JP7236161B2 - 形質転換体および当該形質転換体を用いた還元型リン化合物の有無の検出方法 - Google Patents

形質転換体および当該形質転換体を用いた還元型リン化合物の有無の検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、形質転換体および当該形質転換体を用いた還元型リン化合物の有無の検出方法に関する。
近年、多岐の用途に適用可能な遺伝子組み換え生物が作製されている。作製された遺伝子組み換え生物は、例えば、経口ワクチン剤、または、自然環境の改善などの目的に使用されることが期待されている。
その一方で、遺伝子組み換え生物を実際に用いる為には、いくつか条件がある。条件の１つとして、限定された場所のみにおいて増殖し、当該場所以外では増殖出来ない遺伝子組み換え生物（換言すれば、封じ込め効果の高い遺伝子組み換え生物）を作製する必要がある。このような遺伝子組み換え生物であれば、たとえ当該遺伝子組み換え生物が自然界に漏れ出たとしても、当該遺伝子組み換え生物が自然界で増殖することはできず、当該遺伝子組み換え生物によって自然界が汚染されることを防ぐことができる。
このような遺伝子組み換え生物を作製するための様々な方法が開発されている。方法の１つに、生物に対して、自然界には存在しない化合物に対する栄養要求性を付与する方法（合成栄養要求性（synthetic auxotrophy））がある。該方法を開示した具体例として、非特許文献１を挙げることができる。非特許文献１では、本発明者が、環境中にほとんど存在しない亜リン酸に依存して生育するように代謝を改変することで、世界最高レベルの封じ込め効果を示す、大腸菌の形質転換体の作製に成功している。
Ryuichi Hirota et. al., A Novel Biocontainment Strategy Makes Bacterial Growth and Survival Dependent on Phosphite，Scientific RepoRts，20 March 2017
本発明者が開発した形質転換体は、従来の合成栄養要求性を付与された形質転換体と比べ、高い封じ込め効果を有し、かつ形質転換体の増殖のために発生するコストを低減するものであった。それ故に、大腸菌に限らず、多種の生物を宿主として、亜リン酸に依存して増殖する形質転換体、および、該形質転換体を自然界において適切な場所（換言すれば、亜リン酸化合物が含まれない場所）を確実に選択し、該場所のみで該形質転換体を培養させる為の手段の開発が期待されている。
本発明の一態様は、亜リン酸に依存して増殖を行う様々な生物種の形質転換体および該形質転換体を用いた還元型リン化合物の有無の検出方法の実現を目的とする。
本発明者は、大腸菌の形質転換体を作製する技術を、別の宿主に用いようとしたが、別の宿主では所望の形質転換体を得ることができなかった。本発明者は、鋭意検討した結果、宿主内で発現させる特定のタンパク質の局在が所望の形質転換体の作製の可否に関与していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る形質転換体は、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換されていることを特徴としている。
上記課題を解決するために、本発明の一態様に係る還元型リン化合物の有無の検出方法は、検出対象である培地中の還元型リン化合物の有無の検出方法であって、本発明の一態様に係る形質転換体を、検出対象である培地を用いて培養する培養工程と、上記培養工程における上記形質転換体の増殖の有無を検出する検出工程と、を有することを特徴としている。
本発明の一態様に係る形質転換体では、次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドを、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換することにより、次亜リン酸輸送体タンパク質の機能を宿主において確実に発現させることができる。従って、亜リン酸に依存して増殖し、かつ高い封じ込め効果を発揮する、様々な生物種の形質転換体を実現することが可能である。
本発明の一態様に係る形質転換体は、安価な還元型リン化合物を用いて培養されるため、形質転換体の増殖におけるコストを低減することが可能である。
本発明の一態様に係る形質転換体は、高価な抗生物質などを使用せずに培養されるため、形質転換体の増殖におけるコストを低減することが可能である。
本発明の一態様に係る還元型リン化合物の有無の検出方法は、安価な還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体を用いることにより、煩雑な工程を必要とせず、かつ形質転換体の増殖のために発生するコストを低減できるような、還元型リン化合物の有無の検出方法を実現できる。
本発明の形質転換体の構造を説明するための図である。 膜に結合しているＨｔｘＢＣＤタンパク質の構造を説明するための図である。 ＨｔｘＢのシグナルペプチド、ＨｔｘＢのシグナルペプチドと置換される各シグナルペプチド、および、ＨｔｘＢのシグナルペプチドが置換されたHtxBCDE-PtxD融合プラスミドを説明するための図である。 実施例における各プラスミドの構造を説明するための図である。 （ａ）は、リン酸および亜リン酸依存的増殖の結果を示す像である。（ｂ）は、リン酸および亜リン酸依存的増殖の結果を示すグラフである。 （ａ）および（ｃ）は、破壊株ＲＨ７１４と野生株とにおける、１９２時間後の増殖の様子を示す像である。（ｂ）および（ｄ）は、破壊株ＲＨ７１４と野生株との、増殖の経時的変化を示すグラフである。 各リン化合物をリン源とする培地にて培養された破壊株ＲＨ７１４の増殖の様子を示す像である。 破壊株ＲＨ７１４の生存菌数の経時的変化を示すグラフである。 亜リン酸依存的増殖の結果を示すグラフである。
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ～Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
〔１．本発明の基本原理〕
リン酸（または、リン酸化合物）は自然界に多量に存在する一方で、還元型リン化合物（例えば、亜リン酸、および、次亜リン酸）は、存在しないか、または、存在したとしても非常に少量である。この場合、リン酸には依存せず、かつ、還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体を作製すれば、当該形質転換体は、たとえ自然界に漏れたとしても、自然界では増殖することができない。本発明者は、この点に着目し、リン酸には依存せず、かつ、還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体を作製した。その結果、高い封じ込め効果を有する形質転換体の実現に成功した。
上記形質転換体について、図１を用いて説明する。図１は、本発明の形質転換体の構造を説明するための図である。図１に示すように、生物には、基本的に、リン酸輸送体タンパク質、および、リン酸エステル輸送体タンパク質が存在している。
リン酸輸送体タンパク質は、リン酸および還元型リン化合物を細胞内に取り込むタンパク質である。一方、リン酸エステル輸送体タンパク質は、リン酸エステルを細胞内に取り込むタンパク質である。なお、リン酸エステルが細胞内に取り込まれると、細胞内の代謝系によって、当該リン酸エステルは、間接的にリン源として利用される。
自然界から細胞内へリン酸が供給されることにより、形質転換体が自然界において、リン酸に依存して増殖することを防ぐため、本発明者はまず、形質転換体では、リン酸輸送体タンパク質、および、リン酸エステル輸送体タンパク質の両方の機能を欠損させた。その結果、自然界から形質転換体の細胞内へのリン酸の供給を防止できた。
しかし、リン酸輸送体タンパク質、および、リン酸エステル輸送体タンパク質の両方の機能を欠損させることで、自然界から細胞内へ、リン酸だけでなく還元型リン化合物も供給されなくなった。この場合、形質転換体は、還元型リン化合物に依存して増殖できなくなる。
本発明者は、シュードモナス・スタッツェリ ＷＭ８８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＷＭ８８）由来のＨｔｘＢＣＤＥ遺伝子（または、ＨｔｘＢＣＤ遺伝子）がコードする次亜リン酸輸送体タンパク質が、還元型リン化合物を輸送し、リン酸を輸送しないという機能を有することを発見することにより、上述の問題を解決した。
すなわち、本発明者は、宿主のリン酸輸送系の機能を欠損させ、かつ、宿主にＨｔｘＢＣＤＥ遺伝子（または、ＨｔｘＢＣＤ遺伝子）を導入することで、還元型リン化合物のみを利用する形質転換体を作製した。形質転換体がＨｔｘＢＣＤＥタンパク質（または、ＨｔｘＢＣＤタンパク質）を発現すれば、当該形質転換体は、細胞内に還元型リン化合物のみを取り込むことができる。当該還元型リン化合物は、細胞内の代謝系によってリン酸へと変換され、当該リン酸を利用して形質転換体は増殖することができる。
本発明者が発明した上述の形質転換体は、合成栄養要求性が付与された従来の形質転換体（具体的に、大腸菌の形質転換体）と比べ、形質転換体の作製時に煩雑な工程を必要とせず、かつ形質転換体の増殖のために発生するコストを低減できるものであった。更に、該形質転換体は、高い封じ込め効果を有するものであった。それ故に、大腸菌を含む、多種の生物を宿主とした、還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体が期待されていた。
該形質転換体の作製が望まれている、大腸菌以外の生物の例としては、例えば、原核生物の代表例である微細藻類が挙げられる。微細藻類は、植物に比べて増殖速度が速く、かつ、二酸化炭素を固定しながら様々な有用物質を合成できる。また、微細藻類は、環境負荷の少ない物質の生産を行うことができる。上述の理由から、微細藻類は、宿主としての利用が期待されている。さらに、遺伝子組み換え技術の発展を受け、様々な有用形質を持つ組み換え微細藻類が開発されるとともに、該組み換え微細藻類を商業的に用いることが期待されている。
しかし、物理学的な封じ込めが困難な屋外培養では、組み換え生物の使用の承認を得ることが難しく、該組み換え生物の屋外培養の実施が困難であった。そのため、多種の生物において、高い生物学的封じ込め効果を発揮する形質転換体が求められていた。
そこで、本発明者は、原核生物の代表例であるシアノバクテリアを宿主とする形質転換体の作製を試みた。具体的には、（ｉ）リン酸輸送体タンパク質、および、リン酸エステル輸送体タンパク質の機能を欠損させ、（ｉｉ）亜リン酸をリン酸へ変換する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を導入し、および（ｉｉｉ）ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質（または、ＨｔｘＢＣＤタンパク質）を発現させる、３つの工程をシアノバクテリアに行うことで、形質転換体の作製を試みた。しかし、シアノバクテリアにおいては、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質（または、ＨｔｘＢＣＤタンパク質）の機能が発現しなかった。
ここで、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質およびＨｔｘＢＣＤタンパク質の詳細について、図２を用いて説明する。図２は、膜に結合しているＨｔｘＢＣＤＥタンパク質およびＨｔｘＢＣＤタンパク質の構造を便宜的に説明するための図である。ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質およびＨｔｘＢＣＤタンパク質は、膜結合型のタンパク質の複合体であり、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質、並びに、任意でＨｔｘＥタンパク質（図示せず）によって構成されている。
ＨｔｘＢは、細胞膜の外側のペリプラズムに局在するタンパク質である。ＨｔｘＣは、細胞膜と結合するタンパク質である。ＨｔｘＤは、細胞質に存在し、ＡＴＰａｓｅ活性を有するタンパク質である。図２に示すとおり、これらのタンパク質のうち、ＨｔｘＢが、基質の亜リン酸（図２中のＰｔ）と結合する。
本発明者は、考え得る多くの原因の中で、ＨｔｘＢＣＤＥ遺伝子をシアノバクテリアへ導入した場合、ＨｔｘＢタンパク質が適切な場所（具体的に、ペリプラズム）に局在できなかった（図２中の、点線矢印よりも左側を参照）ことにより、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質およびＨｔｘＢＣＤタンパク質の機能が発現しなかった、と考えた。なお、図２中の、点線矢印よりも右側は、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質およびＨｔｘＢＣＤタンパク質の機能が発現しているときのＨｔｘＢの局在を示している。
そこで、本発明者は、ＨｔｘＢタンパク質の配列のうち、シグナルペプチドの配列を、宿主に由来するシグナルペプチドの配列へ置換し、置換されたＨｔｘＢタンパク質を含むＨｔｘＢＣＤＥタンパク質をシアノバクテリアにて発現させることにより、シアノバクテリアのペリプラズムにＨｔｘＢタンパク質が適切に局在しできると、仮説を立て、検証した。
本発明者は、上述の（ｉ）、（ｉｉ）の工程を行うと同時に、上述の（ｉｉｉ）の工程として、次の工程を実施した。すなわち、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質の配列のうち、ＨｔｘＢタンパク質のシグナルペプチドの配列を、微細藻類由来のペリプラズムタンパク質のシグナルペプチドへ置換した。具体的に、シアノバクテリアの１種であるアナベナ（Anabaena sp. PCC7120）が有するペリプラズムタンパク質ＰｔｘＢのシグナルペプチド配列を、ＨｔｘＢタンパク質のシグナルペプチドの配列と置換した。そして置換後のＨｔｘＢタンパク質を含むＨｔｘＢＣＤＥタンパク質をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入した。その結果、シアノバクテリアの形質転換体が得られ、該形質転換体のリン酸非依存的、かつ、亜リン酸依存的な増殖が確認できた。また、該形質転換体は、高い封じ込め効果を発揮することが実証できた。
以下に、本発明について、更に詳細に説明する。
〔２．本発明の形質転換体〕
本実施形態の形質転換体は、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換されていることを特徴としている。
具体的に、「宿主に近縁な生物種」とは、例えば、宿主の属（ｇｅｎｕｓ）と同一属の生物であることを意図する。
本実施形態の形質転換体の宿主としては、例えば、原核生物（具体的に、大腸菌、微細藻類等）、真核生物（酵母等）を挙げることができるが、勿論、本発明は、これらの宿主に限定されない。本発明の形質転換体は、少ない数の遺伝子を操作することによって作製され得る。それ故に、あらゆる生物（例えば、微生物）を宿主とし得る。
上記宿主として用いられる上記大腸菌としては、例えば、Ｋ－１２株、ＢＬ２１株等が挙げられる。
上記微細藻類としては、例えば、シアノバクテリア、ユーグレナ、ボトリオコッカス、珪藻類等が挙げられる。
宿主として用いられる上記シアノバクテリアとしては、例えば、Anabaena sp. PCC7120、Synechocystis sp.、Synechococcus sp.等が挙げられる。
本明細書において、「リン酸輸送体タンパク質」とは、リン酸および還元型リン化合物の両方を細胞内に取り込む活性を有するタンパク質を意図する。一方、「リン酸エステル輸送体タンパク質」とは、リン酸エステルを細胞内に取り込む活性を有するタンパク質を意図する。
この場合、宿主に対して人為的に変異を施すことによって、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損した形質転換体を作製してもよいが、元々、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を有していない宿主（例えば、ゲノム中にリン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子が存在しない宿主、または、リン酸輸送体タンパク質、および、リン酸エステル輸送体タンパク質が発現しない宿主、など）を用いて形質転換体を作製してもよい。
生物種が異なれば、細胞内に存在する、リン酸輸送体タンパク質の種類、および、リン酸エステル輸送体タンパク質の種類も異なる。それ故に、本実施の形態の形質転換体において機能が欠損しているリン酸輸送体タンパク質、および、リン酸エステル輸送体タンパク質の種類は、特に限定されない。宿主に応じて、機能を欠損させるリン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子を適宜、決定すればよい。
例えば、形質転換体の宿主がシアノバクテリア（Synechococcus elongatus PCC7942、以降７９４２株と称する）である場合、機能を欠損させるリン酸輸送体タンパク質としては、ｐｉｔ、ｓｐｈＸ－ｐｓｔＳＣＡＢ等が挙げられる。ここで、上記Ｐｉｔタンパク質およびｓｐｈＸ－ｐｓｔＳＣＡＢタンパク質は、Kazusa Genome Resourceにおいて公開されているＰＣＣ ７９４２株のゲノムデータ（シアノベース：http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）より、ＰＣＣ ７９４２株に存在するリン酸輸送体タンパク質であることが示唆されているものである。
より具体的に、Ｐｉｔタンパク質は、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン酸輸送体として機能するタンパク質、（３）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質、または（４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リン酸の輸送活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質、である。
ｓｐｈＸ－ｐｓｔＳＣＡＢタンパク質は、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＣ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質から構成される。
具体的には、上記ｓｐｈＸタンパク質は、（５）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（６）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＣ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ｐｓｔＳタンパク質は、（７）配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（８）配列番号３４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＣ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ｐｓｔＣタンパク質は、（９）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（１０）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ｐｓｔＡタンパク質は、（１１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（１２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＣおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ｐｓｔＢタンパク質は、（１３）配列番号４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（１４）配列番号４１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＣタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質であってもよい。
上記ｓｐｈＸ－ｐｓｔＳＣＡＢ遺伝子は、リン酸輸送体を構成するｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＡ、ｐｓｔＣおよびｐｓｔＢタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドから構成される。つまり、ｓｐｈＸ－ｐｓｔＳＣＡＢタンパク質は、ｓｐｈＸ－ｐｓｔＳＣＡＢ遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。
具体的には、上記ｓｐｈＸタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（１５）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（１６）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＣ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ｐｓｔＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（１７）配列番号３３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（１８）配列番号３３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＣ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ｐｓｔＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（１９）配列番号３８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（２０）配列番号３８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ｐｓｔＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（２１）配列番号４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、（２２）配列番号４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＣおよびｐｓｔＢタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ｐｓｔＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（２３）配列番号４２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（２４）配列番号４２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｓｐｈＸ、ｐｓｔＳ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＣタンパク質と共にリン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
リン酸の輸送活性を有するタンパク質であるか否かは、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損した生物に、所望のタンパク質をコードした遺伝子を発現可能に導入し、当該微生物を、各種リン源を含む培地中で増殖させることによって確認することができる。当該微生物が、リン酸を含む培地中で増殖すれば、上記タンパク質が、リン酸の輸送活性を有するタンパク質である、と判定することができる。
また、リン酸エステルの輸送活性を有するタンパク質であるか否かは、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損した生物に、所望のタンパク質をコードした遺伝子を発現可能に導入し、当該微生物を、各種リン源を含む培地中で増殖させることによって確認することができる。当該微生物が、リン酸エステルを含む培地中で増殖すれば、上記タンパク質が、リン酸エステルの輸送活性を有するタンパク質である、と判定することができる。
また、例えば、形質転換体の宿主が大腸菌である場合、例えば、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損した形質転換体を用いることができる。大腸菌は、ＰｉｔＡ、ＰｉｔＢ、ＰｓｔＳＣＡＢ、ＰｈｎＣＤＥの４つのリン酸輸送体タンパク質が存在することが知られている。上述した４つのリン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子と、ｐｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子と、が破壊されたＭＴ２０１２株（ΔｐｉｔＡ，ΔｐｉｔＢ，ΔｐｈｎＣ，ΔｐｓｔＳＣＡＢｐｈｏＵ，ΔｐｈｏＡ）が既に作製されている（Motomura, K. et al. Overproduction of YjbB reduces the level of polyphosphate in Escherichia coli: a hypothetical role of YjbB in phosphate export and polyphosphate accumulation. FEMS microbiology letters 320, 25-32, 2011.）。
本明細書において、「次亜リン酸輸送体タンパク質」とは、亜リン酸または次亜リン酸を細胞内に取り込む活性を有するタンパク質を意図する。上記次亜リン酸輸送体タンパク質としては、例えば、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質、ＨｔｘＢＣＤタンパク質等が挙げられる。なお、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質をコードする遺伝子、ＨｔｘＢＣＤタンパク質をコードする遺伝子は、シュードモナス・スタッツェリ ＷＭ８８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＷＭ８８）に由来する遺伝子であり得る。
ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質は、ＨｔｘＢ、ＨｔｘＣ、ＨｔｘＤおよびＨｔｘＥによって構成されるタンパク質の複合体である。
また、本発明の形質転換体において、上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換されている。当該構成によれば、次亜リン酸結合タンパクを、宿主内の適切な箇所に局在させることができる。
本明細書において、「次亜リン酸結合タンパク質」とは、基質（具体的には、亜リン酸または次亜リン酸）との結合能を有するタンパク質を意図する。
上記「宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチド」の配列は、例えば、宿主がシアノバクテリア（７９４２株）であり、次亜リン酸輸送体タンパク質としてＨｔｘＢＣＤＥまたはＨｔｘＢＣＤタンパク質が用いられる場合は、シアノバクテリアの１種であるアナベナ（Anabaena sp. PCC7120、以降７１２０株と称する）のペリプラズムタンパク質（例えば、ＰｔｘＢタンパク質）のシグナルペプチドを採用することができる。ＨｔｘＢタンパク質のオリジナルのシグナルペプチドを該シグナルペプチドへ置換することにより、本発明の形質転換体が得られる。
また、宿主は、シアノバクテリアに限らず、様々な原核生物を用いることもできる。例えば、宿主が大腸菌（例えば、Ｋ－１２株、ＢＬ２１株等）であり、次亜リン酸輸送体タンパク質としてＨｔｘＢＣＤＥが用いられる場合は、土壌性グラム陰性細菌の近縁種であるラルストニア（Ralstonia sp.4506、以降４５０６株と称する）のペリプラズムタンパク質のシグナルペプチド（例えば、ＰｔｘＢタンパク質）等を採用することができる。ＨｔｘＢタンパク質のオリジナルのシグナルペプチドを該シグナルペプチドへ置換することにより、本発明の一実施形態に係る形質転換体が得られる。
具体的に、本実施の形態の次亜リン酸輸送体タンパク質は、ＨｔｘＢタンパク質（シグナルペプチドを置換後のもの）、ＨｔｘＣタンパク質、および、ＨｔｘＤタンパク質によって構成され、任意で、更なる細胞膜結合タンパク質を構成するＨｔｘＥタンパク質によって構成されてもよい。
具体的に、アナベナ由来のペリプラズムタンパク質ＰｔｘＢのシグナルペプチドの配列は、（２５）配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（２６）配列番号５４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ペリプラズムタンパク質のシグナルペプチドとしての活性を有するタンパク質であってもよい。
また、アナベナ由来のペリプラズムタンパク質ＰｔｘＢのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、（２７）配列番号５５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（２８）配列番号５５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ペリプラズムタンパク質のシグナルペプチドとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
上述の、アナベナ由来のペリプラズムタンパク質ＰｔｘＢのシグナルペプチドの配列に置換された後のＨｔｘＢタンパク質は、例えば、（２９）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（３０）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質、または、ＨｔｘＣタンパク質、ＨｔｘＤタンパク質およびＨｔｘＥタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ＨｔｘＣタンパク質は、（３１）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（３２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＨｔｘＢタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質、または、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＤタンパク質およびＨｔｘＥタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ＨｔｘＤタンパク質は、（３３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（３４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＨｔｘＢタンパク質およびＨｔｘＣタンパク質、または、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＥタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質であり、上記ＨｔｘＥタンパク質は、（３５）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（３６）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質であってもよい。
上述のＨｔｘＢＣＤＥ遺伝子は、ＨｔｘＢ、ＨｔｘＣ、ＨｔｘＤおよびＨｔｘＥタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドからなる。
上記ＨｔｘＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（３７）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（３８）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質、または、ＨｔｘＣタンパク質、ＨｔｘＤタンパク質およびＨｔｘＥタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ＨｔｘＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、（３９）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（４０）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＨｔｘＢタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質、または、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＤタンパク質およびＨｔｘＥタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ＨｔｘＤタンパク質をコードする遺伝子は、（４１）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（４２）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨｔｘＢタンパク質およびＨｔｘＣタンパク質、または、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＥタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上記ＨｔｘＥタンパク質をコードする遺伝子は、（４３）配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（４４）配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＨｔｘＢタンパク質、ＨｔｘＣタンパク質およびＨｔｘＤタンパク質と共に次亜リン酸輸送体として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
ここで、ＨｔｘＥタンパク質は、細胞膜結合タンパク質を構成するタンパク質である。そのため、上述のＨｔｘＢＣＤＥタンパク質からＨｔｘＥタンパク質を除いたＨｔｘＢＣＤタンパク質を、次亜リン酸輸送体タンパク質として利用することができる。
本発明の形質転換体において、上記次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドを、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドへ置換する際の遺伝子組み変えの手段としては、公知の方法が用いられる。
本実施形態の形質転換体は、更に、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子が導入されていてもよい。上記構成であれば、細胞内に取り込まれた還元型リン化合物を効率良くリン酸に変換することができるので、本実施形態の形質転換体が、亜リン酸に依存してより良く増殖することができる。
亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＷＭ８８に由来する遺伝子であり得る（例えば、ＰｔｘＤ遺伝子）。
より具体的に、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は、以下の（４５）または（４６）に示されるタンパク質からなるタンパク質、以下の（４５）または（４６）に示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質、以下の（４７）または（４８）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（４７）または（４８）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（４５）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（４６）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（４７）配列番号１３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（４８）配列番号１３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質が、ＮＡＤＰ＋依存的、または、ＮＡＤＰ＋依存的に亜リン酸を酸化してＨＰＯ４ ２－を生成するか否かに基づいて、確認することができる。具体的に、所望のタンパク質と、ＨＰＯ３ ２－と、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋と、を混合した後、ＨＰＯ４ ２－が生成されていれば、当該タンパク質が亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であると判定することができる。
本実施形態の形質転換体は、更に、アルカリホスファターゼタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＰｈｏＡ遺伝子）の機能が欠損していることが望ましい。例えば、アルカリホスファターゼタンパク質は、細胞外に存在する亜リン酸をリン酸へ変換し、これによって、細胞外の亜リン酸の濃度を低下させる作用を有している。また、大腸菌以外の生物種が有するアルカリホスファターゼタンパク質も、大腸菌のアルカリホスファターゼタンパク質と同様に、上述の作用を有している場合がある。アルカリホスファターゼタンパク質をコードする遺伝子の機能が欠損している形質転換体であれば、細胞外の亜リン酸の濃度を高く保つことができる。それ故に、上記構成であれば、細胞内に取り込まれる還元型リン化合物の量を増加させることができるので、本実施形態の形質転換体が、還元型リン化合物に依存してより良く生育することができる。
生物種が異なれば、細胞内に存在する、アルカリホスファターゼタンパク質の種類も異なる。それ故に、本実施の形態の形質転換体において機能が欠損しているアルカリホスファターゼタンパク質の種類は、特に限定されない。宿主に応じて、機能を欠損させるアルカリホスファターゼタンパク質をコードする遺伝子を適宜、決定すればよい。
例えば、形質転換体の宿主がシアノバクテリア（Synechococcus elongatus PCC7942）である場合、アルカリホスファターゼタンパク質は、以下の（４９）または（５０）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、以下の（４９）または（５０）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質、以下の（５１）または（５２）に示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（５１）または（５２）に示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（４９）配列番号６１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（５０）配列番号６１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（５１）配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（５２）配列番号６２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質；
アルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質が、亜リン酸をリン酸へ変換するか否かに基づいて、確認することができる。具体的に、所望のタンパク質と亜リン酸とを混合した後、リン酸が生成されていれば、当該タンパク質がアルカリホスファターゼ活性を有するタンパク質であると判定することができる。
本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、５０個以内、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
〔３．還元型リン化合物の有無の検出方法〕
本実施の形態の還元型リン化合物の有無の検出方法は、検出対象である培地中の還元型リン化合物の有無の検出方法であって、本発明の形質転換体を、検出対象である培地を用いて培養する培養工程と、該培養工程における形質転換体の増殖の有無を検出する検出工程と、を有することを特徴としている。
上記構成によれば、安価な還元型リン化合物に依存して増殖する形質転換体を用いることにより、煩雑な工程を必要とせず、かつ形質転換体の増殖のために発生するコストを低減できるような、還元型リン化合物の有無の検出方法を実現できる。
上記還元型リン化合物の有無の検出方法は、例えば、オープンポンド培養等の屋外培養の実施場所を決定する場合等に用いることができる。本発明の形質転換体は、還元型リン化合物（例えば、亜リン酸、および、次亜リン酸）は、存在しないか、または、存在したとしても非常に少量である。それ故に、当該形質転換体は、たとえ自然界に漏れたとしても、自然界では増殖することができない。しかし、還元型リン化合物は農業資材または工業資材等に含まれる場合があるため、該資材から流出した還元型リン化合物が自然界に存在する可能性がある。屋外培養において、還元型リン化合物が含まれている場所で本発明の形質転換体を培養した場合、当業者の意に反し、該形質転換体の増殖規模が拡大する虞がある。
上述の問題を回避するために、本発明の検出方法を用いることができる。具体的に、本発明の形質転換体の増殖をするための、所望の場所に存在する水等の物質を採取し、採取したサンプルをリン源として培地へ含ませ、該培地を検出対象として本発明の形質転換体を培養させる。培養の結果、本発明の形質転換体が増殖しなかった場合、サンプルの採取場所には還元型リン化合物が含まれていないと判定できるため、サンプルの採取場所において、本発明の形質転換体を増殖させることが可能であると判断できる。
本実施の形態の還元型リン化合物の有無の検出方法では、培養工程において形質転換体が増殖していれば、検出対象である培地中に還元型リン化合物が含まれていると判定でき、培養工程において形質転換体が増殖していなければ、検出対象である培地中に還元型リン化合物が含まれていないと判定できる。
検出対象である培地の成分および形態は、特に限定されない。例えば、検出対象である培地の形態は、液体状であってもよいし、固体状であってもよい。
検出対象である培地が液体状である場合には、例えば、検出工程では、培地の濁度（例えば、ＯＤ６００）を測定することによって、培養工程における形質転換体の増殖の有無を検出することができる。一方、検出対象である培地が固体状である場合には、例えば、検出工程では、固体状の培地上に形成される形質転換体のコロニーの有無を確認することによって、培養工程における形質転換体の増殖の有無を検出することができる。
本実施の形態の検出方法で検出される還元型リン化合物としては、特に限定されないが、例えば、亜リン酸および次亜リン酸を挙げることができる。
〔まとめ〕
本発明の一態様に係る形質転換体は、リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主あるいは宿主に近縁な生物種に由来するシグナルペプチドに置換されていることを特徴としている。
本発明の一態様に係る形質転換体は、更に、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子が導入されていてもよい。
本発明の一態様に係る形質転換体は、更に、アルカリホスファターゼタンパク質をコードする遺伝子の機能が欠損していてもよい。
本発明の一態様に係る形質転換体は、原核生物の形質転換体であってもよい。
本発明の一態様に係る形質転換体は、シアノバクテリアの形質転換体であってもよい。
本発明の一態様に係る還元型リン化合物の有無の検出方法は、検出対象である培地中の還元型リン化合物の有無の検出方法であって、本発明の一態様に係る形質転換体を、検出対象である培地を用いて培養する培養工程と、上記培養工程における上記形質転換体の増殖の有無を検出する検出工程と、を有することを特徴としている。
本発明の一実施例について以下に説明する。
＜１．亜リン酸資化能（亜リン酸をリン酸へ変換する能力）の付与＞
シアノバクテリアへ、亜リン酸資化能を付与するための発現ベクターを作製した。まず、Synechococcus elongatus PCC7942株（以下７９４２株と称する）用の発現ベクターであるpNSHA(参考文献１：Watanabe et al., Mol Microbiol. 2012 Feb;83(4):856-65)をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。切断後の発現ベクターに対し、Ralstonia sp. 4506株（以下４５０６株と称する）の染色体をテンプレートとして、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片（約３．６ｋｂ）を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて挿入した：
P0048：５’－acagaccatggaattcGTGTCATATCACGACATTACCATCG－３’（配列番号２３）
P0049：５’－caaaacagccaagcttTCACGCCGCCTTTACTCCCGGATAC－３’（配列番号２４）。
得られたプラスミドpNSptxAD（配列番号６３）を、自然形質転換により７９４２株に導入した。具体的に、まず、該７９４２株をＢＧ－１１培地（１０ｍｌ）で培養し、ＯＤ７５０が０．７～１．０程度になった後、遠心分離処理（６０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ)によって集菌し、ＢＧ－１１培地１．０ｍｌに細胞を再懸濁した。この懸濁液４００μｌに上記プラスミドを約０．１μｇ加え、アルミホイルで遮光して、３０℃インキュベーター中で、シェーカーを用いて１２時間混合させた。
その後、アルミホイルを除いてさらに１時間混合させ、菌体とプラスミドとの混合液を得た。この混合液を、スペクチノマイシン（４０μｇ／ｍｌ）を含むＢＧ－１１平板培地上に塗布し、植物インキュベーター内（照度：２０００－３０００Ｌｕｘ、温度：３０℃）で培養した。約１０日後に出現したコロニーをコロニーピッカーで取得し、上記平板培地と同じ組成を有するＢＧ－１１平板培地にコロニーをストリークした。
約５日後に得られたコロニーを組み換え体（スぺクチノマイシン耐性株）として解析に用いた。スペクチノマイシン耐性株を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した亜リン酸（終濃度０．２ｍＭ）をリン源とするＢＧ－１１液体培地（ＢＧ－１１Ｐｔ）で、２％のＣＯ２ガス供給条件で培養した。その結果、得られた形質転換体は亜リン酸を利用して生育することが可能であった。一方、野生株は亜リン酸を利用して増殖することができなかった。このことから、この発現系によって、ＰｔｘＤが機能的に発現した、つまり、亜リン酸資化能が付与されたことがわかった。
＜２－１．野生型HtxBCDE-PtxD融合プラスミドの導入＞
ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質は、Pseudomonas stutzeri WM88株由来の次亜リン酸輸送体である。ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質の発現プラスミドは、以下の方法で作製した。
まず、pNSptxADをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、得られた約９．９ｋｂのＤＮＡ断片をベクターとした。pSTVhtxAE(参考文献2：Hirota et al., Sci. Rep. 2017,44748)（配列番号６４）をテンプレートとし、以下のプライマーで増幅したＤＮＡ断片（約３．３ｋｂ）をインサートＤＮＡとして調整した：
P0132：５’－ACAGACCATGGAATTCATGCAAGTTTTTACTCTGTT－３’（配列番号２５）
P0133：５’－AGCTGAAGGCGTCGACTAGTAGTTGCGGGCCGCGA－３’（配列番号２６）。
両者をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてライゲーションし、得られたプラスミドpNShtxBCDE-ptxD（配列番号６５）を７９４２株に導入した。得られた形質転換体を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧおよび４０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを添加した５０ｍＬのＢＧ－１１で７日間培養し、遠心分離処理によって菌体のペレットを得た。
この菌体のペレットを、２ｍＬのＭＯＰＳ（０）溶液中に懸濁した後、出力２０％にて、１０分間の超音波破砕処理（Digital sonifier,BRANSON）を行った。超音波破砕処理を施したＭＯＰＳ（０）溶液を超遠心分離用チューブ（Centrifuge Tubes, BECKMAN,349622）に分注し、当該チューブに対し、超遠心分離機（OptimaTM TLX Ultracentrifuge, BECKMAN COULTER）にて、超遠心分離処理を行った（２７０，０００×ｇ、４℃、３０分間）。
超遠心分離処理後のチューブから上清を回収して、当該上清を、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性測定用の粗抽出液とした。該粗抽出液（タンパク質量：１０μｇ）、ＮＡＤ＋（１ｍＭ）、亜リン酸（１ｍＭ）およびＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を含む、全量１０００μＬの反応液を調製し、当該反応液の温度を３７℃に上昇させて反応を開始させた。
所定の時間の間（０～３０分）、各サンプルの吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、１ｍｇのタンパク質が単位時間あたりに生成するＮＡＤＨ量を１unitとして評価した。その結果、形質転換体からは、約４０milliunitsのＰｔｘＤ活性が検出された。この様に、十分なＰｔｘＤ活性が検出されたにもかかわらず、ＢＧ－１１Ｐｔ培地での増殖が見られなかったことから、ＨｔｘＢＣＤＥが機能的に発現していない事が推察された。
＜２－２．置換されたＨｔｘＢ遺伝子を含むＨｔｘＢＣＤＥ－ＰｔｘＤ融合プラスミドを用いたＨｔｘＢＣＤＥタンパク質の発現＞
ＨｔｘＢタンパク質のシグナルペプチド配列（配列番号６０）を、シアノバクテリア等が有する３種類のバクテリアタンパク質由来のものに置換した発現プラスミドを作製し、その効果を検証した。まず、pSTVhtxAEをテンプレートとし、プライマーP0268およびP0269を用いたインバースＰＣＲによって、シグナルペプチド配列を除去した、ＨｔｘＢの発現ベクターを得た：
P0268：５’－CATGGTGATGCTCCTAGGATCCCCG－３’（配列番号２７）
P0269：５’－GCTGAGGTTGTCAATGGTAAACTTC－３’（配列番号２８）。
ＨｔｘＢのシグナルペプチドと置換するシグナルペプチドとして、４５０６株由来ＰｔｘＢ（配列番号５８、５９）、７９４２株由来ＰｓｔＳ（配列番号５６、５７）、Anabaena sp. PCC7120株（以下７１２０株と称する）由来ＰｔｘＢ（配列番号５４、５５）のシグナルペプチドを用い、それぞれのシグナルペプチドの配列としては、図３に示すようにEMBOSS sigcleave（http://emboss.sourceforge.net/apps/release/6.5/emboss/apps/sigcleave.html）を用いて得られたシグナルペプチドの配列を用いた。
シグナルペプチドのＤＮＡ断片は、４５０６株、７９４２株および７１２０株染色体をテンプレートとして、それぞれ以下のプライマーペア(P0270(配列番号１７)/P0271(配列番号１８)、P0274(配列番号２１)/P0275(配列番号２２)、P0272(配列番号１９)/P0273(配列番号２０)、表１参照）を用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を用いた。
Figure 0007236161000001
 これらのＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとを、上記手法と同様にライゲーションした。得られたプラスミドを、pSTVhtxBE4506-SP、pSTVhtxBE7942-SPおよびpSTVhtxBE7120-SPと称する。次に、これら３種類のプラスミドを用いて、シグナルペプチド配列を置換したＨｔｘＢＥ遺伝子配列を、上記pNShtxBCDE-ptxDの作製方法と同様に作製し、得られたプラスミドをpNShtxBE4506-SP-ptxD、pNShtxBE7942-SP-ptxDおよびpNShtxBE7120-SP-ptxDとした（図４を参照のこと、図４中に記載の「ＳＰ」は「シグナルペプチド」の略称である）。この３種のプラスミドで７９４２株を形質転換し、HtxBE-ptxD発現株を得た。これらの株をスペクチノマイシン（４０μｇ／ｍｌ）、０．１ｍＭＩＰＴＧを含む、各ＢＧ－１１（リン無し、リン酸含有および亜リン酸含有）で培養し、その増殖を調べた。
その結果を図５に示す。図５の（ａ）は、リン酸および亜リン酸依存的増殖の結果を示す像である。図５の（ｂ）は、リン酸および亜リン酸依存的増殖の結果を示すグラフである。ここで、「Pｉ」はリン酸を含むＢＧ－１１、「Ｐｔ」は亜リン酸を含むＢＧ－１１、「ｎｏｎｅ」はリンを含まないＢＧ－１１を示す。また、「４５０６－ＳＰ」は（pNShtxBE4506-SP-ptxD：配列番号６７）により形質転換された７９４２株、「７９４２－ＳＰ」は（pNShtxBE7942-SP-ptxD：配列番号６８）により形質転換された７９４２株、「７１２０－ＳＰ」はpNShtxBE7120-SP-ptxDにより形質転換された７９４２株を示す。図５の（ａ）および（ｂ）に示される通り、７１２０株のＰｔｘＢ由来シグナルペプチド配列に置換した発現コンストラクト(pNShtxBE7120-SP-ptxD：配列番号６６)を導入した株（ＲＨ６９３）で亜リン酸依存的増殖が確認された。この事から、Ｈｔｘ輸送体をシアノバクテリアで機能的に発現させるためには、シグナルペプチド配列の適合性を高めることが効果的である事が明らかとなった。
＜３．７９４２株のリン輸送体遺伝子破壊＞
リン酸に対する依存性を欠損させるため、７９４２株のリン酸輸送体の遺伝子破壊を行った。Kazusa Genome Resourceにおいて公開されている７９４２株のゲノムデータ（シアノベース：http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）より、ＰＣＣ７９４２にはpit(データベース中の遺伝子名：Synpcc7942_0184)およびsphX-pstSCAB(データベース中の遺伝子名：Synpcc7942_2445-2441)の２種類のリン酸輸送体遺伝子が存在することが示唆された。そこで、これらの遺伝子を、相同組換えを利用して破壊した。遺伝子破壊は、pit（配列番号１）の上流および下流の各々の配列約１ｋｂの間にゲンタマイシン耐性遺伝子（配列番号２９）を挿入したＤＮＡ断片と、sphX-pstSCAB（配列番号３）の上流および下流の各々の配列約１．５ｋｂの間にカナマイシン耐性遺伝子（配列番号３０）を挿入したＤＮＡ断片とをOverlap extension-PCRにより作製し、得られたＤＮＡ断片の各々約０．１μｇを用いて７９４２株を形質転換することによって行った。プライマーは、表２に示すものを使用した。
Figure 0007236161000002
 遺伝子破壊の確認は、ＰＣＲにより行い、破壊対象とした遺伝子は７９４２株に複数コピー存在するので、当該遺伝子が全て破壊されていることを確認した。Ｐｉｔ遺伝子の破壊は、ＲＨ６９３を対象としてＰｉｔ遺伝子破壊を行い、ゲンタマイシン（２．０μｇ／ｍｌ）を含むＢＧ－１１寒天培地で破壊株（ＲＨ７１３）を得た。ｐｉｔ－ｐｓｔ二重破壊は、ＲＨ７１３を対象としてＰｓｔ遺伝子破壊を行い、ゲンタマイシン（２．０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＢＧ－１１（Ｐｔ）寒天培地でスクリーニングすることによって破壊株（以降、ＲＨ７１４と称する）を得た。
ＲＨ７１４の亜リン酸依存性を確認するために、ＲＨ７１４をＢＧ－１１（Ｐｔ）中で培養した後、当該ＲＨ７１４をＢＧ－１１（リン酸含有）、または、ＢＧ－１１（Ｐｔ）にそれぞれ植菌し、白色光照射下(50 μmol photons/m2/s)、２％のＣＯ２供給条件で培養を行った。
培養の結果を図６に示す。図６の（ａ）および（ｃ）は、ＲＨ７１４と野生株とにおける、１９２時間後の増殖の様子を示す像である。図６の（ｂ）および（ｄ）は、ＲＨ７１４と野生株とにおける、増殖の経時的変化を示すグラフである。ここで、（ａ）および（ｂ）は、ＢＧ－１１（亜リン酸含有）で培養された結果を、（ｃ）および（ｄ）は、ＢＧ－１１（リン酸含有）で培養された結果を示す。図６の（ａ）～（ｄ）に示される通り、ＲＨ７１４は、亜リン酸含有のＢＧ－１１では良好な生育を示したが、通常のＢＧ－１１培地では全く増殖することができなかった。この結果から、ＲＨ７１４は、リン酸を利用できず、亜リン酸をリン源とする培地で増殖することが確認された。
さらに、ＲＨ７１４の増殖に対する、様々なリン酸化合物の効果を調べるため、ＢＧ－１１培地のリン源を、様々な種類のリン化合物に置換した培地で同様の培養を行った。供試リン化合物として、アミノエチルホスホン酸、メチルホスホン酸、グルコース６－リン酸、ＡＴＰ、ピロリン酸および鮭精子のＤＮＡを用いて、いずれもリン酸ベースでＢＧ－１１培地中の終濃度を０．２ｍＭとした。さらに、天然の河川に含まれるリン源によるＲＨ７１４の増殖への影響を調べるため、東広島市内の湖沼または河川から採取した水を用いて同様の実験を行った。
その結果を図７に示す。図７は、各リン化合物をリン源とする培地にて培養されたＲＨ７１４の増殖の様子を示す像である。亜リン酸以外のリン源を用いる各像のいずれにおいても、ＲＨ７１４は増殖することができなかった。以上の結果から、一連の遺伝学的操作によって、７９４２株に完全な亜リン酸依存性を付与できたことが確認された。
＜４．エスケープアッセイおよび生存率の測定＞
２５ｍＬのＢＧ－１１Ｐｔ液体培地で５日間培養したＲＨ７１４を遠心分離で集菌し、リン酸フリーのＢＧ－１１培地で３回洗浄後、約１０ｍＬの同培地で再懸濁した。菌体懸濁液０．１ｍＬを１０－５～１０－８倍に希釈し、ＢＧ－１１Ｐｔプレート（許容培地）に希釈後の菌体懸濁液を０．１ｍＬをスプレッドした。残りの菌体懸濁液を２４５ｍｍ×２４５ｍｍ角形ディッシュで作製した５枚のＢＧ－１１プレート（非許容培地）に約２．０ｍＬずつスプレッドした。
これらのプレートを３０℃、白色灯照射下で２８日間培養した。プレートは1日毎に確認し、コロニー出現の有無を確認した。非許容培地においては、ＲＨ７１４の生育は確認されなかった。この実験系における検出限界値は、以下の計算式によって求めた数値で表記した。
[検出限界値（escapee/CFU）]=1/([許容培地で形成されたコロニー数（CFU）]×[希釈倍率（－）]÷[スプレッドした培養液量（mL）]×[使用した培養液量（mL）])
本実験における検出限界値は、３．６×１０－１１であった。
また、ＲＨ７１４の生存率を測定するため、１０ｍＬの対数期中期の菌体を回収し、５ｍＬのリン酸フリーのＢＧ－１１で３回洗浄し、再び５ｍＬのリン酸フリーのＢＧ－１１に再懸濁した。この細胞懸濁液を吸光度（ＯＤ７５０値）が約０．８になる様にＢＧ－１１液体培地、ＢＧ－１１Ｐｔ液体培地に植菌し、３日おきに適当に希釈した培養液をＢＧ－１１Ｐｔプレートにスプレッドした。コロニーの形成を１０日後に観察し、生存菌数を計数した。
その結果を図８に示す。図８は、ＲＨ７１４の生存菌数の経時的変化を示すグラフである。図８に示す通り、ＲＨ７１４はＢＧ－１１液体培地中においては生存菌数が０となった。一方で、ＢＧ－１１Ｐｔ液体培地中においては、ＲＨ７１４は高い生存菌数を維持していた。このことから、ＲＨ７１４は高い生物学封じ込め効果を発揮することが確認された。
なお、配列番号３１は、ｐｔｘＢ(Ralstonia sp.4506由来)遺伝子の全長の塩基配列、配列番号３２は、ＰｔｘＢ(Ralstonia sp.4506由来)タンパク質の全長のアミノ酸配列、配列番号３５は、ｐｔｘＢ(Anabaena sp. 7120由来)遺伝子の全長の塩基配列、および配列番号３６はＰｔｘＢ(Anabaena sp. 7120由来)タンパク質の全長のアミノ酸配列にあたる。
＜５．置換されたＨｔｘＢ遺伝子を含むＨｔｘＢＣＤＥ－ＰｔｘＤ融合プラスミドを用いたＨｔｘＢＣＤＥタンパク質の発現の他の例＞
ＨｔｘＢタンパク質のシグナルペプチド配列（配列番号６０）を、シアノバクテリア等が有する３種類のタンパク質由来のシグナルペプチド配列に置換した、ＨｔｘＢＣＤＥタンパク質の発現プラスミドを作製し、かつ、当該発現プラスミドを大腸菌に導入した。
上述の＜２－２＞の欄と同様の手順で、シグナルペプチド配列を除去した、ＨｔｘＢの発現ベクターを得た。ＨｔｘＢのシグナルペプチドと置換するシグナルペプチドとして、４５０６株由来ＰｔｘＢ（配列番号５８、５９）、７９４２株由来ＰｓｔＳ（配列番号５６、５７）、Anabaena sp. PCC7120株（以下７１２０株と称する）由来ＰｔｘＢ（配列番号５４、５５）のシグナルペプチドを用いた。
これらのシグナルペプチドのＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを、上記手法と同様にライゲーションした。得られたプラスミドを、pSTVhtxBE4506-SP、pSTVhtxBE7942-SPおよびpSTVhtxBE7120-SPと称する。pSTVhtxBE4506-SP、pSTVhtxBE7942-SPおよびpSTVhtxBE7120-SPの各々のプラスミドで、ptxD/pTWV229（配列番号６９）が導入された、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損している大腸菌ＭＴ２０１２株を形質転換し、HtxBE-ptxD発現株を得た。これらの株を、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む、各モルホリノプロパンスルホン酸培地（ＭＯＰＳ）（亜リン酸を０．５ｍＭ含有）で、３７℃にて培養し、その増殖を調べた。
その結果を図９に示す。図９は、亜リン酸依存的増殖の結果を示すグラフである。ここで、「４５０６－ＳＰ」はプラスミドpSTVhtxBE4506-SPが導入されたＭＴ２０１２株、「７９４２－ＳＰ」はプラスミドpSTVhtxBE7942-SPが導入されたＭＴ２０１２株、「７１２０－ＳＰ」はプラスミドpSTVhtxBE7120-SPが導入されたＭＴ２０１２株を示す。
図９に示される通り、４５０６株のＰｔｘＢ由来シグナルペプチド配列に置換されたプラスミドを導入した株では、亜リン酸依存的増殖が確認された。また、７９４２株のＰｓｔＳ由来シグナルペプチド配列に置換されたプラスミドを導入した株においても、４５０６株のＰｔｘＢ由来シグナルペプチド配列に置換されたプラスミドを導入した株に比べて、増殖開始までに時間を要したものの、増殖が認められた。一方、７１２０株のＰｔｘＢ由来シグナルペプチド配列に置換されたプラスミドを導入した株では、増殖は認められなかった。
この事は、シグナルペプチドの適合性が宿主ごとに異なることを意味しており、大腸菌においては、近縁種のシグナルペプチドを選択することで良好な結果が得られることが明らかとなった。
本発明は、形質転換体を必要とする分野（例えば、経口ワクチン剤を製造する分野、自然環境の改善を目的とする分野、および、バイオ燃料を生産する分野）に、広く利用することができる。

Claims (5)

  1. リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子、および、リン酸エステル輸送体タンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損し、かつ、次亜リン酸輸送体タンパク質をコードする遺伝子が導入されており、更に、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子が導入されていることによって、リン酸を増殖に利用できず、かつ、亜リン酸を増殖に利用することができ、
    上記次亜リン酸輸送体タンパク質では、当該次亜リン酸輸送体タンパク質の構成要素の１つである次亜リン酸結合タンパク質のシグナルペプチドが、宿主、宿主に近縁な生物種、シアノバクテリア、またはラルストニアに由来するシグナルペプチドに置換されており、
    上記宿主に近縁な生物種は、上記宿主の属（ｇｅｎｕｓ）と同一属の生物である、形質転換体。
  2. 更に、アルカリホスファターゼタンパク質をコードする遺伝子の機能が欠損していることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
  3. 上記形質転換体が、原核生物の形質転換体であることを特徴とする請求項１または２に記載の形質転換体。
  4. 上記形質転換体が、シアノバクテリアの形質転換体であることを特徴とする請求項３に記載の形質転換体。
  5. 検出対象である培地中の還元型リン化合物の有無の検出方法であって、
    請求項１～４の何れか１項に記載の形質転換体を、検出対象である培地を用いて培養する培養工程と、
    上記培養工程における上記形質転換体の増殖の有無を検出する検出工程と、を有することを特徴とする還元型リン化合物の有無の検出方法。
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