JP6518955B2 - 亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をマーカーとした微生物の選択的培養方法 - Google Patents

亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をマーカーとした微生物の選択的培養方法 Download PDF

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Description

本発明は、抗生物質耐性遺伝子以外の選択マーカーを用いて、微生物を選択的に培養する方法に関する。より具体的には、本発明は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとして利用する、生物の選択的培養方法に関する。
微生物は、バイオ燃料の生産をはじめ各種有用物質の生産に利用されている。バイオ燃料や物質生産のための微生物培養は、一般に、目的とする微生物（以下、「目的微生物」という。）の純粋培養を前提としている。そこで、目的微生物以外の微生物のコンタミネーションを防ぐために、培地や機器の殺菌処理（「滅菌処理」ともいう。特記しない限り「殺菌」と「滅菌」とは同義として扱う。）や、抗生物質等の各種薬剤の利用が必要となる。抗生物質を利用する場合、抗生物質耐性遺伝子を目的微生物に導入し、当該抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質が添加された殺菌培地中で、目的微生物を培養することにより純粋培養が維持される。アンピシリンやテトラサイクリンの薬剤耐性遺伝子を、選択マーカーとして利用することは古くから知られている（例えば、非特許文献１を参照のこと。）。
しかしながら、培養スケールが大きくなるほど、培地等の殺菌のための投入エネルギーにかかるコストや、殺菌を行うための設備費が高くなる。また、培養スケールが大きくなると、培地に添加する抗生物質等の薬剤調達のためのコストが高くなるという問題が生じ得る。さらに、抗生物質を含む廃液は抗生物質耐性菌の出現を助長する恐れがあるため、抗生物質を含む廃液処理は厳重に行われなければならない。このため、抗生物質を含む廃液の処理にかかる手間およびコストも必要となる。
また、抗生物質を利用した従来の培養方法においては、抗生物質耐性遺伝子を有する微生物が、培地中の抗生物質を分解してしまう場合がある。当該抗生物質耐性遺伝子を有する微生物を継代培養しても、培地中の抗生物質の量が減少し、最終的には目的微生物を選択できないことがわかっている。
一方、当然のことではあるが、設備の簡素化の点から開放系で培養を行ったり、培養工程のコスト削減のために殺菌等の処理工程を削減したりする等の経済的な培養方法を採用すると、目的微生物を工業的に純粋培養することはできない。
したがって、上記の問題点は、微生物を用いた物質生産を実用化する上で、大きな障壁となっている。
ところで、非特許文献２には、Pseudomonas stutzeriから亜リン酸酸化遺伝子および次亜リン酸酸化遺伝子を単離するため、P. stutzeriゲノムのコスミドクローンを作製し、ホスト細胞（緑膿菌）が亜リン酸または次亜リン酸資化能を獲得することを指標として遺伝子を単離することが記載されている。しかし、非特許文献２においても、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとすること、及び、目的微生物以外の微生物の増殖を抑え、目的微生物を選択的に培養することは開示されていない。なお、非特許文献２においても、殺菌条件下で培養が当然行われている。また、抗生物質を含まない培地の記述もない。さらに言えば、非特許文献２は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の単離を目的としている技術なので、本発明とは技術思想が異なる。
日経バイオ最新用語辞典 第５版 第８４６頁、日経ＢＰ社発行、２００２年９月１７日発行 WILLIAM W. METCALF AND RALPH S. WOLFE, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 180, No. 21, 1998, p. 5547 - 5558
そこで、本発明は上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、培養系に対する殺菌操作や、抗生物質を利用しなくても、目的微生物以外の微生物の増殖を抑え、長期間にわたって目的微生物の選択的な培養を行うことができる、簡便且つ安価な微生物の選択的培養方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、抗生物質耐性遺伝子（「薬剤耐性遺伝子」ともいう。）以外の選択マーカーを用いて、微生物を選択的に培養する方法を提供することにある。
さらに本発明は、目的微生物を大量培養する際に奏効する、微生物の選択的培養方法を提供することを目的としている。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとして用いることによって、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明にかかる微生物の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴としている。
亜リン酸自体を資化できる微生物は極小数に限られているため、無殺菌条件下で培養を行ったとしても、目的外の微生物のコンタミネーションが起こりにくい。このため、本発明の選択的培養方法によれば、培地や培養装置等の培養系の殺菌にかかるコストを削減することができる。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法（以下「本発明の選択的培養方法」という。）では抗生物質抵抗性遺伝子が選択マーカーとして用いられていないために、微生物の培養に際し、抗生物質を利用する必要がない。このため、抗生物質入手にかかるコストを抑えることができ、原料コストを抑えることができる。
また本発明の選択的培養方法では、抗生物質を利用する必要がないため、抗生物質を含む培養廃液による環境負荷（抗生物質耐性菌出現等）の問題点が存在しない。さらに亜リン酸自体は、生物に対して毒性をほとんど示さない。このため、本発明の選択的培養方法によれば、培養廃液処理にかかる労力およびコストを削減することができる。
また本発明の選択的培養方法に用いられる亜リン酸は、化学合成で容易に合成できるとともに、界面活性剤合成や金属メッキ加工の廃液中に亜リン酸は高濃度で含まれている。このため、亜リン酸は容易かつ安価に入手可能である。よって本発明の選択的培養方法によれば、培地の原料コストを抑えることができる。また本発明の選択的培養方法は、界面活性剤合成や金属メッキ加工の廃液の有効利用の観点から、好ましいといえる。
なお、本発明の選択的培養方法による有利な効果は、培養スケールが大きくなればなるほど顕著となる。
実施例において使用したプラスミドベクターRsptxABCD/pSTV28の構造を示す模式図である。 実施例において、大腸菌へのｐｔｘＡＢＣＤ導入の効果を検証した結果であり、（ａ）はRsptxABCD/pSTV28が導入されていない大腸菌MT2012を、亜リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むモルホリノプロパンスルホン酸平板培地（MOPS-Pt（0.5））上で培養した結果を示す写真図であり、（ｂ）はRsptxABCD/pSTV28が導入された大腸菌MT2012の形質転換体を、同培地上で培養した結果を示す写真図である。 実施例において使用したプラスミドベクターRsptxABCDmt/pNSHAの構造を示す模式図である。 実施例において、シアノバクテリア（Synechococcus elongates PCC7942）へのｐｔｘＡＢＣＤ導入の効果を検証した結果であり、（ａ）はｐＮＳＨＡをシアノバクテリア（S. elongates PCC7942）に導入して取得された形質転換体（コントロール）をＢＧ−１１培地で培養した結果を示す写真図であり、（ｂ）はRsptxABCDmt/pNSHAを同シアノバクテリアに導入して取得された形質転換体を同培地で培養した結果を示す写真図である。 実施例において、野生型の酵素および変異型の酵素それぞれについて、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを基質として亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した結果を示すヒストグラムであり、「ＷＴ」は変異されていない野生型のＲｓＰｔｘＤの結果を示し、「D175A/ P176R」はRsPtxD D175A/ P176Rの結果を示し、「D175A」はRsPtxD D175Aの結果を示し、「P176R」はRsPtxD P176Rの結果を示す。 ｐｔｘＡＢＣＤのオペロン構造を示す模式図である。 RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体、およびベクターpSTV28のみが導入された大腸菌MG1655の形質転換体のＯＤ６００の経時変化を示すグラフである。 RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体を、無殺菌培地および開放系で培養した際の、大腸菌MG1655の形質転換体のＯＤ６００の経時変化を示すグラフである。 RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体（初代培養後、および２〜１０回継代培養後）から調製したプラスミドＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す写真図である。 実施例において使用したプラスミドベクターRsptxABCDmt/pUC118の構造を示す模式図である。 RsptxABCDmt/pUC118が導入された大腸菌MG1655の形質転換体（初代培養後、および２〜６回継代培養後）から調製したプラスミドＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す写真図、および、上記形質転換体に含まれるプラスミドの含有量（％）の継代培養による変化を示すグラフである。（ａ）は上記形質転換体を、リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含み、さらにアンピシリンを含むモルホリノプロパンスルホン酸培地（MOPS-Pi, Amp(+)）上で培養した結果であり、（ｂ）はリン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むモルホリノプロパンスルホン酸培地（MOPS-Pi, Amp(-)）上で培養した結果であり、（ｃ）は亜リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むモルホリノプロパンスルホン酸培地(MOPS-Pt)上で培養した結果である。 図１１（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における結果を、上記形質転換体に含まれるプラスミドの含有量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）の継代培養による変化として示すグラフである。 亜リン酸非利用競合株存在下における、総菌体数に対するｐｔｘＤが導入された株の割合の変化を示す図である。（ａ）は培養前のｐｔｘＤ導入株の割合を示し、（ｂ）は培養後のｐｔｘＤ導入株の割合を示している。 分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)のL972株およびL975株を、液体培地において４０時間培養した結果を示すグラフである。「none」はリン源無しの培地、「Pi」はリン酸をリン源とした培地、「Pt」は亜リン酸をリン源とした培地において培養した結果である。 分裂酵母のL972株およびL975株を、固体培地において４日培養した結果を示す写真図である。（ａ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、（ｂ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)において培養した結果である。 分裂酵母の形質転換体を固体培地において培養した結果を示す写真図である。（ａ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、（ｂ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)において培養した結果である。「Ｒｓ−１」はRsPtxD/HFF1導入株、「Ｒｓ−４１」はRsPtxD/HFF41導入株、「Ｒｓ−８１」はRsPtxD/HFF81導入株、「Ｐｓ−１」はPsPtxD/HFF1導入株、「Ｐｓ−４１」はPsPtxD/HFF41導入株、「Ｐｓ−８１」は、PsPtxD/HFF81導入株、「Control」はpDUAL-HFF41導入株を表す。 分裂酵母の形質転換体を液体培地において培養した結果を示すグラフである。（ａ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、（ｂ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)において培養した結果である。「Ｒｓ−１」はRsPtxD/HFF1導入株、「Ｒｓ−４１」はRsPtxD/HFF41導入株、「Ｐｓ−１」はPsPtxD/HFF1導入株、「Ｐｓ−４１」はPsPtxD/HFF41導入株、「Control」はpDUAL-HFF41導入株を表す。 分裂酵母の形質転換体を固体培地において培養した結果を示す写真図である。（ａ）はコントロールプラスミドを導入した形質転換体における結果、（ｂ）はRsPtxD/HFF1プラスミドを導入した形質転換体における結果を示す。（ａ）および（ｂ）のそれぞれにおいて、（ｉ）はリン源無しの培地(none)、（ｉｉ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、（ｉｉｉ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)における結果を示す。また、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）はそれぞれ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の拡大図である。 亜リン酸非利用競合株存在下における、総菌体数に対するｐｔｘＤが導入された株の割合の変化を示す図である。（ａ）は培養前のｐｔｘＤ導入株の割合を示し、（ｂ）は培養後のｐｔｘＤ導入株の割合を示している。 亜リン酸非利用競合株存在下における、亜リン酸非利用競合株及びｐｔｘＤが導入された株の細胞数の変化を示す図である。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔１．微生物の選択的培養方法〕
本発明は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴とする、微生物の選択的培養方法に関する。本明細書において、本発明にかかる微生物の選択的培養方法を「本発明の選択的培養方法」と適宜称する。
ここで、「微生物の選択的培養方法」とは、目的外の微生物の増殖を抑えて、目的微生物のみを選択的（優先的）に培養することを意味するが、更に目的微生物を優先的に培養することも含まれる意味である。換言すれば、本発明の選択的培養方法において、目的微生物のみが培養されることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではなく、目的微生物以外の微生物に対して目的微生物が優先的に培養されていればよい。また目的微生物は、単一の微生物のみならず、複数種類の微生物からなるものであってもよい。
本発明の選択的培養方法は、目的微生物の種菌を、目的微生物以外の微生物も存在し得る条件下で、培地に植菌し、目的微生物を選択的に培養することを意味する。工業的に無殺菌と言っても、しばしば雑菌汚染が起こることが知られている。本発明の選択的培養方法は、目的微生物以外の微生物も存在し得ることを想定して、意図的に目的外の微生物を混入して培地に植菌し、目的微生物を選択的に培養することも含まれる。ただし、本発明の選択的培養方法は、目的微生物の中から亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された株のみを選択的に培養することも含まれる。
殺菌処理に要するコストを削減するという観点からは、無殺菌条件下で、培地に植菌し、目的微生物を選択的に培養することがより好ましい。ただし、当然、殺菌条件下で本発明の選択的培養方法を行えば、より確実に目的外の微生物のコンタミネーションを防ぐことができる。工業的により確実な安全を求める場合、殺菌条件下で本発明の選択的培養方法を行うことが好ましい場合もある。つまり、本発明の選択的培養方法は、殺菌条件下および無殺菌条件下のいずれの場合においても、上記微生物を選択的に培養することができる培養方法である。
また本発明の選択的培養方法には、目的微生物の種菌を培養する種菌培養工程（「前培養工程」）が含まれていてもよい。
本発明の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物が用いられる。本発明の選択的培養方法に用いられる目的微生物は、亜リン酸デヒドロゲナーゼを有しない微生物であっても、亜リン酸デヒドロゲナーゼを元来有する微生物であってもよい。また本発明の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現し、これが機能し得る全ての微生物に適用され得る。目的微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、細菌、酵母（分裂酵母または出芽酵母等）、カビ、放線菌、藻類、古細菌等が例示される。なお、上記目的微生物は、亜リン酸デヒドロゲナーゼを有しない微生物であっても、亜リン酸デヒドロゲナーゼを元来有する微生物であってもよい。
本発明は特に限定されるものではないが、亜リン酸デヒドロゲナーゼが発現し易いとの観点から、亜リン酸デヒドロゲナーゼの由来に応じて、目的微生物を選択すればよい。例えば、後述する細菌由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＲｓＰｔｘＤ）を本発明の選択的培養方法に適用する場合は、細菌を目的微生物とすることがより好ましい。
本発明の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼを選択マーカーとして利用することを主旨としている。リンは生物が生育するためには必須の元素である一方で、亜リン酸自体を資化できる微生物は極小数に限られているため、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地で目的微生物を培養すれば、例え無殺菌の培地を用いて培養を行ったとしても、目的微生物以外の微生物が生育する可能性は極めて少ない。このため、目的微生物以外の微生物のコンタミネーションが起こりにくい。このため、本発明の選択的培養方法は、目的微生物の選択的培養を達成することができる。
ここで「無殺菌条件」とは、加熱殺菌、フィルター殺菌、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理を、培養系（培地、培養装置、供給される気体（酸素等））に対して一切行われていない条件であることが好ましい。無殺菌条件には、開放系の培養も含まれる意味である。なお、本発明の選択的培養方法においては、全工程において無殺菌条件下で培養してもよいが、種菌培養工程（前培養工程）では殺菌条件で行われてもよい。
上記無殺菌条件は、実質的な無殺菌条件であってもよい。つまり、通常の完全な殺菌を意図した殺菌処理に比べて殺菌レベルの低い加熱殺菌、フィルター殺菌、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理が行われていてもよい。通常の殺菌処理に比べて殺菌レベルの低い殺菌処理とは例えば、１００℃未満、９０℃未満または８０℃未満で、３０分未満、２０分未満または１０分未満の加熱処理等であってもよい。
本発明の選択的培養方法は、殺菌条件下および無殺菌条件下のいずれの場合においても、長期間にわたって上記微生物を選択的に培養することができる培養方法である。本明細書において、「長期間にわたって微生物を選択的に培養することができる」とは、例えば、１５時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７２時間以上にわたって、目的微生物以外の微生物の増殖を抑え、目的微生物を選択的に培養することを意味する。
ここで、「亜リン酸を唯一のリン源として含む培地」とは、亜リン酸以外のリン元素を供給する成分（例えばリン酸、次亜リン酸、ホスフィン等）を培地中に実質的に含有していない培地を意味する。なお本明細書において「実質的に含有していない」とは、濃度が１００μＭ以下、より好ましくは１０μＭ以下であることを意味する。「培地」は亜リン酸を唯一のリン源として含む培地であれば、特に限定されるものではなく、目的微生物に応じて適宜選択すればよい。ただし、リン源を亜リン酸のみにコントロールし易いとの観点から、完全合成培地が好ましい。後述する実施例では、モルホリノプロパンスルホン酸培地（ＭＯＰＳ培地）が用いられている。
本発明の選択的培養方法では、抗生物質（ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン等）を選択マーカーとして利用していないために、培地には抗生物質が含まれている必要はない。このため、本発明の選択的培養方法に適用される無殺菌培地は、抗生物質を実質的に含有していない培地であり得る。
また本発明の選択的培養方法による効果は、既述の通り、培養スケールが大きくなればなるほど顕著となる。このため、本発明の選択的培養方法は、１０Ｌ以上（好ましくは１００Ｌ以上、より好ましくは１０００Ｌ以上、さらに好ましくは５０００Ｌ以上、最も好ましくは１００００Ｌ以上）の無殺菌培地を用いて実施されることが好ましい。
また本発明の選択的培養方法は、上述の通り、亜リン酸デヒドロゲナーゼを選択マーカーとしているため、目的微生物以外の微生物のコンタミネーションがそもそも起こりにくい。このため本発明の選択的培養方法は、培養槽が密閉されていない開放系で行なわれてもよい。開放系で本発明の選択的培養方法が実施されることで、より簡便に本発明の選択的培養方法を実施することができる。また培養装置の構造が比較的単純であるため、培養装置にかかるコストを押さえることができるため、培養スケールをより大きくし易くなる。
なお、開放系よりもさらにコンタミネーションが起こりにくく、かつ目的微生物が自然界に拡散し難いとの理由から、培養槽が密閉されている閉鎖系で、本発明の選択的培養方法が実施されてもよい。
なお、本発明の選択的培養方法における培地、温度、通気条件等の培養条件は、目的微生物に応じて適宜選択すればよい。
〔２．亜リン酸デヒドロゲナーゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子〕
本発明の選択的培養方法では、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を利用する。本明細書において「亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物」には、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された組換え微生物が包含される。本発明の選択的培養方法では、既に亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を利用すればよいため、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を微生物に導入する工程（「遺伝子導入工程」という。）が特に含まれている必要はないが、遺伝子導入工程が含まれていてもよい。
かかる遺伝子導入工程は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターを公知の方法により作製し、当該発現ベクターを自体公知の方法にて目的微生物に導入すればよい。上記発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＴＶ２８、ｐＮＳＨＡ、ｐＵＣ１１８、ｐＥＴ，ｐＧＥＸ等のプラスミドが挙げられる。上記発現ベクターは、宿主である目的微生物において機能するプロモーターの制御下に、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を連結することによって構築することができる。また、上記発現ベクターには、プロモーターの他に、亜リン酸デヒドロゲナーゼの発現に必要な配列や、抗生物質耐性遺伝子（薬剤耐性遺伝子）等が含まれていてもよい。また後述する、亜リン酸トランスポーター遺伝子が上記発現ベクターに含まれていてもよい。
さらに、上記発現ベクターには、目的微生物において生産を行うべきタンパク質（目的タンパク質）をコードする遺伝子が含まれ得る。この時、目的タンパク質をコードする遺伝子は、目的微生物において機能するプロモーターの制御下に連結されていることが好ましい。これにより、目的微生物が元来生産しないタンパク質を、目的微生物において生産させることができる。
遺伝子導入工程における遺伝子の導入方法は、宿主である目的微生物の種類に応じて好ましい方法を適用すればよい。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等が適宜適用可能である。
上記の通り、本発明の選択的培養方法に含まれ得る、遺伝子導入工程は、当業者が有する通常の知識によって、容易に実施し得る工程である。
ただし、本発明の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのコピー数を増加させることができ、さらに継代培養しても目的とするプラスミドのコピー数を安定的に維持することができる。つまり、上記構成によれば、プラスミドのコピー数が多い状態を安定的に維持することができる。よって、本発明の選択的培養方法は、目的微生物の選択的培養をより効率的に行うことができる。このことは本発明者らによって初めて見出されたものである。
本発明の選択的培養方法において、「亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのコピー数を増加させる」とは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのコピー数が、リン酸を唯一のリン源として含む培地にて微生物を培養した場合に比べて、亜リン酸で培養した方が増加することを意味する。さらに、本発明の選択的培養方法は、抗生物質を選択マーカーとして利用した従来の選択的培養方法（リン酸を唯一のリン源として含み、さらに抗生物質を含んでいる培地を用いる培養方法）にて微生物を培養した場合に比べても、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのコピー数を増加させることができる。
また、上記「プラスミドのコピー数を安定的に維持する」とは、例えば、微生物を継代培養した場合（例えば、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の回数で継代培養した場合）に、初代培養時の上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのコピー数の８０％以上（より好ましくは９０％以上）を維持することができることを意味する。
本発明の選択的培養方法において、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と上記目的タンパク質をコードする遺伝子とを含んだ発現ベクターが微生物に導入されている場合は、上記目的タンパク質をコードする遺伝子を高発現させることができる。よって、目的微生物が元来生産しないタンパク質を、目的微生物において安定的に生産させることができると考えられる。
本発明の選択的培養方法において、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んだプラスミドを発現ベクターとして用いた場合、プラスミドを例えば１．０〜１００μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００で保持することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
本発明の選択的培養方法において利用される、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、適宜「ｐｔｘＤ」と表記する。）がコードする亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質（以下、適宜「ＰｔｘＤ」と表記する。）は、バクテリアの一部などが有するタンパク質であり、一般的な植物は本来有していないタンパク質である。なお、本明細書において亜リン酸デヒドロゲナーゼと表記すれば、特記しない限りにおいて、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のことを意味する。
ＨＰＯ３ ２−＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ → ＨＰＯ４ ２−+ＮＡＤＨ＋Ｈ＋
ＨＰＯ３ ２−＋ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ → ＨＰＯ４ ２−+ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋
亜リン酸の酸化還元電位は極めて低く、この反応は非常に大きな発エルゴン反応でほぼ不可逆的に進行するため、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生酵素として工業的にも注目されている。
既述の通り、これまでに本発明者らは、土壌集積培養系において、亜リン酸培地上で優れた増殖を示すRalstonia sp. 4506株（４５０６株）を単離し、この４５０６株からＰｔｘＤを取得した（参考文献：Hirota et al., J. Biosci. Bioeng., Vol. 113, 445-450, 2012.）。４５０６株由来のＰｔｘＤは、現在クローニングされている亜リン酸デヒドロゲナーゼの中で最も高い比活性を有していることを本発明者らが明らかにし、すでに特許出願を行った（国際公開番号：ＷＯ／２０１２／１４７５５６）。亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、亜リン酸トランスポーター遺伝子（ｐｔｘＡ、ｐｔｘＢ、ｐｔｘＣ）とオペロン構造を形成していることが分かっている（図６を参照のこと。）。亜リン酸トランスポーターおよび亜リン酸トランスポーター遺伝子については、次項にて説明する。なお、本明細書において亜リントランスポーターと表記すれば、特記しない限りにおいて、亜リン酸トランスポータータンパク質のことを意味する。
本明細書において、４５０６株由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼおよびこれをコードする遺伝子を、それぞれ「ＲｓＰｔｘＤ」および「ＲｓｐｔｘＤ」と表記する。また亜リン酸トランスポーター（ＰｔｘＡ、ＰｔｘＢ、ＰｔｘＣで構成されている）およびこれをコードする遺伝子（ｐｔｘＡ、ｐｔｘＢ、ｐｔｘＣ）を、それぞれ「ＰｔｘＡＢＣ」および「ｐｔｘＡＢＣ」と表記する。特に４５０６株由来の亜リン酸トランスポーターおよびこれをコードする遺伝子を、それぞれ「ＲｓｐｔｘＡＢＣ」および「ＲｓｐｔｘＡＢＣ」と表記する。なお「ｐｔｘＡＢＣＤ」および「ＲｓｐｔｘＡＢＣＤ」と表記されていれば、亜リン酸トランスポーター遺伝子および亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む遺伝子であることを意味する。
本発明の選択的培養方法において使用される亜リン酸デヒドロゲナーゼは、導入される微生物内で機能する酵素であれば、特に限定されるものではない。例えば、上記の４５０６株由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼ、Pseudomonas stutzeri WM88由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼ（参考文献：ＷＯ２０１０／０５８２９８Ａ２）、Desulfotignum phosphitoxidans, Dietzia cinnamea, Methylobacterium extorquens, Comamonas testosterone, Acidovorax ebreus, Cupriavidus metallidurans, Thioalkalivibrio sp., Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Marinobacter algicola, Marinobacter aquaeolei, Shewanella putrefaciens, Prochlorococcus sp., Cyanothece sp., Trichodesmium erythraeum, Nostoc sp., Nodularia spumigena, Nostoc punctiforme, Gallionella capsiferriformans, Burkholderia vietnamiensis, Acinetobacter radioresistens, Herminiimonas arsenicoxydans, Alcaligenes faecalis, Oxalobacter formigenes由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼ等が、本発明の選択的培養方法において利用可能である。ただし、酵素の熱安定性や比活性が高い等の理由から、ＲｓＰｔｘＤおよびこれをコードするＲｓｐｔｘＤが好ましく利用可能である。
ＲｓｐｔｘＤは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
上記ＲｓｐｔｘＤは（i）可溶化した状態で大腸菌宿主内にて多量に発現され得る、（ii）高い熱安定性を有する、（iii）各種阻害物質によって活性が阻害され難い、という利点を有している亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質である（国際公開番号：ＷＯ／２０１２／１４７５５６）。
したがって、ＲｓｐｔｘＤを本発明の選択的培養方法に適用した場合、宿主微生物での亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現量が多いため、目的微生物の選択的培養がより実施し易くなる。また、ＲｓｐｔｘＤを本発明の選択的培養方法に適用した場合、酵素の熱安定性が高いため、高温条件下で生育する微生物に対しても選択的培養方法を実施することができる。またＲｓｐｔｘＤを本発明の選択的培養方法に適用した場合、培地中に各種阻害剤が存在する条件下でも、選択的培養方法を実施することができる。
亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードしているものであればよく、一種類の塩基配列に限定されず、同じアミノ酸をコードする別のコドンに置換可能である。
また本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。ここで、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、１０個以内のアミノ酸であることが好ましく、８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１個のアミノ酸であることが最も好ましい。
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。「保存的置換」とは、特定のアミノ酸から、このアミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されていることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、ならびに側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
このような分類を用いれば、保存的置換とは、同じ群内のアミノ酸同士の置換であるといえ、例えばセリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンとの置換が挙げられる。
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がコードする亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は、亜リン酸デヒドロゲナーゼと８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）を行い、一致するアミノ酸配列の割合（％）として相同性を算出することができる。
またＲｓｐｔｘＤは、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドであり得る。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
上記配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子には、付加的な塩基配列が連結され得る。なお、当該付加的な塩基配列は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の５’末端に連結されてもよいし、３’末端に連結されてもよく、連結される位置は特に限定されない。
上記付加的な塩基配列の具体的な構成は特に限定されないが、タグなど（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタンパク質、ＧＦＰ、ＣＦＰまたはＹＦＰ）をコードする塩基配列であり得る。
なお、上記の説明は「亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」に関するものであるが、共通する項目については、次項の「亜リン酸トランスポーター遺伝子」の説明において適宜援用することができる。
〔３．亜リン酸トランスポーターおよび亜リン酸トランスポーター遺伝子〕
前項の説明によって、本発明の選択的培養方法において、少なくとも亜リン酸デヒドロゲナーゼが導入された目的微生物を利用すれば効果を奏することが説明された。ただし、本発明の選択的培養方法においては、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、亜リン酸トランスポーター遺伝子とが導入された目的微生物であることが好ましい場合が有る。目的微生物に亜リン酸取り込み能力がない（または低い）場合に、培地中の唯一のリン源である亜リン酸を効率よく菌体内に取り込むことができず、目的微生物の増殖速度が低い場合がある。この場合に、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、亜リン酸トランスポーター遺伝子とが導入された目的微生物を利用することによって、上記問題をあらかじめ回避することができる。
本発明の選択的培養方法で利用され得る亜リン酸トランスポーターは、目的微生物において機能し得るものであれば特に限定されるものではない。したがって、公知の亜リン酸トランスポーターが利用可能である。例えば、Pseudomonas stutzeri, Desulfotignum phosphitoxidans, Dietzia cinnamea, Methylobacterium extorquens, Comamonas testosterone, Acidovorax ebreus, Cupriavidus metallidurans, Thioalkalivibrio sp., Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Marinobacteralgicola, Marinobacter aquaeolei, Shewanella putrefaciens, Prochlorococcus sp., Cyanothece sp., Trichodesmium erythraeum, Nostoc sp., Nodularia spumigena, Nostoc punctiforme, Gallionella capsiferriformans, Burkholderia vietnamiensis, Acinetobacter radioresistens, Herminiimonas arsenicoxydans, Alcaligenes faecalis, Oxalobacter formigenes由来の亜リン酸トランスポーター等が適宜利用可能である。また、亜リン酸トランスポーターとして機能する、リン酸トランスポーター、ホスホン酸トランスポーター等も適宜利用可能である。
本発明は特に限定されるものではないが、亜リン酸トランスポーターとしては上述の４５０６株由来の亜リン酸トランスポーター（ＲｓＰｔｘＡＢＣ）が好ましく利用可能である。ＲｓＰｔｘＡ、ＲｓＰｔｘＢ、およびＲｓＰｔｘＣのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３、４、および５に示す。なお、亜リン酸トランスポーターは、ＲｓＰｔｘＡ、ＲｓＰｔｘＢ、およびＲｓＰｔｘＣの３つのユニットで構成されているため、亜リン酸トランスポーターとして機能するためにはＲｓｐｔｘＡ、ＲｓｐｔｘＢ、およびＲｓｐｔｘＣの全てを目的微生物に導入する必要が有る。
上記ＲｓｐｔｘＡは、（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＢおよびＲｓＰｔｘＣと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
また上記ＲｓｐｔｘＢは、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＡおよびＲｓＰｔｘＣと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
また上記ＲｓｐｔｘＣは、（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（６）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＡおよびＲｓＰｔｘＢと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
また上記ＲｓｐｔｘＡは、（７）配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（８）配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと表現できる。
またＲｓｐｔｘＢは、（９）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（１０）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと表現できる。
またＲｓｐｔｘＣは、（１１）配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（１２）配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであると表現できる。
なお、上記３つのユニットをコードする遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターによって目的微生物に導入されてもよいし、３つのユニットをコードする遺伝子を含む一つの発現ベクターによって目的微生物に導入されてもよい。また、上記３つのユニットをコードする遺伝子は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現ベクターとは別の発現ベクターによって目的微生物に導入されてもよいし、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現ベクターと同一の発現ベクターによって目的微生物に導入されてもよい。この場合は、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤは、例えば、以下の（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドであり得る。
（ｉ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸トランスポーターおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
なお、本項の説明において、前項の〔２．亜リン酸デヒドロゲナーゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子〕と共通する項目については、前項の説明を適宜援用することができる。
〔４．ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子〕
特に限定されるものではないが、本発明の選択的培養方法においては、ＮＡＤＰ利用型の亜リン酸デヒドロゲナーゼが適宜利用され得る。シアノバクテリアをはじめとする光合成を行う生物は、カルビンサイクルを利用するため、一般的に細胞内のＮＡＤＰ濃度が高いことが知られている。一方、大腸菌をはじめとする従属栄養細菌では、一般的に細胞内のＮＡＤ濃度が高くなっている。
ＲｓｐｔｘＤは、従属栄養細菌であるRalstonia sp. 4506株由来であるため、ＮＡＤＰよりもＮＡＤに対する基質特異性が高いことが考えられた。このため、シアノバクテリア等の光合成微生物をはじめとする、細胞内のＮＡＤＰ濃度が高い微生物を目的微生物とする場合にはＮＡＤＰを効率よく利用することができず、その結果、亜リン酸を効率よく酸化することができない場合が考えられた。つまり、シアノバクテリア等の細胞内のＮＡＤＰ濃度が高い微生物を目的微生物とする際には、ＮＡＤＰに対する基質特異性が高い、ＮＡＤＰ利用型の亜リン酸デヒドロゲナーゼを用いることが好ましい場合がある。
ここで、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼとは、ＮＡＤＰに対する基質特異性が野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼに対して向上するように改変された変異型酵素を意味する。
これまでに、α-hydroxysteroid dehydrogenase等のデヒドロゲナーゼのタンパク質立体構造が示され、その立体構造からＮＡＤが結合するRossman-foldドメインから１８アミノ酸残基程度後方に位置する酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸、グルタミン酸）が、ＮＡＤＰの利用性に関与することが示されている（参考文献：Katzberg M., et al., Int. J. Mol. Sci., Vol. 11, 1735-1758, 2010）。また、この酸性アミノ酸残基周辺に正電荷を持つアミノ酸を部位特異的変異により導入すると、ＮＡＤＰの利用能が上昇することが判明している。
亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔｘＤ）についても、Woodyerらが、Pseudomonas sututzeri由来の亜リン酸デヒドロゲナーゼの１７５番目のグルタミン酸および１７６番目のアラニンを、それぞれアラニンとアルギニンとに変更した結果、ＮＡＤＰに対する特異性を上昇させることに成功している（参考文献：Woodyer et al., Biochemistry, Vol. 42, 11604-11614, 2003.）。
本発明の選択的培養方法で利用され得るＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼは、上記の観点からアミノ酸置換を行えばよい。アミノ酸の置換については、自体公知の方法で実施可能であり、当業者は特に試行錯誤を行う必要はない。
後述する実施例では、ＲｓＰｔｘＤの１７５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異型酵素（ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ）、ＲｓＰｔｘＤの１７６番目のプロリンをアルギニンに置換した変異型酵素（ＲｓＰｔｘＤ Ｐ１７６Ｒ）、並びにＲｓＰｔｘＤの１７５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換するとともに１７６番目のプロリンをアルギニンに置換した変異型酵素（ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒ）を取得している。いずれの変異型酵素も野生型酵素に比してＮＡＤＰに対する基質特異性が向上していた。
ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ、ＲｓＰｔｘＤ Ｐ１７６Ｒ、ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９、１０、１１に示した。またＲｓｐｔｘＤ Ｄ１７５Ａ、ＲｓｐｔｘＤ Ｐ１７６Ｒ、ＲｓｐｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒの塩基配列をそれぞれ配列番号１２、１３、１４に示した。
すなわち本発明の選択的培養方法において利用され得る、ＮＡＤＰ利用型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。
（ｅ）配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｆ）配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
また上記ＮＡＤＰ利用型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドであり得る。
（ｇ）配列番号１２、１３、または１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。（ｈ）配列番号１２、１３、または１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
なお、本項の説明において、前項の〔２．亜リン酸デヒドロゲナーゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子〕および〔３．亜リン酸トランスポーターおよび亜リン酸トランスポーター遺伝子〕と共通する項目については、前項の説明を適宜援用することができる。
本発明は以下のように構成することも可能である。
すなわち本発明にかかる微生物の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴としている。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された組換え微生物を、抗生物質を含まず、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養してもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、殺菌条件下および無殺菌条件下のいずれの場合においても、長期間にわたり上記微生物を選択的に培養してもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で、無殺菌条件下で培養してもよい。
亜リン酸デヒドロゲナーゼは、一部のバクテリアのみが有するタンパク質であり、ＮＡＤ依存的に亜リン酸（ＰＯ３）を酸化し、ＮＡＤＨとリン酸とを生成する酵素である。リンは、核酸や脂質などの細胞構成成分であるとともに、生体内情報伝達物質にも必要である。このため、生物に必須な元素の一つであり、全ての生物はリン源無しでは生育することはできない。そして、亜リン酸デヒドロゲナーゼを有し、亜リン酸を資化できる微生物は、極少数のバクテリアのみである。それゆえ、亜リン酸を唯一のリン源とした培地中では、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された目的の微生物および亜リン酸デヒドロゲナーゼを元来有する極少数のバクテリアは生育することができるが、亜リン酸デヒドロゲナーゼを有していない大多数の目的外の微生物は生育することができず、目的外の微生物のコンタミネーションを防止することが可能となる。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記微生物は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、亜リン酸トランスポーター遺伝子とが導入されていてもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記無殺菌条件は、培養装置および培地が無殺菌状態であってもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記培地は抗生物質を含有しない培地であってもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記培養は、１０Ｌ以上の培地中で行われてもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記培養は、開放系で行なわれてもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記微生物には、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドが導入されており、上記微生物の選択的培養方法は、上記プラスミドのコピー数を増加させることができ、かつ、上記微生物を継代培養した場合に、上記プラスミドのコピー数を安定的に維持することができることが好ましい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であってもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドであってもよい：
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記亜リン酸トランスポーター遺伝子は、亜リン酸トランスポーターを構成するＲｓＰｔｘＡ、ＲｓＰｔｘＢ、およびＲｓＰｔｘＣをそれぞれコードするポリヌクレオチドからなり、上記ＲｓＰｔｘＡは、（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＢおよびＲｓＰｔｘＣと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質であり、上記ＲｓＰｔｘＢは、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＡおよびＲｓＰｔｘＣと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質であり、上記ＲｓＰｔｘＣは、（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（６）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＡおよびＲｓＰｔｘＢと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質であってもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記亜リン酸トランスポーター遺伝子は、亜リン酸トランスポーターを構成するＲｓＰｔｘＡ、ＲｓＰｔｘＢ、およびＲｓＰｔｘＣをそれぞれコードするポリヌクレオチドからなり、上記ＲｓＰｔｘＡをコードするポリヌクレオチドは、（７）配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（８）配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、上記ＲｓＰｔｘＢをコードするポリヌクレオチドは、（９）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（１０）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、上記ＲｓＰｔｘＣをコードするポリヌクレオチドは、（１１）配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（１２）配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい：
（ｅ）配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｆ）配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドであってもよい：
（ｇ）配列番号１２、１３、または１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｈ）配列番号１２、１３、または１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記微生物は、以下の（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドが導入されていてもよい：
（ｉ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸トランスポーターおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記微生物は、大腸菌であってもよい。
本発明にかかる微生物の選択的培養方法において、上記微生物は、酵母またはカビであってもよい。
なお、これまで、大腸菌等のバクテリアを利用し、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をクローニングすることは行われている（例えば非特許文献２を参照のこと）。出願人も、熱安定性や比活性が高い亜リン酸デヒドロゲナーゼを見出し、国際出願を行った（国際公開番号：ＷＯ／２０１２／１４７５５６）。この出願においても亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体を培養することを行っている。しかし、従来は、本発明のごとく亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとして利用することによって微生物を選択的に培養するという技術的思想のもとで形質転換体の培養が行われていない。よって、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で、目的微生物以外の微生物の増殖を抑え、目的微生物である形質転換体を選択的に培養することを容易に想到することはできない。また、さらに言えば、従来は、本発明のごとく亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとして利用することによって微生物を選択的に培養するという技術的思想のもとで形質転換体の培養が行われていないために、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で、形質転換体を無殺菌条件下で培養することは行われていない。また亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で形質転換体を無殺菌条件下で培養することを容易に想到することはできない。
さらに、従来は抗生物質耐性遺伝子を選択マーカーとして利用しているため、培地中には抗生物質が必ず含まれている。この点において、従来の形質転換体の培養では、本発明の課題を解決し得ない。これに対して本発明は、抗生物質を培地中に含有させる必要はなく、抗生物質を使用することによる問題点を解決することができる。
〔１．ＲｓｐｔｘＡＢＣＤのクローニング〕
Ralstonia sp. 4506株（参考文献：Hirota et al., J. Biosci. Bioeng., Vol. 113, 445-450, 2012.）の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子：ＲｓｐｔｘＤおよび亜リン酸トランスポーター遺伝子：ＲｓｐｔｘＡＢＣを含む、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤを、以下のようにしてクローニングを行った。
４５０６株の染色体をテンプレートとして、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、約３．６ｋｂの増幅ＤＮＡを取得した。
プライマー配列：
ptxA(-186)fw：５’−GGAATTCTAGCAGGCGTCTATATTTGGCATAG−３’（配列番号１６）なお、５’末端側の「GGAATTC」はクローニングのために付加された配列である。
ptxD_rv ：５'−AAGGATCCCAGATCTATCACGCCGCCTTTACTC−３’（配列番号１７）なお、５’末端側の「AAGGATCC」はクローニングのために付加された配列である。
得られたＤＮＡ断片を精製後、pGEM-Easy T-vector（プロメガ社）にクローニングした。得られたプラスミドのEcoRＩ消化産物を、pSTV28（タカラバイオ社）のEcoRＩ消化産物にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入した。
形質転換体からプラスミドを取得し、得られたプラスミドの中で、lacZの転写方向と同方向にＲｓｐｔｘＡＢＣＤが挿入されているプラスミドを選択し、「RsptxABCD/pSTV28」と命名した（図１を参照のこと。）。
〔２．大腸菌へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕
RsptxABCD/pSTV28を、リン酸および亜リン酸に対する利用能を完全に欠如させた大腸菌MT2012（参考文献：K. Motomura, et al., FEMS Microbiol. Lett., 320, 25-32 (2011)）に導入した。そして、当該大腸菌MT2012を、０．５ｍＭの亜リン酸を含むモルホリノプロパンスルホン酸平板培地：MOPS-Pt（0.5）（０．５ｍＭ ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ、２２．２ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ｐＨ７．２]、５０ｍＭ ＮａＣｌ、９．５２ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、４ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、０．５２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２８ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、０．０１ｍＭ ＦｅＳＯ４、０．０００５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０μＭ ｔｈｉａｍｉｎｅ、１．５％ Ａｇａｒ）に塗布し、３７℃でインキュベートした。
その結果を図２に示す。図２（ａ）はRsptxABCD/pSTV28が導入されていない大腸菌MT2012の結果、図２（ｂ）はRsptxABCD/pSTV28が導入された大腸菌MT2012の形質転換体の結果である。図２によれば、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤが発現した大腸菌のみが、亜リン酸を唯一のリン源とする培地において成育することができた。つまりＲｓｐｔｘＡＢＣＤを大腸菌に導入することによって、大腸菌の選択的培養が可能であるということが示された。
なお、７２時間後に良好な増殖を示す形質転換体のコロニーが確認された。これは、リン酸を獲得できない制限圧がある状態で長時間培養することにより、プラスミド中の遺伝子に自己変異誘導が起こり、適合性が高まったＲｓｐｔｘＡＢＣＤ変異体を持つクローンが出現した可能性が考えられた。
そこで、MOPS-Pt（0.5）上で生育したクローンが持つプラスミドを取得し、ＤＮＡ断片の全てのＤＮＡ塩基配列を決定したところ、ＲｓｐｔｘＡの開始コドンの８塩基上流に位置するＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に変異していることを確認した。この変異はリボソーム結合領域と考えられるため、この変異によってＲｓｐｔｘＡＢＣＤの翻訳量が適切な量に変化した結果、大腸菌に対する適合性が高まり、亜リン酸を効率良く利用できるようになったと考えられた。以後の実験においては、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤ変異体から取得したプラスミドRsptxABCDmt/pSTV28を用いた。
〔３．シアノバクテリアSynechococcus elongates PCC7942へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕
RsptxABCDmt/pSTV28をEcoRＩ消化し、得られたＤＮＡ断片（約３．６ｋｂ）を、S. elongates PCC7942 （以下「ＰＣＣ７９４２株」という。）への遺伝子導入用プラスミドpNSHA(参考文献：Watanabe et al., Mol Microbiol. 2012 Feb;83(4):856-65)のEcoRIサイトに導入した。プロモーター制御とＤＮＡ断片中の遺伝子の向きが同じになっているプラスミドを選択し、RsptxABCDmt/pNSHAとした（図３を参照のこと。）。
RsptxABCDmt/pNSHAを用いて、以下の方法でＰＣＣ７９４２株を形質転換した。ＰＣＣ７９４２株を１０ｍＬのＢＧ−１１培地（ＮａＮＯ3 ：１．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：３０ｍｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：７５ｍｇ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ：３６ｍｇ、クエン酸：６ｍｇ、Ｎａ2 ・ＥＤＴＡ：１ｍｇ、Ｎａ2 ＣＯ3 ：２０ｍｇ、Ｈ3 ＢＯ3 ：２．８６ｍｇ、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ：１．８１ｍｇ、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２２２μｇ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ：０．３９ｍｇ、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ：７９μｇ、Ｃｏ（ＮＯ2 ）2 ・６Ｈ2 Ｏ：４９．４μｇ、ビタミンＢ12：１μｇ、蒸留水：１リットル）で培養し、ＯＤ７５０が０．７〜１．０程度になった後、遠心分離（6,000 rpm、５分間）で集菌し、ＢＧ−１１培地１．０ｍＬに細胞を再懸濁した。この懸濁液４００μＬにプラスミド５μＬ（１００μｇ/ｍＬ）を加え、アルミホイルで遮光して２８℃インキュベーター中でシェーカーを用いて１２時間混合した。
その後、アルミホイルを外してさらに１時間混合を続けた。この菌体混合液を、スペクチノマイシン(４０μＬ/ｍＬ)を含むＢＧ−１１平板培地に塗布し、植物インキュベーター内（照度2000〜3000 Lux, 温度２８℃）で培養を行った。培養開始から約１０日後に得られたコロニーを形質転換体として以後の解析に用いた。
上記で取得した形質転換体を、ＢＧ−１１培地で培養した後、遠心分離（8,000 rpm,５分間）により菌体を沈殿させ、滅菌水で再懸濁した。この操作を３回繰り返すことで菌体懸濁液に残留するリン酸を除去した後、唯一のリン源として０．２ｍＭの亜リン酸を含むＢＧ−１１培地に植菌し、２８℃でインキュベートした。コントロールとしてｐＮＳＨＡをＰＣＣ７９４２株に導入して取得された形質転換体を用いて同様に培養を行った。
その結果を、図４に示す。図４（ａ）はｐＮＳＨＡをＰＣＣ７９４２株に導入して取得された形質転換体（コントロール）の結果であり、図４（ｂ）はRsptxABCDmt/pNSHAをＰＣＣ７９４２株に導入して取得された形質転換体の結果である。図４によれば、RsptxABCDmt/pNSHA が導入された形質転換体のみが増殖した。つまり、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤｍｔが発現することによってシアノバクテリアが亜リン酸を資化できるようになったといえる。このため、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤｍｔをシアノバクテリアに導入することによって、シアノバクテリアの選択的培養が可能であるということが示された。
〔４．部位特異的変異導入によるＲｓＰｔｘＤのＮＡＤＰ利用型への改変〕
ＲｓＰｔｘＤの１７５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体（ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ）、ＲｓＰｔｘＤの１７６番目のプロリンをアルギニンに置換した変異体（ＲｓＰｔｘＤ Ｐ１７６Ｒ）、並びにＲｓＰｔｘＤの１７５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換するとともに１７６番目のプロリンをアルギニンに置換した変異体（ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒ）を取得することにした。変異体の取得方法は以下の通りである。
まずはｐｔｘＤの全長配列を取得するためのプライマー（ＲｓＰＴＸＤ−ＦおよびＲｓＰＴＸＤ−Ｒ）を作製した。以下に、これらのプライマーの塩基配列を示す。
ＲｓＰＴＸＤ−Ｆ：５’−CGGGATCCGATGAAGCCCAAAGTCGTCCTC−３’（配列番号１８）
ＲｓＰＴＸＤ−Ｒ：５’−CGGAATTCGCCGCCTTTACTCCCGGATAC −３’（配列番号１９）
ＲｓＰＴＸＤ−ＦおよびＲｓＰＴＸＤ−Ｒを用いて、４５０６株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を、プラスミドであるｐＥＴ２１ｂ（Novagen社製）へ挿入し、RsPtxD/pET21bを作製した。
次にRsPtxD/pET21bをテンプレートとして、以下のプライマーとPrime Star Mutagenesis Basal Kit (タカラバイオ社)を用いてＰＣＲを行い、キットのマニュアルに従ってコンピテントセルにＤＮＡを導入し、得られたコロニーからプラスミドを得た。なお、シークエンス解析により目的の位置に変異が導入されていることを確認した。
ptxD sdm_DM-fw：５’−TTGCGCACGTATTCCGCTCAATGCCGAA−３’（配列番号２０）
ptxD sdm_DM-rv：５’−GGAATACGTGCGCAATACAAGAGATTCA−３’（配列番号２１）
ptxD sdmP176R-fw：５’−TTGCGATCGTATTCCGCTCAATGCCGAA−３’（配列番号２２）
ptxD sdmP176R-rv：５’−GGAATACGATCGCAATACAAGAGATTCA−３’（配列番号２３）
ptxD sdmD175A-fw：５’−TTGCGCACCGATTCCGCTCAATGCCGAA−３’（配列番号２４）
ptxD sdmD175A-rv：５’−GGAATCGGTGCGCAATACAAGAGATTCA−３’（配列番号２５）
得られたプラスミドを大腸菌Rosetta 2（クロンテック社）に導入し、組換えタンパク質を含む細胞粗抽出液を得た。この細胞粗抽出液を用いて、ＮＡＤおよびＮＡＤＰを基質とした場合の亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した。亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定方法は以下の通りである。
上記で所得された各クローンを、４ｍＬの２×ＹＴ液体培地に植菌し、４５℃にて一晩培養した。１ｍＬの培養液を１．５ｍＬ容量のチューブ内へ入れ、当該チューブを１２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を捨てて菌体のペレットを得た。
培地由来のリン酸を除くために、上記菌体のペレットを１ｍＬのリン成分を含まないＭＯＰＳ培地（ＭＯＰＳ（０）：２２．２ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ｐＨ７．２]、５０ｍＭ ＮａＣｌ、９．５２ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、４ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、０．５２ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．２８ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、０．０１ｍＭ ＦｅＳＯ４、０．０００５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０μＭ ｔｈｉａｍｉｎｅ）中に懸濁し、当該懸濁液を１２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を捨てて菌体のペレットを得た。当該洗浄操作をもう一度行った後、得られた菌体のペレットを１ｍＬのＭＯＰＳ（０）中に懸濁した後、１００μＬの当該懸濁液を１０ｍＬのMOPS-Pt（0.5）に植菌して、４５℃にて培養した。
２４〜７２時間の培養を行って、ＯＤ６００の値が１．５〜２．０に達した時に、全培養液を５０ｍＬの容量のチューブに移し、当該チューブを６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離処理にかけた。遠心分離処理の後、上清を捨てて菌体のペレットを得た。
上記菌体のペレットを１０ｍＬのＭＯＰＳ（０）に懸濁した後で、出力２０％にて、１０分間の超音波破砕（Digital sonifier, BRANSON）を行った。超音波破砕処理を施したＭＯＰＳ（０）を超遠心分離用チューブ（Centrifuge Tubes, BECKMAN, 349622）に分注し、当該チューブを、超遠心分離機（OptimaTM TLX Ultracentrifuge, BECKMANCOULTER）にて、２７０，０００×ｇ、４℃、４５分間の超遠心分離にかけた。
超遠心分離後の上清を回収して、当該上清を、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性測定用の粗抽出液とした。当該粗抽出液（タンパク質量：１０μｇ）、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ（１ｍＭ）、亜リン酸（１ｍＭ）およびＭＯＰＳ−ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を含む、全量１０００μＬの反応液を調製し、当該反応液の温度を４５℃に上昇させて反応を開始させた。所定の時間の間（０〜１８０分）、所定の時間間隔にて１００μＬずつのサンプルを採取し、各サンプルの吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、１ｍｇのタンパク質が単位時間あたりに生成するＮＡＤＨ（ＮＡＤＰ基質の場合はＮＡＤＰＨ）量として評価した。
結果を図５に示す。図５の「ＷＴ」は変異されていないＲｓＰｔｘＤの結果を示し、「Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒ」はＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒの結果を示し、「Ｄ１７５Ａ」はＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａの結果を示し、「Ｐ１７６Ｒ」はＲｓＰｔｘＤ Ｐ１７６Ｒの結果を示す。
ＲｓＰｔｘＤでは、ＮＡＤＰを基質として用いた場合よりもＮＡＤを基質として用いた場合の方が、圧倒的に亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性が高かった（ＮＡＤＰ/ＮＡＤ＝０．０７８５）のに対して、ＲｓＰｔｘＤ Ｐ１７６Ｒの場合はＮＡＤＰを基質として用いた場合の亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性がＷＴに比して高くなった。その結果、ＲｓＰｔｘＤ Ｐ１７６Ｒの場合、ＮＡＤＰ/ＮＡＤ＝０．２３となった。またＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａの場合は、ＮＡＤＰを基質として用いた場合の亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性がＷＴに比して高くなるとともに、ＮＡＤを基質として用いた場合の亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性がＷＴに比して低くなった。その結果、ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａの場合、ＮＡＤＰ/ＮＡＤ＝０．３４となった。さらに、ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒの場合、ＮＡＤを基質として用いた場合よりもＮＡＤＰを基質として用いた場合の方が、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性が高くなった。その結果、ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／ Ｐ１７６Ｒの場合、ＮＡＤＰ/ＮＡＤ＝１．６３となった。つまり、ＲｓＰｔｘＤ Ｄ１７５Ａ／Ｐ１７６Ｒの亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ＷＴに比して２０．７倍高くなっていた。
よって、部位特異的変異導入によって、ＲｓＰｔｘＤのＮＡＤＰ利用能が向上したことが確かめられた。
〔５．大腸菌野生株へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕
上述の〔２．大腸菌へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕では、リン酸および亜リン酸に対する利用能を完全に欠如させた大腸菌MT2012を用いたが、今回は、リン酸および亜リン酸に対する利用能を欠如させていない大腸菌野生株（大腸菌Ｋ−１２株MG1655：以下「大腸菌MG1655」という。(Blomfield IC, et al., Mol. Microbiol. 1991, Jun;5(6):1439-45)）を用いて実験を行った。
大腸菌MG1655にRsptxABCDmt/pSTV28およびpSTV28を導入した株を作製し、４ｍＬのMOPS-Pt(0.5)液体培地を用いて３７℃で終夜培養した。得られた菌体培養液を、MOPS(0)で１回洗浄し、ＯＤ６００が１．０になるように再懸濁したものを、６０ｍＬのMOPS-Pt（0.5）培地が入った３００ｍＬ三角フラスコに１％（ｖ/ｖ）植菌した。植菌後の培養液を３７℃で培養し、経時的にＯＤ６００の値を計測した。得られた値を培養時間に対してプロットし、菌体の比増殖速度を計測した。
その結果を図７に示す。図７はRsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体、およびベクターpSTV28のみが導入された大腸菌MG1655の形質転換体のＯＤ６００経時変化を示すグラフである。
図７によれば、ベクターpSTV28のみが導入された大腸菌MG1655の形質転換体に比して、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体の方が、増殖速度が２倍以上高くなった。ここで、pSTV28のみが導入された大腸菌MG1655の形質転換体の比増殖速度は０．２４８ｈ−１であり、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体の比増殖速度は０．５２４ｈ−１であった。さらに、pSTV28のみが導入された大腸菌MG1655の形質転換体は、ラグタイム（増殖が開始するまでに必要な時間）が、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体に比べ、２倍近くかかることが分かった。これにより、仮に２つの菌が同時に存在した場合は、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体が増殖し終わった時には培地の栄養成分が枯渇し、pSTV28のみが導入された大腸菌MG1655の形質転換体は、もはや増殖が起こらないことが予想できる。よって、大腸菌野生株に対しても、ＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入の効果が確認されたことになる。
〔６．無殺菌培地を用いた開放系培養〕
(i)MOPS-Pt培地および三角フラスコに対して殺菌処理を施さずに培養を行ったこと、および(ii)培養時にはシリコ栓を用いず、開放系で培養を行ったこと、以外は上述の〔５．大腸菌野生株へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕と同様にして実験を行った。
培養終了時の、コンタミネーションの有無を確認するために、クロラムフェニコールを含む２×ＹＴプレートと、クロラムフェニコールを含まない２×ＹＴプレートとに対して、１６時間後の培養液の２×１０5倍希釈液４０μＬをスプレッドした。このプレートを３７℃で終夜培養し、出現コロニー数を計数し、比較した。
図８は、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体を、無殺菌培地および開放系で培養した際の、大腸菌MG1655の形質転換体のＯＤ６００の経時変化を示すグラフである。
増殖速度（０．４７６ｈ−１）および最終到達ＯＤ６００は（１．４５）、共に図７に示す滅菌培地を使用した場合と略同等であった。またクロラムフェニコールを含まない培地におけるコロニー数（３０８±２８個／プレート）と、クロラムフェニコールを含む培地におけるコロニー数（３１５±１４個／プレート）との間に有意差は見られなかった。クロラムフェニコールを含む培地では、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体が増殖できるが、雑菌（目的外の微生物）は増殖できない。クロラムフェニコールを含まない培地では、RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体と雑菌の両方が増殖し得る。もし、雑菌が増えれば、クロラムフェニコールを含まない培地におけるコロニー数が、クロラムフェニコールを含む培地に比べ、１０倍以上に増えることが考えられる。この結果は、無殺菌培地を用いた開放系で培養を行った場合であっても、コンタミネーションがほとんど起こっていないということを意味する。
〔７．継代によるプラスミド保持の安定性〕
RsptxABCDmt/pSTV28が導入された大腸菌MG1655の形質転換体を、MOPS-Pt (0.5)で約１２時間培養し、増殖した後に、新しいMOPS-Pt（0.5）に再び１％（ｖ/ｖ）植菌するという植え継ぎ操作を１０回繰り返した。
得られた菌体（ＯＤ600＝１．０で１．０ｍＬ相当量）からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、４０μＬの滅菌水に溶解させた。このプラスミドＤＮＡ溶液２μＬをアガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイドで染色し、可視化した。
この時のアガロースゲル電気泳動像を図９に示す。１０回継代培養を行ったが、プラスミドＤＮＡのバンドの濃度にほとんど変化が見られず、菌体内のプラスミドＤＮＡ量はほとんど変化していないことが分かった。よって、菌体内のプラスミドＤＮＡは、安定に保持されていると考えられる。このため、本発明の選択的培養方法は、安定的に実施することができるということが確認できた。
〔８．継代によるプラスミド保持の安定性−２〕
RsptxABCDmt/pSTV28をEcoRＩ消化し、得られたＤＮＡ断片（約３．６ｋｂ）を、pUC118（タカラバイオ社）のEcoRＩサイトに導入した。プロモーター制御とＤＮＡ断片中の遺伝子の向きが同じになっているプラスミドを選択し、RsptxABCDmt/pUC118とした（図１０を参照のこと。）。
RsptxABCDmt/pUC118を大腸菌MG1655に導入し、当該大腸菌MG1655を２×ＹＴプレート（アンピシリンを含む）上に塗布し、３７℃にて一晩培養した。得られた大腸菌MG1655の形質転換体のシングルコロニーを２ｘＹＴ液体培地（アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含む）に植菌し、３７℃にて一晩培養し前培養液を作製した。当該前培養液１．０ｍＬを遠心分離して菌体と培養液を分離し、培地由来のリン酸を除くために、上記菌体のペレットを１ｍＬのリン成分を含まないＭＯＰＳ（０）に再懸濁した。この菌体懸濁液０．０４ｍＬを、４．０ｍＬのＭＯＰＳ培地に加えた。上記ＭＯＰＳ培地としては、リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むＭＯＰＳ培地（MOPS-Pi, Amp(-)：２２．２ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ｐＨ７．２］、５０ｍＭ ＮａＣｌ、９．５２ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、４ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、０．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、０．５２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２８ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、０．０１ｍＭ ＦｅＳＯ４、０．０００５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０μＭ ｔｈｉａｍｉｎｅ）、リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含み、さらにアンピシリンを含むＭＯＰＳ培地（MOPS-Pi, Amp(+)：２２．２ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ｐＨ７．２］、５０ｍＭ ＮａＣｌ、９．５２ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、４ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、０．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、０．５２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２８ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、０．０１ｍＭ ＦｅＳＯ４、０．０００５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０μＭ ｔｈｉａｍｉｎｅ、５０ｍｇ／Ｌ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、亜リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むＭＯＰＳ培地（MOPS-Pt(0.5)：組成は上述の〔２．大腸菌へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕を参照）の３つの培地を用意した。
大腸菌MG1655の形質転換体をそれぞれの培地で一晩培養し、増殖した後に、それぞれ新しい培地に再び１％（ｖ／ｖ）植菌するという植え継ぎ操作を５回繰り返した。
初代培養後、および２〜６回継代培養後には毎回、得られた菌体（約１×１０８細胞）からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、４０μＬの滅菌水に溶解させた。このプラスミドＤＮＡ溶液５μＬをアガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイドで染色し、可視化した。
図１１は、RsptxABCDmt/pUC118が導入された大腸菌MG1655の形質転換体（初代培養後、および２〜６回継代培養後）から調製したプラスミドＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す写真図、および、上記形質転換体に含まれるプラスミドの含有量の継代培養による変化を示すグラフである。グラフの横軸は継代数であり、写真図の各バンドも当該継代数に対応している。つまり、写真図の最も左のバンドは初代培養後のバンドである。グラフは初代培養後のプラスミドの含有量を１００％とした場合の変化を表している。図１１の（ａ）は上記形質転換体を、MOPS-Pi, Amp(+)上で培養した結果であり、（ｂ）はMOPS-Pi, Amp(-)上で培養した結果であり、（ｃ）はMOPS-Pt上で培養した結果である。
MOPS-Pi培地にて培養した菌体では、アンピシリンが含まれているか否かにかかわらず、継代培養を重ねるごとにプラスミドの含有量が減少した。これは、プラスミドから発現するアンピシリン分解酵素（アンピシリン耐性に関与する）が、培地のアンピシリンを分解してしまうため、プラスミドの脱落した大腸菌の割合が増えたと考えられる。一方、MOPS-Pt培地にて培養した菌体では、６回継代培養を行ったが、プラスミドＤＮＡのバンドの濃度にほとんど変化が見られず、MOPS-Pi培地にて培養した場合に比べて菌体内のプラスミドＤＮＡ量はほとんど変化していないことが分かった。
図１２は、図１１の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における結果を、上記形質転換体に含まれるプラスミドの含有量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）の継代培養による変化として示すグラフである。プラスミドＤＮＡ含有量は以下のようにして決定した。得られたプラスミドＤＮＡ溶液を適宜希釈し、光路長１．０ｃｍのセルを用いて２６０ｎｍの吸光度を分光光度計により測定し、得られた値に希釈倍率とＤＮＡ濃度係数（５０μｇ／ｍＬ）を乗じて得られたプラスミドＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を算出した。菌体濃度（ＯＤ６００）が１．０の培養液１．０ｍＬ相当の菌体から抽出したプラスミドＤＮＡ濃度をプラスミド含有量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）とした。
図１２より、MOPS-Pt培地にて培養した菌体では、MOPS-Pi培地にて培養した場合に比べてプラスミドＤＮＡ量の変化が小さいだけではなく、プラスミドが高コピー数にて保持されていることがわかる。つまり、本発明の選択的培養方法は、抗生物質を用いること無くプラスミドを高コピー数にて安定的に保持できるという点でも優れているということが確認できた。
〔９．競合株存在下における、ｐｔｘＤが導入された大腸菌の選択的培養〕
コンタミネーションが起こった場合を想定し、競合株存在下におけるｐｔｘＤが導入された大腸菌（以下、ｐｔｘＤ導入株ともいう）の生育について調べた。ｐｔｘＤ導入株としてはアンピシリン耐性を有するMG1655を使用し、競合株としてはカナマイシン耐性を有する大腸菌MG1655(yjbB::Kmr)を使用した。なお、上記ｐｔｘＤ導入株は、〔８．継代によるプラスミド保持の安定性−２〕に記載した方法によって得られた。
上記ｐｔｘＤ導入株と上記競合株とを、亜リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むＭＯＰＳ培地（MOPS-Pt(0.5)：組成は上述の〔２．大腸菌へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕を参照）に混合植菌し、３７℃で１５時間培養した。上記培養は、混合植菌時の総菌体数に対するｐｔｘＤ導入株の割合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％として競合株とともに植菌したMOPS-Pt(0.5)培地をそれぞれ用意して行われた。なお以下では、総菌体数に対するｐｔｘＤ導入株および競合株の割合をそれぞれ単に「ｐｔｘＤ導入株の割合」及び「競合株の割合」と称する。各MOPS-Pt(0.5)培地における総菌体数は４．０×１０６であった。
各MOPS-Pt(0.5)培地から得られた培養物を、アンピシリンを含むＬＢ培地およびカナマイシンを含むＬＢ培地にそれぞれプレーティングし、３７℃で１０時間培養し、出現したコロニー数からｐｔｘＤ導入株および競合株の菌体数を決定した。つまり、アンピシリンを含むＬＢ培地からｐｔｘＤ導入株の菌体数を決定し、カナマイシンを含むＬＢ培地から競合株の菌体数を決定した。アンピシリンを含むＬＢ培地における菌体数（ｃｆｕ）をＡとし、カナマイシンを含むＬＢ培地における菌体数（ｃｆｕ）をＫとすると、培養終了時のｐｔｘＤ導入株の割合Ｄ（％）は以下の式で表される。
Ｄ＝{Ａ／（Ａ＋Ｋ）}×１００
図１３は、培養前および培養後におけるｐｔｘＤ導入株の割合の変化を示す図である。図１３（ａ）は培養前のｐｔｘＤ導入株の割合を示し、図１３（ｂ）は培養後のｐｔｘＤ導入株の割合を示している。図１３の横軸の番号は培地の対応関係を示しており、図１３（ａ）および（ｂ）において同じ番号が付されているデータは同じ培地に由来することを示している。各バーに付された数値はｐｔｘＤ導入株の細胞数を示している。培養前のｐｔｘＤ導入株の割合が２０〜９０％であった場合、培養後のｐｔｘＤ導入株の割合は９５％以上であった。また、培養前のｐｔｘＤ導入株の割合が１０％であった場合においても、培養後のｐｔｘＤ導入株の割合は９０％程度に達した。つまり、本発明の選択的培養方法は、コンタミネーション等により競合株が存在する場合であっても、ｐｔｘＤ導入株を優先的に培養することができるという点で優れていることが確認できた。
〔１０．酵母の亜リン酸資化能力の判定〕
目的酵母菌株にｐｔｘＤを導入して選択的に増殖させるためには、宿主が亜リン酸資化能力を有していないことが前提となる。そこで、分裂酵母に亜リン酸資化能力があるかどうか調べた。
菌株は、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe (Sz. pombe) L972株(h-)、同L975株(h+)（いずれも野生型株）を用いた。前培養ではYeast extract-Peptone-Dextrose （ＹＰＤ）培地 (1.0% yeast extract, 2.0% peptone, 2% glucose) を用い、上記酵母菌株を３０℃で２４時間培養した。得られた菌体培養液１ｍＬをマイクロチューブに移し、遠心分離（３，０００×ｇ、３分）により菌体を沈殿させた。上記マイクロチューブから上清を除いた後、滅菌水１ｍＬで懸濁し、再度遠心分離を行い、菌体を沈殿させた。この操作を３回繰り返し、菌体の洗浄を行った。この後、菌体濃度がＯＤ６００値で１．０になるように、滅菌水を用いて菌体懸濁液の濃度を調整した。
この菌体懸濁液４０μＬを、４ｍＬのEdinburgh minimal medium （ＥＭＭ２）最少培地（Forsburg S.& Rhind N., Yeast, 23:173-183, 2006）を用いた培地に植菌し、２８℃で培養した。亜リン酸資化能力を判定するにあたり、上記培地として、リン源無しの培地(none)、リン酸をリン源とした培地(Pi)、および、亜リン酸をリン源とした培地(Pt)の３種類を作製し、試験に用いた。なお、上記３種類の培地のそれぞれについて、固体培地と液体培地とを作製した。
以下に上記培地の作製方法を示す。寒天を使用した固体培地の作製については、寒天中に含まれる微量のリン酸を取り除くため、洗浄操作を施した寒天を用いた。例えば５０ｍＬの固体培地を作製する場合、遠沈管に１．２ｇの精製寒天末および脱イオン水５０ｍＬを入れ、５分間転倒混和させた後、１，５００ｒｐｍ×３分で遠心分離し、寒天を沈殿させ上清を捨てた。この操作を３回繰り返し、寒天を培地の作製に使用した。リン酸溶液および亜リン酸溶液は濃度１Ｍ、ｐＨ７．０で調製し、フィルター濾過により滅菌処理を行った。ＥＭＭ２培地を用いた全ての培地において、リン源を除く成分をオートクレーブした。その後、リン酸溶液または亜リン酸溶液を終濃度が１５ｍＭとなるようにＥＭＭ２培地に添加し、リン酸をリン源とした培地、および、亜リン酸をリン源とした培地を作製した。
結果を図１４および１５に示す。図１４は、Sz. pombeのL972株およびL975株を、液体培地において４０時間培養した結果を示すグラフである。「none」はリン源無しの培地、「Pi」はリン酸をリン源とした培地、「Pt」は亜リン酸をリン源とした培地において培養した結果である。図１５は、L972株およびL975株を、固体培地において４日培養した結果を示す写真図である。図１５（ａ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、図１５（ｂ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)において培養した結果である。分裂酵母はリン酸をリン源とした最少培地では増殖を示した。一方、亜リン酸をリン源とした培地では増殖しなかった。液体培養および固体培養のどちらにおいても同様の結果が得られた。培養時間を延長しても結果は同様であった。以上のことから分裂酵母は亜リン酸をリン源として利用できないことが明らかになった。
〔１１．分裂酵母へのｐｔｘＤの導入と亜リン酸依存的増殖〕
前述のように分裂酵母は亜リン酸を利用できないことが明らかになったため、ｐｔｘＤを酵母株に導入し機能的に発現させることができれば、亜リン酸を唯一のリン源として生育させることができる可能性がある。本実験においては、分裂酵母において２種類のバクテリア由来のｐｔｘＤ遺伝子を導入し、亜リン酸を利用することができるか検討した。
（１１−１．ＰｔｘＤ発現プラスミドの作製）
発現プラスミドの作製には、Sz. pombeにおけるタンパク質発現システムとして知られるpDUALベクターを用いた（Matsuyama A. et al, Yeast, 21: 1289-1305, 2004）。本ベクターには、プロモーターの強度が高（ＨＦＦ１）、中（ＨＦＦ４１）、低（ＨＦＦ８１）の３つの異なる種類のプラスミドがあり、これらを用いた発現株を構築することにより、ＰｔｘＤ発現強度と増殖との関係について知見が得られると考えた。
ＰｔｘＤ発現プラスミドの作製は、In-Fusion HD Cloning System (タカラバイオ社製)を用いて行った。まず、Ralstonia sp. 4506株由来のｐｔｘＤ（ＲｓｐｔｘＤ、配列番号２）を、Ralstonia sp. 4506株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして下記プライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅した。
pombe_RsptxD IF fw：５’−caccatcatcatatgAAGCCCAAAGTCGTCCTCAC−３’（配列番号２６）
pombe_RsptxD IF rv：５’−atcatccttataatcTCACGCCGCCTTTACTCCCG−３’ （配列番号２７）
また、同様にPseudomonas stutzeri由来のｐｔｘＤ（ＰｓｐｔｘＤ、配列番号２８）を、P. stutzeriの染色体ＤＮＡをテンプレートとして下記プライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅した（配列番号２８の塩基配列によってコードされているタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２９に示す）。
pombe_PsptxD IF fw：５’−caccatcatcatatgCTGCCGAAACTCGTTATAAC−３’（配列番号３０）
pombe_PsptxD IF rv：５’−atcatccttataatcTCAACATGCGGCAGGCTCGGC−３’（配列番号３１）
小文字の配列部分はIn-Fusion Cloning反応において必要となる１５塩基の付加配列を意味する。
また、ベクターＤＮＡとして、pDUAL-HFF1、pDUAL-HFF41、pDUAL-HFF81をテンプレートとして下記プライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、増幅した約７ｋｂのＤＮＡ断片を線状化ベクターとして反応に用いた。
pDUAL_rv：５’−CATATGATGATGGTGGTGATGCATAG−３’（配列番号３２）
pDUAL_fw：５’−GATTATAAGGATGATGACGATAAAC−３’（配列番号３３）
得られたＤＮＡ断片を精製し、キットの説明に従って反応を行い、反応産物で大腸菌DH5aを形質転換して目的クローンを得た。得られたプラスミドのｐｔｘＤ配列は、DYEnamic ET Terminator（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定し、目的ＤＮＡ配列が正しく導入されていることを確認した。具体的な方法は、DYEnamic ET Terminatorに添付のプロトコールに従った。以上の操作により、RsPtxD/HFF1、RsPtxD/HFF41、RsPtxD/HFF81、PsPtxD/HFF1、PsPtxD/HFF41、PsPtxD/HFF81、計６種類のＰｔｘＤ発現プラスミドを構築した。
（１１−２．ＰｔｘＤ発現プラスミドの導入（染色体導入型））
作製したＰｔｘＤ発現プラスミドのSz. pombe染色体への導入は、線状化プラスミドを用いた酢酸リチウム法により行った。本方法では、ゲノム上に１コピーで目的遺伝子が挿入されるため、上記３種類のプロモーターの強度による影響を比較することが可能となる。
具体的には、下記手順に従って形質転換を行った。まず、４ｍＬのＹＥ（５Ｓ）液体培地（3% glucose、0.5% yeast extractsに終濃度１００μｇ／ｍＬで硫酸アデニン、ウラシル、ロイシン、ヒスチジン-HCl、およびリジンをそれぞれ溶解させたもの）で対象株Sz. pombe 635株(leu1-32)を終夜培養し、ＯＤ６００＝０．５程度の培養液を遠心分離し、菌体を沈殿させた。ピペットで上清を除去し、細胞を滅菌水で洗浄した。再度遠心分離を行い、上清を捨て、０．３ｍＬの酢酸リチウム溶液（0.1M Lithium-acetate, TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA) pH 7.5）に懸濁した。これを再び遠心し、酢酸リチウム溶液を取り除き、０．３ｍＬの酢酸リチウム溶液に細胞を懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬに、制限酵素NotＩで処理して線状化したプラスミドＤＮＡ溶液（＜１０μＬ、約１μｇ）をCarrier DNA （サケ精子ＤＮＡ）２μＬとともに混合し、室温で１０分間静置した。その後、５０％ＰＥＧ（polyethylene glycol (average MW 3350) 50% (w/v) in water）を２６０μＬ加えて混合し、６０分間室温で静置した。その後、４３μＬのＤＭＳＯを加えてよく混ぜた後、４２℃で５分インキュベートした。この細胞を上記と同様に滅菌水で２回洗浄し、０．３ｍＬの滅菌水に懸濁した。当該細胞懸濁液０．１ｍＬを亜リン酸またはリン酸をリン源としたＥＭＭ２固体培地（Leu-）にプレーティングした。３０℃で３〜５日程度培養し、形質転換体を得た。
（１１−３．ｐｔｘＤ導入Sz. pombeの亜リン酸培地における増殖）
得られた形質転換体のコロニーをＹＰＤ培地に植菌し、終夜培養した。この培養液を〔１０．酵母の亜リン酸資化能力の判定〕の項と同様に洗浄し、菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液４０μＬを亜リン酸またはリン酸をリン源とするＥＭＭ２培地（４ｍＬ）に植菌して２８℃で培養を行い、経時的にＯＤ６００値を計測した。
結果を図１６および１７に示す。図１６は、Sz. pombeの形質転換体を固体培地において培養した結果を示す写真図である。図１６（ａ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、図１６（ｂ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)において培養した結果である。図１７は、Sz. pombeの形質転換体を液体培地において培養した結果を示すグラフである。図１７（ａ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、図１７（ｂ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)において培養した結果である。なお、「Ｒｓ−１」はRsPtxD/HFF1導入株、「Ｒｓ−４１」はRsPtxD/HFF41導入株、「Ｒｓ−８１」はRsPtxD/HFF81導入株、「Ｐｓ−１」はPsPtxD/HFF1導入株、「Ｐｓ−４１」はPsPtxD/HFF41導入株、「Ｐｓ−８１」は、PsPtxD/HFF81導入株、「Control」はpDUAL-HFF41導入株を表す。
ＨＦＦ１プロモーター制御下でＲｓＰｔｘＤおよびＰｓＰｔｘＤを発現するSz. pombeは、亜リン酸をリン源とした培地において培養４日ほどで生育を示した（図１６（ｂ））。一方、コントロールプラスミドを導入した株は生育を示さなかった。ＨＦＦ４１、ＨＦＦ８１制御下のコンストラクトでは培養期間を延長することで弱い生育が観察された。以上の結果から、分裂酵母においてＰｔｘＤを発現させることで亜リン酸をリン源として増殖することが可能であることが明らかとなった。
液体培養においても、同様にＨＦＦ１プロモーター制御下でＲｓＰｔｘＤおよびＰｓＰｔｘＤを発現するSz. pombeは亜リン酸をリン源とした培地で良好な増殖を示した（図１７（ｂ））。最終到達ＯＤはリン酸を用いたときとほぼ遜色ないレベルであった。ＨＦＦ４１制御下の発現系においてもＨＦＦ１制御下の場合には劣るが、増殖が見られた。なお、〔４．部位特異的変異導入によるＲｓＰｔｘＤのＮＡＤＰ利用型への改変〕に記載の測定方法によって、細胞粗抽出液のＰｔｘＤ活性を測定したところ、プロモーターの強度とＰｔｘＤ活性は比例関係にあった。以上の結果から、亜リン酸依存的な増殖はＰｔｘＤの発現強度に依存している事が明らかになった。
液体培養における増殖特性において、ＲｓＰｔｘＤまたはＰｓＰｔｘＤのどちらを用いた場合も、同程度の生育が見られたことから、両者の機能に大きな差は無いと考えられる。
以上のように、ｐｔｘＤの導入によってSz. pombeは本来利用することのできない亜リン酸を利用して生育することができた。すなわち、ＰｔｘＤがSz. pombeのマーカーとして利用できる可能性が示された。また、亜リン酸依存的な増殖速度はＰｔｘＤの発現強度に依存している事が明らかになった。さらに２種類のＰｔｘＤ（Ralstonia sp. 4506由来ＰｔｘＤ (ＲｓＰｔｘＤ)、Pseudomonas sp.由来ＰｔｘＤ（ＰｓＰｔｘＤ））のどちらも同様の効果があることが明らかになった。
〔１２．ｐｔｘＤ導入プラスミドを保持した分裂酵母の選択的培養〕
ＰｔｘＤをマーカーとして利用する場合、プラスミドに導入して利用するケースが想定される。そこで、ＰｔｘＤ発現プラスミドを細胞内で保持させた場合に機能的に作用するか、また、ＰｔｘＤ発現プラスミドで形質転換された株が、亜リン酸最少培地で選択的にスクリーニングできるか調べた。
使用菌株には、Sz. pombe KSP632(ura4-D18)、プラスミドは（１１−１．ＰｔｘＤ発現プラスミドの作製）で作製したRsPtxD/HFF1、コントロールプラスミドとしてpDUAL-HFF1を使用した。プラスミドによる菌株の形質転換は、制限酵素処理とCarrier DNAの使用が不要である点を除いては、（１１−２．ＰｔｘＤ発現プラスミドの導入（染色体導入型））と同様に操作を行った。形質転換操作後の菌体溶液は、リン源無しの培地(none)、リン酸をリン源とした培地(Pi)、および、亜リン酸をリン源とした培地(Pt)の３種類のＥＭＭ２固体培地にプレーティングし、２８℃で７日間培養した。
結果を図１８に示す。図１８（ａ）はコントロールプラスミドを導入した形質転換体における結果、図１８（ｂ）はRsPtxD/HFF1プラスミドを導入した形質転換体における結果を示す写真図である。図１８（ａ）および（ｂ）のそれぞれにおいて、（ｉ）はリン源無しの培地(none)、（ｉｉ）はリン酸をリン源とした培地(Pi)、（ｉｉｉ）は亜リン酸をリン源とした培地(Pt)における結果を示す。また、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）はそれぞれ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の拡大図である。
コントロールプラスミドおよびRsPtxD/HFF1プラスミドを導入した分裂酵母は、どちらもリン酸をリン源としたＥＭＭ２プレートではコロニーを形成した（図１８（ａ）の（ｉｉ）および図１８（ｂ）の（ｉｉ））。このことから、それぞれのプラスミドが目的菌株に形質転換されていることが確認された。しかし、亜リン酸をリン源としたプレートにおいてはコントロールプラスミドを導入した株は全く生育できない一方、ＲｓｐｔｘＤを導入した株はコロニーを形成した（図１８（ａ）の（ｉｉｉ）および図１８（ｂ）の（ｉｉｉ））。
このことから、ｐｔｘＤを導入することで、形質転換体をプレート上で容易に判別できることが明らかとなった。また、RsPtxD/HFF41を用いた場合でもわずかではあるが形質転換体が得られた（データ示さず）。このことは、弱いプロモーターを用いた場合でも、亜リン酸資化能力を発揮するために十分なタンパク質発現量を確保できるコピー数のｐｔｘＤがあれば、亜リン酸依存的な生育が可能であることを意味している。以上の結果から、ｐｔｘＤは酵母の有用な選択マーカーとして利用できることが示された。
〔１３．競合株存在下における、ｐｔｘＤが導入された大腸菌の選択的培養−２〕
コンタミネーションが起こった場合を想定し、競合株存在下におけるｐｔｘＤが導入された大腸菌の生育について調べた。ｐｔｘＤ導入株としてはアンピシリン耐性を有するMG1655を使用し、競合株としては亜リン酸を利用しないBacillus subtilisを使用した。なお、上記ｐｔｘＤ導入株は、〔８．継代によるプラスミド保持の安定性−２〕に記載した方法によって得られた。
上記ｐｔｘＤ導入株と上記競合株とを、亜リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むＭＯＰＳ培地（MOPS-Pt(0.5)：組成は上述の〔２．大腸菌へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕を参照）に混合植菌し、３７℃で１５時間培養した。上記培養は、混合植菌時の総菌体数に対するｐｔｘＤ導入株の割合を２．９％、１３．４％、２４．６％、４２．４％、５５．８％、６６．２％、７４．６％、８１．５％、８７．３％、９２．２％、９６．４％としてB.subtilisとともに植菌したMOPS-Pt(0.5)培地をそれぞれ用意して行われた。なお以下では、総菌体数に対するｐｔｘＤ導入株および競合株の割合をそれぞれ単に「ｐｔｘＤ導入株の割合」及び「競合株の割合」と称する。各MOPS-Pt(0.5)培地における総菌体数は１．４×１０６〜３．７×１０６の間であった。
各MOPS-Pt(0.5)培地から得られた培養物を、アンピシリンを含むＬＢ培地および通常のＬＢ培地にそれぞれプレーティングし、３７℃で１０時間培養し、出現したコロニー数からｐｔｘＤ導入株および競合株の菌体数を決定した。B. subtilisのコロニーは、その形態から明確に大腸菌のコロニーと区別できたため、ＬＢ培地上でのコロニーを計数する事で測定した。つまり、アンピシリンを含むＬＢ培地からｐｔｘＤ導入株の菌体数を決定し、通常のＬＢ培地から競合株の菌体数を決定した。アンピシリンを含むＬＢ培地における菌体数（ｃｆｕ）をＡとし、通常のＬＢ培地におけるB. subtilisの菌体数（ｃｆｕ）をＢとすると、培養終了時のｐｔｘＤ導入株の割合Ｄ（％）は以下の式で表される。
Ｄ＝{Ａ／（Ａ＋Ｂ）}×１００
表１は、培養前および培養後におけるｐｔｘＤ導入株およびB. subtilisの菌体数および割合の変化を示す。
図１９は、培養前および培養後におけるｐｔｘＤ導入株の割合の変化を示す図である。つまり図１９は表１に示される実験結果を図として表したものである。図１９（ａ）は培養前のｐｔｘＤ導入株の割合を示し、図１９（ｂ）は培養後のｐｔｘＤ導入株の割合を示している。図１９の横軸の番号は培地の対応関係を示しており、表１、図１９（ａ）および（ｂ）において同じ番号が付されているデータは同じ培地に由来することを示している。各バーに付された数値はｐｔｘＤ導入株の細胞数を示している。いずれの条件においても、培養後のｐｔｘＤ導入株の割合は９９％以上に達した。つまり、本発明のｐｔｘＤ導入株の選択的培養方法は、他種微生物の増殖を長期に防ぐことができることが確認できた。
〔１４．競合株存在下における、ｐｔｘＤが導入された大腸菌の選択的培養−３〕
上述の〔１３．競合株存在下における、ｐｔｘＤが導入された大腸菌の選択的培養−２〕の表１の１１番と同様の条件で、長期間にわたる選択的培養について調べた。つまり、ｐｔｘＤ導入株３％、B. subtilis９７％（総菌体数１．５×１０６）を、亜リン酸（０．５ｍＭ）を唯一のリン源として含むＭＯＰＳ培地（MOPS-Pt(0.5)：組成は上述の〔２．大腸菌へのＲｓｐｔｘＡＢＣＤ導入と亜リン酸培地での増殖〕を参照）に混合植菌し、３７℃で０時間、２４時間、４８時間または７２時間培養した。菌体数の測定方法は、上述の〔１３．競合株存在下における、ｐｔｘＤが導入された大腸菌の選択的培養−２〕と同様である。
結果を表２に示す。
また、図２０は、表２に示される実験結果を図として表したものである。当該実験により、亜リン酸利用能が無い競合株が３０倍以上の割合で持ち込まれた状態で長期間培養しても、競合株は増殖せず、ｐｔｘＤ導入株のみが選択的に増殖することが確認できた。
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明は、バイオ燃料の生産をはじめとする、微生物を利用した物質生産の分野において広く利用することができる。

Claims (16)

  1. 亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された組換え微生物を、抗生物質を含まず、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養し、
    上記微生物には、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、生産を行うべき目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むプラスミドが導入されており、
    上記微生物を継代培養した場合に、上記プラスミドのコピー数を安定的に維持することができ、
    上記微生物は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、亜リン酸トランスポーター遺伝子とが導入されており、
    上記亜リン酸トランスポーター遺伝子は、
    亜リン酸トランスポーターを構成するＲｓＰｔｘＡ、ＲｓＰｔｘＢ、およびＲｓＰｔｘＣをそれぞれコードするポリヌクレオチドからなり、
    上記ＲｓＰｔｘＡは、（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＢおよびＲｓＰｔｘＣと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質であり、
    上記ＲｓＰｔｘＢは、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＡおよびＲｓＰｔｘＣと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質であり、
    上記ＲｓＰｔｘＣは、（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（６）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＲｓＰｔｘＡおよびＲｓＰｔｘＢと会合した際に亜リン酸トランスポーターとして機能するタンパク質であることを特徴とする、微生物の選択的培養方法。
  2. 殺菌条件下および無殺菌条件下のいずれの場合においても、１５時間以上にわたり上記微生物を選択的に培養することを特徴とする請求項１に記載の、微生物の選択的培養方法。
  3. 上記無殺菌条件は、培養装置および培地が無殺菌状態である、請求項２に記載の、微生物の選択的培養方法。
  4. 上記培養は、１０Ｌ以上の培地中で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
  5. 上記培養は、開放系で行なわれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
  6. 上記微生物の選択的培養方法は、上記プラスミドのコピー数を増加させることができることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
  7. 上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
  8. 上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法：
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  9. 上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法：
    （ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  10. 上記亜リン酸トランスポーター遺伝子は、
    亜リン酸トランスポーターを構成するＲｓＰｔｘＡ、ＲｓＰｔｘＢ、およびＲｓＰｔｘＣをそれぞれコードするポリヌクレオチドからなり、
    上記ＲｓＰｔｘＡをコードするポリヌクレオチドは、（７）配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（８）配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、
    上記ＲｓＰｔｘＢをコードするポリヌクレオチドは、（９）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（１０）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、
    上記ＲｓＰｔｘＣをコードするポリヌクレオチドは、（１１）配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または（１２）配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載の、微生物の選択的培養方法。
  11. 上記ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項７に記載の、微生物の選択的培養方法：
    （ｅ）配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｆ）配列番号９、１０、または１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 上記ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項７に記載の、微生物の選択的培養方法：
    （ｇ）配列番号１２、１３、または１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｈ）配列番号１２、１３、または１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮＡＤＰ利用型亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
  13. 上記微生物は、以下の（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする請求項１に記載の、微生物の選択的培養方法：
    （ｉ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
    （ｊ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸トランスポーターおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
  14. 上記微生物は大腸菌であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
  15. 上記微生物は酵母またはカビであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
  16. 上記微生物は藻類であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の、微生物の選択的培養方法。
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