TR201809053T4 - Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları. - Google Patents
Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201809053T4 TR201809053T4 TR2018/09053T TR201809053T TR201809053T4 TR 201809053 T4 TR201809053 T4 TR 201809053T4 TR 2018/09053 T TR2018/09053 T TR 2018/09053T TR 201809053 T TR201809053 T TR 201809053T TR 201809053 T4 TR201809053 T4 TR 201809053T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- polypeptide
- isolated
- sequences
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 59
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 51
- 241001495426 Macrophomina phaseolina Species 0.000 title abstract description 33
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 title abstract description 30
- 239000001814 pectin Substances 0.000 title abstract description 28
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 title abstract description 28
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 67
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 64
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 claims description 20
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N alpha-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 claims description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 241001175996 Modiolula phaseolina Species 0.000 claims 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 10
- 239000004753 textile Substances 0.000 abstract description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 47
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 20
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 19
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- 240000008564 Boehmeria nivea Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 2
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000758405 Zoopagomycotina Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000012232 AGPC extraction Methods 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001136561 Allomyces Species 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101000709143 Aspergillus aculeatus Rhamnogalacturonate lyase A Proteins 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101000765308 Aspergillus niger N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000235432 Blastocladiella Species 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000233652 Chytridiomycota Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001279801 Coelomomyces Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004792 Corchorus capsularis Species 0.000 description 1
- 244000044849 Crotalaria juncea Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N D-Galacturonic acid Natural products O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N N-Ethyl-N-nitrosourea Chemical compound CCN(N=O)C(N)=O FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 101000728666 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) Putative rhamnogalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 241000221535 Pucciniales Species 0.000 description 1
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100348089 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) BUR6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 240000004308 marijuana Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108091022901 polysaccharide lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000020244 polysaccharide lyase Human genes 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 108010070456 protopectinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000013022 regulation of pectin catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013042 solid detergent Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 238000011514 vinification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01011—Pectinesterase (3.1.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01171—Rhamnogalacturonan hydrolase (3.2.1.171), i.e. rhamnogalacturonase
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
- C12Y402/02002—Pectate lyase (4.2.2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
- C12Y402/02023—Rhamnogalacturonan endolyase (4.2.2.23)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, Macrophomina phaseolina ("M. phaseolina") fungusundan türetilen, pektini parçalamadan sorumlu olan enzimleri şifreleyen izole edilmiş polinükleotidi açıklar ve bu, SEQ. ID NO.'ları: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 ve 61'de izah edilen nükleotid dizilerini veya bu dizilerin komplemanını içerir ve/veya bunlardan oluşur. Mevcut buluş ayrıca, SEQ ID NO'.ları: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 ve 63'te izah edilen polinükleotid dizileri tarafından şifrelenen izole edilmiş polipeptit; polinükleotidi içeren bir rekombinant gen yapısı; pektin parçalama enziminin arttırılmış üretimi ile veya pektin parçalama enziminin arttırılmış üretimine sahip olan, rekombinant gen yapısını içeren bir transformant ve bir transgenik fungus ile de ilgilidir. Buluşun polipeptidi, diğer şeyler arasında, üretilmiş meyve suları, tekstil ürünleri, kâğıt hamuru ve kâğıt, kahve, çay ve sıvı yağ ekstraksiyonu ve pektik atık su muamelesi, için kullanılabilir.
Description
TARIFNAME
MACROPHOMINA PHASEOLINA'DAN ELDE EDILEN PEKTIN
PARÇALAMA ENZIMLERI VE BUNLARIN KULLANIMLARI
BULUSUN ALANI
Mevcut bulus, pektat liyazi aktivitesine sahip olan M. phaseolina'dan izole edilmis
polipeptitler ve polipeptitleri sifreleyen izole edilmis polinükleotidler ve bu
polinükleotidleri ve polipeptitleri yapmak ve kullanmak için yöntemler ile
ilgilidir. Bulus ayrica, polinükleotidleri içeren nükleik asit yapilari, vektörler ve
konak hücreler ayni zamanda polipeptitleri üretmek ve kullanmak için yöntemler
ile de ilgilidir. Bulusun polipeptitleri, diger seyler arasinda, lifin ve kumaslarin
havuzlanmasi ve zamklanmasi için tekstil endüstrisinde; meyve ve sebze suyunun
ekstraksiyonu için gida endüstrisinde; iyi kalitede kâgidin üretilmesi için kâgit
endüstrisinde ve ayrica kahvenin ve çayin fermentasyonu, sivi yag ekstraksiyonu
ve pektik atik su muamelesi için, kullanilabilir.
BULUSUN ALT-YAPISI
Pektin, primer bitki-hücresi duvarinin orta lamelinde bulunan kompleks
heteropolimerlerin bir grubudur ve inter-selüler dolgu olarak etki eder. Bunlar
ayrica, bunlarin kolloidal dogasindan dolayi bitkilerin su-regülasyonunda önemli
bir fonksiyona da sahiptir. Hücre duvarlari arasinda konumlandirilan orta lameller
agirlikli olarak, protopektinden (pektinin bir çözünemeyen formundan) insa edilir.
Pektin iki farkli belirli bölgeden olusur: "düz" ve "saçakli" bölgeler. "Düz" bölge,
metanol ile esterlenmis karboksil gruplarinin bazilari ile bir poligalaktoüronik asit
olusturan, 0t-l,4-bagli D-galaktüronik asidin bir omurgasindan olusur (Rouse A.
Pectin: distribution, signiücance. In: Nagy S, Shaw P, Veldhuis Meds. Citrus
Science and Technology, Vol 1. Westport CT: AVI publishing Inc. 1977).
01 678-P-0004
tarafindan bölünür.
Pektin/pektat liyazlari, düz bölgede pektini depolimerize eder, bu 4,5-d0ymamis
indirgememe ucu olan oligomerler üretmek için ß-eliminasyonu vasitasiyla
glikosidik baglari yarar (Lombard V, Bernard T, Rancurel C, Brumer H, Coutinho
PM, Henrissat B. A hierarchical classifîcation of polysaccharide lyases for
pektinin saçakli bölgeleri içinde yarar (Jensen MH, Otten H, Christensen U,
Borchert TV, Christensen LL, Larsen S, Leggio LL. Structural and biochemical
studies elucidate the mechanism of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus
Pektin esteraz, pektini metanole ve poligalaktüronik aside hidrolize eder. Bu
enzim, Aspergi'llus türünü, Botrytis cinerea, Fusari'um monilforme, Rhizopus
stoloni'ßar, Trichoderma türünü, vb. içeren birkaç fungus tarafindan üretilebilir
(Polizeli ML, Jorge JA, Terenzi HF. Pectinase production by Neurospora crassa:
purification and biochemical Characterization of extracellular polygalacturonase
esterazinin ticari üretimi için majör kaynaktir (Torres EF, Aguilar C, Esquivel
JCC, Gonzales GV. Pectinase. In: Enzyme Technology, Pandey, A., Webb, C.,
Soccol, C.R., Larroche, C (Eds), Asiatech Publishiers Inc., New Delhi, India,
Pektin-parçalama enzimleri, gida endüstrisinde, primer olarak meyve ve bitki
isleme, örnegin, meyve suyu üretimi veya sarap yapimi, için, önemli araçlardir.
Uygulamalarin diger alanlari, kâgit hamuru ve kâgit endüstrisini (Reid l, Ricard
M. Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps
hayvan yemini (Barreto de Menezes TJ, Salva JG, Baldini VL, Papini RS, Sales
AM. Protein enrichment of citrus wastes by solid substrate fermentation. Proc.
01 678-P-0004
(Hoondal GS, Tiwari RP, Tiwari R, Dahiya N, Beg QK. Microbial alkaline
pectinases and their applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol.
Elsevier Sci. Ltd. ppzl33-154), sivi yag ekstraksiyonunu (Scott D. Enzymes,
industrial. In: Encyclopedia of Chemical Technology. Grayson M, Ekarth D and
temizlenmesini (Singh R, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A
(Kapoor M, Beg QK, Bhushan B, Singh K, Dadich KS, Hoondal GS. Application
of alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp. MGcp-2 in
degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sunn hemp (Crotolaria juncia) bast
Chemical technology in the pretreatment processes of textiles. In: Textile science
and technology serieslst ed., Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1999; p. 12) ve
atik yönetimini (Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R. Applications of
içerir. WO 98/45393, çamurlu zeminlemeye karsi göze çarpan temizleme gücü
olan protopektinaz içeren deterjan bilesimlerini açiklar.
Bu enzimler endüstride münferit olarak veya bir kokteyl (karisim) formunda
kullanilir. Örnegin, gida endüstrisinde, bu, münferit enzim, örnegin, peltelesme
için gerekli olan pektin esterazi, ayni zamanda farkli enzimlerin kombinasyonu,
örnegin, bitki materyalinin sivilastirilmasi için gerekli olan poligalaktüronaz ile
pektin esterazi, olarak kullanilir (Heldt-Hansen HP, Kofod LV, Budolfsen G,
Nielsen PM, Hüttel S, Bladt T. Application of tailor made pectinases. ln: Visser J
and Voragen AJG (eds), Pectin and Peactnases. Progress in Biotechnology.
01 678-P-0004
Aspergi'llus niger'den elde edilen bu enzimlerin bir kaçinin klonlanmasi ve
ekspresyonu bildirilmistir. EP 0 278 355, pektin liyazi geninin klonlanmasini,
bunun dizisini ve ekspresyonunu tarif eder. EP 0 353 188, bazi diger pektin
liyazlarini ekler. EO 0 421 919, iki poligalaktüronazi açiklar ve bir baska endo-
poligalaktüronaz EP 0 388 593'te açiklanmistir. Bu patent basvurularinin ikisi,
genin kaynagi olarak Aspergi'llus niger'i kullanmistir. WO 94/ 14952, Aspergillus
aculeatus'tan elde edilebilen endo-poligalaktüronaz aktivitesi olan üç enzimi tarif
eder. Bununla birlikte, M. phaseoli'na'dan elde edilen pektin parçalama
enzimlerini sifreleyen genlerin klonlanmasi konusunda bildirilmis yayin yoktur.
Mevcut bulus, diger seyler arasinda, endüstriyel proseslerde veya amaçlarda
kullanilabilen, M. phaseolina'dan türetilen pektin parçalama enzimlerinin
genlerini ve bunlann sifrelenniis proteinlerini açiklamak amaciyla bir genomik
yaklasimi alir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI
Diger seyler arasinda, mevcut bulus, M phaseoli'na'dan türetilebilen pektin
parçalama enzimleri ile ilgilidir. Mevcut açiklama ayrica, pektinin
parçalanmasinda M phaseoli'na fungusunun kullanimi ile de ilgilidir.
Mevcut bulusun primer amaci, pektat liyazini sifreleyen nükleotid dizilerinin
kümelerini (M. phaseolina fungusunun SEQ ID NO.'1ar1: 1'i ve 2'yi) açiklamaktir.
Bulusun her bir geni için, bir açik okuma çerçevesi (ORF) dizisi, tahmin edilen
intron dizilerini silme ve ekzon dizilerinin birbirine uçlarini-birlestirme ile ilgili
genomik diziden manüel olarak türetilmistir. Enzim genlerini içeren vektörler,
ekspresyon vektörleri ve konak hücreler de dâhil edilir.
Ilaveten, bulus genlerin ORF dizilerinden çikarim yapilan polipeptit dizilerini
saglar. Bulusun polipeptit dizileri, pektat liyazininkilere (SEQ ID NO: 3) karsilik
gelir. Mevcut bulus ayrica, yukarida tarif edilen nükleotid dizilerinin
komplemanini içeren bir izole edilmis polinükleotid ile de ilgilidir.
01 678-P-0004
Mevcut bulusun bir baska amaci, degerli endüstriyel ürünlerin üretimi amaciyla
pektin parçalanmasinin regülasyonu, dönüsümü için faydalamlacak/yararlanilacak
olan primer amaçta izah edilen genlerin ve enzimlerin moleküler biyolojisini ve
Dahasi, mevcut bulusun amaci, pektin parçalama polipeptidinin in vitro üretimini
kolaylastirmaktir ve mevcut bulus ayrica, SEQ ID NO: 3'te izah edildigi üzere en
az %80 sirali amino asit içeren polipeptidi eksprese edebilen bir ekspresyon yapisi
da içerir. Tercihen, ekspresyon yapisi, SEQ ID NO: 2'de izah edildigi üzere sirali
nükleotid içeren DNA'yi veya cDNA'yi içeri yerlestirmistir.
Mevcut bulusun bir baska amaci, SEQ ID NO: 2'de izah edilen nükleotid dizisine
sahip olan bir polinükleotid sablonu içeren bir rekombinant gen yapisini açiklar,
burada polinükleotid sablonu, pektini parçalayan bir enzimi üretmek için bir
konak hücre içinde eksprese edilebilir. Tercihen, rekombinant gen yapisi ilaveten,
polinükleotid sablonunun ekspresyonunu arttirmak için operatif olarak bagli bir
promotör bölgesi içerir.
Mevcut bulusun tercih edilen uygulamalarinin biri, bir enfekte olmus Hint
keneviri bitkisinden izole edilen M. phaseoli'na'nin msö susudur. Izole edilmis
polipeptit ayrica tercihen bu sustan da türetilir.
Ilaveten, mevcut açiklamanin amaci, diger seyler arasinda, meyve suyunun
üretilmesi, tekstil ürünleri, kâgit hamuru ve kâgit, kahve, çay ve sivi yag
ekstraksiyonu, için artan küresel talep ile basa çikmak amaciyla M. phaseolina'dan
pektin parçalama enzimini izole etmek için bir potansiyel ticari olarak
Açiklamanin ilave amaci, hayvan yemlerinin islenmesinde, ineyve suyunda,
tekstil ürünlerinde, kâgit hamurunda ve kâgitta, kahvede, çayda ve sivi yag
01 678-P-0004
ekstraksiyonunda, sak liflerinin havuzlanmasinda/zamklanmasinda pektin
parçalama maddelerinden yararlanmaya yöneliktir.
Bu yararliliklarin herhangi biri veya tümü, endüstriyel ve diger kullanimlar için
arastirma ürünleri olarak veya malzemeler olarak ticarilestirme için bir kit hâlinde
gelistirilebilmektedir. Kitler, bulusun bir veya birden fazla M. phaseolina genine
karsilik gelen polinükleotidleri ve/veya polipeptitleri, antikorlari ve/veya baska
reaktitleri içerebilir.
Bir birinci yönünde, bulus, SEQ ID NO: 1'de veya 2'de izah edilen nükleotid
dizisine veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuna veya bunlarin komplemanina
en az %80 özdes olan bir izole edilmis polinükleotid dizisi saglar, burada söz
konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler.
Bir ikinci yönünde, bulus orta-sertlikteki kosullar altinda SEQ ID NO: 1'de veya
2'de izah edilen bir nükleotid dizisini veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu
veya bunlarin komplemanini içeren bir izole edilmis polinükleotid dizisine
hibridize olan bir izole edilmis nükleik asit probu saglar, burada söz konusu
polinükleotid bir pektat liyazini sifreler ve burada söz konusu orta-sertlikteki
kosullar, filtreye-bagli DNA'ya 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) içinde
yaklasik 45°C'de hibridizasyonu, akabinde yaklasik 50 ila yaklasik 65°C'de
0,2xSSC/%O,1 SDS içinde bir veya birden fazla yikamayi içerir.
Bir üçüncü yönünde, bulus birinci yönün, bir heterolog proteini veya peptidi
sifreleyen bir kodlama dizisi içindeki durdurma kodonu ile kesintiye-ugratilmamis
izole edilmis polinükleotid dizisini içeren bir nükleik molekül saglar.
Bir dördüncü yönünde, bu bulus birinci yönün izole edilmis polinükleotid dizisini
içeren bir rekombinant vektör saglar.
01 678-P-0004
Bir besinci yönünde, bulus birinci yönün izole edilmis polinükleotid dizisini
içeren bir ekspresyon yapisi saglar, burada polinükleotid dizisi bir konak hücre
içinde nükleotid dizisinin ekspresyonunu kontrol eden transkripsiyonel veya
translasyonel regülatör sinyallerini veya her ikisini içeren bir regülatör nükleotid
dizisi ile operatif olarak iliskilendirilir.
Bulusun bir altinci yönü, birinci yönün izole edilmis polinükleotid dizisini içeren
bir genetik olarak mühendislik uygulanmis konak hücre saglar.
Bulusun bir yedinci yönü, polipeptit yapmanin asagidaki adimlari içeren bir
yöntemini saglar:
i. besinci yönün bir ekspresyon yapisi ile transforme edilmis bir hücreyi
polipeptidi üretmek için etkili olan kosullar altinda kültürleme ve
ii. polipeptidi izole etme.
Bulusun bir sekizinci yönü, SEQ ID NO: 3'te izah edilen bir amino asit dizisine
veya bunun herhangi bir kombinasyonuna en aZ %80 özdes olan ve pektat
liyazinin katalitik aktivitesini gösteren bir amino asit dizisini içeren bir izole
edilmis polipeptit saglar.
Bulusun bir dokuzuncu yönü, bir ikinci polipeptidin bir amino asit dizisine bir
kovalent bag vasitasiyla kaynastirilmis sekizinci yönün bir polipeptidini içeren bir
kimerik protein saglar.
Bulusun bir onuncu yönü, besinci yönün ekspresyon yapisini içeren bir konak
hücre saglar.
Bulusun bir on birinci yönü, besinci yönün ekspresyon yapisini içeren, M.
phaseoli'na'nin bir transgenik fungusunu saglar.
01 678-P-0004
Teknikte uzmanligi olan bir kisi, mevcut bulusun, amaçlari yerine getirmek ve
bahsedilen sonlari ve avantajlari ayni zamanda bunlarin içinde olanlari elde etmek
için iyi uyarlandigini kolaylikla anlayacaktir. Burada tarif edilen uygulamalar
bulusun kapsami üzerinde sinirlandirmalar veya kisitlama olarak amaçlanmaz.
Mevcut bulusun bu ve diger özellikleri, yönleri ve avantajlari, asagidaki
açiklamaya ve istemlere atfen daha iyi anlasilir hâle gelecektir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Spesifikasyona dâhil edilen ve spesifikasyonun bir parçasini olusturan eslik-eden
sekiller, mevcut bulusun uygulamalarini ve baska açiklamalari gösterir ve
tarifname ile birlikte, bulusun prensiplerini açiklama görevi görür.
Sekil 1, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 1'in pektat
liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M, DNA moleküler agirlik
merdivenidir.
Sekil 2, PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 4'ün
açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
Sekil 3, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 7'nin
açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
Sekil 4, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ 1D NO: lO'un
açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
Sekil 5, PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
01 678-P-0004
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: l3'ün
açiklamasinin pektat liyazinln polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ ID NO: 16'nin
açiklamasinin pektat liyazinln polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 19'un
açiklamasinin pektat liyazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 22'nin
açiklamasinin pektat liyazinln polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 28'in
açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: 31'in
açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: 34'ün
açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenldlr.
PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ ID NO: 37'nin
açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
01 678-P-0004
PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ lD NO: 40'in
açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun l, SEQ 1D NO: 43'ün
açiklamasinin pektat liyazi C'nin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 46'n1n
açiklamasinin pektinesterazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 49'un
açiklamasinin pektinesterazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR ampliflkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 55'in
açiklamasinin pektinesterazinin polinükleotidleridir ve sütun M,
DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifîkasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 58'in
açiklamasinin ramnogalaktüronazinln polinükleotidleridir ve
sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.
PCR amplifikasyonu sonucunu gösteren elektroforez uygulanmis
agaroz jel görüntüsüdür, burada sütun 1, SEQ ID NO: 61'in
açiklamasinin ramnogalaktüronazinln polinükleotidleridir ve
sütun M, DNA moleküler agirlik merdivenidir.
BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI
01 678-P-0004
Burada saglanan tanimlar ve/veya yöntemler mevcut bulusu tanimlar ve teknikte
normal uzmanligi olan kisilere mevcut bulusun pratiginde kilavuzluk eder.
Aksinin ifade edildigi yerler disinda, terimler ilgili teknikte normal uzmanligi olan
kisiler tarafindan geleneksel kullanima göre anlasilacaktir. Tanimlarin ve/veya
yöntemlerin herhangi birinin baska bir yerde bulunan herhangi bir referansta
saglanan tanimlarin ve/veya yöntemlerin herhangi biri ile tutarsiz oldugunun
bulunmasi ölçüsünde, bu basvuruda açik bir sekilde saglanan/uyarlanan söz
konusu tanimin ve/veya yöntemin burada kullanilacagi anlasilir. "Bir", "biri" veya
göndergeleri içerir. Benzer sekilde, "veya" sözcügünün, baglam açik bir sekilde
aksini göstermedikçe "ve" sözcügünü içermesi amaçlanir. Bundan dolayi, "A'yi
veya B'yi içeren", A'yi veya B'yi veya A'yi ve B'yi içerdigi anlamina gelir.
Nükleik asitler veya polipeptitler için verilen tüm baz boyutlarinin veya amino
asit boyutlarinin ve tüm moleküler agirlik veya moleküler kütle degerlerinin
yaklasik oldugu ve açiklama için saglandigi ilaveten anlasilacaktir. Burada tarif
edilenlere benzer veya es-deger yöntemlerin ve materyallerin mevcut açiklamanin
pratiginde veya testlerinde kullanilabilmesine ragmen, uygun yöntemler ve
materyaller asagida tarif edilir.
Mevcut bulus ve ilgili açiklama, pektin parçalanmasina dâhil edilen M. phaseolina
genlerinin nükleotid dizilerini saglar. Genler, gidayi, hayvan yemini, kâgidi, sivi
yag ekstraksiyonunu, tekstili, atik suyu içeren bir endüstride kullanimda olan veya
bir endüstrinin ilgisini çeken pektin parçalama enzimi aktivitesine sahip olan
proteinleri sifreler. Bulusun genleri ve açiklamanin diger genleri, bunlarin
tanimlanmasi, karakterizasyonu, modifikasyonu ve çesitli endüstriyel proseslerde
kullanim yöntemleri burada asagida tarif edilir.
M. phaseoli'na genomik DNA'sinin nükleotid dizileri, bir tüm-genom rastgele
saçma DNA dizileme çalisinasi ile elde edilmistir. Genoinik DNA, enfekte olmus
Hint keneviri (Core-horus türleri) bitkisinden izole edilmis M. phaseoli'na ms6'nin
bir izolatindan hazirlanmistir. Üretilen nükleotid dizileri, Newbler birlestirici ile
01 678-P-0004
contig'ler ve iskeleler olusturmak için birlestirilmistir. Nükleotid dizileri ilk
olarak, yazilim programlari, örnegin, Augustus, Glimmer M (The Institute of
Genome Research, Rockville, Md.) ve varsayimsal kodlama bölgelerini, intronlari
ve uç-birlestirme baglanti-yerlerini tanimlayabilen, Evidence Modeler (EVM), ile
notlarla açiklanmistir. Nükleotid dizilerinin ilave otomatiklestirilmis ve manüel
iyilestirmesi, kodlama bölgelerinin ve diger gen özelliklerinin kesin
karakterizasyonunu aritmak ve olusturmak için gerçeklestirilmistir.
Pektin parçalama enzimlerini sifreleyen bulusun genomik dizileri ve açiklamanin
dizileri primer olarak, M. phaseoli'na genomik DNA'sinin nükleotid dizilerini ve
diger mikroorganizmalarin bilinen enzim genlerinin nükleotid dizilerini
karsilastirma ile tanimlanmistir. Bu M. phaseolina genlerinin nükleotid dizileri,
okuma çerçeveleri, ekzonlarin ve intronlarin pozisyonlari, enzimlerin yapisi ve
çesitli endüstrilerde bunlarin potansiyel kullanisliligi, örnegin, gidanin ve yemin,
içeceklerin, tekstillerin ve deterjanlarin yapimina dâhil edilenler, bilinmemektedir.
M. phaseoli'na'dan 14000'den fazla cDNA parsiyel olarak veya tam olarak
dizilenmistir. Bunlar arasinda, pektin parçalanmasinda varsayimsal rolleri olan
yeni enzimleri sifreleyen yirmi-bir cDNA kesfedilmistir.
Açik okuma çerçeveleri (ORF'Ier), M. phaseolina mRNA'sindan türetilen cDNA
kütüphanelerinin klonlarinin tam veya parsiyel dizilenmesini takiben analiz edilir
ve dizi analizi yazilimi kullanilmasi ile ve veri tabanlarinda (halka açik/özel)
bilinen dizilere homolojiyi belirleme ile ilaveten analiz edilir.
Bu açiklamanin baglaminda, spesitîkasyon boyunca kullanilan çok sayida terim,
farkli bir anlama sahip oldugu açik bir sekilde gösterilmedikçe, gösterilen
anlamlara sahiptir.
Burada kullanildigi sekliyle, "gen" terimi, M. phaseoli'na fungusunun genomik
dizileri, özellikle bir dizi enzimin polipeptidini sifreleyen polinükleotid dizisi,
01 678-P-0004
olarak tanimlanir. Terim ilaveten, upstream, downstream ve/veya intron nükleotid
dizilerini içeren nükleotid asit moleküllerini içerebilir.
amino asitleri kodlayan bir dizi nükleotid üçlüsü anlamina gelir ve üçlü dizi, özel
bir organizma için uygun kodon kullanim bilgisi kullanilarak proteine
aktarilabilir.
Bir "kodlama dizisi" veya "kodlama bölgesi", dizi eksprese edildiginde, bir gen
ürününü, örnegin, bir amino asidi veya polipeptidi, üretmek için gerekli olan dizi
bilgisine sahip olan bir nükleik asit molekülünü ifade eder. Kodlama dizisi,
aktarilmis bölgeler içinde aktarilmamis diziler (örn., intronlar veya 5' veya 3'
aktarilmamis bölgeler) içerebilir veya bu tarz araya- giren aktarilmamis dizilerden
(örn., cDNA'da oldugu gibi) yoksun olabilir.
Burada kullanildigi sekliyle, bir "polinükleotid", bir nükleotid dizisidir, örnegin,
bir nükleik asit fragmanidir. Bir polinükleotid, tek- veya çift-sarmalli olan,
opsiyonel olarak sentetik, dogal-olmayan veya degistirilmis nükleotid bazlari
içeren, bir RNA veya DNA polimeri olabilir. Bir DNA polimeri formundaki bir
polinükleotid, cDNA'nin, genomik DNA'nin, sentetik DNA'nin bir veya birden
fazla segmentinden veya bunlarin karisimlarindan olusturulabilir. Mevcut bulusun
bir izole edilmis polinükleotidi ayrica, SEQ ID NO: 1'de veya bu tarz dizinin
komplemanindan da türetilebilir. Açiklamanin bir izole edilmis polinükleotidi
59 ve 62'den veya bu tarz dizilerin komplemanindan da türetilebilir.
bilesim veya madde dogada bulundugunda, bu bunun orijinal ortamindan
degistirildiginde veya uzaklastirildiginda veya her ikisi de yapildiginda, bu "izole
edilmistir". Örnegin, bir canli bitkide veya hayvanda dogal olarak bulunan bir
01 678-P-0004
polinükleotid veya bir polipeptit "izole edilmemistir", ancak, terimin burada
kullanildigi sekliyle, bunun dogal hâlinin birlikte-var olan inateryallerinden
ayrilmis ayni polinükleotid veya polipeptit "izole edilmistir".
Bir polipeptidi veya proteini ifade etmek için burada kullanildiginda
mikrobiyal veya memeli) ekspresyon sistemlerinden türetildigi anlamina gelir.
rekombinant polipeptitleri veya proteinleri ifade eder. Çogu bakteriyel sistemde,
örn., Escherichia coli"de, eksprese edilen polipeptitler veya proteinler,
glikosilasyon modifikasyonlarindan yoksun olacaktir; funguslarda eksprese edilen
polipeptitler veya proteinler glikosile edilecektir.
plazmidi, faji, kozmidi, mayayi veya virüsü, bir yapay kopyalama dizisini (ARS)
veya bir yapay kromozomu ifade eder. "Vektör" teriminin ayrica, bunun
baglanmis oldugu bir baska nükleik asidi tasiyabilen bir nükleik asit molekülünü
ifade etmesi de amaçlanir. Vektörün bir tipi, bunun içine ilave DNA
segmentlerinin baglanabildigi bir dairesel çift-sarmalli DNA kivrimini ifade eden
bir "plazmid'dir". Vektörün bir baska tipi, burada ilave DNA segmentlerinin Viral
genom içine baglanabildigi bir Viral vektördür. Belirli vektörler (örn., bir
bakteriyel replikasyon orijinine sahip olan bakteriyel vektörler ve epizomal
memeli vektörleri) içine bunlarin uygulandigi bir konak hücre içinde otonom
replikasyon yapabilir. Diger vektörler, konak hücreye uygulanmasi üzerine bir
konak hücrenin genomuna entegre edilebilir ve böylece konak genomu ile birlikte
kopyalanir. Dahasi, belirli vektörler, bunlarin operatif olarak bagli oldugu genlerin
ekspresyonunu yönlendirebilir. Bu tarz vektörler burada, "rekombinant
ekspresyon vektörleri" (veya basitçe, "ekspresyon vektörleri") olarak ifade edilir.
Genel olarak, rekombinant DNA tekniklerinde yararlanilan ekspresyon vektörleri
siklikla, plazinidler formundadir. Mevcut spesifikasyonda, "plazmid'I ve "vektör",
plazmid en yaygin sekilde kullanilan vektör formu oldugundan, birbiri ile
01 678-P-0004
degistirilebilir bir sekilde kullanilabilir. Bununla birlikte, bulusun, es-deger
fonksiyonlar görevi gören, bu tarz baska ekspresyon vektörleri formlarini,
örnegin, viral vektörleri (öm., replikasyon kusurlu retrovirüsleri, adenovirüsleri ve
adeno-iliskili virüsleri), içermesi amaçlanir.
nükleotidlere operatif olarak bagli, bulusun bir polipeptidini sifreleyen bir
polinükleotidi içeren bir lineer veya dairesel DNA molekülü olarak tanimlanir.
genetik elemanin (elemanlarin), örnegin, promotörlerin veya hizlandiricilarin veya
RNA'ya, mRNA'ya aktarilan ve proteine aktarilan ve promotöre veya uygun
transkripsiyon baslatma ve sonlandirma dizilerine operatif olarak bagli olan bir
kodlama dizisinin, bir birlesimini içerebilir.
dizisinin kodlama dizisine göre bir uygun pozisyona konumlandirildigi, böylece
kontrol dizisinin bir polipeptidin kodlama dizisinin ekspresyonunu yönlendirdigi,
bir konfigürasyonu gösterir.
Burada kullanildigi sekliyle, "konak hücre" terimi, mevcut bulusun bir
polinükleotidini içeren bir nükleik asit yapisi veya ekspresyon vektörü ile
transformasyona, transfeksiyona, transdüksiyona ve benzerlerine yatkin olan
herhangi bir hücre tipini içerir.
transkripsiyonel birim içeren ve rekombinant transkripsiyonel birim içinde DNA
segmenti veya sentetik gen tarafindan sifrelenen heterolog polipeptitleri veya
proteinleri ve RNA'yi eksprese edecek olan kültürlenmis hücreler anlamina gelir.
Hücreler prokaryotik veya ökaryotik olabilir.
01 678-P-0004
Burada kullanildigi sekliyle, "polipeptit", peptit baglari ile birbirine bagli ve 100
amino asitten daha uzun olan bir diziye sahip olan amino asitlerin bir tek lineer
zinciridir.
Burada kullanildigi sekliyle, "promotör" terimi, bir downstream genin
transkripsiyonunu yönlendirme islevi gösteren bir nükleik asit dizisini ifade eder.
Promotör genel olarak, içinde hedef genin eksprese edilmekte oldugu konak
hücreye uygun olacaktir. Diger transkripsiyonel ve translasyonel regülatör nükleik
asit dizileri (ayni zamanda "kontrol dizileri" olarak da adlandirilirlar) ile birlikte
promotör verilen bir geni eksprese etmek için gereklidir. Genel olarak,
transkripsiyonel ve translasyonel regülatör dizileri, bunlarla sinirli kalmamak
kaydiyla, promotör dizilerini, ribozomal baglama yerlerini, transkripsiyonel
baslatma ve durdurma dizilerini, translasyonel baslatma ve durdurma dizilerini ve
hizlandirici veya aktivatör dizileri, içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "in-vitro" terimi genel olarak, bir canli organizma
disinda bir yapay ortamda gerçeklesen, genel olarak bir organizmanin,
gerçeklestirilecek olan daha detayli veya daha uygun bir analize izin vermek
amaciyla bunlarin olagan biyolojik baglamindan izole edilmis olan bilesenleri
kullanilarak bir laboratuvarda yürütülen, bir biyolojik reaksiyonu ifade eder.
degistirilebilir bir sekilde kullanilir ve normalde, bir dizi hizalama programi
kullanilarak hizalandiginda, bulusa ait polipeptitlerin herhangi birini sifreleyen
nükleik asit dizisi veya bulusa ait polipeptidin amino asit dizisi arasindaki nükleik
asit veya amino asit dizisi özdesliginin düzeyini ifade eder.
Örnegin, burada kullanildigi sekliyle, %80 homoloji, bir tanimlanmis algoritma
tarafindan belirlenen %80 dizi özdesligi ile ayni sey anlamina gelir ve bu
dogrultuda verilen bir dizinin bir homologu, verilen dizinin bir uzunlugu boyunca
01 678-P-0004
Dizi özdesliginin emsal düzeyleri, burada tarif edildigi üzere, verilen bir diziye,
öm., bulusa ait polipeptitlerin herhangi biri için kodlama dizisine, bunlarla sinirli
Iki dizi arasindaki özdesligi belirlemek için kullanilabilen emsal bilgisayar
programlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, BLAST programlari takimini,
örn., BLASTN, BLASTX ve TBLASTX, BLASTP ve TBLASTN,
WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST internet sitesinde halka açiktir, içerir.
Dizi arastirmalari tipik olarak, GenBank DNA Dizilerindeki ve diger halka açik
veri tabanlarindaki nükleik asit dizilerine kiyasa verilen bir nükleik asit dizisini
degerlendirirken, BLASTN programi kullanilarak yürütülür. BLASTX programi,
GenBank DNA Dizilerindeki ve diger halka açik veri tabanlarindaki amino asit
dizilerine karsi tüm okuma çerçevelerinde aktarilmis olan nükleik asit dizilerini
Iki veya daha dazla dizi arasindaki "özdeslik %'si'ni" belirlemek için seçilmis
dizilerin bir tercih edilen hizalamasi, örnegin, CLUSTAL-W programi,
kullanilarak yapilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "primer" terimi, bir hedef nükleik asit dizisini
baglayabilen ve nükleik asit sentezini hazirlayabilen bir oligonükleotiddir. Burada
tanimlandigi üzere bir amplitîkasyon oligonükleotidi tercihen, 10 ila 50, en
tercihen 15 ila 25 nükleotid uzunlugunda olacaktir. Mevcut bulusun
ampliükasyon oligonükleotidleri kimyasal olarak sentezlenebilir.
Nükleotid dizilerini içeren nükleik asitleri ifade etme için spesifikasyon boyunca
kullanilan kisaltma, geleneksel bir-harfli kisaltmalardir. Böylelikle, bir nükleik
aside dâhil edildiginde, dogal olusumlu sifreleyen nükleotidler asagidaki sekilde
kisaltilir: adenin (A), guanin (G), sitozin (C), timin (T) ve urasil (U). Ayrica, aksi
belirtilmedikçe, burada sunulan nükleik asit dizileri, 5'-› 3' yönündedir.
01 678-P-0004
Burada kullanildigi sekliyle, "komplementer" terimi ve bunun türevleri, A'nin T
veya U ile ve C'nin G ile eslestigi iyi-bilinen kurallar ile nükleik asitlerin
eslesmesine atfen kullanilir. Kompleman, "parsiyel" veya "tam" olabilir. Parsiyel
komplemana, nükleik asit bazlarinin yalnizca bazlari baz eslesme kurallarina göre
eslesirken; tam veya toplam koinplemanda, tüm bazlar eslesme kuralina göre
eslesir. Nükleik asit sarmallari arasindaki komplemanin derecesi, teknikte iyi
bilindigi üzere nükleik asit sarmallari arasindaki hibridizasyonun etkililigi ve gücü
üzerine anlamli etkilere sahip olabilir. Bu, nükleik asitler arasindaki baglamaya
dayanan saptama yönteminde özellikle olabilir.
Bulusun DNA dizileri, dizileme reaksiyonlari ile üretilmistir ve yanlis-
tanimlanmis nükleotidler, içeri yerlestirmeler ve/veya silinmeler olarak var
olabilen minör hatalar içerebilir. Bununla birlikte, mevcut oldugunda, bu tarz
ininör hatalar, dizilerin endüstriyel olarak ilgilenilen bir enzimi sifreleyen M.
phaseolina'nin bir geni olarak tanimlanmasini bozmamalidir ve bulusun
kapsamina spesifik olarak dâhil edilir.
Endüstriyel olarak ilgilenilen M phaseolina'nin enzimlerini Sifreleyen genomik
nükleotid dizileri ve kodlama dizileri mevcut bulus tarafindan kapsanir. Bu
dogrultuda, bir uygulamada, bir tanimlanmis genin açik okuma çerçevesinin
(ORF) bir nükleotid dizisini tanimlayan SEQ 1D NO: 2 saglanir. Bir baska
uygulamada, SEQ ID NO: 1 ile tanimlanan genin genomik dizileri saglanir.
Açiklamaya uygun sekilde, her biri bir tanimlanmis genin açik okuma
çerçevesinin (ORF) bir nükleotid dizisini tanimlayan SEQ ID NO.`lari: 2, 5, 8, 11,
herhangi bir karisimi/kombinasyonu saglanir. Açiklama ayrica, SEQ 1D NO.'lar1:
bunlarin herhangi bir karisimi/kombinasyonu ile tanimlanan genlerin genomik
dizilerini de saglar.
01 678-P-0004
ve/Veya bunlarin fragmanlarinin en az birini içeren ve/Veya bunlarin en az
sifreleyen herhangi bir nükleotid dizisini veya bunun fragmanini; (iii) SEQ ID
izah edilen nükleotid dizilerinin komplemanina orta-sertlikteki kosullar, öm.,
filtreye-bagli DNA'ya bir uygun/etkili 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC)
miktari içinde bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, 45°C'de (yaklasik olarak)
hibridizasyonu, akabinde bir uygun/etkili SDS miktari, örnegin, 0,2xSSC/%0,1
SDS, içinde, bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, örnegin, 50 ila 65°C'de (yaklasik
olarak) bir veya birden fazla yikama, altinda veya hayli-sert kosullar, öm.,
filtreye-bagli nükleik aside bir uygun/etkili SSC miktari, örnegin, 6x SSC, içinde
bir uygun/etkili sicaklik düzeyinde, 45°C'de (yaklasik olarak) hibridizasyonu,
akabinde bir uygun/etkili SDS miktari, örnegin, 0,1 X SSC/%0,2 SDS, içinde, bir
uygun/etkili sicaklik düzeyinde, örnegin, 68°C'de (yaklasik olarak) bir veya
birden fazla yikama, altinda veya teknikte uzmanligi olan kisiler için asikâr olan
diger hibridizasyon kosullari altinda (bakiniz, örnegin, Ausubel FM, Brent R,
Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in
Molecular Biology, 1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley &
Sons, Inc., New York) hibridize olan herhangi bir nükleotid dizisini ifade eder.
Tercihen, burada açiklanan DNA dizilerinin komplemanlarina hibridize olan
polinükleotidler, gen ürünlerini, örn., enzim genlerinin veya bunlarin
fragmanlarinin biri tarafindan sifrelenen bir gen ürününe fonksiyonel olarak es-
deger olan gen ürünlerini, sifreler.
Yukarida tarif edildigi üzere, açiklamanin gen dizileri, yalnizca SEQ ID NO.'lari:
01 678-P-0004
amino asit dizilerini sifreleyen dejenerat nükleotid dizilerini içermez ayni
zamanda M. phaseolina disindaki organizmalarda aktarildiginda, SEQ lD
63'ün amino asit dizilerinin birini içeren bir polipeptidi veya bunun bir fragmanini
üretecek olan dejenerat nükleotid dizilerini de içerir. Teknikte uzmanligi olan bir
kisi, M. phaseolina'da veya diger organizmalarda gen dizilerini kullanirken, uygun
bilecektir. Örnegin, Candida albi'cans'da, CTG kodonu, lösin rezidüsü yerine bir
serin rezidüsünü sifreler.
Bulusun nükleotid dizileri, M. phaseoli'na genomunun bir genetik, Iiziksel veya
dizi haritasinin gelistirilmesine yardimci olmak için genetik belirteçler ve/veya
dizi belirteçleri olarak kullanilabilir. Bulusun nükleotid dizileri ve karsilik gelen
gen ürünleri ayrica, M. phaseolina'nin varligini saptamak için de kullanilabilir.
Teknikte iyi bilinen hibridizasyon yöntemleri ve antikor-temelli yöntemler,
bulusun nükleotid dizilerinin ve karsilik gelen gen ürünlerinin varligini ve
konsantrasyonunu belirlemek için kullanilabilir.
Nükleotid dizileri ayrica, enzimlerin bir enfeksiyon sirasinda bir konagin
istilasinda bir rol oynayabilecegi gerçegi göz önünde bulunduruldugunda,
terapötik etkilere sahip olabilen enzimlerin inhibitörlerini tanimlamak için de
kullanilabilir.
Bir baska uygulamada, yukarida tarif edilen M. phaseolina'nm nükleotid dizilerine
ek olarak, M. phaseoli'na'da ve diger fungal türlerde bulunabilen bulusun
genlerinin homologlari veya ortologlari da dâhil edilir. F ilamentöz funguslardaki
homologlar veya ortologlar özellikle tercih edilir. Bu enzim genleri teknikte iyi
bilinen moleküler biyoloji teknikleri ile tanimlanabilir ve izole edilebilir.
01 678-P-0004
Burada kullanildigini sekliyle, "Funguslar" terimi, Ascomycota, Basidiomycota,
Chytridiomycota ve Zygomycota subelerini (Hawksworth DL, Kirk PM, Sutton
BC, Pegler DN. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi (8th Ed). 1995;
CAB International, Wallingford, United Kingdom. 616p) ve inayalari içerir.
Ascomycota'nin temsili gruplari, örn., Neurospora, Pem'cilli'um, Aspergi'llus'u,
içerir. Basidiomycota'nin temsili gruplari, yemeklik mantarlari, paslari ve isleri
(ekin hastaligi), içerir. Chytridiomyeota'nin temsili gruplari, Allomyces,
Blastocladiella, Coelomomyces'i içerir. Zygomycota'nin temsili gruplari, örn.,
Rhizopus ve Mucor'u, içerir.
Filamentöz funguslar, kitinden, selülozdan, glukandan, kitozandan, mannandan ve
diger kompleks polisakkaritlerden olusan bir vejetatif miselyum ile karakterize
edilir. Vejetatif büyüme, hifal elongasyon ile yapilir ve karbon katabolizmasi
zorunlu bir sekilde aerobiktir.
Bu dogrultuda, mevcut bulus ayrica genlerin polinükleotidlerine hibridize olabilen
fungal nükleotid dizileri de saglar. Açiklama, asagidakileri içeren ve/Veya
asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisine en az %50 özdes
olan bir nükleotid dizisini içeren ve/veya böyle bir nükleotid dizisinden olusan bir
karisimi/kombinasyonu.
52, 55, 58 ve 61'i ve/veya bunlarin herhangi bir karisimini/kombinasyonunu
içeren ve/veya bunlardan olusan gruptan seçilen bir nükleotid dizisinden olusan
ve/veya bu tarz nükleotid dizisini içeren bir ikinci nükleik aside orta-sertlikteki
01 678-P-0004
kosullar altinda hibridize olan bir fungal nükleotid dizisi içeren bir izole edilmis
nükleik asit de içerir.
gruptan seçilen bir amino asit dizisine en az %50 özdes olan bir polipeptidi
sifreleyen bir fungal nükleotid dizisi içeren bir izole edilmis nükleik asit de içerir.
Açiklamaya uygun sekilde nükleotid dizileri daha ilaveten, SEQ ID No. 2, 5, 8,
nükleotid dizilerine en az %40 özdes olan fungal nükleotid dizileri içerir.
Homolog genleri izole etmek için, yukarida tarif edilen M. phaseoli'na gen dizisi,
bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, M. phaseolina'yi, içeren, söz konusu
organizmadan elde edilen mRNA'dan yapilan bir cDNA kütüphanesini taramak
için etiketlenebilir ve kullanilabilir. Bu dogrultuda, SEQ ID No. 2, 5, 8, 11, 14,
herhangi birini içeren, tercihen saptanabilir bir sekilde etiketlenmis, nükleik asit
problari açiklamaya dâhil edilir. Hibridizasyon kosullari tercihen, CDNA
kütüphanesi bundan etiketlenmis dizinin türetildigi organizma tipinden farkli bir
organizmadan türetildiginde, bir düsük-sertlikte olabilir. CDNA taramasi ayrica,
ayni tür içinde alternatif olarak uçlari-birlestirilmis transkriptlerden türetilen
klonlari da tanimlayabilir. Alternatif olarak, etiketlenmis prob, yine, uygun
sekilde sertlikteki kosullar kullanilarak, söz konusu organizmadan türetilen bir
genomik kütüphaneyi taramak için kullanilabilir. Düsük sertlikteki kosullar
teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinecektir ve bundan kütüphanenin
ve etiketlenmis dizilerin türetildigi spesifik organizmalara bagli olarak tahmin
edilebilir bir sekilde çesitlilik gösterecektir (Details in Sambrook J, Russell DW.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third edition, 2001, Cold Spring
01 678-P-0004
Harbor Press, N.Y. ve Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman
JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology,1994; Green
Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York).
Ilaveten, bir homolog gen dizisi, söz konusu gen içindeki amino asit dizilerine
göre tasarlanan iki dejenerat oligonükleotid primer araci kullanilarak bir
polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçeklestirme ile izole edilebilir. Reaksiyon
için sablon, söz konusu organizmadan hazirlanan mRNA'nin ters transkripsiyonu
ile elde edilen cDNA olabilir. PCR ürünü alt-klonlanabilir ve çogaltilmis dizilerin
bir homolog enzim geni dizisinin dizilerini temsil ettigini garanti etmek için
dizilenebilir.
PCR fragmai akabinde, teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi
bilinen çesitli yöntemler ile bir tam boy cDNA klonunu izole etmek için
kullanilabilir. Altematif olarak, etiketlenmis fragman bir genomik kütüphaneyi
taramak için kullanilabilir.
Açiklamaya uygun sekilde, M phaseoli'na gen dizileri, özel olarak arzu edilebilen
kimyasal ve/veya fiziksel karakteristikler gösteren modifiye edilmis veya yeni
enzimleri gelistinnede kullanilabilir. M phaseoli'na'nin ve diger filamentöz
funguslarin enzimleri arasinda amino asit dizilerinin asikâr
ilgililiginden/benzerliginden dolayi, bir baska fungusun bir enzimin yapisi, M
phaseolina enzimin yapisini tahmin etmek ve yararli ve üstün özellikler için M.
phaseoli'na enziminin akla uygun modifikasyonuna yardimci olmak için
kullanilabilir. Saglanan diziler ayrica, enzimlerin talep edilen proseslerde daha iyi
performans göstermesine olanak saglayan karakteristikleri olan yeni enzimlerin
akla uygun modifikasyonu veya tasariini için preparatör materyaller olarak da
kullanilabilir.
Gen nükleotid dizileri, rastgele ve yere-yönlendirilmis mutajenez teknikelri veya
yönlendirilmis moleküler evrim teknikleri örnegin, bunlarla sinirli kalmamak
01 678-P-0004
kaydiyla, (Arnold FH. Protein engineering for unusual environments. Curr.
oligonükleotide-yönlendirilmis mutajenez (Reidhaar-Olson JF, Sauer RT.
Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of
Drinkwater NR. recA-dependent and recA-independent N-ethyl-N-nitrosourea
mutagenesis at a plasmid-encoded herpes simplex virus thymidine kinase gene in
E. coli. Mutat Res. 1987;178:l-10), yere-yönlendirilmis mutajenez (Kunkel TA.
Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc.
hataya-yatkin PCR (Cadwell RC, Joyce GF. Randomization of genes by PCR
mutagenesis. PCR Methods Appl. 1992;2:28-33), kaset mutajenezi (Stauss Hj,
Davies H, Sadovnikova E, Chain B, Horowitz N, Sinclair C. Induction of
cytotoxic T lymphocytes with peptides in vitro: identification of candidate T-cell
WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro
820 Numarali ABD Patentleri'nde tarif edildigi üzere yöntemler ile,
ile belirlenebilir.
Bir uygulamada, SEQ 1D NO: 2'de gösterilen 747 hp uzunlugundaki
polinükleotid, yaklasik 26 kDa'luk bir hesaplanmis moleküler kütle ile, SEQ ID
NO: 3'te oldugu üzere, 248 amino asitlik polipeptidi sifreleyen bir açik okuma
çerçevesi gösteren pektat liyaz proteinini sifreleyen tam boy cDNA klonudur.
SEQ ID NO: 2'nin SMART analizi yoluyla, bu dizi içinde Pfam pektat liyazi
alaninin varligini ortaya çikarir. Pektat liyazi, bunlarin indirgemeyen uçlarinda 4-
deoksi-alfa-D-gluk-4-enüronosil gruplari tasiyan oligosakkaritler üretmek için
01 678-P-0004
pektatin eliminasyonlu klevajini katalizleyen bir ekstraselüler enzimdir. Bu enzim,
pektinin parçalanmasina dâhil edilir.
Açiklama ayrica, (a) genlerin yukaridaki dizilerinin ve/veya bunlarin
komplemanlarinin herhangi birini içeren bir nükleotid dizisini içeren ve/veya bu
tarz bir nükleotid dizisinden olusan nükleik asit vektörleri; (b) kodlama dizilerinin
ekspresyonunu yönlendiren bir regülatör eleman ile operatif olarak bagli olan
genlerin yukaridaki kodlama dizilerinin herhangi birinden olusan ve/veya bunlarin
herhangi birini içeren bir nükleotid dizisi içeren ekspresyon yapilari ve (c) konak
hücrelerde kodlama dizilerinin ekspresyonunu yönlendiren bir regülatör eleman
ile operatif olarak bagli olan kodlama bölgelerini içeren, genin yukaridaki
dizilerinin herhangi birini içeren ve/veya bunlarin herhangi birinden olusan
rekombinant konak hücreler ile de ilgilidir.
Polinükleotid dizilerini rekombinant DNA yöntemlerinden yararlanarak modifiye
etmek için teknikler, teknikte iyi bilinir. Çesitli diziler, bilinen tekniklere, örnegin,
restriksiyona, komplementer restriksiyon yerlerini birlestiimeye ve baglamaya,
çikintilarda doldurma ile küt uç-yapmaya ve küt-uç ligasyonuna veya
benzerlerine, uygun sekilde birlestirilebilir. Poli baglayicilar ve uyarlayicilar,
uygun oldugunda, kullanilabilir ve DNA vektörlerinin ve ekspresyon yapilarinin
birlesmesinin kolayligina olanak saglamak için bilinen teknikler ile uygulanabilir
veya uzaklastirilabilir. Çok sayida vektör, klonlama ve genetik manipülasyon için
mevcuttur. Normalde, klonlama, E. 0011' içinde gerçeklestirilebilir.
Bulusun bir baska uygulamasinda, bulusun bir enzim gen dizisini içeren vektörler
ilaveten, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, E. coli' hücrelerini, filamentöz fungal
hücreleri, inaya hücrelerini ve Bacillus hücrelerini, içeren, bir veya birden fazla
konak hücre türünde vektörlerin transferine, idamesine ve propagasyonuna olanak
saglayan replikasyon fonksiyonlari içerebilir. Vektör kendi kendine-replikasyonu
garanti etmek için herhangi bir araç içerebilir. Alternatif olarak, vektör, konak
hücre içine uygulandiginda, genom içine entegre edilen ve içine bunun entegre
01 678-P-0004
edilmis oldugu kromozom (kromozomlar) ile birlikte kopyalanan bir vektör
olabilir. Vektör seçimi tipik olarak, vektörün içine vektöiün uygulanacagi konak
hücre ile uygunluguna bagli olacaktir.
Bulusun ekspresyon yapisi, bir promotör, bulusun bir gen dizisini sifreleyen bir
nükleotid dizisi, bir transkripsiyon sonlandirma dizisi ve seçilebilen belirteç
(opsiyonel) içerir ve/veya bunlardan olusur. Bu ekspresyon yapisini bir konak
hücre içine uygulamak için teknikte bilinen herhangi bir yöntein kullanilabilir.
Fungal hücreler, kendi basina bilinen bir sekilde, protoplast olusumunu,
protoplastlarin transformasyonunu ve hücre duvarinin yenilenmesini içeren bir
proses ile transforme edilebilir. Aspergi'llus ve T ri'choderma konak hücrelerinin
transformasyonu için uygun prosedürler, EP 238 023'te ve Yelton MM, Hames J E,
Timberlake WE. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid.
transforme etmek için uygun yöntemler Malardier L, Daboussi MJ, Julien J,
Roussel F, Scazzocchio C, Brygoo Y. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD)
of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum.
DM, Guarentc L. High-effîciency transformation of yeast by electroporation. In:
Abelson JN ve Simon MI (eds), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,
H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated
tarafindan tarif edilen prosedürler kullanilarak transforme edilebilir.
Endüstriyel uygulamalar için, mevcut bulusun enzimleri bir fungal hücre
tarafindan üretilir. Tercihen, ekspresyon konak hücresi, büyük ölçekte endüstriyel
fermentasyonda kullanilmakta olan bir filamentöz fungal hücredir. Uygun hücre
hatlari veya konak sistemleri, eksprese edilen yabanci proteinin dogru
modifikasyonunu ve islenmesini temin etmek için seçilebilir. Tercihen, bunlarin
01 678-P-0004
endojen proteinlerinin etkili salgilamasini yapabilen bir ekspresyon konagi seçilir.
Bir konak hücre ayrica, salgilanmis enzim kültür vasati içinde
parçalanabileceginden, ekstraselüler proteaz aktivitelerindeki eksiklikler için de
seçilebilir.
Mevcut bulus ayrica, mevcut bulusun bir polipeptidini üretmek için, asagidakileri
içeren, yöntemler ile de ilgilidir: (i) bunun dogal-tip formunda, polipeptidin
üretimi için elverisli olan kosullar altinda polipeptidi üretebilen bir hücreyi
yetistirme ve (ii) polipeptidi geri-kazanma. Tercih edilen bir yönünde, hücre, M.
phaseolina'dir.
Açiklama ayrica, bir polipeptidi üretmek için, asagidakileri içeren, yöntemler ile
de ilgilidir: (i) polipeptidin üretimi için elverisli olan kosullar altinda bir konak
polipeptidi sifreler ve (ii) polipeptidi geri-kazanma.
Ekspresyon konak hücreleri veya transformantlar, teknikte iyi bilinen yöntemler
kullanilarak proteinlerin büyümesi ve ekspresyonu için uygun bir besin vasati
içinde yetistirilebilir. Örnegin, hücre bir uygun vasat içinde ve polipeptidin
eksprese edilmesine ve/veya izole edilmesine izin veren kosullar altinda
gerçeklestirilen laboratuvar veya endüstriyel fermentörler içinde sallama flask
kültivasyonu ve (sürekli, kesikli, beslemeli-kesikli fermentasyonlari veya kati hâl
fermentasyonlarini içeren) küçük-ölçekte veya büyük-ölçekte ferinentasyon ile
yetistirilebilir. Kültivasyon, teknikte bilinen prosedürler kullanilarak, karbon ve
nitrojen kaynaklari ve inorganik tuzlar içeren bir uygun besin vasati içinde
gerçeklesir (bakiniz: More Gene Manipulations in Fungi. Bennett J W, Lasure L.,
(eds). 1991; Academic Press, San Diego, CA). Polipeptit besin vasatina
01 678-P-0004
salgilandiginda, polipeptit vasattan dogrudan geri-kazanilabilir. Polipeptit vasata
salgilanmadiginda, bu hücre lizatlarindan geri-kazanilabilir.
Polipeptitler, polipeptitlere spesifik teknikte bilinen yöntemler kullanilarak
saptanabilir. Bu saptama yöntemleri, spesifik antikorlarin kullanimini, bir enzim
ürününün olusumunu veya bir enzim substratinin kaybolmasini içerebilir. Bir
enzim analizi, polipeptidin aktivitesini belirlemek için kullanilabilir.
Üretilen polipeptit teknikte bilinen yöntemler kullanilarak geri-kazanilabilir.
Polipeptit, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, filtrasyonu, sentrifügasyonu,
ekstraksiyonu, sprey ile kurutmayi, buharlastirmayi ve presipitasyonu veya
bunlarin kombinasyonunu, içeren geleneksel prosedürler ile besin vasatindan
çesitli yöntemlerde geri-kazanilabilir.
Mevcut bulusun polipeptitleri ve açiklamanin diger polipeptitleri, bunlarla sinirli
kalmamak kaydiyla, kromatografi yöntemini (örnegin, iyon degisimi, afinite,
hidrofobik, kromato-odaklanma ve boyut dislama), elektroforetik prosedürleri
(örnegin, izoelektrik odaklanma), diferansiyel çözünürlügü (örnegin, amonyum
sülfat presipitasyonu), SDS-PAGE'i veya büyük ölçüde saf polipeptitler elde
etmek için ekstraksiyonu (bakiniz, details in Protein Purification, Principles, High
Resolution Methods and Applications. Janson JC, Rydén L. (eds(). 1989; VCH
Publishers Inc., New York), içeren teknikte iyi bilinen çesitli prosedürler ile
saflastirilabilir.
gen ürünleri (örn., RNA veya proteinler) ile de ilgilidir. Enzim gen ürünleri
sifrelenen bu RNA'yi ve proteinleri de içerir. Enzimler, SEQ 1D NO.'lar1: 3, 6, 9,
01 678-P-0004
ve/veya bunlardan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içerir.
Enzimler, pektat liyazini. pektat liyazi C'yi, pektinesterazi ve ramnogalaktüronazi
içeren ve/veya bunlardan olusan gruptan seçilen bir enzimin aktivitelerinin en az
birini gösterir. Enzim gen ürünleri, örn, sentetik teknikler ile veya teknikte iyi
bilinen teknikler kullanilarak rekombinant DNA teknolojisinin yöntemleri ile,
kolaylikla üretilebilir (Bakiniz, Creighton TE. Proteins: Structures and Molecular
Principles, 1983; W. H. Freeman and Co., N.Y.).
Açiklamanin yöntemleri ve bilesimleri ayrica, fonksiyonel olarak es-deger gen
ürünlerini temsil eden proteinleri ve polipeptitleri de içerir. Bu tarz fonksiyonel
olarak es-deger gen ürünleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, SEQ ID NO. 3,
edilen bir amino asit dizisine sahip olan polipeptitlerin dogal varyantlarini, içerir.
Bu tarz es-deger gen ürünleri, örn., yukarida tarif edilen enzim gen dizileri
tarafindan sifrelenen amino asit dizileri içindeki amino asit rezidülerinin
silinmelerini, eklenmelerini veya Sübstitüsyonlarini içerebilir, ancak bir sessiz
degisim ile sonuçlanir, böylelikle bir fonksiyonel olarak es-deger ürün üretir.
Amino asit sübstitüsyonlari, dâhil edilen rezidülerin polaritesindeki, yükündeki,
çözünürlügündeki, hidrofobisitesindeki, hidrofilisitesindeki ve/Veya amfipatik
dogasindaki benzerlige göre yapilabilir.
Yukarida tarif edilen gen ürünü kodlama dizilerinin diger modifikasyonlari bir
seçilen konak hücre içinde, örn., ekspresyon için, ölçek-büyütme için, Vb., daha
uygun olan polipeptitler üretmek için yapilabilir. Örnegin, sistein rezidüler disülfit
köprülerini elimine etmek amaciyla silinebilir veya bir baska amino asit ile
sübstüte edilebilir.
01 678-P-0004
Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, mevcut bulusun, kati formdaki, enzimlerini
içerir. Kati formdaki enzimler veya enzim granülati, örnegin, kati deterjanda ve
hayvan yeminde, kullanilabilir. Enzimlerin kati formlarini yapmak için yöntemler,
bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, prillestirme (bir mumlu materyal
içinde sprey ile sogutma), ekstrüzyon, aglomerasyon veya granülasyon (bir inert
materyal ve baglayicilar ile seyreltme), teknikte iyi bilinir. Bulusun bir enziminin
bir kati formunu, karistirilmis toz, tabletler ve benzerleri formunda, içeren kati
enzimatik bilesimler tasarlanir.
Mevcut açiklama, ekli istemlerin içerigine ayni zamanda yukaridaki
açiklamaninkine dâhil edilir. Bu bulusun bir ayirt-edicilik derecesi ile bunun
tercih edilen formunda tarif edilmis olmasina ragmen, tercih edilen formdaki
mevcut açiklamanin yalnizca örnek olarak yapilmis oldugu ve yapinin
detaylarinda ve parçalarin kombinasyonunda ve dizilimlerinde çok sayida
degisime basvurulabilecegi anlasilir.
Asagidaki örnegin, bulusun orada tarif edilen spesifik uygulamalar ile
sinirlandirilinasi için herhangi bir niyet olmadan, bulusu ve baska açiklamayi
Örnek 1 M. phaseolina'dan Genomik DNA'nin Izolasyonu
Genomik DNA, Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA.
Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp.
162-208, tarafindan tarif edilen prosedürler kullanilarak M. phaseoli'na susu
msö'dan izole edilmistir. Özet olarak, miselyumlar inoküle etme kivrimi
kullanilarak bir stok Petri plakasindan kazinmistir ve bir konikal flask içinde bir
sivi patates-dekstroz vasati içine inoküle edilmistir. Konikal flask, 30°C'de
yaklasik 72 saat boyunca sallama olmadan inkübe edilmistir. Miselyumlar hava-
01 678-P-0004
vasat ara-yüzünde yüzey üzerinde büyümüstür. Miselyumlar, bir steril kürdan
kullanilarak hasat edilmistir ve steril kâgit havlular arasina yerlestirilmistir ve bir
kaçi fizyolojik çözelti (Sodyum fosfat tamponu, pH 7,0) ile yikanmistir.
Miselyumlar, fazla siviyi uzaklastirmak için sikilmistir ve hasat edilmis
miselyumlar 30 dakika boyunca hava ile kurumaya birakilmistir. Yari-kuru
miselyumlar, sivi nitrojen içine yerlestirilmistir ve ince toz üretmek ve son olarak
Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces
tarif edilen protokol izlenerek DNA'yi izole etmek için ögütülmüstür.
Ornek 2 Primerlerin tasarlanmasi ve sentezi
Çalismada kullanilan primerler, manüel olarak düzenlenmis transkriptomdan ve
M. phaseoli'na 1ns6'sin1n genomik dizisinden tahmin edilen "gen modelleri'nden",
dizileri tam ORF'ler ile manüel olarak seçme veya burada benzer genlerin diger
bitkilerden basarili bir sekilde izole edilmis oldugu veri tabanlarinin kullanilmasi
ile, tasarlanmistir. Transkriptomdan elde edilen nükleotid dizilerinin
karsilastirmali biyoenformatik analizi, ilgili genlerin homologlarmi tanimlamak
için ve genin uygun tanimlanmasi için NCBl BLAST, BLASTP, RPS-BLAST,
BLASTX ve PSI-BLAST kullanilarak yürütülmüstür. Nükleotid dizisi
hizalamalari, çok sayida dizi "gen havuzu'ndan" bulundugunda, clustalW versiyon
1.82 kullanilarak gerçeklestirilmistir. Gen spesifik primerler (hem ileri hem de
geri), manüel olarak veya Primer 3 plus araci yoluyla seçilmistir ve primerler
istege özel sentezlenmistir.
Bu çalismada kullanilan tüm oligonükleotidler, saglayici tarafindan
sentezlenmistir ve HPLC ile saIlastirilmistir ve Integrated DNA Technologies
(IDT) firmasindan temin edilmistir. 100 pmol'lük stok çözeltisi, otoklavlanmis
ddHZO içinde hazirlanmistir ve kullanim için alikotlar hâlinde, -20°C`de
saklanmistir.
01 678-P-0004
PCR için primerler olarak kullanilan Oligonükleotidlerin Dizileri
1iyazi
liyazi
liyazi
liyazi
1iyazi
1 iyazi
liyazi
liyazi
SEQ Primer Dizisi Çogaltilmis
Ileri TCATCACCGACCCACAATCGC
(SEQ ID NO: 64)
Revers CTTAGCAAGCGGGAGCCGTC
(SEQ ID NO: 65)
Ileri CAGACAACGGCGTCGACAGT (SEQ
Revers ACGGACCACATCCAACGCGA
(SEQ ID NO: 67)
Ileri ATGCCCTGGTACCCTGCCCC (SEQ
Revers GAAAGGTCCCGGGCTCACGC
(SEQ ID NO: 69)
Ileri CCGCTCCTCTGTGCGTTGTTGAA
(SEQ ID NO: 70)
ACAGCGATAGAGCCGCAACACG (SEQ
(SEQ ID NO: 72)
Revers CGAAAGCCAGCCCAAGCGAC
(SEQ ID NO: 73)
Ileri GGCAAGCATCCTCTCTCCGGC
(SEQ ID NO: 74)
Revers CCTGAGGCCCATCGTCCGAGT
(SEQ ID NO: 75)
Ileri TCCCTGCCTCTCCATCCTACCCT
(SEQ ID NO: 76)
Revers CCAACCGTGTGGCCGTCGAA
(SEQ ID NO: 77)
Ileri ACATGCAGTTCAAGTACGCCGCT
(SEQ ID NO: 78)
Revers GCAGGGGCCCACACCTCTTG
(SEQ ID NO: 79)
01 678-P-0004
Gen ID Primer Dizisi Çfignaltilmis
adi urun (bp)
Ileri TCCAAGGCAGAGCCTCCGAAACA
(SEQ lD NO: 81)
Ileri ACAGACCCCATCACATCCGCCA
(SEQ ID NO: 82)
liyazi C Revers 1790
(SEQ 1D NO: 83)
Ileri CTGTCCTCCAGCAGCAGCCTC
Pektat (SEQ ID NO: 84) 1133
liyazi C Revers CGAGCAACCCGTCGAGGTCAA
(SEQ ID NO: 85)
Q . . . . Çogaltilmis
Gen Adi ID Primer Dizisi ürün (bp)
Ileri CATGAAGGCCACCACCCTCGC (SEQ ID
liyazi C Revers CCGAACCCTGGCTCGGGCAT (SEQ ID
Pektat 37 Ileri ACCCCCACGCCGAACAATACC (SEQ ID 1534
liyazi C NO: 88)
Revers CCGCCAAGTCTATCCGCTCGC (SEQ ID
Ileri GGCTTCGGTGGACCGTCCTAT (SEQ ID
liyazi C Revers CCACCCGCTCCGCCCTTAAA (SEQ ID
Ileri AGGAGATGGGCTGCCGTCCT (SEQ ID
Pektat 43 NO: 92) 1051
liyazi C Revers GCTCAGCAAGCGTCCAACCCA (SEQ
Pektinest Ileri TCCCGTGCCATGGTAGCCTTT (SEQ ID
46 1352
eraz NO: 94)
01 678-P-0004
Pektinest
Pektinest
Pektinesteraz
Ramnogalaktü
Ramnogalaktü
Q Priiner Dizisi
Çogaltilmis
Revers GCTGGCCACCACAATCCACA (SEQ ID
Ileri TGGCCTCTTGATCAGGCTCGT (SEQ 1D
Revers GCGGTGACCCATCCCTGCTT (SEQ ID
Ileri TCGTCCACCGGTACCACGTT (SEQ ID
(SEQ ID NO: 99)
Primer Dizisi
CCTCG (SEQ [D NO:
TTGCAT (SEQ ID NO:
GGACTT (SEQ ID NO:
CAACACG (SEQ ID NO:
AGAAC (SEQ ID NO:
Çogaltil
01 678-P-0004
Q . . . . Çogaltilmis
Gen Adi ID Primer Dizisi ürün (bp)
CTCGCT (SEQ ID NO:
Örnek 3 M. phaseoli'na ms6'dan elde edilen pektat liyazinin, Pektat liyazi
C'nin, pektinesterazin ve ramnogalaktüronazin amplifikasyonu, klonlanmasi
ve dizilenmesi
Toplam RNA, önceden Chomczynski P ve Sacchi N, Single-step method of RNA
isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction (Anal
büyütülmüs üç günlük miselyumdan izole edilmistir. RNA'nin kalitesi veya
bütünlügü standart prosedürler uyarinca agaroz jel elektroforezi ile kontrol
edilmistir ve Therrno Scientific Nano Drop 2000 kullanilarak kantifiye edilmistir.
cDNA birinci sarmali, üreticinin talimatlari izlenerek SuperScript III Revers
transcriptase (Invitrogen) kullanilarak sentezlenmistir. Gen, gen spesifik primerler
kullanilarak PCR ile cDNA'dan çogaltilmistir. PCR reaksiyonu (50 uL), 1 uL
CDNA, her bir primerden 20 pmol, 5 uL 10X PCR Taponu, 5 uL 2,5 mM dNTP
karisimi ve 1,0 ünite PfuTaq DNA polimerazi, içennistir. PCR asagidaki kosullar
kullanilarak Thermal Cycler (Applied Biosystems) içinde gerçeklestirilmistir:
95°C'de 5 dakika ("dk") boyunca ilk denatürasyon akabinde 95°C'de 30 saniye
("s") boyunca denatürasyonun, 59-61°C'de 30 s boyunca tavlamanin ve 72°C'de
hedeflenen genin uzunlugunda bagli olarak 1 ila 2,0 dk boyunca uzamanin 35
siklusu, son olarak 72°C'de 7 dk boyunca bir nihai uzama. PCR ürünü, 1X TAE
tamponu kullanilarak %1 agaroz jel ile analiz edilmistir ve amplikon üreticinin
talimatlari izlenerek QIAGEN gel extraction kit kullanilarak jelden
ayristirilmistir. Saflastirilmis PCR ürünü, pCR®8/GW/TOPO® TA Cloning kit'e
(Invitrogen) baglanmistir ve kompetan E. coli hücrelerine (Invitrogen) transforme
edilmistir. Plazmidler, üreticinin talimatlari izlenerek QlAprip Spin Miniprep Kit
01 678-P-0004
(QIAGEN) kullanilarak varsayimsal kolonilerden izole edilmistir. Içeri
yerlestirmenin varligi, gen spesifik primerler kullanilarak kontrol edilmistir ve
pozitif plazmidler Dizileme'ye tabi tutulmustur.
Örnek 4 Dizinin Analizi
Nükleotid dizisi ve amino asit dizisi sirasiyla, BLASTN ve BLASTP programlari
ile analiz edilmistir. Diger bitkilerden bildirilen diziler ClustalW ile hizalanmistir.
Filogenetik analiz, Komsu Birlestirme (NJ) kullanilarak yürütülmüstür.
Claims (15)
- ISTEMLER Bir izole edilmis polinükleotid dizisidir, SEQ ID NO: l'de veya 2'de izah edilen nükleotid dizisine veya bunun komplemanina en az %80 özdes olan bir nükleotid dizisi içerir, burada söz konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler.
- Orta-sertlikteki kosullar altinda SEQ ID NO: 1'de veya 2'de izah edilen bir nükleotid dizisini veya bunun komplemanini içeren bir izole edilmis polinükleotid dizisine hibridize olan bir izole edilmis nükleik asit probudur, burada söz konusu polinükleotid bir pektat liyazini sifreler ve burada söz konusu orta-sertlikteki kosullar, filtreye-bagli DNA'ya 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) içinde yaklasik 45°C'de hibridizasyonu, akabinde yaklasik 50 ila yaklasik 65°C'de 0,2xSSC/%0,l SDS içinde bir veya birden fazla yikamayi içerir.
- Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu genomik DNA'dir.
- Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu cDNA'dir.
- Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu RNA'dir.
- Istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi veya istem 2'ye göre izole edilmis nükleik asit probudur, bu tek-sarmallidir.
- Bir nükleik asit molekülüdür, bir heterolog proteini veya peptidi sifreleyen bir kodlama dizisi içindeki durdurma kodonu ile kesintiye-ugratilmamis, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir.
- 8. Bir rekombinant vektördür, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir.
- 9. Bir ekspresyon yapisidir, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir, burada polinükleotid dizisi, bir konak hücre içinde nükleotid dizisinin ekspresyonunu kontrol eden transkripsiyonel veya translasyonel regülatör sinyallerini veya her ikisini içeren bir regülatör nükleotid dizisi ile operatif olarak iliskilendirilir.
- 10. Bir genetik olarak mühendislik uygulanmis konak hücredir, istem l'e göre izole edilmis polinükleotid dizisi içerir.
- 11. Bir polipeptit yapmanin bir yöntemidir, asagidaki adimlari içerir: i. istem 9'a göre bir ekspresyon yapisi ile transforme edilmis bir hücrenin polipeptidi üretmek için etkili olan kosullar altinda kültürlenmesi ve ii. polipeptidin izole edilmesi.
- 12. Bir izole edilmis polipeptittir, SEQ ID NO: 3'te izah edilen bir amino asit dizisine en az %80 özdes olan ve pektat liyazinin katalitik aktivitesini gösteren bir amino asit dizisi içerir.
- 13. Bir kimerik proteindir, bir ikinci polipeptidin bir amino asit dizisine bir kovalent bag vasitasiyla kaynastirilmis istem 12'ye göre bir polipeptit
- 14. Bir konak hücredir, istem 9'a göre ekspresyon yapisi içerir.
- 15.M. phaseolina'nin bir transgenik fungusudur, istem 9'a göre ekspresyon yapisi içerir.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261683914P | 2012-08-16 | 2012-08-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TR201809053T4 true TR201809053T4 (tr) | 2018-07-23 |
Family
ID=50101609
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TR2018/09053T TR201809053T4 (tr) | 2012-08-16 | 2013-08-15 | Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları. |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9765322B2 (tr) |
EP (1) | EP2885407B1 (tr) |
JP (1) | JP6644547B2 (tr) |
KR (1) | KR102043363B1 (tr) |
CN (1) | CN104837991A (tr) |
AU (1) | AU2013302535B2 (tr) |
DK (1) | DK2885407T3 (tr) |
ES (1) | ES2674922T3 (tr) |
HK (1) | HK1213597A1 (tr) |
IN (1) | IN2015DN02049A (tr) |
MY (1) | MY169809A (tr) |
PL (1) | PL2885407T3 (tr) |
PT (1) | PT2885407T (tr) |
TR (1) | TR201809053T4 (tr) |
WO (1) | WO2014028772A2 (tr) |
ZA (1) | ZA201501635B (tr) |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
GB8702475D0 (en) | 1987-02-04 | 1987-03-11 | Ciba Geigy Ag | Expression system |
EP0353188B2 (en) | 1988-07-28 | 2002-03-06 | Novartis AG | Novel expression system |
DE3908813A1 (de) | 1989-03-17 | 1990-09-20 | Roehm Gmbh | Verfahren zur expression eines aus aspergillus niger stammenden gens in einem aspergillus |
WO1994014952A1 (en) | 1992-12-23 | 1994-07-07 | Novo Nordisk A/S | An enzyme with polygalacturonase activity |
US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
EP0777737B1 (en) | 1994-06-30 | 2005-05-04 | Novozymes Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
CN102080070B (zh) * | 1995-03-17 | 2016-01-20 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新的内切葡聚糖酶 |
US6171820B1 (en) | 1995-12-07 | 2001-01-09 | Diversa Corporation | Saturation mutagenesis in directed evolution |
US5939250A (en) | 1995-12-07 | 1999-08-17 | Diversa Corporation | Production of enzymes having desired activities by mutagenesis |
US5965408A (en) | 1996-07-09 | 1999-10-12 | Diversa Corporation | Method of DNA reassembly by interrupting synthesis |
DE69819704T3 (de) | 1997-04-09 | 2009-08-27 | Kao Corp. | Waschmittelzusammensetzung |
US7214786B2 (en) * | 2000-12-14 | 2007-05-08 | Kovalic David K | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
ES2359381T5 (es) * | 2002-05-14 | 2014-07-10 | Novozymes A/S | Variantes de pectato liasa |
WO2004074468A1 (en) * | 2002-05-30 | 2004-09-02 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel pectinases and uses thereof |
CA2716806A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Production and use of plant degrading materials |
CN102292437B (zh) * | 2008-12-19 | 2015-06-24 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 生产酶产品的方法 |
WO2010101158A1 (ja) * | 2009-03-02 | 2010-09-10 | 住友商事株式会社 | クロストリジウム セルロボランス由来新規遺伝子及びその利用 |
-
2013
- 2013-08-15 CN CN201380054070.9A patent/CN104837991A/zh active Pending
- 2013-08-15 DK DK13829902.9T patent/DK2885407T3/en active
- 2013-08-15 KR KR1020157006677A patent/KR102043363B1/ko active IP Right Grant
- 2013-08-15 ES ES13829902.9T patent/ES2674922T3/es active Active
- 2013-08-15 WO PCT/US2013/055198 patent/WO2014028772A2/en active Application Filing
- 2013-08-15 JP JP2015527642A patent/JP6644547B2/ja active Active
- 2013-08-15 PT PT138299029T patent/PT2885407T/pt unknown
- 2013-08-15 EP EP13829902.9A patent/EP2885407B1/en active Active
- 2013-08-15 PL PL13829902T patent/PL2885407T3/pl unknown
- 2013-08-15 IN IN2049DEN2015 patent/IN2015DN02049A/en unknown
- 2013-08-15 MY MYPI2015000387A patent/MY169809A/en unknown
- 2013-08-15 AU AU2013302535A patent/AU2013302535B2/en active Active
- 2013-08-15 TR TR2018/09053T patent/TR201809053T4/tr unknown
- 2013-08-15 US US14/421,729 patent/US9765322B2/en active Active
-
2015
- 2015-03-10 ZA ZA2015/01635A patent/ZA201501635B/en unknown
-
2016
- 2016-02-12 HK HK16101535.2A patent/HK1213597A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104837991A (zh) | 2015-08-12 |
JP6644547B2 (ja) | 2020-02-12 |
BR112015003086A2 (pt) | 2018-06-26 |
US9765322B2 (en) | 2017-09-19 |
ES2674922T3 (es) | 2018-07-05 |
KR20150042849A (ko) | 2015-04-21 |
IN2015DN02049A (tr) | 2015-08-14 |
EP2885407A4 (en) | 2016-05-11 |
MY169809A (en) | 2019-05-16 |
AU2013302535A1 (en) | 2015-03-26 |
DK2885407T3 (en) | 2018-07-16 |
WO2014028772A3 (en) | 2014-05-08 |
KR102043363B1 (ko) | 2019-11-11 |
EP2885407B1 (en) | 2018-06-13 |
JP2015529071A (ja) | 2015-10-05 |
AU2013302535B2 (en) | 2018-12-06 |
PT2885407T (pt) | 2018-07-02 |
EP2885407A2 (en) | 2015-06-24 |
ZA201501635B (en) | 2016-01-27 |
US20150259667A1 (en) | 2015-09-17 |
HK1213597A1 (zh) | 2016-07-08 |
WO2014028772A2 (en) | 2014-02-20 |
PL2885407T3 (pl) | 2018-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101821402B (zh) | 修剪式多位点组合装配 | |
JP6518955B2 (ja) | 亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をマーカーとした微生物の選択的培養方法 | |
CN105886487B (zh) | 一种几丁质脱乙酰基酶突变体 | |
CA2825105A1 (en) | Thermostable chitosanase | |
KR101062978B1 (ko) | 신균주 페니실륨 피노필럼 kmj601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝 | |
CN111041013B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶或果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用 | |
AU2013302536B2 (en) | Lignin degrading enzymes from Macrophomina phaseolina and uses thereof | |
CN105969751B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
TR201809053T4 (tr) | Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları. | |
KR102358538B1 (ko) | 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법 | |
Kumari et al. | Screening and molecular characterization of cellulase producing actinobacteria from Litchi Orchard | |
JP6616687B2 (ja) | Macrophominaphaseolina由来のセルロースおよび/またはヘミセルロース分解酵素およびその使用 | |
CN111187795A (zh) | 一种双葡基海藻糖的制备方法 | |
BR112015003086B1 (pt) | Sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão recombinante e célula hospedeira procariótica geneticamente engenheirada | |
CN116240199B (zh) | 一种突变的核糖核酸酶r及其应用 | |
CN111040025B (zh) | Yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用 | |
El-Bakary et al. | Identification of Endoglucanase Gene Responsible for Cellulose Degradation Using Aspergillus flavus | |
KR101873327B1 (ko) | 애기 장대에서 유래한 신규 호밍 엔도뉴클레아제 | |
TWI609961B (zh) | 用於生產重組酵素之核酸建構物、重組型表現載體及其方法 | |
CN101967483A (zh) | 棉花fdh基因的启动子及其应用 | |
BR112015003085B1 (pt) | Molécula de ácido nucleico recombinante, constructo recombinante de expressão e célula hospedeira procariótica engenheirada geneticamente |