KR101858044B1

KR101858044B1 - 토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabG-h 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101858044B1
Application number: KR1020170022877A
Authority: KR
Inventors: 이선우; 칸 래이스; 최기혁
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2018-06-27

Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabG-h 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규 트리클로산 저항성 ENR 변이체 FabG-h 유전자는 대장균뿐만 아니라 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 다양한 세균에 발현시켜 트리클로산 저항성 형질전환체를 효과적으로 선별할 수 있는 트리클로산 저항성 선발 마커로 활용할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabG-h 및 이의 용도{Novel FabG-h gene resistant to triclosan from soil metagenome and uses thereof}

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabG-h 및 이의 용도에 관한 것이다.

이전의 미생물 분자생태학적 연구 결과, 통상적인 방법인 순수 배양기술을 통해서 발견되었던 미생물보다 더 많은 미생물이 지구상에 존재한다는 것이 밝혀졌고, 토양 내에 존재하는 미생물의 99% 이상이 배양이 되지 않는 것으로 밝혀졌다(Amann 등 Microbiol . Rev. 59:143-169, 1995). 즉, 이전의 미생물 자원의 발굴이 미생물 순수배양에 의존해 왔으므로 지구상에 존재하는 대다수 다양한 미생물의 자원이 발굴되지 못했던 문제가 있었다.

이러한 문제를 해결하기 위해서 개발된 미생물 분자생태학적 방법 중의 하나가 메타게놈 연구방법이다. 메타게놈은 미생물이 존재하는 자연환경에 존재하는 모든 미생물 군집의 총 게놈(genome)을 통칭하는 의미로 1998년 Jo Handelsman에 의해서 처음 사용되었다(Handelsman 등 Chem . Biol . 5:R 245-249, 1998). 상기 방법은 특정 환경 시료에서 미생물 군집의 총 DNA를 바로 추출하여 커다란 크기의 DNA를 수용할 수 있는 코스미드(cosmid), 포스미드(fosmid) 또는 BAC 벡터(vector)에 클로닝하여 유전자 라이브러리를 제작하는 방법을 포함한다(Schloss 등 Curr . Opin. Biotechnol . 14:303-310, 2003). 메타게놈으로부터 지난 수년간 다양한 항생제 및 항생제 저항성 관련 유전자들이 발견되었다.

트리클로산(triclosan, 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)-phenol)은 많은 미생물을 죽일 수 있는 광범위 항생제로서 다양한 생활용품의 성분으로 오랜 기간 사용되고 있다(Halden Environ. Sci . Technol . 48:3603-3611, 2014). 트리클로산은 세균에게는 제2유형의 지방산 합성과정에 중요한 마지막 효소인 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)에 결합하여 지방산 합성을 억제하여 항생효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Heath 등 J. Biol . Chem . 274:11110-11114, 1999). 현재까지 네 가지 종류의 ENR 동질효소(isozyme)들이 보고되어 있으며(도 1), 이들은 각각 fabI , fabL , fabV , fabK의 유전자에 의해 암호화되며 FabK만 제외하면 이들은 모두 SDR(short chain dehydrogenase/reductase) 서브패밀리의 효소를 암호화하는 것으로 알려져 있다. 이들 트리클로산의 결합 대상인 단백질 중 FabK는 완벽히 트리클로산 저항성 단백질로 보고된 non-SDR 계의 ENR으로 알려져 있다(Massengo-Tiasse 등 Cell. Mol . Life. Sci . 66:1507-1517, 2009). ENR은 트리클로산 외의 다른 합성 항생물질의 약물 타겟으로 아이소나이아지드(isoniazid), 헥사클로로펜(hexachlorophene), 디플루페니칸(diflufenican) 등의 다양한 항생제의 결합부위로 알려져 있는데 이 ENR의 변이는 이들 약물에 대한 저항성을 유발한다(Lu 등, Acc. Chem . Res 41:11-20, 2008).

최근에 트리클로산 저항성 세균이 환경에 광범위하게 분포하고 있는 것으로 알려져 있는데 그 주된 기작은 ENR을 암호화하는 유전자의 변이에 의한 트리클로산 결합에 대한 저항성을 보이거나 막의 투과성 변화로 트리클로산을 흡수하지 않거나, 들어온 트리클로산을 외부로 유출하는 수송자 단백질에 의한 저항성 등이 그것이다(Yazdankhah 등 Microb . Drug. Resist. 12:83-90, 2006).

한편, 한국등록특허 제1693285호에서는 '트리클로산 노출에 대응하는 히드라 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabG-h 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 트리클로산이 오랜기간 동안 사용되고 환경에 방출되어 항생제 저항성 변이 유전자가 존재할 것으로 예상되지만, 현재까지는 트리클로산 저항성 유전자를 유전자 조작용 선발 마커로 활용한 상용화된 클로닝 벡터는 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명에서는 토양 메타게놈 기술을 통해 트리클로산 저항성 유전자를 선발하여 세균의 트리클로산 저항성 선발 마커(selection marker)로 사용할 수 있음을 보고하고자 한다.

우선, 본 발명자들은 트리클로산에 저항성을 보이는 신규한 유전자를 토양으로부터 동정하기 위하여, 토양 미생물로부터 메타게놈을 분리한 후 포스미드(fosmid)를 이용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 작성하였다. 상기 작성된 라이브러리로부터 트리클로산이 첨가된 배지에서 숙주세포인 대장균의 생장여부를 통해 트리클로산 저항성 유전자를 가진 포스미드 클론을 선별하였다. 선별된 트리클로산 저항성 메타게놈 관련 유전자들을 다시 작게 재분리하고 초기 선별된 글론과 동일한 수준으로 트리클로산에 저항성 여부를 판별하여 활성 유전자 부위를 결정하였고 이들의 염기서열을 분석하였다.

상기 염기서열들을 분석한 결과, 서열번호 3은 총 1,680 염기서열을 포함하는 활성 서브클론으로, 828 bp의 염기서열로 이루어지는 FabG 유사 효소를 암호화하는 유전자 부위를 포함하였다. 상기 서열번호 3의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 536 내지 1363 부위(1361-1363: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame, 서열번호 1)은 FabG 유사 단백질을 암호화하는 부위로서 서열번호 2로 기재되는 275개 아미노산을 암호화하는 것으로 예측되었다. 상기 유전자 염기 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 다수의 미생물에서 유래된 3-옥소아실-ACP 리덕타제(3-oxoacyl-ACP reductase) 유전자와 매우 높은 상동성을 보였다.

그러나, 특이하게도 해당 유전자는 본 발명 결과 3-옥소아실-ACP 리덕타제를 암호화하는 것이 아니라 새로운 종류의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)을 암호화함을 세균 유전학적으로 입증하여 새로운 ENR 활성을 암호화하고 그 결과 트리클로산에 저항성을 부여하는 신규한 유전자로 확인됨으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabG-h(FabG-homolog)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 FabG-h를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환체를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 선발 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체를 코딩하는 FabG-h(FabG-homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규 트리클로산 저항성 ENR 변이체 FabG-h 유전자는 대장균뿐만 아니라 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 다양한 세균에 발현시켜 트리클로산 저항성 형질전환체를 효과적으로 선별할 수 있는 트리클로산 저항성 선발 마커로 활용할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

도 1은 트리클로산 존재시 지방산 생합성에 관여하는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)의 활성이 저해되는 기작을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 메타게놈 3-옥소아실-ACP 리덕타제(3-oxoacyl-ACP(acyl-carrier-protein) reductase, FabG)-유사 ENR 후보자는 원형체의 대장균 FabG 및 바실러스 서틸리스 FabL와 공통 형태를 공유한다. a, 메타게놈 FabG-유사 ENR 후보자들(pD-1-7, pAM1-4)은 대장균 FabG와 다중의 정렬을 나타낸다. Ser138, Tyr151 및 Lys155의 활성자리 트리아드(triad) 잔기는 *로 표시하였고, Tyr151은 메타게놈 FabG-유사 ENR 후보자에서 비극성 발린으로 치환되었다. 삼각형은 ACP-결합에 중심인 두 개의 아르기닌 잔기를 표시한다. b, 메타게놈 FabG-유사 ENR 후보자들(pD-1-7, pAM1-4)과 바실러스 서틸리스 FabL ENR의 다중의 정렬을 나타낸다. YX6K 활성 자리 잔기는 *로 표시하였다. 기질 결합 영역과 코펙터 결합과 연관된 잔기는 열린 흰 막대 및 닫힌 검은 막대로 각각 표시하였다. 고도로 보존된 Asn113 및 Ser141 잔기는 삼각형으로 표시하였다.
도 3은 본 발명의 메타게놈에서 선발한 FabG와 유사한 유전자가 ENR 활성을 보이는지 확인하기 위해서 대장균의 ENR 중 한가지인 FabI 유전자가 변이된 대장균 변이주 JP1111를 이용하여 ENR 활성의 상보성(complementation)을 조사한 결과이다. 각각의 플레이트의 상단 왼쪽은 FabI을 가지는 대장균에 pGEM-T Easy를 형질전환시킨 JP1111, 상단 오른쪽은 pGEM-T Easy만을 형질전환시킨 JP1111, 하단 왼쪽은 aHSD(pBF1-4)을 가지는 JP1111, 하단 오른쪽은 FabG (pD-1-6)을 가지는 JP1111이다. 각 플레이트는 30℃에서 24시간, 42℃에서 48시간 배양하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabG-h(FabG-homolog)를 제공한다.

본 발명의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabG-h는 트리클로산(triclosan)에 저항성을 부여한다. 트리클로산(triclosan, 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)-phenol)은 많은 미생물을 죽일 수 있는 광범위 항생제로서 다양한 생활용품의 성분으로 오랜 기간 사용되고 있으며, 세균에게는 제2유형의 지방산 합성과정에 중요한 마지막 효소인 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)에 결합하여 지방산 합성을 억제하여 항생효과를 나타내는 것으로, 현재까지 네 가지 종류의 ENR 동질효소(isozyme)들인 FabI, FabL, FabV, FabK이 보고되어 있다.

본 발명의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabG-h는 대장균 및 바실러스 서틸리스 FabG와 서열 유사성을 나타내어, FabG-h(FabG-homolog)로 명명한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabG-h에서, 상기 ENR 변이체 FabG-h는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에 대한 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 아미노산 서열과 유사한 기능을 갖는 아미노산 서열이다. 구체적으로, ENR 변이체 FabG-h는 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 FabG-h를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, ENR 변이체 FabG-h 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 작동가능하게 연결된 하기 서열을 포함하는 형질전환 숙주세포 선발 마커 발현 카세트를 제공한다:

(i) 프로모터 서열;

(ii) ENR 변이체 FabG-h 코딩 서열; 및

(iii) 3' 비번역(untranslated) 터미네이터 서열.

발현된 단백질이 트리클로산 내성을 부여할 수 있는 식으로 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 본 발명에 따른 ENR 변이체 FabG-h 코딩 서열은 일반적으로 그것이 숙주의 생화학적 기계류에 의해 인지되는 것을 가능하게 하고 오픈 리딩 프레임이 숙주 세포 내에 전사 및 해독되도록 하는 조절 인자를 갖는 발현 카세트로 제공될 것이다. 그것은 일반적으로 선택 숙주 세포 내에 발현될 수 있는 임의의 유전자로부터 적당하게 유래될 수 있는 전사 개시 영역뿐만 아니라 리보좀 인식 및 부착을 위한 전사 개시 영역을 포함할 것이다. 진핵 식물 세포에서, 발현 카세트는 일반적으로 전사가 종결되고 일차 전사체의 폴리아데닐화가 일어나도록 하는, 상기 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 위치된 전사 종결 영역을 추가로 포함한다. 또한, 코돈 사용량은 선발 숙주의 허용된 코돈 사용량에 적합할 수 있다. 선발된 숙주 세포에서 잡종 DNA 작제물의 발현을 좌우하는 원리는 일반적으로 당업자에 의해 이해되며 발현할 수 있는 잡종 DNA 작제물의 작제는 원핵 또는 진핵 생물인 임의 종류의 숙주 세포에 대해 일반적이다.

본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 발현 카세트에서, (i) 프로모터 서열; (ii) 목적 단백질 코딩 서열; 및 (iii) 3' 비번역(untranslated) 터미네이터 서열을 포함하는 목적 단백질 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 발현 카세트에서, 상기 목적 단백질 발현 카세트는 상기 선발 마커 발현 카세트와 함께 하나의 발현 카세트로서 직렬로(in tandem) 구축될 수 있다. 즉, 하나의 발현 카세트에 목적 단백질 발현 카세트와 선발 마커 발현 카세트가 함께 나란히 연결되는 것이다. 또한, 상기 목적 단백질 발현 카세트와 선발 마커 발현 카세트는 각각 별개의 발현 카세트에 존재하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 오픈 리딩 프레임이 숙주 세포 내에 유지되도록 하기 위하여, 그것은 일반적으로 선발된 숙주 세포에 의해 인지되고 복제되는 DNA에 연결된 본 발명에 따른 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 레플리콘 형태로 제공될 것이다. 따라서, 레플리콘의 선발은 선발 숙주 세포에 의해 많이 좌우된다. 선발된 특별한 숙주에 적합한 레플리콘의 선발을 좌우하는 원리는 당업자의 범위 내에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 세포일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 그람 음성 세균, 트리클로산에 민감한 그람 양성 세균 또는 진균일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 그람 음성 세균, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)인 그람 양성 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 뉴로스포라 크라쎄(Neurospora crassa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)인 진균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환체를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 선발 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 당업자들이 이용하는 일반적인 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환체를 트리클로산 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함한다. 형질전환체는 트리클로산 함유 배지에서 생존할 것이며, 비형질전환체는 상기 배지에서 살아남지 못하고 죽을 것이다. 따라서, 형질전환 숙주세포를 간단하게 선발할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 제조 방법을 제공한다. 형질전환체는 트리클로산 함유 배지에서 생존할 것이며, 비형질전환체는 상기 배지에서 살아남지 못하고 죽을 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체를 코딩하는 FabG -h( FabG - homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물을 제공한다. 본 발명의 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물은 FabG -h( FabG - homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하며, 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주세포는 트리클로산 함유 배지에서 살아남기 때문에, 형질전환체의 선발이 가능한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 토양 메타게놈 DNA의 분리

본 발명자들은 부산광역시 사상구 학장동에 위치한 감전수로의 인근에 위치한 공단으로부터 산업적으로 오염된 토양으로부터 만들어진 메타게놈 라이브러리(Tao 등 2011, J. Microbiol. Biotechnol. 21:1203-1210) 외에 낙동강 하구의 을숙도 퇴적토양을 메타게놈 라이브러리 작성에 사용하였다. 상기 채취한 토양은 각 구멍이 2 mm 직경인 체에 쳐서 1.5 mm 이상의 입자와 식물 잔재물 등을 제거하고 메타게놈 추출을 위하여 5 g씩 사용하였다. 메타게놈 추출은 토양에 SDS와 프로테나제 K(proteinase K)를 처리하여 DNA를 추출하였다.

구체적으로, 채취한 토양 5 g을 완충용액 15 ml에 넣어 섞어주었다. 상기 완충용액의 조성은, 100 mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM의 EDTA(pH 8.0), 100 mM의 인산나트륨(sodium phosphate)(pH 8.0), 1.5 M의 NaCl 및 1%의 CTAB로 구성하였다. 상기 완충용액에 현탁이 된 토양에 100 mg/ml 농도의 프로테나제 K를 100 ㎕ 첨가하고 37℃ 진탕배양기에서 90 rpm의 속도로 30분간 진탕하였다. 이후에 20%의 SDS를 1.5 ml 첨가하고 잘 흔들어 섞어주었다. 이를 65℃ 항온수조에서 30분마다 한번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다. 이후에 7,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하고 같은 부피의 클로로포름/아이소아밀알코올(24:1)을 첨가하여 섞어준 후 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 상등액의 부피의 0.6배에 해당하는 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 섞은 후, 11,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻은 다음, 이를 70% 에탄올을 첨가하여 재원심분리하고 침전물을 말려서 0.5 ml의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹여서 4℃에 보관하였다. 그 결과, 해당 토양 시료로부터 메타게놈을 분리하여 토양 1 g당 약 1~1.5 ㎍의 DNA를 회수하였고 분리된 DNA 크기는 약 20~100 kb로 분리가 가능하였다.

실시예 2. 메타게놈 라이브러리의 작성

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 추출해낸 메타게놈으로부터 라이브러리를 구축하였다. 이때, DNA의 전기영동, 플라스미드(plasmid) 분리 및 DNA의 절단은 기준이 되는 분자생물학적 방법으로 수행하였다.

구체적으로, 추출해낸 메타게놈을 저융점 아가로즈겔(low melting point agarose gel)에서 전기영동한 후, 25kb 이상의 DNA를 포함하는 아가로즈 블락(agarose block)만을 회수하였고, 이를 GeLase(Epicentre, USA)를 처리하여 DNA를 순화하였다. 상기 과정을 통하여 부식산(humic acid)을 제거할 수 있었다. 순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA 말단 회복(DNA end-repair) 효소를 이용하여 수리하고, 25kb 이상의 메타게놈을 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드 벡터 pEpi-FOS5와 pCC1FOS(Epicentre, USA)에 라이게이션(ligation)한 후 packaging extract(Epicentre. USA)를 이용하여 대장균(E. coli)에 도입하여 형질전환체를 선발하였다. 선발한 형질전환체로부터 재조합 효율을 검정하기 위하여 전통적인 SDS-알칼리 용해(SDS-alkali lysis) 방법으로 플라스미드를 분리한 후 제한효소로 절단하여 전기영동하였다.

그 결과, 검정한 30여 개의 모든 형질전환체들은 모두 재조합 플라스미드로 확인되어 라이브러리가 잘 작성됨을 알 수 있었다. 작성된 라이브러리는 400~1,000 클론씩 풀(pool)로 -80℃에서 보관하였다. 을숙도 퇴적토양으로부터 작성된 라이브러리는 총 48,800 클론이었다. 삽입된 메타게놈 DNA의 평균 크기는 무작위로 메타게놈 라이브러리 클론 플라스미드를 추출하여 BamHI으로 절단한 후 전기영동하여 확인한 결과 35 kb 이상으로 나타났다. 한편, 기존에 구축한 산업적으로 오염된 인공수로 퇴적토양으로부터는 기존에 구축한 메타게놈 라이브러리를 사용하였다(Tao 등 2011. J. Microbiol. Biotechnol. 21:1203-1210). 이 라이브러리는 총 78,600 클론으로 구성된 라이브러리였다(Khan 등, 2016. Scientific Reports 6:32322).

실시예 3. 메타게놈 라이브러리의 트리클로산 저항성 활성 클론 선발

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 구축한 메타게놈 라이브러리와 기 구축된 라이브러리로부터 트리클로산 저항성을 보이는 클론을 선발하였다. 우선 먼저 메타게놈 라이브러리의 숙주인 대장균의 트리클로산 저항성을 결정하기 위해 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 다음과 같이 결정하였다. 대장균 EPI-300 (pCC1FOS 플라스미드를 포함), DH5α(pUC119 플라스미드를 포함) 균주를 먼저 600 nm에서 흡광도 1.0까지 배양한 후 이 대장균 배양액을 희석하여 10⁵ cfu/ml이 되도록 하여 0.1-5 ㎍/ml의 다양한 농도의 트리클로산과 적정 항생제가 포함된 LB 배지에 도말하였다. 이 LB 배지에서 대장균이 자라는지 여부를 37℃에서 배양하며 매일 관찰하였다. 그 중 대장균의 배양을 억제하는 최소농도인 0.9 ㎍/ml 트리클로산을 최소저해 농도로 결정하였다.

메타게놈 라이브러리로부터 트리클로산 저항성 유전자를 탐색하기 위해 구체적으로, 저장된 각 라이브러리 풀(library pool)을 희석 평판법을 사용하여 알맞은 희석배수를 결정하고, 정해진 희석 배수에서 한 개의 풀(pool)당 저장된 클론수의 3배수 정도가 되도록 플레이트(plate)에 배양하여 자라나는 클론을 트리클로산 저항성으로 간주하였다. 라이브러리 클론의 희석을 위해서는 희석 완충용액(diluent buffer)[NaCl: 8.5 g, KH₂PO₄: 0.3 g, Na₂HPO₄: 0.6 g, 젤라틴(gelatin): 0.1 g]을 사용하였다. 작성된 메타게놈 라이브러리로부터 트리클로산 저항성 클론의 탐색을 위해 5 ㎍/ml의 트리클로산이 첨가된 LB 아가(agar) 배지 위에 적정 희석배수를 정해서 라이브러리 클론들을 도말한 후에 3~4일간 37℃에 배양하여 배지에서 자라는 클론들을 선발하였다. 트리클로산 저항성 활성을 나타내는 클론은 동일한 배지에 순수 배양하여 2차적으로 활성을 검정하였다. 최종 선발된 클론들은 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 BamHI을 사용해 삽입 DNA를 분석하고 동일한 클론들은 제외시켰다. 선발된 활성 클론은 플라스미드를 재분리하고 대장균 EPI-100 및 EPI-300에 형질전환하여 트리클로산 저항성 활성을 재검정하고 -80℃에 보관하였다.

실시예 4. 트리클로산 저항성 유전자 부위 결정 및 염기서열 결정

<4-1> 트리클로산 저항성 활성 유전자 부위 결정

본 발명자들은 토양으로부터 분리된 메타게놈에서 트리클로산 저항성 유전자 부위를 결정하였다. 구체적으로, 트리클로산 활성이 우수한 32개의 클론으로부터 플라스미드 DNA를 대량으로 분리하였고, 플라스미드 DNA를 제한효소 Sau3AI으로 부분 절단하거나, EcoRI, HindIII, BamHI 등으로 절단하여 절단된 DNA를 무작위로 서브클론하였다. 상기 DNA 절편들을 동일한 제한효소로 절단한 pUC119(Vieira 및 Messing, Methods Enzymol . 153: 3-11, 1987)에 라이게이션하여 2차 숏건 라이브러리(shot gun library)를 작성하였다. 작성된 라이브러리를 암피실린(ampicillin)과 트리클로산이 첨가된 LB 배지에 도말하고 37℃에서 3일간 배양하여 트리클로산 저항성 활성 서브클론들을 분리하였다. 그 결과, 분리한 활성 서브클론 중 삽입 DNA가 가장 적은 서브클론들을 선발하였다.

<4-2> 염기서열 분석

상기 실시예 4-1에서 결정한 트리클로산 저항성 활성 서브클론의 DNA의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, 앞서 선발된 32종류 3-옥소아실-ACP 리덕타제(3-oxoacyl-ACP reductase)를 암호화하는 유전자 클론들이 2개 선발되었다. 이들 2개 클론들에 대하여 모두 활성 서브클론들을 획득하여 염기서열을 분석하였는데 모두 활성 유전자가 90% 이상 염기서열이 동일하였다. 서브클론의 DNA 염기서열 결정은 코스모진텍(Seoul, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 밝혀진 DNA 염기서열은 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여서 분석하였다.

그 결과, 트리클로산 저항성을 보이는 서브클론들의 염기서열은 다음과 같이 분석되었다. 염기서열의 분석결과 서열번호 3은 총 1,680 염기서열을 포함하는 활성 서브클론 pD-1-6로 823bp의 염기서열로 이루어지는 3-옥소아실-ACP 리덕타제(3-oxoacyl-ACP reductase) 효소와 유사한 단백질을 암호화하는 유전자 부위를 포함하였다. 상기 서열번호 3의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 536 내지 1363 부위(1361-1363: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame, 서열번호 1)은 FabG 효소 단백질을 암호화하는 부위로 결정되었다. 서열번호 2로 기재되는 275개 아미노산을 암호화하는 것으로 예측되었다. 상기 FabG 단백질의 염기 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 다수의 미생물에서 유래된 3-옥소아실-ACP 리덕타제와 60-70%의 매우 높은 상동성을 보였다(도 2). 그러나, 해당 유전자는 본 발명 결과 3-옥소아실-ACP 리덕타제 효소가 아니라 새로운 종류의 ENR임을 본 발명에서 입증하여 새로운 ENR 활성을 암호화하고 그 결과 트리클로산에 저항성을 부여하는 신규한 유전자로 확인되었다.

<4-3> 아미노산 서열 분석

상기 실시예 <4-2>에서 결정한 염기서열들을 이용하여 이로부터 암호화되는 아미노산 서열들을 분석하였다. 구체적으로, 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열로부터 암호화되는 서열번호 2의 275개 아미노산 서열로 구성된 3-옥소아실-ACP 리덕타제 유사 ENR 단백질을 'gENR'으로 명명하였다. 그 결과, 3-옥소아실-ACP 리덕타제 유사 ENR 단백질의 아미노산 서열은 많은 미생물 유전체 정보에서 유래한 3-옥소아실-ACP 리덕타제와 높은 아미노산 유사도를 보였다. 2개의 FabG 유사 단백질은 모두 대장균의 FabG와 유사한 효소활성 부위로 세린(138), 라이신(155) 아미노산이 관찰되었으나 대장균 FabG의 151번째 티로신은 메타게놈 유래의 단백질에서는 비극성 아미노산인 발린으로 바뀌어 있었다. 그리고 ACP(Acyl Carrier Protein)가 결합하는 중심부위인 두 개의 아르기닌 잔기도 확인되었다. 또한 이 메타게놈 유래의 단백질은 바실러스 서틸리스의 FabL과도 부분적인 유사도를 보였으며 기질과 코펙터가 결합하는 부위도 잘 보존되어 있었다.

실시예 5. 트리클로산 저항성 유전자의 ENR 활성 검정을 위한 상보성(complementation) 분석

본 발명자들은 메타게놈에서 선발한 FabG 유사 유전자가 ENR 활성을 보이는지 확인하기 위해서 대장균의 ENR 중 한가지인 FabI 유전자가 변이된 대장균 변이주 JP1111를 이용하여 ENR 활성의 상보성(complementation)을 조사하였다. JP1111은 FabI 유형의 ENR에 변이를 가지고 있으며 이로 인해 정상적인 야생형 대장균에 비해 42℃의 온도에서는 생장을 할 수 없는 변이체이나 30℃의 온도에서는 야생형 대장균처럼 생장하는 변이체이다(Egan and Russell, 1973; Genet. Res. 21:139-152). 따라서 본 발명자들이 선발한 FabG 유사 유전자를 가진 클론 pD-1-6을 가진 대장균 JP1111에 도입하고 이 형질전환된 대장균을 LB 고체 배지에 접종하여 30℃와 42℃에서 배양하였다. 대조구로는 pGEM-T Easy를 가진 JP1111와 대장균의 원래 FabI 유전자를 도입한 JP1111을 각각 사용하였다.

구체적으로, 각 플라스미드 pGEM-T Easy, pD-1-6를 콤피턴트 대장균 세포 JP1111 50㎕와 혼합한 후 얼음에서 20분간 정치시킨 다음, 42℃에서 45초간 열처리하여 서브클론을 콤피턴트 세포내로 도입한 후, LB 배지 400 ㎕를 가하여 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 이로부터 형질전환체들을 선별하기 위하여 암피실린이 100 ㎍/㎖ 함유된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양된 플레이트로부터 형성된 콜로니들을 선별하고 pGEM-T Easy, pD-1-6 도입여부를 플라스미드 DNA를 분리하고 각각의 알맞은 제한효소로서 절단양상을 판별하여 확인하였다.

선별된 대장균 형질전환체들을 IPTG가 포함된 LB 배지에서 3 반복으로 배양할 때 각각 30℃와 42℃에서 배양하며 세균의 배양여부를 48시간 후에 관찰하였다. 42℃에서 대장균의 콜로니 형성여부가 ENR 활성의 상보적 현상(complementation)으로 간주하였다. 그 결과 pGEM-T Easy를 함유한 대장균 JP1111은 30℃에서만 성장한 반면 42℃에서는 콜로니를 형성하지 못하였다. 양성 대조구로 대장균의 fabI 유전자가 도입되었거나 ENR 활성 유전자 pD-1-6이 도입된 대장균 JP1111은 30℃와 42℃에서 모두 대장균이 콜로니를 형성하였다(도 3). 이는 pD-1-6에 클로닝된 유전자가 ENR 활성의 유전자임을 유전적으로 입증한 결과이다.

실시예 6. 트리클로산 저항성 유전자의 다른 미생물에서 활성 확인

ENR 활성을 가진 FabG 유사 유전자가 대장균 외의 다른 미생물의 트리클로산의 선발 마커로 사용가능한지 확인하기 위해 광범위 숙주 플라스미드인 pRK415 (Keen 등 1988, Gene 70:191-197)에 클로닝하여 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonis solanacearum)에 도입하여 트리클로산 저항성을 검정하였다. pD-1-6에 있는 ENR 활성 유전자를 자체의 프로모터를 포함하도록 아래의 프라이머로 증폭하여 pRK415에 클로닝하였다: FW2PAT7A: 5’-TGATGCGGATCCACTACGCCATCCTCGCTTGT-3’(BamHI 포함, 서열번호 4), RV2PAT7A: 5’-CCCTTCGACAGGCTCAGGGCGAATTCGGGAAT-3’(EcoRI 포함, 서열번호 5).

PCR 반응물은 25 ㎕ 용액에 10X Taq DNA 버퍼, dNTPs, Taq DNA 폴리머라제, 2 mM MgSO₄, 약 1 ~ 5 ng의 주형(template) DNA를 조합하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분의 초기 변성을 실시하고, 총 30 사이클(cycle)의 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링(annealing), 및 72℃에서 1분 20초간 확장반응을 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장반응을 실시하였다.

증폭된 PCR 산물은 직접 KpnI과 BamHI으로 절단한 후 동일한 제한효소로 절단한 pRK415에 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드 산물을 대장균 DH5a에서 형질전환을 통해 클로닝하여 테트라사이크린 15 ㎍/ml과 트리클로산 5 ㎍/ml이 첨가된 LB 배지에서 콜로니를 형성하는 대장균을 선발하여 서브클론을 선발하였다. 선발된 클론은 'pRK-FabG'로 명명하였다. pRK-FabG는 분리하여 제한효소 절단을 통해 pD-1-6의 유전자가 서브클로닝됨을 확인하였다. 해당 플라스미드 pRK-FabG는 삼친교배법(triparental mating)을 통해 랄스토니아 솔라나세아룸으로 도입되었다. 슈도모나스 푸티다의 경우에는 상당히 높은 농도의 트리클로산 배지에서도 자라므로 이 미생물에서는 선발한 유전자가 선발 마커로 사용이 불가능하였다. 이는 슈도모나스 푸티다의 경우에 유전체에 트리클로산 저항성 유전자를 보유하기 때문으로 판단된다.

삼친교배법은 우선 공여자(donor)로 대장균 DH5a (pRK-FabG)를 테트라사이클린이 15 ㎍/ml 포함된 LB 배지에서 24시간 배양하고, 헬퍼(helper)로 대장균 HB101 (pRK2013)을 카나마이신이 50 ㎍/ml 포함된 LB 배지에서 24시간 배양하며 수용자(recipient)로 랄스토니아 솔라나세아룸을 CPG 배지에서 36시간 각각 배양하였다. 세 세균을 각각 생리식염수 1 ml에 긁어 모아 현탁하고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 이와 같은 세척을 2회 더 반복한 후 세균세포 침전물을 동일한 생리식염수에 현탁하여 100 ul씩 세 세균을 혼합하여 YDC 배지에 떨어뜨리고 배양하였다. 30℃에서 3일간 배양된 삼친교배법 혼합물은 다시 생리식염수로 재현탁하고 테트라사이클린이 15 ㎍/ml 포함된 MG 최소배지에 현탁하였다. 대장균은 최소배지에 자라지 못하며 테트라사이클린이 포함된 배지에서는 pRK-FabG가 도입된 랄스토니아 솔라나세아룸만 자라서 선발되었다. 선발된 랄스토니아 솔라나세아룸 (pRK-FabG)에 대한 대조구로는 동일한 삼친교배법으로 선발한 pRK415만을 가지는 랄스토니아 솔라나세아룸(pRK415)을 이용하였다.

트리클로산이 다양한 농도로 포함된 CPG 배지에서 랄스토니아 솔라나세아룸(pRK415)은 0.5 ㎍/ml의 트리클로산 농도에서도 성장이 안되었으나 랄스토니아 솔라나세아룸(pRK-FabG)은 100 ㎍/ml 농도의 트리클로산에서도 정상적인 콜로니를 형성하였다. 즉 FabG 유사한 ENR 효소 활성을 가진 유전자는 트리클로산 저항성 선발 마커로 다른 세균에서도 활용이 가능함을 확인하였다.

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Novel FabG-h gene resistant to triclosan from soil metagenome and uses thereof <130> PN17049 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 828 <212> DNA <213> Soil metagenome <400> 1 atgaaaaccg acacccggtt caagccaaat gaatgggctt tgatcctcgg agggtcaagt 60 ggatttggag gagccgccgc ggtcgaactg gccaagcatg gcatgaacat ttttggtgtc 120 catttggatc ggcaggcgac catgcccgct gtgcagcaag tcatccgcga tatcaaacat 180 acgggaagcg acgccgtttt cttcaatatc aatgcagccg attcaataaa acgagaagaa 240 gcgcttgatg agatacgcga gaggttttcg aaagactcat cgcagactgt gcgtgtcctc 300 ctgcattccc tcgccttcgg gacgctcaaa cccttcattg ccagcaaacc ggaagaagaa 360 atctccgagg ctcagatgga gatgacgctg gatgtaatgg ccaacagtct cgtgtattgg 420 gtccagggtc tcatgggacg aaagctgatg aagaaaggtg gaagaatcat aggattgaca 480 agttccggcg gacactcggt catcccgaac tatggagccg tctctgccgc gaaagcgact 540 ttggaatcac acctcagaca actggcaatg gagttgggac cctacggtat tactgcgaac 600 gcggtgatgg ccggtgttac cgatacgccc gctttgcgaa agatcccgaa caacgttcgc 660 atgcgagaag tcgcgaaggc aaagaatccg tttggcaggc tgaccacgcc tgaggatgtg 720 gcgaaagcga tcgtgctcct tgccgatgaa aacgcctact ggatatcggg gagcatcatc 780 ggagttgatg gaggggaaga tgttgtgagc tacatcggtc caaagtga 828 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> Soil metagenome <400> 2 Met Lys Thr Asp Thr Arg Phe Lys Pro Asn Glu Trp Ala Leu Ile Leu 1 5 10 15 Gly Gly Ser Ser Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ala Val Glu Leu Ala Lys 20 25 30 His Gly Met Asn Ile Phe Gly Val His Leu Asp Arg Gln Ala Thr Met 35 40 45 Pro Ala Val Gln Gln Val Ile Arg Asp Ile Lys His Thr Gly Ser Asp 50 55 60 Ala Val Phe Phe Asn Ile Asn Ala Ala Asp Ser Ile Lys Arg Glu Glu 65 70 75 80 Ala Leu Asp Glu Ile Arg Glu Arg Phe Ser Lys Asp Ser Ser Gln Thr 85 90 95 Val Arg Val Leu Leu His Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Lys Pro Phe 100 105 110 Ile Ala Ser Lys Pro Glu Glu Glu Ile Ser Glu Ala Gln Met Glu Met 115 120 125 Thr Leu Asp Val Met Ala Asn Ser Leu Val Tyr Trp Val Gln Gly Leu 130 135 140 Met Gly Arg Lys Leu Met Lys Lys Gly Gly Arg Ile Ile Gly Leu Thr 145 150 155 160 Ser Ser Gly Gly His Ser Val Ile Pro Asn Tyr Gly Ala Val Ser Ala 165 170 175 Ala Lys Ala Thr Leu Glu Ser His Leu Arg Gln Leu Ala Met Glu Leu 180 185 190 Gly Pro Tyr Gly Ile Thr Ala Asn Ala Val Met Ala Gly Val Thr Asp 195 200 205 Thr Pro Ala Leu Arg Lys Ile Pro Asn Asn Val Arg Met Arg Glu Val 210 215 220 Ala Lys Ala Lys Asn Pro Phe Gly Arg Leu Thr Thr Pro Glu Asp Val 225 230 235 240 Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Ala Asp Glu Asn Ala Tyr Trp Ile Ser 245 250 255 Gly Ser Ile Ile Gly Val Asp Gly Gly Glu Asp Val Val Ser Tyr Ile 260 265 270 Gly Pro Lys 275 <210> 3 <211> 1680 <212> DNA <213> Soil metagenome <400> 3 catccgggaa atcgcggctg aattcaagga ggcgaagaac ttcttgtacc ttggacgtgg 60 tgcgaacttc cctgtcgctc tggaaggagc cctgaagctg aaggagatct cctacattca 120 tgccgaggga tcccccgcag cggaaatgaa acacggccct atcgcgctca tcgatgagca 180 gatgccggtg gtagtcattg cgccgcacga tgccatctat gagaaggtcg tgagcaacat 240 tcaggaagta cgtgcccgga agggacggtt gattgtcatt gcaaatgagg acgaccgaga 300 aattgaggat cttgctgaat tcgttgttaa ggttccaaga acttatggtt actttggccc 360 catcctgaac gtcattccgc tccagatgct tgcctaccac atcgccgttg cgcgtgggct 420 gaacgttgac cagccacgta atcttgcaaa aagcgtgacg gttgaatgat ctttgatttt 480 cctcgatttc ttgctatctt taacaccttc aacgaatacc ccaaaggaga acagcatgaa 540 aaccgacacc cggttcaagc caaatgaatg ggctttgatc ctcggagggt caagtggatt 600 tggaggagcc gccgcggtcg aactggccaa gcatggcatg aacatttttg gtgtccattt 660 ggatcggcag gcgaccatgc ccgctgtgca gcaagtcatc cgcgatatca aacatacggg 720 aagcgacgcc gttttcttca atatcaatgc agccgattca ataaaacgag aagaagcgct 780 tgatgagata cgcgagaggt tttcgaaaga ctcatcgcag actgtgcgtg tcctcctgca 840 ttccctcgcc ttcgggacgc tcaaaccctt cattgccagc aaaccggaag aagaaatctc 900 cgaggctcag atggagatga cgctggatgt aatggccaac agtctcgtgt attgggtcca 960 gggtctcatg ggacgaaagc tgatgaagaa aggtggaaga atcataggat tgacaagttc 1020 cggcggacac tcggtcatcc cgaactatgg agccgtctct gccgcgaaag cgactttgga 1080 atcacacctc agacaactgg caatggagtt gggaccctac ggtattactg cgaacgcggt 1140 gatggccggt gttaccgata cgcccgcttt gcgaaagatc ccgaacaacg ttcgcatgcg 1200 agaagtcgcg aaggcaaaga atccgtttgg caggctgacc acgcctgagg atgtggcgaa 1260 agcgatcgtg ctccttgccg atgaaaacgc ctactggata tcggggagca tcatcggagt 1320 tgatggaggg gaagatgttg tgagctacat cggtccaaag tgaacccccc gggtaagttt 1380 agtttgtcct catctgcgca atagccaata caagggagaa ctatggtcga attcgaactc 1440 agcgaagagc aaaagatgct cagagagatg gtgcgtgatt tcacaaacac agaaatcaag 1500 ccaatcgcgc gtcagatcga tgagcaagaa cgggtacccc gcgaactcat caacaagctt 1560 ggagagttgg gattgctcgg agctgttttc cctacagagt atggaggagg gggattcggc 1620 gaactgggat actgcctggt tcaggaagaa atcgggcgtg gttgccttgc gacctcgaca 1680 1680 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgatgcggat ccactacgcc atcctcgctt gt 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cccttcgaca ggctcagggc gaattcggga at 32

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabG-h(FabG-homolog).
제1항의 FabG-h를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 뉴로스포라 크라쎄(Neurospora crassa) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제4항에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 선발 방법.
제4항에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 제조 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체를 코딩하는 FabG -h(FabG - homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물.