JP7236161B2 - 形質転換体および当該形質転換体を用いた還元型リン化合物の有無の検出方法 - Google Patents
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Description
リン酸(または、リン酸化合物)は自然界に多量に存在する一方で、還元型リン化合物(例えば、亜リン酸、および、次亜リン酸)は、存在しないか、または、存在したとしても非常に少量である。この場合、リン酸には依存せず、かつ、還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体を作製すれば、当該形質転換体は、たとえ自然界に漏れたとしても、自然界では増殖することができない。本発明者は、この点に着目し、リン酸には依存せず、かつ、還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体を作製した。その結果、高い封じ込め効果を有する形質転換体の実現に成功した。
本実施形態の形質転換体は、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の1つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換されていることを特徴としている。
(45)配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(46)配列番号14で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;
(47)配列番号13で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または、
(48)配列番号13で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(49)配列番号61で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または、
(50)配列番号61で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(52)配列番号62で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質;
アルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質が、亜リン酸をリン酸へ変換するか否かに基づいて、確認することができる。具体的に、所望のタンパク質と亜リン酸とを混合した後、リン酸が生成されていれば、当該タンパク質がアルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質であると判定することができる。
本実施の形態の還元型リン化合物の有無の検出方法は、検出対象である培地中の還元型リン化合物の有無の検出方法であって、本発明の形質転換体を、検出対象である培地を用いて培養する培養工程と、該培養工程における形質転換体の増殖の有無を検出する検出工程と、を有することを特徴としている。
本発明の一態様に係る形質転換体は、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の1つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換されていることを特徴としている。
シアノバクテリアへ、亜リン酸資化能を付与するための発現ベクターを作製した。まず、Synechococcus elongatus PCC7942株(以下7942株と称する)用の発現ベクターであるpNSHA(参考文献1:Watanabe et al., Mol Microbiol. 2012 Feb;83(4):856-65)をEcoRIおよびHindIIIで切断した。切断後の発現ベクターに対し、Ralstonia sp. 4506株(以下4506株と称する)の染色体をテンプレートとして、以下のプライマーを用いて、PCRにより増幅したDNA断片(約3.6kb)を、In-Fusion HD cloning kit(タカラバイオ)を用いて挿入した:
P0048:5’-acagaccatggaattcGTGTCATATCACGACATTACCATCG-3’(配列番号23)
P0049:5’-caaaacagccaagcttTCACGCCGCCTTTACTCCCGGATAC-3’(配列番号24)。
HtxBCDEタンパク質は、Pseudomonas stutzeri WM88株由来の次亜リン酸輸送体である。HtxBCDEタンパク質の発現プラスミドは、以下の方法で作製した。
P0132:5’-ACAGACCATGGAATTCATGCAAGTTTTTACTCTGTT-3’(配列番号25)
P0133:5’-AGCTGAAGGCGTCGACTAGTAGTTGCGGGCCGCGA-3’(配列番号26)。
HtxBタンパク質のシグナルペプチド配列(配列番号60)を、シアノバクテリア等が有する3種類のバクテリアタンパク質由来のものに置換した発現プラスミドを作製し、その効果を検証した。まず、pSTVhtxAEをテンプレートとし、プライマーP0268およびP0269を用いたインバースPCRによって、シグナルペプチド配列を除去した、HtxBの発現ベクターを得た:
P0268:5’-CATGGTGATGCTCCTAGGATCCCCG-3’(配列番号27)
P0269:5’-GCTGAGGTTGTCAATGGTAAACTTC-3’(配列番号28)。
リン酸に対する依存性を欠損させるため、7942株のリン酸輸送体の遺伝子破壊を行った。Kazusa Genome Resourceにおいて公開されている7942株のゲノムデータ(シアノベース:http://genome.microbedb.jp/cyanobase/)より、PCC7942にはpit(データベース中の遺伝子名:Synpcc7942_0184)およびsphX-pstSCAB(データベース中の遺伝子名:Synpcc7942_2445-2441)の2種類のリン酸輸送体遺伝子が存在することが示唆された。そこで、これらの遺伝子を、相同組換えを利用して破壊した。遺伝子破壊は、pit(配列番号1)の上流および下流の各々の配列約1kbの間にゲンタマイシン耐性遺伝子(配列番号29)を挿入したDNA断片と、sphX-pstSCAB(配列番号3)の上流および下流の各々の配列約1.5kbの間にカナマイシン耐性遺伝子(配列番号30)を挿入したDNA断片とをOverlap extension-PCRにより作製し、得られたDNA断片の各々約0.1μgを用いて7942株を形質転換することによって行った。プライマーは、表2に示すものを使用した。
25mLのBG-11Pt液体培地で5日間培養したRH714を遠心分離で集菌し、リン酸フリーのBG-11培地で3回洗浄後、約10mLの同培地で再懸濁した。菌体懸濁液0.1mLを10-5~10-8倍に希釈し、BG-11Ptプレート(許容培地)に希釈後の菌体懸濁液を0.1mLをスプレッドした。残りの菌体懸濁液を245mm×245mm角形ディッシュで作製した5枚のBG-11プレート(非許容培地)に約2.0mLずつスプレッドした。
[検出限界値(escapee/CFU)]=1/([許容培地で形成されたコロニー数(CFU)]×[希釈倍率(-)]÷[スプレッドした培養液量(mL)]×[使用した培養液量(mL)])
本実験における検出限界値は、3.6×10-11であった。
HtxBタンパク質のシグナルペプチド配列(配列番号60)を、シアノバクテリア等が有する3種類のタンパク質由来のシグナルペプチド配列に置換した、HtxBCDEタンパク質の発現プラスミドを作製し、かつ、当該発現プラスミドを大腸菌に導入した。
Claims (5)
- リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されており、更に、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、
上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の1つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主、宿主に近縁な生物種、シアノバクテリア、またはラルストニアに由来するシグナルペプチドに置換されており、
上記宿主に近縁な生物種は、上記宿主の属(genus)と同一属の生物である、形質転換体。 - 更に、アルカリホスファターゼタンパク質をコードする遺伝子の機能が欠損していることを特徴とする請求項1に記載の形質転換体。
- 上記形質転換体が、原核生物の形質転換体であることを特徴とする請求項1または2に記載の形質転換体。
- 上記形質転換体が、シアノバクテリアの形質転換体であることを特徴とする請求項3に記載の形質転換体。
- 検出対象である培地中の還元型リン化合物の有無の検出方法であって、
請求項1~4の何れか1項に記載の形質転換体を、検出対象である培地を用いて培養する培養工程と、
上記培養工程における上記形質転換体の増殖の有無を検出する検出工程と、を有することを特徴とする還元型リン化合物の有無の検出方法。
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