se hacen para producir las variantes de enzima de la invención. Una enzima precursora puede ser una enzima aislada a partir de una fuente natural o una enzima en donde las modificaciones previas han sido hechas mientras se conserva la actividad característica de la enzima en cuestión. La pectato liasa de la invención puede ser una pectato liasa tipo silvestre. El término "variante de la enzima" significa una enzima que comprende diferencias en su secuencia de aminoácidos a partir de la enzima precursora. Las diferencias comprenden sustituciones, eliminaciones y/o inserciones comparadas a las enzimas precursoras. El término "ortólogo" (o "especies homologas") denota un polipéptido o proteina obtenida a partir de una especie que es homologa a una proteina o polipéptido análogo a partir de especies diferentes. El término "parálogo" denota una proteina o polipéptido obtenido a partir de especies dadas que tienen una homología para una proteína o polipéptido distinto de las mismas especies. El término "vector de expresión" denota' una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica a un polipéptido de interés enlazado operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y de terminación y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un mejorador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente a partir de ADN viral o plásmido, o pueden contener elementos -de ambos. El vector de expresión de la invención puede ser cualquier vector de expresión que se somete convenientemente a los procedimientos de ADN recombinantes, y la selección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedadora en la cual el vector será introducido. Así, el vector puede ser un vector que replica autónomamente, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomal, la replicación de la cual es independiente de la replicación crornosorna1, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y replicado junto con los cromosomas en los cuales ha sido integrado. El término "expresado recombinante" o "expresado recombinantemente" usado aquí en relación con la expresión de una proteina o polipéptido · se define de acuerdo a la definición estándar en la técnica. La expresión recombinante de una proteina se realiza generalmente usando un vector de expresión como se describe inmediatamente arriba. El término "aislado", cuando se aplica a una molécula del polinucléotido, denota que el polinucléotido ha sido retirado de su entorno genético natural y está por lo tanto, libre de otras secuencias de codificación extravenosas o no deseadas y en una forma adecuada para usarse dentro de los sistemas de producción de proteínas generadas mediante ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su ambiente natural e incluyen clones genómicos y cADN. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención se encuentran libres de genes que se asocian ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se presentan naturalmente tales como promotores y terminadores . La identificación de regiones asociadas serán evidentes para un experto en el arte (ver por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). El término "un polinucleótido aislado" puede llamarse alternativamente "un polinucleótido clonado". Cuando se aplica a una proteina/polipéptido, el término "aislado" indica que la proteina se encuentra en una condición distinta a su ambiente natural. En una forma preferida, la proteina aislada se encuentra sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homologas (es decir, "impurezas homologas" (ver abajo)). Se prefiere proporcionar la proteína en una forma mayor que el 40%, más preferiblemente mayor que 60% en forma pura. Más aun preferiblemente, se opta por proporcionar la proteína en una forma altamente purificada, es decir, mayor que el 80% pura, más preferiblemente mayor que el 95% puro y más aun preferiblemente que 99% puro, determinado por SDS-PAGE. El término "proteina/polipéptido aislado puede llamarse alternativamente "proteina/polipéptido purificados". El término "impurezas homologas" significa cualquier impureza, por ejemplo, otro polipéptido distinto al polipéptido de la invención, que se origina a partir de la célula homologa de donde el polipéptido de la invención se obtiene originalmente. El término "obtenido de" como se usa en la presente en relación con una fuente microbiana específica, significa que el polinucleótido y/o polipéptido se produce mediante la fuente específica, o mediante una célula en la cual ha sido insertado un gen de la fuente. El término "enlazado operablemente" cuando se refiere a segmentos de ADN, denota que los segmentos ' se configuran de manera que funcionen de acuerdo con los propósitos pretendidos, por ejemplo, la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación para el terminador . El término "polinucleótido" denota un polímero de hebra sencilla o doble de bases desoxiribonucleótido o ribonucleótido que se lee desde el extremo 5' hasta 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN y pueden aislarse a partir de fuentes naturales, sintetizados in vitro o preparados a partir de una combinación de moléculas sintéticas y naturales . El término "complementos de moléculas de polinucleótidos" denota moléculas de polinucleótidos que tienen una secuencia base complementaria y orientación inversa comparada a una secuencia de referencia. Por ejemplo, • la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' El término "secuencia de nucleótidos degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluyen uno o más codones degenerados (comparados a una molécula de polinucléotido de referencia que codifica a un polipéptido) . Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero que codifican al mismo residuo del aminoácido (es decir, "cripletes GAU y GAC codifican cada Asp) . El término "promotor" denota una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la polimerasa del ARN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente pero no siempre en las regiones 5' no codificadas de los genes. El término "secuencia de señal secretora" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipéptido grande, dirige el polipéptido más grande a través de una trayectoria secretora de una célula que se sintetiza. El péptido más grande se desdobla comúnmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la trayectoria secretora . El término "pectina" denota pectato, ácido poligalacturónico y pectina que puede esterificarse a un • - grado más alto o más bajo. El término "pectinasa" denota una enzima de pectinasa definida de acuerdo al arte en donde las pectinasas son un grupo de enzimas que desdoblan los enlaces glicosidicos de sustancias de pectina principalmente poli ( 1 , 4-alfa-D-galacturónido y sus derivados (ver referencia Sakai et al., pectina, pectinasa y protopectinasa : producción, propiedades y aplicaciones, pp 213-294 en: Advances in Applied Microbiology vol : 39, 1993 ) . Preferiblemente, una pectinasa de la invención es una enzima pectinasa que cataliza el desdoblamiento aleatorio de los enlaces 1, 4-glicosidicos en ácido péctico también llamado ácido poligalacturónico mediante la transeliminación tal como la enzima clase poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.2) (PGL) también conocida como poli ( 1 , 4-alfa-D-galacturonido) liasa también conocida como pectato liasa. El término "termoestabilidad" o "estabilidad térmica" pretende significar la estabilidad de la proteina para una influencia térmica. Todas las proteínas de enzima se desestabilizan y degradan eventualmente con el incremento de temperatura, cada proteína de enzima que tiene un cierto rango de temperatura en donde la proteína es estable y mantienen su actividad enzimática. La termoestabilidad incrementada significa que la proteína de la enzima puede retener su actividad enzimática y/o exhibir una actividad relativamente más alta a temperaturas incrementadas. El término "estabilidad del detergente" o "estabilidad de almacenaje" pretende significar la estabilidad de la proteína en una formulación que contiene detergentes, por ejemplo, tensoactivos aniónicos. Los tensoactivos aniónicos se caracterizan por la combinación de un grupo aniónico y un extremo hidrofóbico. Cuando se enlaza a la proteína, un residuo cargado positivamente tipo Lisina y Arginina y un área hidrofóbica son por lo tanto puntos de interacción probables. De manera similar, las regiones dinámicas de regiones particularmente flexibles se abren para la accesibilidad para aminoácidos que se encuentran escondidos normalmente en el interior de la proteína. Estos residuos son típicamente hidrofóbicos y son por lo tanto, atractivos para el extremo del tensoactivo. Una interacción química entre la enzima y el tensoactivo abandonará con una alta certeza la enzima ' inactiva. Así, la estabilidad de almacenaje o detergente mejorada significa que en cierta temperatura y concentración del detergente, se retendrá una mayor actividad enzimática después de un cierto periodo de tiempo (mayor actividad residual) . Por consiguiente, la termoestabilidad y la estabilidad del detergente son dos características independientes de una protelna o una enzima . Las variantes de pectato liasa de la invención que tienen una estabilidad detergente mejorada puede exhibir al menos 120% (preferiblemente al menos 140%, más preferiblemente al menos 160%, más aun preferiblemente al menos 180%, más aun preferiblemente al menos 200%, más preferiblemente al menos 250% en particular al menos 300%) actividad residual comparada a la pectato liasa precursora cuando se somete al método de análisis descrito en el Ejemplo 1.

Numeración de las proteínas En el contexto de esta invención, un número especifico de posiciones de los residuos del aminoácido en las enzimas que degradan a las paredes celulares, se emplean especialmente enzimas de pectato liasa. Por ejemplo, alineando las secuencias del aminoácido de pectato liasa es posible asignar un número de posición para el aminoácido no ambiguo a cualquier residuo de aminoácidos en cualquier enzima de pectato liasa si su secuencia de aminoácidos se conoce . Usando el sistema de numeración a partir del cual se origina la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa codificada por el polinucléotido presente en el plásmido de la cepa Bacillus subtilis DSM 14218, descrita en la SEC ID NO: 2, alineada con la secuencia de aminoácido de varias pectato liasas, es posible indicar la posición de un residuo de aminoácido en una enzima de pectato liasa no ambigua. Al. describir diversas variantes de enzima que degradan las paredes celulares producidas o contempladas de acuerdo a esta invención, las siguientes nomenclaturas se adaptan para facilitar la referencia: Substituciones : [Aminoácido original, posición, aminoácido sustituido] Por · consiguiente, la sustitución de serina con isoleucina en la posición 72 se designa como S721. Las múltiples mutaciones se separan mediante marcadores de adición ("+"), por ejemplo, M1691 + F198V, que representan mutaciones en las posiciones 169 y 198 que sustituyen a la metionina (M) con isoleucina (I), y fenilalanina (F) con valina (V), respectivamente. Eliminaciones : Una eliminación de glicina en la posición 195 se indicará por: Glyl95* o G195* De acuerdo con la eliminación de más de un residuo de aminoácidos, tal eliminación de glicina y leucina en las posiciones 195 y 196 se designarán como Glyl95*+Leul96* o G195*+L196* Inserciones : La inserción de un residuo de aminoácido adicional tal como por ejemplo, una lisina después del G195 se indica por: .Glyl95GlyLys o G195GK; o, cuando más de un residuo de aminoácidos se inserta, tal como por ejemplo, una Lys y Ala después de que G195 se indicará como: Glyl95GlyLysAla o G195GKA en tales casos, los residuos de aminoácido insertados son numerados por la adición de letras minúsculas para el número de posición del residuo del aminoácido que precede a los residuos del aminoácido insertado. En el ejemplo anterior, las secuencias 194 a 196 se cambiaría así de: 194 195 196 A - G - L 194 195 195a 195 b 196 A - G - K - A - L En casos en donde se inserta un residuo de aminoácidos idéntico al residuo de aminoácidos existente, es claro que surge una degeneración en la nomenclatura. Si por ejemplo, una glicina se inserta después la glicina en el ejemplo de arriba se indicaría por G195GG. El mismo cambio actual podría indicarse también como A194AG para el cambio de: 194 195 196 A - G- L 194 195 195a 196 A - G- G - L 194 194a 195 196 , .Tales ejemplos serán aparentes para personas expertas y la indicación G195GG e indicaciones correspondientes para este tipo de inserciones significan que se incluyen tales indicaciones degeneradas equivalentes. Todas las posiciones referidas en la presente mediante la numeración de pectato liasa se refiere a menos que se establezca lo contrario para la numeración descrita anteriormente, y se determina con relación a la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa codificada por el polinucléotido presente en el plásmido de la cepa Bacillus subtilis DSM 14218, descrito en la SEC ID NO: 2.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención pertenece a variantes de una pectato liasa precursora (EC 4.2.2.2). Las variantes tienen propiedades mejoradas comparadas a la enzima precursora, especialmente la estabilidad detergente o estabilidad de almacenaje se mejora en las composiciones de detergentes. En el proceso para mejorar las propiedades de la pectato liasa, los inventores encuentran que las alteraciones de aminoácidos específicos en la estructura del polipéptido precursor alterarían significativamente a estabilidad detergente de la enzima.

Polinucléotidos ¦ . Dentro de las modalidades preferidas de la invención, se contempla que un polinucléotido que codifica la enzima precursora de la variante de pectato liasa de la invención hibridizará regiones con dimensiones similares del polinucléotido correspondiente de la SEC ID NO:l, o una secuencia complementaria de la misma, bajo al menos condiciones de severidad medias, preferiblemente condiciones de severidad altas. En particular, los polinucleótidos de la invención hibridizarán a una sonda de ADN de hebra doble desnaturalizada que comprende ya sea una secuencia variante que corresponde a las posiciones 1-1200 de la SEC ID NO: 1 con alteraciones de secuencia apropiadas que corresponden a sustituciones de aminoácidos actuales hechas o cualquier sonda que comprende una variante subsecuente de la misma que tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 pares base bajo al menos condiciones de severidad medias, pero preferiblemente bajo condiciones de severidad altas como se describe en detalle abajo. Las condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridización en severidades media o alta entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ARN o ADN homologas involucra el pre-hinchamiento del filtro que contienen los fragmentos de ADN p ARN para hibridizar en 5 x SSC (cloruro de sodio/ citrato de sodio, Sambrook et al, 1989) durante 10 minutos, y la prehibridización del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0.5 % de SDS y 100 microgramos/ml de esperma de ADN de salmón sonicado desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguido por la hibridización en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de un cebador aleatorio (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), sonda etiquetada dCTP 32P (actividad especifica más alta que 1 x 109 cpm/microgramos ) durante 12 horas a ca. 45 grados Celsius. El filtro se lava entonces dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% SDS al menos 60 grados Celsius (severidad media) , más preferiblemente al menos 65 grados Celsius (severidad media/alta) , más aun preferiblemente al menos 70 grado Celsius (severidad alta) , y más aun preferiblemente al menos 75 grados Celsius (severidad muy alta) . Las moléculas en las cuales la sonda del oligonucleótido hibridiza bajo estas condiciones se detectan usando una película de rayos X. Como se anotó previamente, los polinucleótidos que codifican las variantes de pectato liasa de la presente invención incluyen ADN o ARN. Los métodos para aislar ADN o ARN son bien conocidas en el arte. El ADN o ARN que codifican genes de interés pueden clonarse en los Bancos de Gen o colecciones de ADN por medio de métodos conocidos en el arte.

Los polinucleótidos que codifican polipéptidos, que tienen actividad de pectato liasa de la invención se identifican y aislan mediante por ejemplo, hibridización o PCR. Las especies homologas de la pectato liasa precursora usada en la preparación de las variantes de pectato liasa de la invención pueden clonarse usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, el ADN puede clonarse usando ADN cromosomal obtenido a partir de un tipo celular que expresa la proteina. Las fuentes adecuadas de ADN pueden identificarse al formar sondas de inmunotransferencias Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en la presente. Una colección se prepara entonces a partir del ADN cromosomal de una linea de células positivas. Un polipéptido que codifica un ADN que tiene actividad de pectato liasa de la invención puede entonces aislarse mediante una variedad de métodos, tales como formar sondas con un ADN parcial o completo o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas en las secuencias descritas. Un ADN puede clonarse usando la reacción de la cadena polimerasa o PCR (Mullís, Patente de los E.U. 4,683,202) usando cebadores designados a partir de las secuencias descritas en la presente. Dentro de un método adicional, la colección de ADN puede usarse para transformar o transfectar células hospedadoras , y la expresión del ADN de interés puede detectarse con un anticuerpo (monoclonal o policlonal) incrementado contra la pectato liasa clonada a partir de la cepa B. subtillis depositada como IFO 3134, o mediante una prueba de actividad que relaciona a un polipéptido que tienen actividad de pectato liasa. Las técnicas similares pueden aplicarse también al aislamiento de clones genómicos. El polipéptido que codifica parte de la secuencia de ADN clonada por un plásmido presente en Bacillus subtillis DSM 14218 y/o una secuencia de ADN análoga de la invención puede clonarse a partir de una cepa de especies bacterianas Bacillus subtillus, preferiblemente la cepa depositada como IFO 3134, que producen la enzima con actividad que degrada a la pectina u otro organismo relacionado descrito en la presente . Alternativamente, la secuencia análoga puede construirse con base a la secuencia de ADN obtenible a partir de un plásmido presente en Bacillus subtillus DSM 14218 por ejemplo, ser un subsecuencia del mismo, y/o mediante la introducción de las sustituciones del nucleótido que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la pectato liasa codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponde al uso de codones del organismo hospedador proyectado para la producción de la enzima, o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a diferentes secuencias de aminoácidos (es decir, una variante de la enzima que degrada la pectina de la invención) .

Polipéptidos La secuencia de aminoácidos no. 1-399 de la SEC ID NO: 2 es una secuencia de pectato liasa madura que corresponde a la pectato liasa tipo silvestre a partir de las especies Bacillus subtillus depositadas como IFO 3 134 (Institute for Fermentation, Osaka, 17-85, Jusohonmachi 2-chome, Yodagawa-ku, Osaka 532-8686, Japón) . La presente invención proporciona también variantes de pectato liasa de polipéptidos que son sustancialmente homólogos para los polipéptidos de la SEC ID NO: 2 y sus especies homologas (parálogas u ortólogas) . El término "sustancialmente homologas" se usa en la presente para denotar polipéptidos que tienen 70%, más preferiblemente al menos 85%, y más aun preferiblemente al menos 90%, identidad de secuencia para la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos o parálogos. Tales polipéptidos se preferirán por ser al menos 95% idénticos, y más preferiblemente 98% o más idénticos para la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos o parálogos. El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante métodos convencionales, por medio de programas de computadora conocidos en el arte tales como GAP proporcionados en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, versión 8, agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) descrito en Needleman, S.B. y unsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La GAP se usa con el siguiente ambiente para comparar la secuencia del polipéptido: penalidad de 3.0 para la creación GAP y la penalidad de la extensión GAP de 0.1. La identidad de la secuencia de moléculas de polinucleótidos se determinan mediante los métodos similares usando GAP con el siguiente ambiente para comparar la secuencia de ADN: penalidad de creación GAP de 5.0 y penalidad para la extensión GAP de 0.3. La pectato liasa precursora se deriva preferiblemente a partir de un microorganimo, preferiblemente a partir de una bacteria, un arquea o un hongo, especialmente de una bacteria tal como una bacteria que pertenece al Bacillus, preferiblemente a una cepa Bacillus alcalofilica que puede seleccionarse a partir de un grupo que consiste de las especies Bacillus subtillus y de especies Bacillus relacionadas en las cuales las especies preferiblemente son al menos 95%, más aun preferiblemente al menos del 98%, homólogos de Bacillus subtillus basados en las secuencias de rADN 16S. Las pectato liasas precursoras de la invención son sustancialmente homologas para los polipéptidos de la SEC ID NO: 2 y su especie homologa (parálogos u ortólogos) . El término "sustancialmente homólogos" se usa en la presente para denotar polipéptidos que tienen 70%, más preferiblemente al menos 85%, y más aun preferiblemente al menos 90%, la secuencia de identidad para la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos o parálogos. Tales polipéptidos serán más preferiblemente al menos 95% idénticos y más preferiblemente 98% o más idénticos para la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos o parálogos. Los polipéptidos y proteínas precursoras sustancialmente homologas se caracterizan porque tienen una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o adiciones. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, que son las sustituciones conservadoras de los aminoácidos (ver la Tabla 1) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegado o actividad de la proteína o polipéptidos; eliminaciones pequeñas, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos, y extensiones amino o carboxi terminales pequeñas tales como un residuo de metionina amino terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20 a 25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad) tal como un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991. Ver n general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, la cual se incorpora aquí por referencia. Las etiquetas de afinidad que codifican ADN se encuentran disponibles a partir de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New Englnad Biolabs, Beverly, MA) . Sin embargo, aun cuando los cambios descritos anteriormente son preferiblemente de naturaleza menor, tales cambios también pueden ser de naturaleza mayor tales como la fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más, ambos como extensiones amino o carboxi terminales.

Tabla 1 Sustituciones de aminoácidos conservadores Básico: arginina lisina Acida: ácido glutámico ácido aspártico Polar: glutamina asparaginas serina treonina cisteina Hidrofóbica: leucina isoleucina valina prolina metionina Aromático/ heteroaromática : fenilalanina triptofano tirosina histidina Pequeña: glicina alanina . Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutirico, isovalina y una serina a-metilo) pueden sustituirse para los residuos de aminoácidos de un polipéptido tipo silvestre. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por los códigos genéticos, y los aminoácidos naturales pueden sustituirse para los residuos de aminoácidos. Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de la proteína, y/o tienen una estructura química en sus cadenas laterales diferentes a la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales pueden sintetizarse químicamente, o preferiblemente, se encuentran comercialmente disponibles e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, deshidroprolina , 3 y 4 metilprolina y 3,3-dimetilprolin . Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos pectato liasa de la presente invención pueden identificarse de acuerdo a los procedimientos conocidos en el arte tales como la mutagénesis dirigida en el sitio o mutagénesis de barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). En la última técnica, las mutaciones de la alanina sencilla se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas imitantes resultantes se prueban para una actividad biológica (es decir, actividad de pectato liasa) para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver por ejemplo, Milton et al., J. Biol . Chem. 271:4699-4708, 1996. El sitio activo de la enzima u otras interacciones biológicas pueden determinarse también mediante el análisis de la estructura, determinadas mediante tales técnicas como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetación de fotoafinidad junto con la mutación de aminoácidos en el sitio de contacto supuesto. Ver por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. 224:899-904, 1992; lodaver et al., FEBS Lett . 309:59-64, 1992, Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden inferirse también a partir del análisis de las homologías con polipéptidos que están relacionados a un polipéptido de acuerdo a la invención . Las sustituciones de aminoácidos múltiples pueden elaborarse y probarse usando los métodos conocidos de la mutagénesis, recombinación y/o agitación seguida por un procedimiento de separación por exclusión relevante tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Saber (Science 241:53-57, 1998), Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989), W095/17413, o WO 95/22625. De manera breve, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido o recombinación/mezcla de mutaciones diferentes (W095/17413, 095/22625) , seguido por la selección de un polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones aceptables en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen exhibir fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner et al., patente de los E.ü. No. 5,223,409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida en la región (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., ADN 7:127, 1988). Los métodos de mutagénesis/mezclado descritos arriba pueden combinarse con métodos de separación por exclusión automatizados de alto rendimiento para detectar una actividad de polipéptidos mutagénesis clonados en las células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagénesis que codifican a los polipéptidos activos pueden recuperarse a partir de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando un equipo moderno. Estos métodos permiten una determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a los polipéptidos de estructura desconocida. Usando los métodos discutidos anteriormente, un experto en el arte puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que son sustancialmente homólogos a los residuos 1 a 399 de la SEC ID NO: 2 y retener la actividad de la pectato liasa de la enzima precursora. Sin embargo, los mismos métodos son útiles también para proporcionar las variantes de pectato liasa de la invención que tienen propiedades más ventajosas a las de la proteina tipo silvestre. Usando estos métodos, los presentes inventores han identificado un número de posiciones en las cuales la pectato liasa tipo silvestre de la SEC ID NO: 2 puede sustituirse ventajosamente para preparar variantes con propiedades mejoradas. Las variantes de pectato liasa preferidas de los inventores se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones (numeración relativa a la SEC ID N0:2): 5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91, 99, 105, 106, 10.7, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193, 194, 196, 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397 Las variantes preferidas de la presente invención comprenden además, variantes en las cuales la carga completa de la enzima se ha hecho más negativa. En tales variantes de aminoácidos cargadas positivamente se puede haber reemplazado y/o haber introducido aminoácidos, que están cargados negativamente bajo las condiciones de aplicación. Asi, de acuerdo con esto, las variantes preferidas pueden haber reemplazado un residuo de aminoácidos que está parcialmente o completamente cargado bajo las condiciones de aplicación, es decir, un His, Lys o un Arg. Además, las variantes preferidas podían haber reemplazado cualquier residuo mediante un residuo de aminoácidos con una carga negativa bajo las condiciones de aplicación, es decir, Asp, Glu y Tyr. Las variantes especialmente preferidas son aquellas en las cuales un residuo de lisina en una o más de las siguientes posiciones (numeración relativa a la SEC ID NO:2): 26, 47, 54, 59, 71, 79, 87, 90, 99, 100, 115, 118, 139, 148, 213, 218, 247, 257, 263, 265, 274, 314, 317, 334, 386 y 397 han sido reemplazadas. De manera similar, las variantes especialmente preferidas son aquellas en las cuales un residuo de arginina en una o más de las siguientes posiciones (numeración relativa a la SEC ID N0:2): 38, 110, 112, 120, 155, 206, 217, 279, 282 y 284 han sido reemplazadas. Además, las variantes preferidas son también aquellas en las cuales un residuo de histidina en una o más de las siguientes posiciones (numeración relativa a la SEC ID NO: 2) : 5, 31, 193, 198, 221, 222, 243, 245, 269, 270, 289, 376 y 384 han sido reemplazadas. Las enzimas de pectato liasa variantes preferidas han sido modificadas para cambiar la constante de enlace por Ca2+, y mejorar asi la estabilidad de vaciado de calcio. En una pectato liasa de la presente invención, los tres residuos de aminoácidos D184, D223 y D227 coordinan el enlace de Ca2+ en el sitio de enlace de calcio primario. Al reunir un cuarto residuo de aminoácido en esta coordinación es posible cambiar la constante de enlace para el Ca2+. La presencia de Ca2+ en el sitio de enlace de calcio primario puede influenciar ya sea el suceso catalítico (reduciendo el pKa del residuo catalítico) , el alineamiento del sustrato o determinar si las funciones de la enzima funcionan como una hidrolasa o una liasa (la presencia de Ca2+ es un prerequisito para la actividad de la liasa) . Tales variantes con estabilidad mejorada de vaciado o agotamiento de calcio pueden comprender una de las sustituciones Q122D y Q182E. Ejemplos adicionales de las variantes preferidas son aquellas con estabilidad de oxidación mejorada en la cual ha sido reemplazado un residuo de aminoácido inestable de oxidación. Por "oxidación inestable" se entiende aminoácidos que sostienen un grupo azufre o hidroxilo, por ejemplo, metionina, cisterna, treonina, serina y tirosina. Las variantes preferidas son aquellas en las cuales un residuo de aminoácidos inestable en uno o más de las siguientes posiciones (numeración relativa para la SEC ID N0:2): 64, 122, 199 y 237 han sido reemplazadas. Ejemplos ¦ adicionales de variantes preferidas son aquellas que sostienen una sustitución de aminoácidos en un residuo flexible, en donde un residuo de aminoácido menos flexible ha sido introducido. En el presente contexto el término "flexible" se refiere al número posible de ángulos phi y psi del átomo C-alfa en el aminoácido. La flexibilidad de la estructura del péptido está limitada por el obstáculo esférico de los átomos enlazados al átomo C-alfa. En general, solo la cadena lateral de aminoácidos difiere de un residuo entre si, por lo tanto, del tamaño de la cadena lateral (el radio Van der Waals) determina la flexibilidad. Una glicina tiene la cadena lateral más pequeña, un átomo de hidrógeno, por lo tanto, un residuo de glicina introduce mayor flexibilidad. La situación opuesta aplica para la prolina, cuando las conformaciones posibles se limitan no solo por una cadena lateral grande sino también debido a la estructura del anillo. Por lo tanto, un residuo de prolina es menos flexible que el promedio y proporciona una rigidez y estabilidad para el péptido. Tales variantes menos flexibles incluyen en particular pero no se limitan a variantes en las cuales el residuo de glicina ha sido sustituido con cualquiera de los otros 19 aminoácidos que se presentan naturalmente o variantes en las cuales cualquier aminoácido ha sido sustituido con un residuo de prolina. En las variantes especialmente preferidas un residuo de aminoácidos flexible ha sido introducido en una o más de las siguientes regiones (numeración de posiciones relativas a la SEC ID N0:2): 26-31, 45-50, 66-72, 81-89, 90-106, 134-137, 169-178, 210-217, 253-262, 275-286, 297-308, 328-343, 354-356, 361-365, 368-372 y 376-379. En una modalidad preferida de la presente invención, la variante de pectato liasa de Bacillus subtillus comprende al menos un residuo de aminoácidos sustituido seleccionado del grupo que consiste de: H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, 71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, 115I, 115N, K115Q, N116D, ?118?, 118E, 122E, M122K, M122N, M122Q, V1231, S134L, T136S, K139E, 139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A2281, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, 1336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, 1357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V3891, 1390N, 1390?, S391N, A393V y K397D, Se contempla en la actualidad que uno o más de estas sustituciones ya sea solas o en combinación incrementan la estabilidad detergente de la variante de pectato liasa cuando se compara con la enzima precursora. Las sustituciones múltiples preferidas que incrementan la estabilidad detergente incluyen: A228I+F251I, S134L+K257E, K115I+K213E, K139I+K213N, H5R+K257N+S302A, K99I+I196V, K115A+K118A, ' Kl15?+?118A+Ml22 , V141E+C199S+K213E, K115I+Q146H, K71E+K118E, T49P+N156S, K314N+S340P, V141E+I235V, G46D+K257N, S28T+S30F+K334E+N363S, D48E+L106Q+I140V+F215Y+K218E, H193Y+S256C+V3891+A393V, E9G+H31N+N50D+L106Q+A111E+T136S+V141L+F201L+N202K+F215Y+ G286A+A381D+H384N, K213N+T258I, E9G+H31N+L106Q+D303S+A305P+T335S+H384N+S391N, E9G+H31N+D48E+L106Q+A111E+S301Y+D3033+A305P+T378S+ H384N+S391N, L45V+N50Y+N185H, N11Y+K87E+K99N, E9G+D48E+L106Q+S316F+A381D, S30P+K1151+K1391+Q146H+S337C, E9G+H31N+D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+ S391N, H31N+T105A+L106Q+A111E+V141L+K218E+D303S+A305P+D326N+T33 5S+H384N+S391N, K26Q+K47N+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391 N, D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N, K213T+K218L+A305P, M64F+K213T+K218L+A305P, M64F+M122K+K118E+K213T+K218L+A305P, K139I+Q146H+K257N+S337C, M64F+K1391+Q146H+S337C, K139I+Q146H+S337C Y D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P+S337K.

Producción de proteínas Los polipéptidos de la presente invención que incluyen proteínas de longitud completa, fragmentos de los mismos y proteínas de fusión, pueden producirse en células hospedadoras generadas mediante ingeniería genética, de acuerdo a las técnicas convencionales. Las células hospedadoras adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y crecen en un cultivo e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucarióticas cultivadas superiores. Se prefieren las células bacterianas, particularmente células cultivadas de organismos gram-positivos . Se prefieren especialmente las células gram-positivas del género de Bacillus tales como B. licheníformis, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. circulans, B. lautus , B. thuringiensis , B. agaradherens o en particular B. subtilis . Las técnicas para la manipulación de las moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células hospedadoras son descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., (ediciones), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; y (Bacillus subtilis y otras bacterias gram-positivas, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D. C), las cuales se incorporan aqui por referencia. En general, una secuencia de ADN que codifica la pectato liasa de la presente invención se enlaza operablemente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyen generalmente un promotor de transcripción y terminador dentro de un vector de expresión. El vector contendrá también, uno o más marcadores selecionables y uno o más orígenes de replicación, a pesar de que los expertos en el arte reconocerán que dentro de ciertos sistemas marcadores seleccionables pueden proporcionarse en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno pueden proporcionarse mediante la integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de los promotores, terminadores, marcadores selecciónateles, vectores y otros elementos es una materia de rutina diseñada dentro del nivel de un experto en el arte. Muchos elementos se describen en la literatura y se encuentran disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido en la trayectoria secretora de una célula hospedadora, una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepo o pre secuencia) se proporciona en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede derivarse del polipéptido o puede derivarse de otra proteína secretada o sintetizada de novo. Numerosas secuencias de señal secretoras adecuadas se conocen en el arte y la referencia se hace para el Bacillus subtillus y otras bacterias gram-positivas, Sonenshein et al., 1993 (American Society for Microbiology, Washington D.C.) y Cutting, S. M. (ediciones). "Molecular Biological Methods for bacillus", (John Willey and Sons, 1990) para una descripción adicional de secuencias de señal secretoras especialmente para la secreción en una célula hospedadora Bacillus. La secuencia de señal secretora se une a la secuencia de ADN en la estructura de lectura correcta. Las secuencias de señal secretoras se colocan comúnmente en 5' para la secuencia de ADN que codifican al polipéptido de interés, a pesar de que ciertas secuencias de señal pueden colocarse en otra parte en la secuencia de ADN de interés (ver por ejemplo, Welch et al., patente de los E.U. No. 5,037,743; Holland et al., patende de lo E.U. No. 5,143, 830) . Las células hospedadoras transfectadas o transformadas se cultivan de acuerdo a los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células hospedadoras seleccionadas. Una variedad de medios adecuados que incluyen medios definidos y medios complejos, se conocen en el arte e incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, esencialmente aminoácidos, vitaminas y minerales. El medio puede contener también componentes tales como factores de crecimiento o suero como se requiera. El medio de crecimiento se seleccionará generalmente para las células que contienen el ADN añadido exógenamente mediante por ejemplo, la selección del fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa mediante el marcador seleccionable transportado sobre el vector de expresión o cotransfectado en la célula hospedadora. La fermentación puede llevarse a cabo mediante el cultivo de células hospedadoras bajo condiciones aeróbicas en un medio nutriente que contiene fuentes de carbono y nitrógeno junto con otros nutrientes esenciales, el medio está compuesto de acuerdo con los principios del arte conocido. El medio puede ser un medio rico complejo o un medio mínimo. La fuente puede ser de naturaleza orgánica y/o inorgánica. Las fuentes de nitrógeno inorgánicas adecuadas son nitratos y sales de amonio. Una gran diversidad de fuentes de nitrógeno orgánicas se usan regularmente en las fermentaciones. Ejemplos de ellas son las harinas de frijol de soya, caseína, maíz, licor crudo de maíz, extracto de levaduras, urea y albúmina. Fuentes de carbono adecuadas son carbohidratos o materiales que contienen carbohidratos. Preferiblemente, el medio nutriente contiene pectato, ácido poligalacturónico y/o pectina esterificada a un grado más alto o más bajo como fuente de carbono y/o inductor de la producción de pectinasa. Alternativamente, el medio contiene un material rico en pectina tal como harina de fríjol de soya, pulpa de manzana o cáscara de cítricos. El cultivo puede ser conducido preferiblemente a valores de pH alcalinos tales como al menos un pH 8 o al menos un pH 9, que pueden obtenerse por la adición de soluciones amortiguadoras adecuadas tales como carbonato de sodio o mezclas de carbonato de sodio y bicarbonato de sodio después de la esterilización del medio de crecimiento.

Aislamiento de la proteína. Cuando el polipéptido recombinante expresado se secreta, el polipéptido puede purificarse a partir del medio de crecimiento. Preferiblemente, la expresión de las células hospedadoras se eliminan a partir del medio antes de la purificación del polipéptido (por ejemplo, mediante centrifugación) . Cuando el polipéptido recombinante expresado no se secreta a partir de la célula hospedadora, la célula hospedadora se divide preferiblemente y el polipéptido se libera en un "extracto" acuoso, que es la primera etapa de tales técnicas de purificación. Preferiblemente, la expresión de las células hospedadoras del medio antes de la división celular (por ejemplo, mediante la centrifugación). La división celular puede realizarse mediante las técnicas convencionales tales como digestión de lisozima o forzando las células a través de presión alta, ver (Robert K. S cobes, protein Purification, segunda edición, Segunda edición, Springer-Verlag) para una descripción adicional de tales técnicas de división celular. Ya sea que los polipéptidos recombinantes expresados se secreten o no (polipéptidos quiméricos) , pueden purificarse usando métodos de fraccionamiento y/o un medio de purificación convencionales. La precipitación de sulfato de amonio y extracción de caotrópo o ácido pueden usarse para el fraccionamiento de las muestras. Ejemplos de etapas de purificación pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa y FPLC. El medio de intercambio de anión adecuado incluye dextranos derivados, azarosa, celulosa, poliacrilamida, especialmente sílices y similares. Se prefieren PEI, DEAE, QAE y Q, se prefieren particularmente con sefarosa de flujo rápido (Pharmacia Biotech, piscataway, NJ) . Ejemplos de medios cromatográficos incluyen aquellos derivados con fenilo, butilo o grupos octilo tales como Fenil-sefarosa FF (Pharmacia) , butil Toyopearl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octal-, sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas con base de sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa de reticulada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que son insolubles bajo las condiciones en las cuales serán usadas. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o grupos carbohidrato. Ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación de bromuro de cianógeno, activación N- hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación de sulfhidrilo, activación de hidrazida y derivados de amino y carboxilo para las químicas de acoplamiento de carbodiimida . Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y usados ampliamente en el arte y se encuentran disponibles a partir de los proveedores comerciales. La selección de un método particular es una materia de diseño de rutina y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Ver por ejemplo, Affinity Chromatography : Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988. Los polipéptidos de la invención o fragmentos de los mimos pueden prepararse también a través de la síntesis química. Los polipéptidos de la invención pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados , pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere también a un método para producir la preparación de la enzima de la invención, el método comprende cultivar un microorganismo capaz de producir la variante de pectato liasa bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperar la enzima del cultivo. El cultivo puede llevarse a cabo usando técnicas de fermentación convencionales, por ejemplo, cultivar en matraces de agitación o termentadores con agitación para asegurar una aireación suficiente en un medio de crecimiento que induce la producción de la variante de pectato liasa. El medio de crecimiento puede contener una fuente N convencional tal como peptona, extracto de levadura o ácidos casamino, una cantidad reducida de una fuente C convencional tal como dextrosa o sucrosa y un inductor tal como pectato c pectina o sustratos de plantas compuestos tales como cereal de salvado (por ejemplo, salvado de trigo o cáscara de arroz) . La recuperación puede llevarse a cabo usando las técnicas convencionales, por ejemplo, separación de biomasa y sobrenadante mediante centrifugación o filtración, recuperación del sobrenadante o ruptura de células si la enzima de interés es intracelular, tal vez seguido por la purificación como se describe en EP 0 406 314 o mediante la cristalización como se describe en la WO 97/15660. En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a una variante de pectato liasa aislada que tiene las propiedades descritas arriba y gue está libre de impurezas homologas, que se produce usando las técnicas recombinantes convencionales .

Métodos y Usos Ensayo de microtitulación para la cuantificación de la actividad pectato liasa. La pectato liasa desdobla el ácido poligalacturónico a través de un mecanismo de eliminación trans . Esto significa que deja un enlace C-C doble para cada división del sustrato. Este enlace absorbe 235 nm permitiendo la detección directa de la acción de la pectato liasa en el ácido poligalacturónico midiendo la absorbancia en la longitud de onda . Una muestra de la enzima se diluye en una solución amortiguadora de ensayo (Tris-HCl 100 mM, CaCl2 0.68 mM, pH 5 8.0) a una concentración entre 5 y 100 ng/ml . Si la muestra de la enzima contiene detergentes deben diluirse a al menos a 1000 pliegues con respecto al detergente. 100 µ? de la dilución de la solución amortiguadora se mezclan con 100 µ? de sustrato (1% (p/v) ácido 0 poligalacturónico de Sigma, P-3850 en una solución amortiguadora de ensayo durante al menos 15 minutos y se centrifuga durante 5 minutos a 2300 g, se usa un sobrenadante) . En una placa de calentamiento se calienta a 40°C durante 10 minutos en un bloque de calentamiento, 5 preferiblemente una máquina o equipo para PCR de presión y velocidades de calentamiento equivalentes. Una solución de 100 µ? de enzima/sustrato se mezcla con un reactivo de detención de 100 µ? (50 mM H3PO4) en una placa de microtitulación de UV transparentes, la placa de UV se 0 agita brevemente y suavemente y la absorbancia a 235 nm se • ·" -mide' , en un espectrómetro de microtitulación (Dispositivos moleculares, Spectra MAX 190) . Las lecturas de absorbancia se corrigen para una absorbancia de fondo mediante la sustracción de la absorbancia de una muestra control se 5 ejecuta sin añadir enzimas para todos los valores medidos.

Una curva estándar basada en la actividad de la pectato liasa de la SEC ID NO : 2 (del Bacillus subtillus depositada como IFO 3134) fue lineal entre 2.5 y 100 ng/ml de la enzima en la mezcla de la reacción: Alternativamente, la actividad catalítica de la pectato liasa puede determinarse por el ensayo de viscosidad APSU.

Ensayos de viscosidad, APSU Unidades APSU: El ensayo APSU mide el cambio en viscosidad de una solución de ácido poligalacturónico en ausencia de los iones de calcio añadidos. Una solución de 5% en p/v de poligalacturonato de sodio (Sigma P-1879) se solubiliza en una solución amortiguadora de glicina 0.1 M, pH 10. Se preincubaron 4 mi de esta solución durante 5 minutos a 40 grados Celsius. Después, se añadieron 250 microlitros de la enzima (o dilución de enzimas) , después de la cual la reacción se mezcla durante 10 segundos en un mezclador a una velocidad más rápida y se incuba durante 20 minutos a 40 grados Celsius o a otra temperatura. La viscosidad se mide usando un viscosímetro MIVI 600 (Sofraser, 45700 Villemandeur, Francia) . La viscosidad se mide como mV después de 10 segundos. Para el cálculo de unidades APSU se usa la siguiente curva estándar. APSU/ml 0.00 4.00 9.00 14.00 19.00 24.00 34.00 49.00 99.00 mV 300 276 249 227 206 188 177 163 168 Uso en la industria de los detergentes En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a una composición de detergente que comprende la variante de pectato liasa o la preparación de la variante de pectato liasa de la invención y a un proceso para el tratamiento de acabado a máquina de telas que comprenden el • · tratamiento de telas durante un ciclo de lavado de un proceso de lavado por máquina con una solución de lavado que contienen la variante de ' pectato liasa o preparación de la variante de pectatc liasa de la invención. Típicamente, la composición detergente de la invención comprende ingredientes convencionales tales como tensoactivos (aniónicos, no iónicos, zwiteriónicos , anfotéricas) , aditivos para detergentes y otros ingredientes, por ejemplo, como se describe en la WO 97/01629 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Uso en las industrias que procesan fibras celulósicas y textiles La variante de pectato liasa de la presente invención puede usarse en combinación con otras enzimas que degradan carbohidratos (por ejemplo hemicelulasas tales como arabinanasa, xiloglucanasa, mananasa y pectinasa) para la biopreparación de fibras para la limpieza de fibras en combinación con detergentes. Las fibras de algodón consisten de una capa de pared celular primaria que contiene pectina y una capa secundaria que contiene principalmente celulosa. Bajo la preparación de algodón o refinamiento del algodón se eliminará parte de la pared celular primaria. La presente invención se refiere a la ayuda durante la refinación del algodón mediante la eliminación de la pared celular primaria, o durante la limpieza del algodón para eliminar las sustancias de pectinas residuales y prevenir el oscurecimiento del textil. En el presente contexto, el término "material celulósico" pretende significar fibras, telas cosidas y no cosidas que incluyen tejidos de punto, tramas, algodones, hilos y toallas hechas de algodón, mezclas de algodón o celulósicos hechos por el hombre o naturales (por ejemplo, que se originan a partir de fibras de celulosa que contienen xilano tales como pulpas de madera) o mezclas de los mismos. Ejemplos de mezclas son mezclas de algodón o rayón/viscosa con uno o más materiales acompañantes tales como lana, fibras sintéticas (por ejemplo, fibras de poliamida, fibras acrilicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinilo, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de cloruro de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) , y fibras que contienen celulosa (por ejemplo, rayón/viscosa, ramio, cáñamo, lino/lino, yute, fibras de acetato de celulosa, lyocell. La preparación de la presente invención es útil en la industria que procesa fibras celulósicas para el pretratamiento o enriado de fibras de cáñamo, lino o fibra de lino . El proceso del material celulósico para la industria textil como por ejemplo, fibras de algodón en un material • · listo para la fabricación de la prenda involucra varias etapas: hilar la fibra en un hilo, construir el tejido o tela tejida a partir del hilo y preparación subsecuente, operaciones de teñido y acabado. Las mercancías tejidas se construyen tejiendo un hilo relleno entre una serie de hilos de la urdimbre; los hilos podrían - ser de dos tipos diferentes. Las mercancías tejidas se construyen formando una red de bucles entrelazados desde una longitud completa del hilo. Las fibras celulósicas pueden usarse también para la tela no te ida. El proceso de preparación prepara el textil para la respuesta apropiada en las operaciones de teñido. Las subetapas involucradas en la preparación son: a) Eliminación del apresto (para mercancías tejidas) usando tamaños poliméricos como por ejemplo, CMC o PVA se añade antes de tejer para incrementar la velocidad de la urdimbre; este material debe ser eliminando antes de un proceso adicional . b. Lavado con detergente, el objeto de este es para eliminar el material no celulósico de la fibra de algodón, especialmente la cutícula (que consiste principalmente de ceras) y pared celular primaria (que consiste principalmente de pectina, proteína y xiloglucano) . Una eliminación de la cera apropiada es necesaria para obtener una humectabilidad alta, que es una medida para obtener un teñido adecuado. La eliminación de la pared celular primaria- especialmente las pectinas- mejora la eliminación de ceras y asegura aún más el teñido. Esto mejora adicionalmente la blancura en el proceso de blanqueado. La química principal usada en el lavado con detergente es hidróxido de sodio en concentraciones elevadas, de hasta 70 g/kg de algodón y temperaturas elevadas de 80 a 95 grados Celsius; y c. Blanqueado; normalmente el lavado con detergente se sigue mediante un blanqueado usando peróxido de hidrógeno como agente de oxidación para obtener ya sea un blanqueado completo (blanco) o para asegurar un matiz limpio del tinte.

Una etapa del proceso combinado lavado con detergente/blanqueado se usa también en la industria. Aunque los procesos de preparación se emplean más comúnmente en una condición de la tela; operaciones de lavado con detergente, blanqueado pueden hacerse en la etapa del hilo o tela. El régimen del proceso puede ser en lotes o continuo con la tela que se contacta por una serie de procesos líquidos en forma abierta o cerrada. Las operaciones continuas usan generalmente un saturador por medio del cual se aplica un peso igual aproximado de un baño químico por peso de la tela seguido por una cámara muy caliente donde tiene lugar la reacción química. Una sección de lavado prepara entonces la tela para la siguiente etapa del proceso. El proceso del baño tiene lugar generalmente en un baño de proceso por medio del cual la tela se contacta con aproximadamente 8 a 15 veces su peso en baño químico. Después de un periodo de reacción, los químicos se escurrieron, la tela se enjuaga y se aplica el siguiente químico. El proceso del lote por furladeaje discontinuo involucra un saturador por medio del cual un peso aproximadamente igual de baño químico por peso de la tela se aplica a la tela, seguido por un periodo extenso, en el caso del lote por furladeaje, podría ser de uno o más días. Los bienes tejidos son una forma frecuente de construcción de telas textiles. El proceso de tejido demanda un "apresto" del hilo de urdimbre para protegerlo de la abrasión. El almidón, alcohol polivinilo (PVA) , celulosa carboximetilo, ceras y aglutinantes acrílieos son ejemplos de químicos de apresto típicos usados debido a su disponibilidad y costo. El apresto debe ser eliminado después del proceso de tejido como la primera etapa para preparar los artículos o mercancías tejidas. La tela de apresto ya sea en forma de ancho de cuerda o abierto, se pone en contacto con el líquido del proceso que contiene los agentes eliminación del apresto. El agente de eliminación del apresto empleado depende del tipo de tamaño que va a eliminarse. Para los tamaños PVA, se usan frecuentemente los procesos de oxidación o de agua caliente. El agente de apresto más común para la tela de algodón se basa en el algodón. Por lo tanto, las telas de algodón tejido eliminan el apresto mediante una combinación de - agua caliente, la enzima alfa-amilasa para hidrolizar el almidón y un agente humectante o tensoactivo. Se permite un material celulósico para resistir junto con los químicos eliminación del apresto un "periodo de retención" suficientemente largo para realizar la eliminación del apresto. El periodo de retención depende del tipo de régimen del proceso y la temperatura, puede variar de 15 minutos a 2 horas o en algunos casos, de varios días. Típicamente, los químicos para eliminación del apresto se aplican en un baño saturado que se encuentra generalmente en los rangos de aproximadamente 15 grados Celsius hasta aproximadamente 55 grados Celsius. La tela se mantiene entonces en un equipo tal como una "caja con forma de J" que proporcione suficiente calor, usualmente entre aproximadamente 55 grados Celsius y aproximadamente 100 grados Celsius se lavan fuera de la tela después de la terminación del periodo de retención. Para asegurar una blancura superior o una humectabilidad adecuada y teñido resultante, los químicos de apresto y otros químicos aplicados deben ser eliminados directamente. Se creé generalmente que un eliminación del apresto eficiente es de crucial importancia para los siguientes procesos de preparación; lavado con detergente y blanqueado. El proceso de lavado con detergente elimina muchos de los compuestos no celulósicos que se encuentran naturalmente en el algodón. Además de las impurezas no celulósicas naturales, el lavado con detergente puede eliminar la suciedad, tierra y materiales residuales que se introducen en la fabricación tales como hilatura, conicidad o lubricantes de cortadores. El proceso de lavado con detergente emplea hidróxido de sodio o agentes cáusticos relacionados tales como carbonato de sodio, hidróxido de potasio o mezclas de los mismos. Generalmente un tensoactivo estable alcalino se añade al proceso para mejorar la solubilización de los compuestos hidrofóbicos y/o prevenir su redeposición posterior en la tela. El tratamiento es generalmente a una temperatura alta, de 80 a 100 grados Celsius, empleando soluciones fuertemente alcalinas, pH 13-14 del agente de lavado con detergente. Debido a la naturaleza no especifica de los procesos químicos no solo son las impurezas sino la misma celulosa que se ataca, provocando daños en la resistencia u otras propiedades de la tela deseables. La suavidad de la tela celulósica es una función de ceras del algodón natural residual. La naturaleza no específica del proceso de lavado con detergente fuertemente alcalino a temperatura alta no puede diferenciarse de los lubricantes de algodón naturales deseables y la fabricación de los lubricantes introducidos. Además, el proceso de lavado con detergente convencional puede provocar problemas ambientales debido al efluente altamente alcalino a partir de estos procesos. La etapa de lavado con detergente prepara la tela para, la respuesta óptima en el blanqueado. Una tela lavada con detergente inadecuadamente necesitará un nivel más alto de químicos de blanqueado en las etapas de blanqueado subsecuentes. La etapa de blanqueado decolora los pigmentos de algodón natural y elimina cualquier componente residual de algodón de madera natural residual no eliminados completamente durante el desmotado, cardado o lavado con detergente. El proceso principal de uso reciente es un blanqueado de peróxido de hidrógeno alcalino. En muchos casos, especialmente cuando no es necesario un blanqueado superior, el blanqueado puede combinarse con el lavado con detergente . En los ejemplos de abajo, se muestra que la etapa de lavado con detergente puede llevarse a cabo usando la pectato liasa o la preparación de la pectato liasa de la presente invención a una temperatura de aproximadamente 50 a 80 grados Celsius y un pH aproximadamente de 7 a 11, asi la sustitución o suplementación de agentes altamente cáusticos. Un proceso enzimático optimizado asegura una eliminación de pectina alta y una humectabilidad completa.

Degradación o modificación del material de la planta. La enzima o preparación de la enzima de acuerdo a la invención se usa preferiblemente como un agente para la degradación o modificación de las paredes celulares de la planta .o cualquier material que contiene pectina que se origina a partir de las paredes celulares de la planta debido a la actividad superior que degrada a célula de la planta de la variante de pectato liasa de la invención. La variante de pectato liasa de la presente invención puede usarse sola o junto con otras enzimas tipo glucanasas, pectínasas y/o hemicelulasas para mejorar la extracción de aceite a partir del material de la planta rico en aceite, como aceite de frijol de soya de frijol de soya, aceite de oliva de aceitunas o aceite de colza de semilla de colza, o aceite de girasol del girasol. La variante de pectato liasa de la presente invención puede usarse para la separación de componentes de materiales de células de plantas. De particular interés es la separación de azúcar o material de plantas rico en almidón en componentes de interés comercial considerable (como sucrosa de remolacha de azúcar o almidón de papa) y componentes de poco interés (como pulpa o pedazos de cáscara) . También, de particular interés es la separación de cultivos ricos en proteínas o ricos en aceite en proteínas valiosas y aceite y fracciones de cáscara inestimables. El proceso de separación puede realizarse mediante el uso de métodos conocidos en el arte . La variante de pectato liasa de la invención, puede usarse también en la preparación de jugos de vegetales o frutas para incrementar el rendimiento y la hidrólisis enzimática de varios materiales derivados de la pared celular de la planta o materiales residuales, por ejemplo, la producción de jugos o vino, residuos de agrocultivos tales como cáscaras de vegetales, cáscara de frijol, azúcar de pulpa de remolacha, pulpa de olivo, pulpa de papa y similares . El material de la planta puede degradarse para mejorar diferentes clases de procesos, facilitar la purificación o extracción de otros componentes de galactanos como la purificación de pectinas de cítricos, mejorar el valor alimenticio, disminuir la capacidad de enlace del agua, mejorar la degradabilidad en plantas de agua de desechos, mejorar la conversión del material de la planta para el ensilado o almacenamiento, etc. Por medio de una preparación de la enzima de la invención es posible regular la consistencia y apariencia de vegetales o frutas procesados. La consistencia y apariencia han demostrado ser un producto de combinación actual de enzimas usadas para procesar, es decir, la especificidad de la enzimas con la cual se combina la variante de pectato liasa de la invención. Ejemplos incluyen la producción de jugos puros por ejemplo de manzanas, peras o bayas, jugos turbios por ejemplo, de manzanas, bayas cítricos o tomates y purés, por ejemplo, de zanahorias y tomates. La variante de pectato liasa de la invención puede usarse en la modificación de la viscosidad del material derivado de la pared celular de la planta. Por ejemplo, la variante de pectato liasa puede usarse para reducir la viscosidad del alimento que contiene galactano, y para promover el proceso del material que contiene galactano viscoso. La reducción de la viscosidad puede obtenerse mediante el tratamiento del material de la planta que contiene galactano con una preparación de la enzima de la invención bajo condiciones adecuadas para una degradación parcial o completa del material que contiene galactano. La variante de pectato liasa puede usarse por ejemplo, en combinación con otras enzimas para la eliminación de sustancias pécticas de fibras de plantas. Esta eliminación es esencial, por ejemplo, en la producción de fibras textiles u otros materiales celulósicos. Para este propósito el material de la fibra de la planta se trata con una cantidad adecuada de la pectato liasa de la invención bajo condiciones adecuadas, para obtener una degradación parcial o completa de sustancias pécticas asociadas con el material de fibra de la planta .

Aditivos para alimentos de animales Las variantes de pectato liasa de la presente invención pueden usarse para la modificación de alimentos para animales y -pueden ejercer su efecto ya sea in vitro (modificando los componentes del alimento) o in vivo. La variante de pectato liasa es adecuada particularmente para la adición de composiciones de alimento animal que contienen cantidades elevadas de arabinogalactanos o galactanos, por ejemplo, alimentos que contienen material de plantas de frijol de soya, semilla de colza, lupina, etc. Cuando se añade a los alimentos, la variante de pectato liasa mejora significativamente la descomposición in vivo del material de la pared celular de la planta, por medio de la cual el animal logra un mejor aprovechamiento de los nutrientes de la planta. Por consiguiente, se mejora la proporción de crecimiento y/o relación de la conversión alimenticia (es decir, el peso de alimento ingerido en relación con la ganancia en peso) del animal. Por ejemplo, la galactana indigestable se degrada por la pectato liasa, por ejemplo, en combinación con la beta-galactosidasa, para la galactosa o galacto-oligómeros que son digeribles por el animal contribuyendo así a la energía disponible del alimento. También, mediante la degradación del galactano de la pectato liasa puede mejorarse la digestabilidad y absorción de los constituyentes alimenticios sin carbohidratos tales como proteínas, minerales y grasas. Para una descripción adicional se hace referencia aquí al PCT/DK 96/00443 y a un ejemplo de trabajo.

Proceso de jugos y vinos La enzima o preparación de enzimas de la invención puede usarse para la despectinización y la reducción en viscosidad en los jugos de frutas y vinos, especialmente en jugos de manzanas y peras. Esto puede realizarse mediante el tratamiento del jugo de vegetales o frutas con una preparación de enzimas de la invención en una cantidad efectiva para degradar el material que contiene pectina contenido en el jugo del vegetal o fruta. La enzima o preparación de la enzima puede usarse en el tratamiento de una pasta de frutas y vegetales para mejorar la extractabilidad o degradabilidad de la pasta. Por ejemplo, la preparación de la enzima puede usarse en el tratamiento de pastas de manzanas y peras para la producción de jugos y en el tratamiento de la pasta de uvas para al producción de vino. La aplicabilidad de las variantes de pectato liasa con estabilidad detergente mejorada se aprecia cuando las variantes se usan en un ambiente que comprende tensoactivos .

Descripción y Ejemplos del detergente Sistema tensoactivo Las composiciones del detergente de acuerdo a la presente invención comprenden un sistema tensoactivo, en donde el tensoactivo puede seleccionarse a partir de tensoactivos no iónicos y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o zwiteriónicos y/o semipolares. El tensoactivo se presenta típicamente en un nivel de 0.1% a 60& en peso.

El tensoactivo se formula preferiblemente para ser compatible con los componentes de la enzima presente en la composición. En composiciones de gel o liquidas, el tensoactivo se prefiere formular de tal forma que promueve o al menos no degrade la estabilidad de cualquier enzima en estas composiciones. Los sistemas preferidos que van a usarse de acuerdo a la presente invención comprende como tensoactivo, uno o más de los tensoactivos no iónicos y/o aniónicos descritos aquí. Los óxidos de polietileno, polipropileno y polibutileno productos de la condensación de fenoles de alquilo son adecuados para usarse como tensoactivos no iónicos de los sistemas tensoactivos de la presente invención, se prefieren con los óxidos de polietileno, productos de la condensación. Estos compuestos incluyen los productos de la condensación de fenoles de alquilo que tienen un grupo alquilo, que contienen desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente desde aproximadamente 14 átomos de carbono, ya sea una configuración de cadena ramificada o cadena recta con el óxido de alquileno. En una modalidad • · preferida, el óxido de etileno se presenta en una cantidad igual desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 moles, más preferiblemente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 15 moles de óxido de etileno por mol de fenol alquilo. Los tensoactivos no iónicos de este tipo disponibles comercialmente incluyen Igepal CO-630, comercializados por la corporación GAF; y Tritón™ X-45, X-114, ?-10? y X-102, todos comercializados por la compañía Rohm & Haas. Estos tensoactivos se refieren comúnmente como alcoxilados de alguilfenol (por ejemplo, alquil fenol etoxilados) . Los productos de condensación de alcoholes alifáticos secundarios y primarios con aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 moles de óxido de etileno, son adecuados para usarse como tensoactivos no iónicos de los sistemas de tensoactivos no iónicos de la presente invención. La cadena alquilo del alcohol alifático puede ser ya sea ramificada o recta, primaria o secundaria, y contiene generalmente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono. Se prefieren los productos de condensación de alcoholes que tienen un grupo alquilo que contiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20 átomos de carbono, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 moles de óxido de etileno por mol de alcohol. Se presentan aproximadamente 7 moles de óxido de etileno y más preferiblemente de 2 hasta 5 moles de óxido de etileno por mol de alcohol en dichos productos de condensación. Ejemplos de tensoactivos no iónicos comercialmente disponibles de este tipo incluyen Tergitol™ 15-S-9 (el producto de condensación del alcohol lineal Cn-Ci5 con 9 moles de óxido de etileno) , Tergitol 24-L-6 NMW (el producto de condensadón del alcohol primario Cj2~Ci con 6 moles de óxido de etileno con una distribución de peso molecular) , ambos marcados por la corporación Union Carbide; Neodol™ 45-9 (el producto de condensación del alcohol lineal C14-C15 con 9 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 23-3 (el producto de condensación del alcohol lineal C3.2-013 con 3.0 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 45-7 (el producto de condensación del alcohol lineal C^-CJS con 7 moles de óxido de etileno) , Neodol™ 45-5 (el producto de condensación del alcohol lineal C14-C15 con 5 moles de óxido de etileno) , comercializado por la compañía química Shell,- Kyro™ EOB (el producto de condensación del alcohol C13-C15 con 9 moles de óxido de etileno) , comercializado por la compañía Procter & Gamble y Genapol LA 050 (el producto de condensación del alcohol CX2-Ci4 con 5 moles de óxido de etileno) , comercializado por Hoechst. El rango preferido de HLB en estos productos es de aproximadamente 8 a 11, se prefiere más de 8 a 10. Útiles también como tensoactivos de los sistemas tensoactivos de la presente invención son los alquilpolisacáridos descritos en la US 4,565,647, que tiene un grupo hidrofóbico que contiene desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 16 átomos de carbono y un polisacárido, por ejemplo, un poliglicósido, grupo hidrofilico que contiene desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 10, preferiblemente desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 3, más preferiblemente desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 2.7 unidades de sacáridos. Cualquier sacárido reducido que contiene 5 o 6 átomos de carbono puede usarse, por ejemplo, glucosa, galactosa y porciones de galactosa pueden sustituirse . para las porciones glucosilo (opcionalmente, el grupo hidrofóbico se coloca en la posición 2-, 3-, 4-, etc proporcionando asi, una glucosa o galactosa opuesta a un glucósido o galactósido) . Los enlaces intersacáridos pueden ser por ejemplo, entre la primera posición de las unidades del sacárido adicional y las pociones 2-, 3-, 4- y/o 6- en las unidades de sacáridos precedentes . Los alquilpoliglicósidos preferidos tienen la fórmula R20 (CnH2n0) t (glicosilo) x. en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de alquilo, alquilfenilo, hidroxialquilo, hidroxialquilfenilo, y mezclas de los mismos en las cuales los grupos que contienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18, preferiblemente desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 14 átomos de carbono; n es 2 ó 3, preferiblemente 2; t es desde 0 hasta aproximadamente 10, preferiblemente 0; y x es desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 10, preferiblemente desde aproximadamente 1.3 hasta aproximadamente 3, más preferiblemente desde 1.3 hasta aproximadamente 2.7. El glicosilo se deriva preferiblemente a partir de la glucosa. Para preparar estos compuestos, el alcohol o alcohol alquilpolietoxi se forma primero y después reacciona con la glucosa o una fuente de glucosa, para formar el glucósido (se coloca en la posición 1) . Las unidades adicionales pueden entonces colocarse entre su posición 1 y las unidades de glucosilos precedentes 2-, 3-, 4- y/o posición -6, se prefiere predominantemente la posición 2. Los productos de condensación del óxido de etileno, con una base hidrofóbica formada por la condensación del óxido de propileno con glicol de propileno son adecuados también para usarse como lo sistemas tensoactivos no iónicos adicionales de la presente invención. La porción hidrofóbica de estos compuestos tendrá preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 1500 hasta aproximadamente 1800 y exhibirá insolubilidad para el agua. La adición de porciones de polioxietileno para esta porción hidrofóbica tiende a incrementar la solubilidad del agua de la molécula como un todo, y el carácter liquido del producto se retiene hasta el punto en el cual el contenido del polioxietileno es aproximadamente 50% del peso total del producto de condensación, que corresponde a la condensación hasta aproximadamente 40 moles de óxido de etileno. Ejemplos de compuestos de este tipo incluyen ciertos tensoactivos comercialmente disponibles Pluronic™ comercializados por BASF. Adecuados también para usar como tensoactivo no iónico del sistema tensoactivo no iónico de la presente invención son los productos de condensación de óxido de etileno con el producto resultante . de la reacción de óxido de propileno y etilendiamina . La porción hidrofóbica de estos compuestos consiste del producto de la reacción de la etilendiamina y exceso de óxido de propileno generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 2500 hasta aproximadamente 3000. Esta porción hidrofóbica se condensa con óxido de etileno a tal grado que el producto de condensación contiene desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 80% en peso del polioxietileno y tiene un peso molecular desde aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 11,000. Ejemplos de este tipo de tensoactivos no iónicos incluyen ciertos compuestos comercialmente disponibles por Tetronic™ comercializados por BASF. , . Preferidos como tensoactivos no iónicos de los sistemas tensoactivos de la presente invención, son condensados de óxido de polietileno de fenoles de alquilo, los productos de condensación de alcoholes alifáticos secundarios y primarios con desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 moles de óxido de etileno, alquilpolisacáridos y mezclas de los mismos. Se prefieren más los etoxilados de fenol C8-Ci4 que tiene desde 3 hasta 15 grupos etoxi y etoxilatos de alcohol C8_Ci3 (preferiblemente en promedio C10) que tienen desde 2 hasta 10 grupos etoxi y mezclas de los mismos. Los tensoactivos no iónicos altamente preferidos son los tensoactivos de anida de ácidos grasos polihidroxi de la fórmula: R2-C-N-Z, II I O R en donde R1 es H, o R1 es hidrocarbilo Ci-4/ 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo o una mezcla de los mismos, R2 es hidrocarbilo C5-31 y Z es un polihidroxihidrocarbilo que tiene una cadena hidrocarbilo lineal con al menos 3 hidroxilos conectados directamente a la cadena, o un derivado alcoxilatado . Preferiblemente, R1 es metilo, R2 es alquilo CHIS lineal o cadena alquilo tal como alquilo de coco o mezclas de los mismos y Z se deriva de un azúcar reducida tal como la glucosa, fructuosa, maltosa o lactosa en una reacción de afinación reductiva . Los tensoactivos aniónicos altamente preferidos incluyen tensoactivos de sulfato alcoxilados. Ejemplos de los mismos son ácidos o sales solubles en agua de la fórmula RO(A)mS03M en .donde R es un alquilo Cio_C24 no sustituido o un grupo hidroxialquilo que tiene un componente alquilo C10-C20/ preferiblemente un alquilo C12-C2o o hidroxialquilo, más preferiblemente alquilo Ci2-Ci8 o hidroxialquilo. A es una unidad propoxi o etoxi, m es mayor que cero, típicamente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 6, más preferiblemente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 3, y M es H o un catión que puede ser por ejemplo, un catión metálico (por ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio, maqnesio, etc.), catión de amonio o amonio sustituido. Los sulfatos etoxilados de alquilo así como los sulfatos propoxilados de alquilo se contemplan aquí. Los ejemplos específicos de cationes de amonio sustituidos incluyen cationes metilo, dimetilo, trimetil-amonio y cationes de amonio cuaternarias tales como cationes tetrametil-amonio y dimetil piperidinio y aquellas derivadas de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina, mezclas de los mismos y similares. Ejemplos de tensoactivos son polietoxilato de alquilo Ci2-Ci8 (1.0) sulfato (Ci2-Ci8E (1.0) ) , polietoxilato de alquilo Ci2-Ci8 (2.25) sulfato (Ci2-C18 (2.25 ) M, y polietoxilato de alquilo Ci2-Ci8 p.oj sulfato <coi2-Ci8E (3.0 ) M, y polietoxilato de alquilo Ci2-C18 (4.0) sulfato (Ci2-Ci8E (4.0) M) , en donde M se selecciona convenientemente a partir de sodio y potasio . Los tensoactivos aniónicos que van a usarse son tensoactivos de sulfonato éster de alquilo que incluyen ésteres lineales de ácidos carboxilicos C8-C2o (es decir, ácidos grasos) que son sulfonados con S03 gaseosos de acuerdo al "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), pp. 323-329. Los materiales .de partida adecuados incluirían sustancias grasas naturales derivadas de sebo, aceite de palma, etc. El tensoactivo éster sulfonato de alquilo preferido especialmente para las aplicaciones de lavandería comprenden tensoactivos éster sulfonato de alquilo de la fórmula estructural: O II R3 - CH - C - OR4 ¡ S03 en donde R3 es hidrocarbilo s~C2or preferiblemente un alquilo, o combinación de los mismos, R4 es un hidrocarbilo Ci~C6, preferiblemente un alquilo o combinación de los mismos, y M es un catión que forma una sal soluble en agua con el éster sulfonato de alquilo. Los cationes que forman sales adecuadas incluyen metales tales como sodio, potasio y litio y cationes de amonio sustituidos y no sustituidos tales como monoetanolamina, dietanolamina y trietanolamina .

Preferiblemente, R3 es un alquilo C10-Ci6 y R4 es metilo, etilo o isopropilo. Especialmente preferidos son los éster sulfonato de metilo en donde R3 es alquilo C10-C16.

Otros tensoactivos aniónicos adecuados incluyen los tensoactivos de sulfato de alquilo que son ácidos o sales solubles en agua de la fórmula ROSO3 en donde R es preferiblemente un hidrocarbilo C10-C2 , preferiblemente un alquilo o hidroxiaiquilo que tiene un componente alquilo Cio~ 2or ™ás preferiblemente un alquilo C12-C18 o hidroxiaiquilo y M es H o un catión, por ejemplo, un catión metálico alcalino (por ejemplo, sodio, potasio, litio) o amonio o amonio sustituido (por ejemplo, cationes de amonio de metilo, dimetilo y trimetilo y cationes de amonio cuaternarios tales como cationes tetrametil-araonio y cationes dimetil piperidinio y cationes de amonio cuaternarios derivados a partir de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina, y mezclas de los mismos, y similares) . Típicamente, las cadenas alquilo de C12-C16 se prefieren para temperaturas de lavado inferiores (por ejemplo, por debajo de aproximadamente 50 grados Celsius) y cadenas alquilo Cie-Ci8 se prefieren para temperaturas de lavado superiores (por ejemplo, arriba de aproximadamente 50 grados Celsius) . Otros tensoactivos aniónicos útiles para propósitos detersivos pueden incluirse también en las composiciones detergentes de lavado de la presente invención. Estos pueden incluir sales (que incluyen por ejemplo, sodio, potasio, amonio y sales de amonio sustituidas tales como sales mono, di y trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos secundarios y primarios C3-C22, olefinsulfonatos C8-C2 olensulfonatos , ácidos policarboxilicos sulfonados, preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos metálicos alcalinotérreos, por ejemplo, como se describe en al especificación de patente Británica No. 1,082,179, alquilpoliglicoltersulfatos .C8-C24 (que contienen hasta 10 moles de óxido de etileno) ; alquil glicerol sulfonatos, acil gliceril sulfonatos grasos, oleil glicerol sulfonatos grasos, éter sulfatos, óxido etileno y alquil fenoles, sulfonatos de parafina fosfatos, isetionatos tales como isetionatos de acilo, tauratos N-acilo, succinamatos y sulfocinatos de alquilo, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente monoésteres Ci2-C18 saturados e insaturados) y diésteres de sulfosuccinatos (especialmente diésteres C^- x2 saturados e insaturados) , sarcosinatos de acilo, sulfatos de alquilpolisacáridos tales como sulfatos de alquilpoliglucósido (los compuestos no sulfatados no iónicos que se describen abajo) sulfatos de alquilo primarios ramificados y carboxilatos polietoxi de alquilo tales como aquellos de la fórmula RO (CH2CH20) k-CH2C00-M+ en donde R es un alquilo. C3-C22r k es un entero de 1 a 10 y M es un catión que forma una sal soluble. Los ácidos de resina y ácidos de resina hidrogenada son también adecuados tales como rosina, rosina hidrogenada y ácidos de resinas y ácidos de resina hidrogenada presentes en o derivado de un aceite elevado.

Se prefieren sumamente los sulfonatos de alquilbenceno . Especialmente preferidos son los sulfonatos alquil benceno lineales (cadena recta) (LAS) en donde el grupo alquilo contiene preferiblemente desde 10 hasta 18 átomos de carbono. Ejemplos adicionales se describen en "Surface Active Agents and Detergents" (Vol. I y II por Schwartz, Perry y Berch) . Una variedad de tales tensoactivos se describen también generalmente en US 3,929,678, (columna 23, linea 58 a través de la columna 29, linea 23 incorporada aquí por referencia) . Cuando se incluye aqui, las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención comprende típicamente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40%, preferiblemente desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 20% en peso de tales tensoactivos aniónicas.

Las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención pueden contener también tensoactivos catiónicos, amfolíticos, zwiteriónicos y semipolares, así como los tensoactivos no iónicos y/o aniónicos distintos a aquellos ya descritos aquí. . Los tensoactivos detersivos catiónicos adecuados para usarse en las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención son aquellos que tienen un grupo hidrocarbilo de cadena larga. Ejemplos de tales tensoactivos catiónicos incluyen tensoactivos de amonio tales como halogenuros alquiltrimetilamonio y aquellos tensoactivos que tienen la fórmula: [R2(OR3)y] [R4 (OR3 ) y] 2RN+X- en donde R2 es un grupo alquilo o alquil bencilo que tiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono en la cadena alquilo, cada R3 se selecciona del grupo que consiste de -CH2CH2-, -CH2CH (CH3) -, -CH2CH (CH2OH) CH2CH2CH2-, y mezclas de los mismos, cada R4 se selecciona del grupo que consiste de alquilo C1-C4, hidroxialquilo C1-C4, estructuras de anillo bencilo formadas mediante la unión de dos grupos R4, CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH en donde R6 es cualquier hexosa o polímero de hexosa que tiene un peso molecular menor a aproximadamente 1000, e hidrógeno cuando y no es 0; R5 es la misma que R4 o es una cadena alquilo, en donde el número total de átomos de carbono o R2 más R5 no es más de aproximadamente 18; cada y es desde 0 hasta aproximadamente 10 y la suma de los valores y es de 0 hasta aproximadamente 15; y X es cualquier anión compatible. Los tensoactivos catiónicos altamente preferidos son los compuestos de amonio cuaternarios solubles en agua útiles en la composición presente que tiene la fórmula: RaR2R3R4N+X~ (i) en donde Ri es un alquilo C8-Ci6/ cada R2, R3 y R4 es independientemente alquilo C1-C4, hidroxi alquilo C1-C4, bencilo, y -(C2H o)xH en donde x tiene un valor de 2 hasta 5 y X es un anión. No más de uno de R2, R3 o 4 deben ser bencilo . La longitud de la cadena alquilo preferida para R3. es C12-C15, particularmente cuando el grupo alquilo es una mezcla de longitud de cadena derivada de grasa de grano de plan o coco o se deriva sintéticamente de acumulación de olefinas o síntesis de alcoholes 0X0. Los grupos preferidos para R2R3 y R4 son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X puede seleccionarse a partir de haluro, metosulfato, acetato y iones fosfato. Ejemplos de compuestos de amonio cuaternarios adecuados de la fórmula (i) para usarse aquí son: cloruro o bromuro de trimetil amonio de coco; cloruro o bromuro de dihidroxietil amonio de coco; cloruro de amonio trietil decilo; bromuro o cloruro de amonio decil dimetil hidroxietilo; bromuro o cloruro de dimetil hidroxietil amonio C12-C15; bromuro o cloruro de dimetil hidroxietil amonio de coco; metil sulfato de amonio miristil trimetilo; bromuro o cloruro de lauril dimetil bencil amonio; bromuro o cloruro de lauril dimetil (etenoxi) 4 de amonio; ésteres de colina (compuestos de la fórmula (i) en donde Ri es CH2-CH2-O-C-C12-14 alquil y R2R3R4 son metilo) . II o di-alquílo imidazolinas [compuestos de la fórmula (i) ] Otros tensoactivos catiónicos útiles aquí se describen también en la US 4,228,044 y en EP 0 000 224. Cuando se incluye aqui, las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención comprenden típicamente desde 0.2% hasta aproximadamente 25%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 8% en peso de tales tensoactivos catiónicos. Los amfolíticos son adecuados también para usarse en composiciones detergentes de lavandería de la presente invención. Estos tensoactivos pueden ser descritos ampliamente como derivados alifáticos de aminas terciarias o secundarias o derivados alifáticos de aminas terciarias y secundarias heterocíclicas en las cuales el radical alifático puede ser una cadena lineal o ramificada. Uno de los sustituyentes alifáticos contienen al menos aproximadamente 8 átomos de carbono, típicamente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono, y al menos uno contienen un grupo solubilízador de agua aniónico, por ejemplo, carboxi, sulfonato, sulfato. Ver US 3,929,678 (columna 19, líneas 18-35) para los ejemplos de tensoactivos anfolíticos . Cuando se incluyen aquí, las composiciones detergentes de lavandería de la presente invención comprenden típicamente de 0.2% hasta aproximadamente 15%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en peso de tales tensoactivos anfolíticas. Los tensoactivos zwiteriónicos son adecuados también para usar composiciones detergentes de lavandería. Estos tensoactivos pueden describirse ampliamente como derivados de aminas terciarias y secundarias, derivados de aminas terciarias y secundarias heterocíclicas o derivados de amonio cuaternario, compuestos de sulfonio terciarios o fosfonio cuaternario. Ver la US 3, 929, 678 (columna 19, línea 38 a lo largo de la columna 22, línea 48) para los ejemplos de tensoactivos zwiteriónicos. Cuando se incluye aquí, las composiciones para detergentes de lavandería de la presente invención, típicamente comprenden de 0.2% hasta aproximadamente 15%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en peso de tensoactivos zwiteriónicos. Los tensoactivos no iónicos semipolares son una categoría especial de tensoactivos no iónicos que incluyen óxidos de amina solubles en agua, que contienen el grupo que consiste de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono; óxidos de fosfina solubles en agua que contienen porciones alquilo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono y 2 porciones seleccionadas del grupo que consiste de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono; y de sulfóxidos solubles en agua que contienen una porción alquilo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono y una porción seleccionada del grupo que consiste de alquilo y porciones hidroxialquilo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono. Los tensoactivos detergente no iónicos semipolares incluyen los tensoactivos óxido amina que tienen la fórmula: O R3(OR4)x ( 5)2 en donde R3 es alquilo, hidroxialquilo, un grupo alquil fenilo o mezclas del mismo que contienen desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono; R4 es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contienen desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono o mezclas del mismo; x es desde 0 hasta aproximadamente 3, y cada R5 es un grupo alquilo o hidroxialquilo que contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono o un grupo óxido de polietileno que contienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 grupos óxido de etileno. Los grupos R5 pueden ser colocados entre sí, por ejemplo, a través de un átomo de nitrógeno u oxígeno para formar una estructura de anillo . Estos tensoactivos de óxido de amina incluyen en particular óxidos de amina alquil Cio-Cis dimetilo y óxidos etil amina de alcoxi C8~Ci2 alcoxi etil dihidroxi. Cuando se incluye aquí, las composiciones detergentes para lavandería de la presente invención comprenden típicamente desde aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 15%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en peso de tales tensoactivos no iónicos semipolares . Sistema de aditivos para deteregentes Las composiciones de acuerdo a la presente invención pueden comprender además un sistema ' de aditivos para detergentes. Cualquier sistema de aditivos para detergentes convencional es adecuado para usarse aquí que incluyen materiales aluminosilicatos , silicatos y ácidos grasos tales como tetraacetato etilendiamina, secuestrantes de iones tales como aminopolifosfonatos, particularmente ácido etilendiamina tetrametilen fosfónico y ácido dietilen triamina pentametilenfosfónico . Aun cuando se prefiere menos por razones ambientales obvias, pueden usarse también aquí aditivos detergentes de fosfonato. Los aditivos detergentes adecuados pueden ser un material que intercambia iones inorgánicos comúnmente, un material aluminosilicato hidratado inorgánico, más particularmente una zeolita sintética hidratada tal como zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP. Otro material aditivo detergente inorgánico adecuado es un silicato estratificado, por ejemplo, SKS-6 (Hoechst) . SKS- 6 es un silicato estratificado cristalino que consiste de silicato de sodio (Na2SÍ20s) . Policarboxilatos adecuados que contienen un grupo carboxi incluyen ácido láctico, ácido glicólico y derivados de éter de los mismos como los descritos en las patentes belgas Nos. 831,368,821,369 y 821,370. Los policarboxilatos que contienen dos grupos carboxi incluyen sales solubles en agua de ácido succinico, ácido malónico, (ácido diacético (etilendioxi ) , ácido maléico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico asi como el éter carboxilato descrito en la alemana Offenle-enschrift 2,446,686 y 2,446,487, US 3,935,257 y los carboxilatos de sulfinilo descritos en la patente Belga No. 840,623. Los policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi incluyen • · en. particular, citratos solubles en agua, aconitratos y citraconatos asi como derivados de succinato tales como los carboximetilsuccinatos descritos en la patente Británica No. 1,379,241, lactoxisuccinatos descritos en la Solicitud de Países Bajos 7205873 y los materiales de oxipolicarboxilato tales como los tricarboxilatos 2-oxa-l, 1, 3-propano descritos en la patente británica No. 1,387,447. Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos carboxi incluyen oxidisuccinatos descritos en la patente británica No. 1,261,829, tetracarboxilatos 1, 1, 2, 2, -etano, tetracarboxilatos 1, 1, 3, 3-propano que contienen sustituyentes sulfa incluyen los derivados sulfosuccinatos descritos en las patentes Británicas Nos. 1,398,421 y 1,398,422 y en US 3,936,448 y los citratos pirolisados sulfonados descritos en la patente Británica No. 1,082,179, mientras que los policarboxilatos que contienen sustituyentes de fosfono se describen en la patente Británica No. 1,439,000. Los policarboxilatos heterociclicos y aciclicos incluyen ciclopentano-cis , cis, cis-tetracarboxilatos , pentacarboxilatos ciclopentadieno, 2, 3, 4 , 5-tetrahidro-furan-cis, cis-cis-cis-tetracarboxilatos , 2 , 5-tetrahidro-furan-cis , discarboxilatos, 2,2,5,5, 5-tetrahidrofuran-tetracarboxilatos , 1,2,3,4,5,6-hexano - hexacarboxilatos y derivados de carboximetilo de alcoholes polihídricos tales como sorbitol, manitol y xilitol. Los policarboxilatos aromáticos incluyen ácido metílico, ácido pirometílico y derivados de ácido ftálico descritos en la patente Británica No. 1,425,343. De lo anterior, los policarboxilatos preferidos son los hidroxi-carboxilatos que contienen hasta tres grupos carboxi por molécula, más particularmente citratos.

Los sistemas aditivos detergentes preferidos para usarse en las presentes composiciones incluyen una mezcla de un aditivo detergente aluminosilicato insoluble en agua tal como zeolita A o de un silicato estratificado (SKS-ß) y un agente quelante de carboxilato soluble en agua tal como ácido cítrico . Un quelante adecuado para la inclusión en las composiciones detergentes de acuerdo con la invención es el ácido etilendiamina-N, N' -disuccínico (EDDS) o el metal alcalino, metal alcalino terreo, amonio o sales de amonio sustituidas de las mismas, o mezclas de los mismos. Los compuestos preferidos DDS son la forma ácida libre y la sal de magnesio o sodio de las mismas. Ejemplos de tales sales de sodio preferidas de EDDS incluyen Na2EDDS y N4EDDS. Ejemplos de tales sales de magnesio preferidas de EDDS incluyen MgEDDS y Mg2EDDS . Las sales de magnesio son las que mejor se prefieren para la inclusión in composiciones de acuerdo con la invención. Los sistemas aditivos detergentes preferidos incluyen una mezcla de aditivo detergente aluminosilicato insoluble en agua tal como la zeolita A y un agente quelante carboxilato soluble en agua tal como ácido cítrico. Otros materiales aditivos detergentes que pueden formar parte del sistema de aditivos para detergentes para usarse en composiciones granulares incluyen materiales inorgánicos tales como carbonates metálicos alcalinos, bicarbonatos, silicatos y materiales orgánicos tales como los fosfonatos orgpánicos, fosfonatos de amino polialquileno y amino policarboxilatos . Otras sales orgánicas solubles en agua adecuadas son los ácidos homo o co-poliméricos o sus sales, en las cuales el ácido policarboxilico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre si por no más de dos átomos de carbono . Los polímeros de este tipo se describen en GB-A- 1,596,756. Ejemplos de tales sales son poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus copolímeros con anhídrido maléico, tales copolímeros que tienen un peso molecular a partir de 20,000 hasta 70,000, especialmente aproximadamente de 40,000. Las sales aditivos detergentes se incluyen normalmente en cantidades desde 5% hasta 80% en peso de la composición. Los niveles preferidos del aditivo detergente para los detergentes líquidos son de 5% hasta 30%.

Enzimas Las composiciones, detergentes preferidas, además de la preparación de la pectato liasa de la invención, comprende otras enzimas qué proporciona la función de limpieza y/o beneficios para el cuidado de la tela, de acuerdo con al presente invención, las enzimas adicionales pueden modificarse para mejorar la estabilidad y vaciado de calcio. Tales enzimas incluyen proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, peorxidasas, oxidasas (por ejemplo, lacasas) , hemicelulasas tales como manasas, xilanasas, galactanasas , arabinofuranosidasas, esterasas, liquenasas, arabinasas y otras liasas de pectato. Proteasas : Puede usarse cualquier proteasa adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se-prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutaciones modificadas químicamente o genéticamente. La proteasa puede ser una proteasa de serina, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa como la tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas , especialmente aquellas derivadas de Bacillus por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279) . Ejemplos de proteasas como la tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa Fusarium descrita en la WO 89/06270. La.s . enzimas de proteasa preferidas comercialmente disponibles incluyen aquellas que se venden bajo los nombres comerciales Alcalasa, Savinasa, Primasa, Durazym y Esperasa por Novo Nordisk A/S (Dinamarca), aquellas vendidas bajo el nombre comercial Maxatasa, Maxacal, maxapem, Properasa, Purafect y Purafect OXP por Genencor International y aquellas vendidas bajo el nombre comercial Opticlean y Optimasa de Solvay Enzymes. Las enzimas de proteasa pueden incorporarse en las composiciones de acuerdo con la invención en un nivel desde 0.00001% hasta 2% de la proteina de enzima en peso de la composición, preferiblemente en un nivel de 0.0001% hasta 1% de la proteína de enzima por peso de la composición, más preferiblemente en un nivel a partir de 0.001% hasta 0.5% de la proteína de la enzima por peso de la composición, incluso más preferiblemente en un nivel de 0.01% hasta 0.2% de la proteína de enzima por peso de la composición. Lipasas: Puede usarse cualquier lipasa adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Se incluyen mutaciones modificadas químicamente o genéticamente. Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa Humicola lanuginosa, por ejemplo, descritas en la EP 258 068 y EP 305 216, un- lipasa Rhizomucor iehei, por ejemplo, como se describe en la EP 238 023, una lipasa Candida tal como una lipasa C. antárctica, por ejemplo, la lipasa C. antárctica ? o. B .descrita en la eP 214 761, una lipasa Pseudomonas tal como una P. alcaligenes y lipasa P. pseudoalcaligenes, por ejemplo, como se describe en la EP 218 272, una lipasa P. espacia, por ejemplo, como se describe en la EP 331 376, una lipasa P. stutzeri, por ejemplo, como se describe en la GB 1,372,034, una lipasa P. fluorescens, una lipasa Bacillus, por ejemplo como una lipasa B. subtilis (dartois et al., (1993) , Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260) , una lipasa B. stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa B. pumilus (WO 91/16422) . Además, una variedad de lipasas clonadas pueden ser útiles, que incluyen la lipasa Penicillium camembertii descrita por Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67); la lipasa Geotricum candidum (Schimada, Y et al., (1989), J. Biochem. , 106, 383-388), y varias lipasas Rhizopus tales como la lipasa R. delemaz (Hass, M.J et al., (1991), Gene 109, 117-113), una lipasa R. niveus (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719) y una lipasa R. oryzae. Pueden ser de utilidad otros tipos de enzimas lipoliticas tales como las cutinasas, por ejemplo, una cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina descrita en la WO 88/09367 o una cutinasa derivada de Fusarium solana pisi (por ejemplo, descrita en la WO 90/09446) . Las lipasas especialmente adecuadas son las lipasas tales como la lipasa MI™, luma Fast™ y Lipomax™ (Genencor) , Lipolasa™ y Lipolasa Ultra™ (Novo Mordisk A/S) , y la Lipasa P "Amano" (Amano P armaceutical Co. Ltd.). Las lipasas se incorporan normalmente en la composición detergente en un nivel a partir de 0.00001% hasta 2% de la proteína de la enzima por peso de la composición, preferiblemente a un nivel a partir de 0.0001% hasta 1% de la proteína de la enzima por peso de la composición, más preferiblemente a un nivel a partir de 0.001% hasta 0.5% de la proteína de la enzima por peso de la composición, más aun preferiblemente a un nivel de 0.01% hasta 0.2% de la proteína de la enzima por peso de la composición. Amilasas: Puede usarse cualquier amilasa (alfa y/o beta) adecuada para usarse en soluciones alcalinas. Las amilasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Se incluyen mutaciones químicamente o- genéticamente modificadas. Las amilasas incluyen por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de una cepa especial de B. licheniformis, descrita con mayor detalle en la GB 1,296,839. Las amilasas comercialmente disponibles son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (disponible a partir de Novo Nordisk A/S) y Rapidase™, Maxamyl P™, Purastar™ y Purastar OxAm™ (disponible de Genencor) . Además, es adecuada una amilasa con más de 70% de homología para SP707 (Tsukamoto, A. et al., 1988. Biochem. Biophys . Res. común. 151:25) o K38 (Kao Corp. EE1022334) . Las amilasas se incorporan normalmente en la composición detergente para un nivel a partir de 0.00001% hasta 2% de la proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente para un nivel de 0.0001% hasta 1% de la proteina de enzima por peso de la composición, más preferiblemente para un nivel a partir de 0.001% hasta 0.5% de la proteina de la enzima por peso de la composición, incluso más preferiblemente para un nivel de 0.01% hasta 0.2% de la proteina de enzima por peso de la composición. Celulasas : Puede usarse cualquier celulasa adecuada para usarse en las soluciones alcalinas. Celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutaciones modificadas químicamente o genéticamente. Las celulasas adecuadas se describen en la US 4,435,307, que describen celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en la solicitud de patente Europea No. 0 495 257. Las celulasas comercialmente ' disponibles incluyen Celluzyme™ producidas por una cepa de Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) , y KAC-500(B)™ (Coporación Kao) . Las celulasas se incorporan normalmente en la composición de detergente para un nivel a partir de 0.00001% hasta 2% de la proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente para un nivel de 0.0001% hasta 1% de la proteína de enzima por peso de la composición, más preferiblemente, para un nivel a partir de 0.001% hasta 0.5% de la proteína de la enzima por peso de la composición, incluso más preferiblemente para un nivel de 0.01% hasta 0.2% de la proteína de enzima por peso de la composición. Peroxidasas/Oxidasas : Las enzimas de peroxidasa se usan en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente de la misma (por ejemplo, percarbonato, perborato o persulfato) . Las enzimas de oxidasa se usan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se usan para el "blanqueado de la solución", es decir, para prevenir la transferencia de un tinte textil a partir de una tela teñida a otra tela, cuando dichas telas se lavan juntas en un licor de lavado, preferiblemente junto con un agente mejorado descrito en por ejemplo, WO 94/12621 y al WO 95/01426. Las peroxidasas/oxidadas incluyen aquellas de origen de plantas, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutaciones químicamente o genéticamente modificadas. Las enzimas de peroxidasa y/o oxidasa se incorporan normalmente en la composición detergente para un nivel de 0.00001% hasta 2% de la proteína de enzima por peso de la composición, preferiblemente para un nivel de 0.0001% hasta 1% de la proteína de enzima por peso de la composición, más preferiblemente para un nivel a partir de 0.001% hasta 0.5% de la proteína de la enzima por peso de la composición, incluso más preferiblemente para un nivel de 0.01% hasta 0.2% de la proteína de enzima por peso de la composición. Pectato liasa: Las pectato liasas han sido clonadas a partir del género bacteriano diferente tal como Erwinia, Pseudomonas, Klebsiella y Xanthomonas . También a partir de Bacillus subtillus (nacer et al., (1993) FEBS 335:319-326) y Bacillus sp. YA-14 (Kim et al., (1994) Biosci. bíotech. Biochem. 58:947-949) se ha descrito la clonación de la pectato liasa. Las pectato liasas se caracterizan por un pH óptimo alcalino y un requerimiento absoluto para cationes divalentes, el Ca2+ es el más estimulatorio . Se incluyen aquí mezclas de las enzimas mencionadas anteriormente, en particular una mezcla de una proteasa, una amilasa, una lipasa y/o una celulosa. La pectato liasa de la invención o cualquier otra enzima incorporada en la composición detergente se incorpora normalmente en la composición detergente para un nivel de 0.00001% hasta 2% de la proteína de la enzima por peso de la composición, preferiblemente para un nivel de 0.0001% hasta 1% de la proteína de la enzima por peso de la composición, más preferiblemente para un nivel a partir de 0.001% hasta 0.5% de la proteína de la enzima por peso de la composición, incluso, más preferiblemente para un nivel de 0.01% hasta 0.2% de la proteína de la enzima por peso de la composición. Agentes de blanqueado: Los ingredientes detergentes opcionales adicionales que pueden ser incluidos en la composición detergente de la presente invención incluyen agentes de blanqueado tales como PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de partícula de 400 a 800 mieras. Estos componentes de agentes blanqueadores pueden incluir uno o más agentes de blanqueado por oxígeno y, dependiendo del agente de blanqueado elegido, uno o más activadores de blanqueado. Cuando se presentan los compuestos de blanqueado por oxígeno se presentarán típicamente para niveles de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 25%. En general, los compuestos de blanqueado se añaden opcionalmente en las formulaciones no líquidas, por ejemplo, detergentes granulares. El componente del agente de blanqueado para usarse aquí, puede ser cualquiera de los agentes de blanqueado útiles para las composiciones detergentes que incluyen blanqueadores de oxígeno así como otros conocidos en el arte. El agente de blanqueado adecuado para la presente invención puede ser un agente de blanqueado activado y no activado . Una categoría del agente de blanqueado con oxígeno que puede usarse abarca agentes de blanqueado con ácido percarboxílico y sales del mismo. Ejemplos adecuados de esta clase, de agentes incluyen hexahidrato de monoperoxiftalato de magnesio, la sal de magnesio de ácido meta-cloro perbenzoico, ácido 4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico y ácido diperoxidodecandioico. Tales agentes de blanqueado se describen en la US 4, 483,781, US 740, 446, EP 0 133 354 y US 4,412,934. Los agentes de blanqueado sumamente preferidos incluyen también ácido 6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico descritos en la US 4,634,551. Otra categoría de los agentes de blanqueado que pueden usarse, abracan los agentes de blanqueado halógeno. Ejemplos de agentes de blanqueado de hipohalita, por ejemplo, incluyen ácido tricloro isocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y potasio y el N-cloro y N-bromo alcano sulfonamidas . Tales materiales se añaden normalmente de 0.5 a 10% por peso del producto terminado, preferiblemente de 1 a 5% en peso. El agente que libera peróxido de hidrógeno puede usarse en combinación con activadores , de blanqueado tales como tetra-acetiletilendiamina (TAED) , nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS, descrito en la US 4,412,934), 3, 5-trimetil-hexsanoloxibencenosulfonato (ISONOBS, descrito en la EP 120 591) o pentaacetilglucosa (PAG), que son perhidrolizados para formar un perécido como las especies de blanqueado activas, conducen a un efecto de blanqueado mejorado. Además, son muy adecuados son los activadores de blanqueado C8 ( 6-octanamido-caproilo) oxibenceno-sulfonato, C9 ( 6-nonanamido caproilo) oxibencenosulfobato y CIO ( 6-decanamido caproilo) oxibencenosulfonato o mezclas de los mismos. Los activadores adecuados también son ésteres de citrato acilado tales como los descritos en la Solicitud de patente Europea No. 91870207.7.

Loa agentes de blanqueado útiles que incluyen sistemas de blanqueado y peroxiácidos que comprenden activadores de blanqueado y compuestos de blanqueado de peroxígeno para usarse en las composiciones de limpieza de acuerdo a la 5 invención se describen en la solicitud USSN 08/136,626. El peróxido de hidrógeno puede estar presente añadiendo un sistema enzimático (es decir, una enzima y un sustrato de los mismos) que es capaz de la generación de peróxido de hidrógeno al inicio o durante el proceso de lavado y/o 0 enjuague. Tales sistemas enzimáticos se describen en la solicitud de patente Europea EP 0 537 381. Los agentes de blanqueado distintos a los agentes de blanqueado se conocen también en el arte y pueden utilizarse aquí . Un tipo de agente de blanqueado sin oxígeno de 5 particular interés incluye agentes de blanqueado fotoactivados tales como el zinc sulfonado y/o ftalocianuros de aluminio. Estos materiales pueden depositarse en el sustrato durante el proceso de lavado. Luego de la irradiación con luz, en presencia de oxígeno, como al colgar 0 las prendas para secarse a la luz del día, el ftalocianuro de - '·· zinc sulfonado se activa y, en consecuencia el sustrato se blanquea. El proceso de blanqueado fotoactivado y un ftalocianuro de zinc preferido se describe en la US 4,033,718. Típicamente, la composición detergente contendrá 5 aproximadamente 0.025% hasta aproximadamente 1.25% por peso de ftalocianuro de zinc sulfonado. Los agentes de blanqueado pueden comprender también un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede por ejemplo, ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalyst for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639. Supresores de la espuma: Otro ingrediente opcional es un supresor de la espuma, ejemplificados mediante silicones y mezclas de silice-silicones . Los silicones pueden estar representados generalmente por materiales polisiloxano alquilado, cuando el sílice se usa normalmente en formas divididas finamente ejemplificadas por xerogeles de sílice y xerogeles y sílices hidrofóbicos de varios tipos. Estos materiales pueden incorporarse como particulados en los cuales el supresor de la espuma se incorpora de forma que se libera ventajosamente en un portador impermeable al detergente sustancialmente no activo en la superficie, dispersable en agua o soluble en agua. Alternativamente el supresor de espuma puede disolverse o dispersarse en un portador líquido y aplicado mediante rocío en uno o más de otros componentes . ün agente que controla la espuma de silicona preferido se describe en la US 3,933,672. Otros supresores de espuma particularmente útiles son los supresores de espuma de silicona que se autoemulsifican descritos en la Solicitud de patente Alemana DTOs 2,646,126. On ejemplo de tal compuesto es DC-544, comercialmente disponible por Dow Corning, que es un copolimero siloxano-glicol . El agente que controla la espuma especialmente preferido es el sistema supresor que comprende una mezcla de aceites de silicona y 2-alquil-alcanoles. Los 2-alquil-alcanoles adecuados son los 2-butil-octanoles que se encuentran comercialmente disponibles bajo el nombre comercial Isofol 12R. Tal sistema supresor de espuma se describe en la solicitud de patente Europea EP 0 593 841. Los agentes que controlan la espuma de silicona especialmente preferidos se describen en la solicitud de patente Europea No. 92201649.8. Dichas composiciones pueden comprender una mezcla de silicona/silice en combinación con una sílice no porosa humeante tal como AerosilR. Los supresores de espuma descritos arriba se emplean normalmente en niveles de 0.001 % hasta 2% por peso de la composición, preferiblemente de 0.01% hasta 1% por peso. Otros componentes: Otros componentes usados en composiciones detergentes pueden emplearse tales como agentes que eliminan suciedad, agentes que liberan suciedad, blanqueadores ópticos, abrasivos, · bactericidas, inhibidores de manchas y/o perfumes encapsulado o no encapsulados. Los materiales encapsulados especialmente adecuados son cápsulas solubles en agua que consisten de una matriz de polisacáridos y compuesto polihidroxi tales como los descritos en la GB 1,464,616. Otros materiales solubles en agua adecuados comprenden dextrinas derivadas de ésteres de ácido de almidón no gelatinizado de ácidos dicarboxílicos sustituidos tales como los descritos en la US 3,455,838. Estas dextrinas ácido-éster se preparan preferiblemente a partir de almidones como maíz ceroso, sorgo ceroso, sago, tapioca y papa. Ejemplos adecuados de dichos materiales de encapsulación incluyen N-lok fabricado por National Starch. El material de encapsulación N-lok consiste de un almidón de maíz modificado y glucosa. El almidón se modifica añadiendo grupos sustituidos monofuncionalmente tales como anhídrido de ácido succínico octenilo. Los agentes de suspensión de suciedad y antiredeposición adecuados aquí incluyen derivados de celulosa tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa y ácidos policarboxílicos homo o co-poliméricos o sus sales. Los polímeros de este tipo incluyen los poliacrilatos y copolímeros de ácido anhídrido-acrílico mélico mencionados previamente como aditivos detergentes, así como copolímeros de anhídrido maleico con etileno, éter metilvinilo o ácido metacrílico, el anhídrido mélico que constituye al menos 20 por ciento en mol del copolímero. Estos materiales se usan normalmente en niveles de 0.5% hasta 10% en peso, más preferiblemente forman 0.75% a 8%, más preferiblemente de 1% a 6% por peso de la composición. Los blanqueadores ópticos preferidos son aniónicos en carácter, ejemplos de los cuales son disulfonato de disodio 4,4' -bis- (2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) stilbeno-2 : 2 ' , disulfonato de disodio 4, - 4' -bis- (2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) stilbeno-2 : 2 ' , disulfonato de disodio 4, 4' -bis- (2, 4~dianilino-s-triazin-6-ilamino) stilbeno-2 : 2' , monosodio 4 , 4 ' ' -bis- (2 , 4-dianilino-s-tri-azin-6-ilamino) stilbeno-2-sulfonato, disulfonato de disodio 4, 4' -bis- (2-anilino-4- (N-metil-N-2-hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) stilbeno-2, 2 ' , disulfonato de. di-sodio 4, ' -bis- (4-fenil-2, 1, 3-triazol-2-il ) -stilbeno-2 : 2 ' , disulfonato de disodio 4, 4'bis- (2-anilino-4- (l-metil-2-hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) stilbeno-2 : 2' , sulfonato de sodio 2 (stilbil-4" - (nafto-1' , 2' : 4, 5) -1, 2, 3, -triazol-2' ' -sulfonato y 4, 4' -bis (2-sulfostiril) bifenilo . Otros materiales poliméricos útiles son los glicoles de polietileno, particularmente aquellos de peso molecular 1000-10000, más particularmente 2000 a 8000 y más preferiblemente aproximadamente 4000. Estos se usan a niveles de 0.20% a 5%, más preferiblemente de 0.25% a 2.5% en peso. Estos polímeros y las sales de policarboxilato homo o copolimérico previamente mencionados son valiosos por mejorar el mantenimiento de la blancura, deposición de las cenizas en la tela y función de la limpieza de la arcilla, suciedad oxidable y de proteínas en presencia de las impurezas del metal de transición. Los agentes que liberan la suciedad útiles en las composiciones de la presente invención son convencionalmente copolímeros o terpolímeros de ácido tereftálico con etilenglicol y/o unidades de propilen glicol en varias configuraciones. Ejemplos de tales copolímeros se describen en la ÜS 4,116,885 y 4, 711, 730 y EP 0 272 033. Un polímero particular preferido de acuerdo con EP 0 272 033 tiene la fórmula : CH3 (PEG) 43) 0.75 (POH) 0.25 [T-PO]2.8 (T-PEG) 0.4] T (POH) 0.25 ( (PEG) 43CH3) 0.75 En donde PEG es -(OC2H4)0-, PO es (OC3H60) y T es (pOOC6H4CO) . También muy útiles son los poliésteres modificados como copolímeros aleatorios de tereftalato de dimetilo, sulfoisoftalato de dimetilo, etilen glicol y 1, 2-propanodiol, los grupos finales que consisten principalmente de sulfobenzoato y monoésteres secundarios de etilen glicol y/o 1, 2-propanodiol . El objetivo es obtener un polímero terminado en ambos extremos por grupos sulfobenzoato, "principalmente" en el presente contexto, la mayoría de dichos copolímeros aquí terminarán en sus extremos grupos sulfobenzoato . Sin embargo, algunos copolímeros de etilen glicol y/o 1,2-propanodiol, consistirán por lo tanto de tales especies "secundarias" . Los poliésteres seleccionados aqui contienen aproximadamente 46% en peso de ácido dimetil tereftálico, aproximadamente 16% en peso de 1 , 2-propanodiol , aproximadamente 10% en peso de etilen glicol, aproximadamente 13% en peso de ácido dimetil sulfobenzoico y aproximadamente 15% en pe,so de ácido sulfoisoftálico y tiene un peso molecular de aproximadamente 3.000. Los poliésteres y su método de preparación se describe en detalle en la EP 311 342. Agentes de ablandamiento: Los agentes de ablandamiento en la tela puede incorporarse también en las composiciones para detergentes de lavandería, de acuerdo con al presente invención. Estos agentes pueden ser orgánicos e inorgánicos en su tipo. Los agentes de ablandamiento inorgánico se ejemplifican mediante las arcillas de esmectita descritas en la GB-A-1 400898 y en la US 5,019,292. Los agentes de ablandamiento de telas orgánicos incluyen aminas terciarias insolubles en agua como se describe en la GB-A1 514 276 y la EP 0 011 340 y su combinación con sales de amonio ·.. cuaternarias mono Ci2-Ci4 se describe e la EP-B-0 026 528 y las amidas de cadena di larga descrita en la EP 0 242 919. Otros ingredientes orgánicos útiles de sistemas de ablandamiento de telas incluyen materiales de oxido de polietileno de peso molecular alto descritos en la EP 0 299 575 y 0 313 146. Los niveles de arcillas de esmectita se encuentran normalmente en el rango de 5% a 15%, más preferiblemente de 8% a 12% en peso con el material que se añade como un componente mezclado para el resto de la formulación. Los agentes de ablandamiento de la tela tales como las aminas terciarias insolubles en agua o materiales de amida de doble largo se incorporan en niveles de 0.5% a 5% en peso, normalmente de 1% a 3% en peso aunque los materiales de óxido de polietileno de peso molecular alto y los materiales catiónicos solubles en agua se añaden a niveles de 0.1% a 2%, normalmente de 0.15% a 1.5% en peso. Estos materiales se añaden normalmente para la porción secada por roció de la composición, a pesar de que en algunos ejemplos puede ser más conveniente añadirlos como un particulado mezclado seco, o rociarse como un liquido fundido a otros componentes de la composición. Agentes que inhiben la transferencia del tinte polimérico : Las composiciones detergentes de acuerdo a la presente invención pueden comprender también de 0.001% a 10%, preferiblemente de 0.01% a 2%, más preferiblemente forman 0.05% a 1% en peso de los agentes que inhiben la transferencia del tinte polimérico. Dichos agentes que inhiben la transferencia del tinte polimérico se incorporan normalmente en las composiciones detergentes para inhibir la transferencia de tintes de telas teñidas sobre telas lavadas con esto. Estos polímeros tienen la capacidad de formar complejos o absorber los tintes que se difuminan de telas teñidas lavadas antes de teñir, tienen la oportunidad de impregnarse a otros artículos durante el lavado. Los agentes que inhiben la transferencia del tinte polimérico especialmente adecuado son los polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinil-pirrolidona y N-vinilimidazol , polímeros de polivinilpirrolidona, poliviniloxazolidonas y polivinilimidaxoles o mezclas de los mismos . La adición de tales copolímeros también mejora el desempeño de las enzimas de acuerdo a la invención. La composición detergente de acuerdo a la invención puede ser un líquido, pasta, geles, barras o formas granulares . Los granulados que no se espolvorean pueden producirse por ejemplo, como se describe en al US 4,106,991 y 4,661,452 (ambas por Novo Industria A/S) y pueden opcionalmente ser revestidas mediante métodos conocidos en el arte. Ejemplos de materiales revestidos, con cera son productos poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000M; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contienen de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual existen de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos, mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales que revisten las formaciones de películas adecuados para la aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado se dan en la GB 1483591. Las composiciones granulares de acuerdo a la presente invención pueden ser también de "forma compacta", es decir, pueden tener una densidad relativamente más alta que los detergentes granulares convencionales, es decir, forman de 550 a 950 g/1; en tal caso, las composiciones detergentes granulares de acuerdo a la presente invención contendrán una cantidad reducida de una "sal rellena inorgánica" comparada a los detergentes granulares convencionales; las sales de relleno típicas son sales metálicas alcalino terreas de sulfatos y cloruros, típicamente sulfato de sodio; "El detergente "compacto" comprende típicamente no más de 10% de la sal de relleno. Las composiciones líquidas de acuerdo a la presente invención pueden ser en "forma concentrada", en tal caso, las composiciones detergentes líquidas de acuerdo a la presente invención contendrán una cantidad reducida de agua, comparada a los detergentes líquidos convencionales. Típicamente, el contenido de agua del detergente líquido concentrado tiene menos de 30%, más preferiblemente, menos de 20%, más preferiblemente menos de 10% en peso de las composiciones del detergente.

Las composiciones de la invención pueden por ejemplo, ser formuladas como composiciones para detergentes de lavandería para lavar con máquina o a mano, que incluyen composiciones aditivas para lavandería y composiciones adecuadas para usarse en el pretratamiento de telas teñidas, composiciones ablandadoras de enjuague para telas y composiciones para usarse en general para las operaciones de limpieza de superficies en casas y operaciones de lavado de trastes . Los siguientes ejemplos se mencionan para ejemplificar las composiciones por la presente invención, pero no necesariamente significa que se limite o defina de otro modo el alcance de la invención. En las composiciones para detergentes, las identificaciones del componente abreviado tienen los siguientes significados: LAS: sulfonato C12 alquil benceno lineal de sodio TAS: sulfato de alquilo de sebo de sodio XYAS: sulafato Cix - C1Y de sodio SS: tensoactivo de jabón secundario de la fórmula del ácido 2-butil octanoico 25EY: Un alcohol primario predominantemente lineal C12-C15 condensado con un promedio de moles Y de óxido de etileno . 45EY: Un alcohol primario predominantemente lineal C3.4-C15 condensado con un promedio de moles Y de óxido de etileno . XYEZS: ün sulfato de alquilo de sodio Clx - C1Y condensado con un promedio de Z moles de óxido de etileno por mol . No iónico: alcohol graso etoxilado/propoxilado C13-C15 mezclado con un grado promedio de 3.8 y un grado promedio de propoxilación de 4.5 vendido bajo el nombre comercial Plurafax LF404 por BASF GMBH. CFAA: alquilo C12 - Ci4 N-metil glucamida. TFAA: alquilo C16 - ¾ N-metil glucamida. silicato: Silicato sódico amorfo (proporción de Si02:Na20 = 2.0) NaSKS-ß: silicato estratificado cristalino de la fórmula 5-Na2Si205. carbonato: carbonato sódico anhidro fosfato: tripolifosfato de sodio ??/??: Copolimero de ácido 1:4 maleico/acrílico, promedio del peso molecular aproximadamente de 80,000 Poliacrilato : homopolimero de poliacrilato con un peso molecular promedio de 8,000 vendido bajo el nombre comercial PA30 por BASF GMBH. Zeolita A: Hidrato de sodio aluminosilicato de la fórmula Na12 (A102Si02) 12 - 27H20 que tiene un tamaño de partícula primaria en el rango de 1 a 10 micrometros.

Citrato: dihidrato de citrato de Tri-sodio. Cítrico: Ácido cítrico. Perborato: blanqueador monohidrato de perborato de sodio anhidro, fórmula empírica NaB02.H202 - PB : tetrahidrato perborato de sodio anhidro. percarbonato : blanqueador de percarbonato de sodio anhidro de la fórmula empírica 2Na2C03 . 3H202 - TAED: Tetraacetil etilen diamina CMC: celulosa carboximetil de sodio DETPMP: penta dietilen diamina (ácido fosfónico de metileno) , comercializado bajo el nombre comercial Dequest 2060. PVP: polímero de polivinilpirrolidona EDDS: ácido etilendiamina-N, N' -disuccinimida, [S,S] isómero en la forma de la sal de sodio. Supresor de espuma 25% de cera de parafina p.f. 50 °C, sílice hidrofóbica 17%, 58% , aceite de parafina Supresor de espumas granulares: 12% de silicona/sílice, 18% de alcohol de estearilo, 70% almidón en forma granular sulfato: sulfato de sodio anhidro. HMWPEO: óxido de polietileno de peso molecular alto TAE 25: alcohol de sebo etoxilado (25) Ejemplo I del detergente Una composición para limpiar telas de acuerdo con la invención puede prepararse como sigue: alquilo C12 lineal de sodio 6.5 sulfonato de benceno sulfato de sodio 15.0 zeolita A 26.0 nitrolotriacetato de sodio 5.0 enzima de la invención 0.1 PVP 0.5 TAED 3.0 ácido bórico 4.0 perborato 18.0 sulfonato de fenol 0.1 menores hasta Ejemplo II del detergente Una composición granular para la limpieza de telas (densidad de 800 g/1) de acuerdo con la invención puede prepararse como sigue: 4.5AS 8.0 25E3S 2.0 25E5 3.0 25E3 3.0 TFAA 2.5 Zeolita A 17.0 NaSKS- 12.0 ácido cítrico 3.0 carbonato 7.0 MA/AA 5.0 CMC 0.4 Enzima de la invención 0.1 TAED 6.0 percarbonato 22.0 EDDS 0.3 supresor de espuma granular 3.5 agua/menores hasta 100%.

Ejemplo III del detergente Las composiciones para la limpieza de telas granulares de acuerdo con la invención que son especialmente útiles en la lavandería de telas teñidas se preparan como sigue: LAS 10.7 TAS 2.4 TPAA — 4.0 45AS 3.1 10.0 45E7 4.0 25E3S - 3.0 68E11 1.8 25E5 - 8.0 citrato 15.0 7.0 carbonato - 10 ácido cítrico 2.5 3.0 zeolita A 32.1 25.0 Na-SKS-6 - 9.0 ??/?? 5.0 5.0 DETPMP 0.2 0.8 Enzima de la invención 0.10 0.05 silicato 2.5 sulfato 5.2 3.0 PVP 0.5 poli (4-vinilpiridina) -N- - 0.2 oxido/copolímero de vinil- imidazol y vinil pirrolidona perborato 1.0 fenol sulfato 0.2 agua/menores hasta 100% Ejemplo IV del detergente Las composiciones granulares para limpiar telas de acuerdo con la invención que proporcionan capacidad para "suavizar a través del lavado" pueden prepararse como sigue : 45AS - 10.0 LAS 7.6 68AS 1.3 45E7 4.0 25E3 - 5.0 cloruro de Coco-alquil-dimetil 1.4 1.0 hidroxi etil amonio citrato 5.0 3.0 Na-SKS-6 - 11.0 Zeolita A 15.0 15.0 ??/?? ' 4.0 4.0 DETPMP · 0.4 0.4 Perborato 15.0 Percarbonato - 15.0 TAED 5.0 5.0 Arcilla de esmectita 10.0 10.0 HMWPEO - ¦ 0.1 Enzima de la invención 0.10 0.05 Silicato . 3.0 5.0 Carbonato 10.0 10.0 Supresor de espuma granular 1.0 4.0 CMC 0.2 0.1 Agua/menores hasta 100%.

Ejemplo V del detergente La composiciones liquidas para limpiar telas con duty heaving de acuerdo con la invención pueden prepararse como sigue: - Ej emplo 1 : Medición de estabilida de pectato liasa en detergente líquido. La Medición de estabilidad de las variantes de pectato liasa de la presente invención se valoran midiendo la actividad de las variantes después de la incubación de una mezcla de una enzima del detergente que se describe abajo.

Ensayo de la actividad residual: 30 microlitros de una solución de enzimas (sobrenadante del cultivo o enzima purificada) se mezcla con 1 mi del detergente liquido de trabajo pesado US o Europea tipica en dos tubos de muestra. Uno de los tubos se deja en hielo mientras que el otro se incuba a 40 grados Celsius durante 90 minutos. Como referencia, se mezclan 30 microlitros con 1 mi del detergente y se incuban en hielo. Después de la incubación, 9 mi de agua enfriada en hielo se añaden a las muestras, las cuales se mezclan vigorosamente y se dejan en hielo hasta que se hace un análisis adicional; La actividad enzimática se mide primero mezclando 50 microlitros de una mezcla de enzima del detergente con 5 mi de una solución amortiguadora de 5 mi (100 mM Tris-HCl, 0.68 mM CaCl2, pH.8), en segundo lugar, a partir de la solución, 75 microlitros se mezclan con 75 microlitros de una solución del sustrato preparada recientemente (1% de ácido poligalacturónico en una solución amortiguadora de ensayo) y se incuba a 40 grados Celsius durante 10 minutos. Tercero, se añaden 100 microlitros de la mezcla de incubación en 100 micro litros de • ¦ solución amortiguadora de detención (50 mM H3PO4) en una placa de microtitulacion de UV transparente y la absorbancxa a 235 nm se mide en un espectofotómetro . La muestra de agua-detergente se usa como cero para el espectofotómetro . La actividad residual reciente se calcula como la actividad (A235 de absorbancia) en la muestra incubada a 40 grados Celsius durante 90 minutos en relación a la actividad en la muestra que permanece en hielo: Actividad residual (RA): absorbancia [muestra incubada a 40 grados Celsius ] /absorbancia [muestra incubada a 0 grados Celsius] x 100 Así, la actividad residual es equivalente para la estabilidad detergente de la enzima. La tabla 2 lista la actividad residual mejorada de una variedad de sustituciones de la pectato liasa de la SEC ID NO: 2 incubada en un detergente liquido de' trabajo pesado Europeo típico. La mayoría de las sustituciones proporcionan más del 50% de estabilidad detergente mejorada en comparación a la pectato liasa como se muestra en la SEC ID NO: 2. Las sustituciones equivalentes de la pectato liasa de la SEC ID NO: 2 listadas en la Tabla 3 mejoran significativamente la estabilidad de la enzima cuando se incuban en un detergente líquido de trabajo pesado US típico. Tabla 2: Las sustituciones en la pectato liasa de la SEC ID NO: 2 proporcionan una actividad residual mejorada después de la incubación en el detergente líquido europeo de trabajo pesado . actividad % de residual en % actividad Mutaciones de enzima residual precursora Pectato liasa de SEQ ID NO:2 (enzima precursora) 23 100 Q40E 28 122 F251 I 30 130.4 A332P 31 134.8 L106Q 31 134.8 272H 31 134.8 R272Y 31 134.8 A91E 33 143.5 K115B-K213E 33 143.5 K139I+K213N 33 143.5 H5R+K257N+S302A 34 147.8 K139M 34 147.8 K87A 34 147.8 D48P 35 152.2 K991+I196V 35 152.2 T105P 35 152.2 K115A+ 118A 36 156.5 K115A+ 118A+M122N 36 156.5 K115Q 36 156.5 K213T 36 156.5 V141E+C199S+K213E 36 156.5 K115I+Q146H 37 160.9 K257N 37 160.9 71E+K118E 38 165.2 S331P 38 165.2 T49P+N156S 38 165.2 K314N+S340P 39 169.6 V141E+I235V 39 169.6 G46D+ 257N 40 173.9 Q146H 40 173.9 218P 41 178 A305P 41 178 S28T+S30F+K334E+N363S 41 178 H193Y+S256C+V3891+A393V 42 183 R272C 42 183 D48E+L106Q+I140V+F215Y+K218E 42 183 D48P+T105P+K139N+K213N+K218P+T258N+A305P+S331 P 78 339 M64F+K139S+Q146H+S337C 78 339 M64F+ 122K+K118E+Q146H+K213T+K218L+A305P 79 343 K139Í+Q146H+K213N+S331 P+S337C 80 348 Q146H+V338E 81 352 K139I+Q146?+? 189D+S337R 81 352 M64F+K139H+Q146H+S337C 81 352 K1391+S337C+S340N 81,5 354 M64F+L106Q+K1.39I+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337C 82 357 N76D+K 39I+Q1 6I+S337C 82 357 M64F+K 39F+Q146V+S337C 82 357 M64F+ 139I+Q146H+Y308S+T335R+I336S+S337L+V338Y+ 82 357 F339I+S340A D48P+M64F+T105?+?139N+Q146H+K213?+?218?+?258?+ 83 361 A305P+S331P 64F+V123I+K139J+Q146H+S337C 84 365 M64F+M122?+? 18E+Q1 6?+?213?+?218L+A305P+S337C 84 365 K1391+Q146H+S256C 84 365 N37D+K139I+Q146H+ 213E+S307R+S337C 84 365 K139I+Q146H+S229T+S337C 84 365 M64F+K139S+Q146V+S337C 84 365 M64F+M122V+K139Q+Q146L+S337C+ 397D 84 365 M64F+K139I+Q146V+S337C 84 365 D48P+ 64F+K118?+?122K+Q146H+D170?+?213?+?218?+ 85 370 A305P+S331P L45V+K213N+K257N+S337C+T378G+H384N+S391N 85 370 M64F+M122?+?118E+Q146?+?213?+?218L+A305P+S340P 86 374 ?139I+V141 G+Q146H+V277D 86 374 M64F+K139L+Q146F+S337C 86 374 64F+K99I+T105P+ 122 +K118E+Q146H+K213N+K218P+ 86,5 376 A305P+S331P ?213?+?218P+A305P+D48P+T105?+?139I+T2581+S331 ? 87 378 D48P+M64F+T105P+K139N+Q146H+K213T+K218P+T258I+ 89 387 A305P+S331P M64F+ 1391+Q146H+S337C 90 391 D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+ 100 435 A305P+S331 +S337 +S340P D48P+ 64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+ 100 435 A305P+S331 P+ 334E+S337K+S340P Tabla 3. Sustituciones en el pectato liasa de la SEC ID 2 proporciona una actividad residual incrementada después de incubación en el detergente liquido para trabajo pesado US.

K386P 61 136 K218P 61 136 A332P 62 138 F251 I 64 142 A305P 64 142 D48P 64 142 S134L+K257E 66 147 M64F+K2 3T+K218L+A305P 73 162 S331P 75 167 M64F+ 122K+ 118E+K213T+ 218L+A305P 78 173 M64F+K1391+Q146H+S337C 91 202 M64F+V123I+K139I+Q146H+S337C 91 202 K139I+Q146H+S337C 100 222 Ejemplo 2: Estabilidad de las pectato liasas en el detergente liquido después de la incubación prolongada La estabilidad detergente de las variantes pectato liasa de la presente invención se valora midiendo la actividad de las variantes después de la incubación de una mezcla detergente enzima que se describe abajo. Ensayo de la actividad residual: 30 microlitros de una solución de al enzima (sobrenadante del cultivo o enzima purificada) se mezcla con 1 mi del tergente liquido de trabajo pesado europeo típico en dos tubos de muestra. Uno de los tubos se deja en hielo mientras que el otro se incuba a 40 grados Celsius durante 18 o 24 horas. Como referencia 30 microlitros de agua se mezclan con 1 mi de detergente y se incuban en hielo. Después de la incubación, 9 mi de agua enfriada en hielo se añade a las muestras, que se mezclan vigorosamente y se dejan en hielo hasta que se analizan adicional. La actividad enzimática se mide primero mezclando 50 microlitros de una mezcla de detergente de enzima con 5 mi de una solución amortiguadora de ensayo (100 M Tris-HCL, 0.68 mM CaCl2, pH.8), en segundo lugar, a partir de la solución, 75 microlitros se mezclan con 75 micro litros de una solución del sustrato preparada recientemente (1% de ácido poligalacturónico en una solución amortiguadora de ensayo) y se incuba a 40 grados Celsius durante 10 minutos. Tercero, se añaden 100 microlitros de la mezcla de incubación en 100 micro litros de solución amortiguadora de detención (50 mM H3PO4) en una placa de microtitulación de UV transparente y la absorbancia a 235 nm se mide en un espectofotómetro . La muestra de agua-detergente se usa como cero para el espectofotómetro . La actividad residual reciente se calcula como la actividad (A235 de absorbancia) en la muestra incubada a 40 grados Celsius durante 90 minutos en relación a la actividad en la muestra que permanece en hielo: Actividad residual (RA) : alsorbancia [muestra incubada a 40 grados Celsius] /absorbancia [muestra incubada a 0 grados Celsius] x 100 Asi, la actividad residual es equivalente para la estabilidad detergente de la enzima. La tabla 4 lista la actividad residual mejorada de una variedad de sustituciones de la pectato liasa de la SEC ID NO: 2 incubada en un detergente liquido de trabajo pesado Europeo tipico durante 18. De igual manera, la tabla 5 lista la actividad residual de las variantes pectato liasas incubadas durante 24 horas.

Tabla 4: Las sustituciones en la pectato liasa de la SEC ID NO: 2 proporcionan una actividad residual mejorada después de la incubación en el detergente liquido europeo de trabajo pesado durante 18 horas. % de Mutaciones actividad residual . 3ectato liasa de SEQIDNO:2 (enzima precursora) <5% 139I+Q146H+S337C 22 D48P+ 64F+K139I+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337C 53 D48P+ 64F+T105P+M122K+K118E+K213T+K218P+A305P+S331 P 41 M64F+M122K+K118E+Q146H+ 213T+K218L+A305P+S340P 38 D48P+M64F+T105P+ 139I+Q146H+K213T+ 218P+T258I+A305P+S331 37 D48P+ 64F+K991+ 118E+M122K+Q146H+K213N+K218P+A305P+S331 P 24 D48P+T105P+ 139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 23 D48P+ 64F+K1391+Q1 6H+K213T+ 218L+A305P+S337K 56 D48P+ 64F+K139I+Q146H+K213T+ 218L+A305P+S337R 46 64F+ 122K+K118E+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337K 49 64F+ 122K+K118E+Q146H+K213T+K218L+A305P+S337R 59 D48P+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P+S337K 60 D48P+T105P+K139N+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P+S337R 57 D48P+M64F+T105P+ 139N+Q14BH+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P 32 D48P+ 991+T105P+ 139N+K213T+ 218P+T258I+A305P+S331 P 44 D48P+ 54F+L106Q+K139I+Q146H+K213T+K218L+Y234H+A305P+S331P+ 52 S337C D48P+MS4F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T2581+A305P+S331P+ 80 S337R D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+ 64 S340P D48P+ 64F+T105P+K139N+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P 30 D48P+M64F+T105P+K139I+Q1 6H+ 189D+K213T+K218P+T258I+A305P+ 80 S331P+S337R D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P 32 Tabla 5. Las sustituciones en la pectato liasa de la SEC ID NO: 2 proporcionan una actividad residual mejorada después de la incubación en el detergente liquido europeo de trabajo pesado durante 24 horas. % de Mutaciones actividad residual 3ectato liasa de SEQIDNO:2 (enzima precursora) <5 D48P+M64F+T105P+ 139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P+ 67 S337 D48P+M64F+T105P+K1391+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+ 85 S337K+S340P D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+N189D+K213T+K218P+T258I+S298N 77 +A305P+S331 P+S337R D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+ 148E+K213T+K218P+T2581+A305P+ 77 S331P+S337R D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T2581+A305P+S331P+ 60 334E+S340P D48P+ 64F+T105P+K1391+Q146H+ 213T+K218P+T258I+A305P+S331P+ 90 K334E+S337K+S340P D48P+M64F+T105P+K139M+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P÷S337K 69 D48P+ 64F+T105P+K139N+ 213T+K218P+T258I+A305P+S331 P+S337R 63 D48P+M64F+T105P+K139I+Q14BH+K213T+K218P+T258I+A305P+S331 P+ 80 S337 D48P+M64F+T105P+K139I+Q148H+K148Q+K213T+K218P+T258I+A305P 83 +S331P+S337K D48P+M64F+T105P+K139I+V141E+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+ 88 S331P+S337K D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+C199S+K213T+K218P+T258I+A305P 82 +S331P+S337K D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+ 218P+T258I+Y295H+A305P 84 +S331P+S337K D48P+M64F+T105P+ 139I+Q146H+ 213T+K218P+T2581+A305P+S331P+ 86 334E+S337K D48P+M64F+K99R+T105P+ 139I+Q146H+K213T+ 218P+T258I+A305P+ 82 S331P+S337K Ejemplo 3. DSC' en variantes de pectato liasa tipo silvestre La estabilidad térmica de las variantes de pectato liasa de la invención se miden con calorimetría de barrido diferencial (DSC) . Los experimentos se llevaron a cabo en un amortiguador (lo opuesto al detergente). Las muestras de enzima purificada se dializaron dos veces contra 5 L de 20 mM, amortiguador HEPES, CaCl2 0.68 mM, pH 8.0 en Slide-A-Lyzers de corte de 10 kDa (Pierce, USA) y se concentró aproximadamente 10 g/ml por 2,400 g de centrifugación en una Biofuge Stratos (Kendro, Alemania) en células Centricon YM 10 kDa (Amicon) . La DSC se corrió en MCS 4100 (Calorimetry Sciences Corporation, USA) con un gradiente l°C/minuto de 5 a 110°C y los datos analizados mediante un software Cp.Calc.2.1 (Applied Thermodynamxcs, USA).

Tabla 6. Temperaturas de transición (Tt) para las enzimas de pectato liasa probadas Se nota que todas las variantes se estabilizan térmicamente comparadas para la precursora. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Una variante de una enzima precursora que tiene actividad de pectato liasa (EC 4.2.2.2), la variante tiene estabilidad detergente mejorada comparada a la enzima precursora, y cuya variante comprende una alteración en una o más posiciones seleccionada del grupo que consiste de las posiciones número: 5, 9, 11, 26, 28, 30, 31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91, .99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 193, 194, 196, 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 393 y 397 caracterizada porque las alteraciones son .independientemente (i) una inserción de un aminoácido en la dirección descendente del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una eliminación del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, y en donde cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2, en donde la enzima precursora es la pectato liasa mostrada en la SEC ID NO: 2 o una pectato liasa que tiene al menos 65% de identidad para la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. 2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las alteraciones son sustituciones. 3. La variante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de: H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, 47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69 *, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P , L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V1231, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202 , G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A2281, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, 1336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, 1357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S3 87A, V3É 391, 1390N, I390T, S391N, A393V y K397D, y en donde cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2. 4. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pectato liasa precursora tiene una secuencia de aminoácido que tiene un grado de identidad para la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 de al menos aproximadamente 70%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, más aun preferiblemente al menos de aproximadamente 95% y más preferiblemente al menos #. aproximadamente de 97%. 5. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pectato liasa precursora se codifica mediante un polinucleótido que hibridiza bajo un condiciones de severidad medias, más preferiblemente bajo condiciones de severidad altas con el polinucleótido de la SEC ID N0:1 o su hebra complementaria. 6. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque las alteraciones se introducen mediante mutagénesis dirigida en el sitio o aleatoriamente o por mezclado de una o más secuencias de ADN que codifican a las pectato liasas que tienen al menos 65% de identidad para la SEC ID NO: 2. 7. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pectato liasa es una pectato liasa de tipo silvestre. 8. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pectato liasa precursora es una pectato liasa de Bacillus . 9. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pectato liasa se codifica por un polinucleótido presente en el plásmido de la cepa Bacillus subtills DSM 14218. 10. La variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el número total de alteraciones es trece, preferiblemente doce, más preferiblemente once, aún más preferiblemente diez, aún más preferiblemente nueve, aún más preferiblemente ocho, aún más preferiblemente siete, aún más preferiblemente seis, aún más preferiblemente cinco, aún más preferiblemente cuatro, aún más preferiblemente tres, aún más preferiblemente dos, y todavía más preferiblemente uno. 11. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica la variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes. 12. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11. 13. Una célula hospedadora microbiana, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 12. 14. La célula hospedadora microbiana de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la célula es una bacteria, preferiblemente un bacilo, más preferiblemente un Bacillus subtillis . 15. La célula hospedadora microbiana de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la célula es un hongo o levadura, preferiblemente un hongo filamentoso, más preferiblemente un Aspergillus. 16. Un método para producir una variante de pectato liasa, ¦ de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la célula hospedadora microbiana de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13-15, se cultiva bajo condiciones conductivas para la expresión y secreción de la variante, y en donde la variante se recupera. 17. Un método para mejorar la estabilidad del detergente de una pectato liasa, caracterizado porque comprende alterar una o más posiciones seleccionadas del 5 grupo que consiste de las posiciones número: 5, 9, 11, 26, 28, 30, '31, 37, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 61, 64, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 79, 86, 87, 91, 99, 105, 106, 107, 111, 115, 116, 118, 122, 123, 134, 136, 139, 140, 141, 146, 148, 156, 158, 170, 182, 185, 186, 189, 10- 193, 194, 196, 199, 201, 202, 204, 213, 215, 218, 224, 228, 229, 234, 235, 237, 251, 256, 257, 258, 272, 277, 286, 295, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 314, 316, 323, 324, 326, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 349, 356, 357, 363, 366, 378, 381, 384, 386, 387, 389, 390, 391, 15 393 y 397, en donde las alteraciones son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en la dirección descendente del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una eliminación del aminoácido que ocupa la posición, o 20 (iü) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, y en donde cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2, en donde la enzima 25 precursora es la pectato liasa mostrada en la SEC ID NO: 2 o una pectato liasa que tiene al menos 65% de identidad para 1 secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17 caracterizado porque las alteraciones son substituciones. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de: H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52 , K54V, T61A, M64F, D68*, N69 *, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V1231, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A2281, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, . R272C, R272H, R272Y, V277Dr G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, 1336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, 1357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, 386R, S387A, V3891, 1390N, I390T, S391N, A393V y K397D, y en donde cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la pectato liasa tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2. 20. Una composición limpiadora o detergente, preferiblemente .una composición de lavandería o lavaplatos, caracterizada porque comprende la variante como se define en cualesquiera de las reivindicaciones 1-10 y comprende además un tensoactivo. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque comprende adicionalmente una celulasa, una lipasa, una cutinasa, una óxidoreductasa, una proteasa, una amilasa, una hemicelulasa, tal como una mananasa, una xilanasa, una galactanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa, una liquenasa, una arabinanasa, otra pectato liasa o una mezcla de las mismas. 22. El uso de una pectato liasa variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-10 en una composición detergente, preferiblemente un detergente de lavandería y/o lavaplatos. 23. El uso de una pectato liasa variante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-10 en el procesamiento de fibra textil y celulósica. 24. Un método enzimático de lavado con detergente, caracterizado porque comprende poner en contacto el material de pared celular con la variante de pectato liasa definida en cualesquiera de las reivindicaciones 1-10. 25. Un método para la remoción enzimática del material de pared celular de un textil, caracterizado porque comprende poner en contacto el textil con la variante de pectato liasa definida en cualesquiera de las reivindicaciones 1-10. 26. Una variante de una enzima precursora que tiene actividad de pectato liasa (EC 4.2.2.2), caracterizada porque la variante tiene una estabilidad al detergente mejorada en comparación con la enzima precursora, y en donde la carga general de la enzima se hace más negativa. 27. Una variante de una enzima precursora que tiene actividad de pectato liasa (EC 4.2.2.2), caracterizada porque la variante tiene una estabilidad al detergente mejorada en comparación con la enzima precursora, y en la cual los residuos de aminoácido inestables de la oxidación de la variante se han reemplazado. 28. Una variante de una enzima precursora que tiene actividad de pectato liasa (EC 4.2.2.2), caracterizada porque la variante tiene una estabilidad al detergente mejorada en comparación con la enzima precursora, y en la cual los residuos de aminoácido más flexibles variantes se han reemplazado con residuos de aminoácido menos flexibles. 29. Una variante de una enzima precursora que tiene actividad de pectato liasa (EC 4.2.2.2), caracterizada porque la variante tiene una estabilidad al detergente mejorada en comparación con la enzima precursora, y cuya variante tiene una estabilidad a la eliminación de calcio mejorada.