KR101858046B1 - 토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabL-h 및 이의 용도 - Google Patents

토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabL-h 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규 트리클로산 저항성 ENR 변이체 FabL-h 코딩 유전자는 대장균뿐만 아니라 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 다양한 세균에 발현시켜 트리클로산 저항성 형질전환체를 효과적으로 선별할 수 있는 트리클로산 저항성 선발 마커로 활용할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabL-h 및 이의 용도{Novel FabL-h gene resistant to triclosan from soil metagenome and uses thereof}
본 발명은 토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 FabL-h 및 이의 용도에 관한 것이다.
이전의 미생물 분자생태학적 연구 결과, 통상적인 방법인 순수 배양기술을 통해서 발견되었던 미생물보다 더 많은 미생물이 지구상에 존재한다는 것이 밝혀졌고, 토양 내에 존재하는 미생물의 99% 이상이 배양이 되지 않는 것으로 밝혀졌다(Amann 등 Microbiol . Rev. 59:143-169, 1995). 즉, 이전의 미생물 자원의 발굴이 미생물 순수배양에 의존해 왔으므로 지구상에 존재하는 대다수 다양한 미생물의 자원이 발굴되지 못했던 문제가 있었다.
이러한 문제를 해결하기 위해서 개발된 미생물 분자생태학적 방법 중의 하나가 메타게놈 연구방법이다. 메타게놈은 미생물이 존재하는 자연환경에 존재하는 모든 미생물 군집의 총 게놈(genome)을 통칭하는 의미로 1998년 Jo Handelsman에 의해서 처음 사용되었다(Handelsman 등 Chem . Biol . 5:R245-249, 1998)). 상기 방법은 특정 환경 시료에서 미생물 군집의 총 DNA를 바로 추출하여 커다란 크기의 DNA를 수용할 수 있는 코스미드(cosmid), 포스미드(fosmid) 또는 BAC 벡터(vector)에 클로닝하여 유전자 라이브러리를 제작하는 방법을 포함한다(Schloss 등 Curr . Opin. Biotechnol . 14:303-310, 2003). 메타게놈으로부터 지난 수년간 다양한 항생제 및 항생제 저항성 관련 유전자들이 발견되었다.
트리클로산(triclosan, 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)-phenol)은 많은 미생물을 죽일 수 있는 광범위 항생제로서 다양한 생활용품의 성분으로 오랜 기간 사용되고 있다(Halden Environ. Sci . Technol . 48:3603-3611, 2014). 트리클로산은 세균에게는 제2유형의 지방산 합성과정에 중요한 마지막 효소인 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)에 결합하여 지방산 합성을 억제하여 항생효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Heath 등 J. Biol . Chem . 274:11110-11114, 1999). 현재까지 네 가지 종류의 ENR 동질효소(isozyme)들이 보고되어 있으며(도 1), 이들은 각각 fabI, fabL , fabV , fabK의 유전자에 의해 암호화되며 FabK만 제외하면 이들은 모두 SDR(short chain dehydrogenase/reductase) 서브패밀리의 효소를 암호화하는 것으로 알려져 있다. 이들 트리클로산의 결합 대상인 단백질 중 FabK는 완벽히 트리클로산 저항성 단백질로 보고된 non-SDR 계의 ENR으로 알려져 있다(Massengo-Tiasse 등 Cell. Mol . Life. Sci . 66:1507-1517, 2009). ENR은 트리클로산 외의 다른 합성 항생물질의 약물 타겟으로 아이소나이아지드(isoniazid), 헥사클로로펜(hexachlorophene), 디플루페니칸(diflufenican) 등의 다양한 항생제의 결합부위로 알려져 있는데 이 ENR의 변이는 이들 약물에 대한 저항성을 유발한다(Lu 등, Acc. Chem . Res 41:11-20, 2008).
최근에 트리클로산 저항성 세균이 환경에 광범위하게 분포하고 있는 것으로 알려져 있는데 그 주된 기작은 ENR을 암호화하는 유전자의 변이에 의한 트리클로산 결합에 대한 저항성을 보이거나 막의 투과성 변화로 트리클로산을 흡수하지 않거나, 들어온 트리클로산을 외부로 유출하는 수송자 단백질에 의한 저항성 등이 그것이다(Yazdankhah 등 Microb . Drug. Resist. 12:83-90, 2006).
한편, 한국등록특허 제1693285호에서는 '트리클로산 노출에 대응하는 히드라 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '토양 메타게놈 유래의 트리클로산 저항성 신규 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 트리클로산이 오랜기간 동안 사용되고 환경에 방출되어 항생제 저항성 변이 유전자가 존재할 것으로 예상되지만, 현재까지는 트리클로산 저항성 유전자를 유전자 조작용 선발 마커로 활용한 상용화된 클로닝 벡터는 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명에서는 토양 메타게놈 기술을 통해 트리클로산 저항성 유전자를 선발하여 세균의 트리클로산 저항성 선발 마커(selection marker)로 사용할 수 있음을 보고하고자 한다.
우선, 본 발명자들은 트리클로산에 저항성을 보이는 신규한 유전자를 토양으로부터 동정하기 위하여, 토양 미생물로부터 메타게놈을 분리한 후 포스미드(fosmid)를 이용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 작성하였다. 상기 작성된 라이브러리로부터 트리클로산이 첨가된 배지에서 숙주세포인 대장균의 생장여부를 통해 트리클로산 저항성 유전자를 가진 포스미드 클론을 선별하였다. 선별된 트리클로산 저항성 메타게놈 관련 유전자들을 다시 작게 재분리하고 초기 선별된 글론과 동일한 수준으로 트리클로산에 저항성 여부를 판별하여 활성 유전자 부위를 결정하였고 이들의 염기서열을 분석하였다.
상기 염기서열들을 분석한 결과, 총 1,749 염기서열을 포함하는 활성 서브클론으로 777bp의 염기서열로 이루어지는 aHSD(7-α-hydroxysteroid dehydrogenase) 효소를 암호화하는 유전자 부위를 포함하였다. 상기 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 585 내지 1361 부위(1359-1361: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)은 aHSD 효소 단백질을 암호화하는 부위로서 258개 아미노산을 암호화하는 것으로 예측되었다. 상기 aHSD 효소의 염기 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 다수의 미생물에서 유래된 aHSD와 매우 높은 상동성을 보였다.
그러나, 특이하게도 해당 유전자는 본 발명의 확인 결과 aHSD 효소가 아니라 새로운 종류의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)임을 입증하였고, 이는 새로운 ENR 활성을 암호화하고 그 결과 트리클로산에 저항성을 부여하는 신규한 유전자로 확인됨으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabL-h(FabL-homolog)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 FabL-h를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환체를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 선발 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체를 코딩하는 FabL-h(FabL-homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 신규 트리클로산 저항성 ENR 변이체 FabL-h 코딩 유전자는 대장균뿐만 아니라 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 다양한 세균에 발현시켜 트리클로산 저항성 형질전환체를 효과적으로 선별할 수 있는 트리클로산 저항성 선발 마커로 활용할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 트리클로산 존재시 지방산 생합성에 관여하는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)의 활성이 저해되는 기작을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 입실론프로테오박테리아(Epsilonproteobacteria)에 존재하는 메타게놈 7-α-HSDH-유사 ENR 상동체들을 나타내는 것으로, 이들은 밀접하게 연관된 매우 특징 분석이 잘된 7-α-HSDH와 원형의 FabI 및 FabL ENRs의 유사 구조적 형태를 공유한다. a, 대장균(E. coli) FabI 및 바실러스 서틸리스(B. subtilis) FabL와 메타게놈 7-α-HSDH-유사 ENR 상동체들(pBF1-4, pL-2, pY-4, pR-2-3, pQ-2-3, pQ2N-2, pBC1-1)의 부분적인 다중 정렬을 나타낸다. 메타게놈 7-α-HSDH 상동체는 FabI 및 FabL와 낮은 유사성을 나타내지만, 유사 촉매 도메인을 여전히 공유하였다. 촉매 자리 티로신 및 라이신 잔기는 *로 표시하였다. b, 코마모나스 테스토스테로니(C. testosteroni) 및 대장균(E. coli) 유래의 7-α-HSDH와 메타게놈 7-α-HSDH-유사 ENRs(pBF1-4, pL-2, pY-4, pR-2-3, pQ-2-3, pQ2N-2, pBC1-1)의 부분적인 다중 정렬을 나타낸다. 효소의 촉매 기능과 연관된 잔기는 *로 표시하였다. 메타게놈 7-α-HSDH-유사 ENRs의 기본적 촉매자리인, Y159/Y161 잔기 (코마모나스 테스토스테로니 및 대장균 각각)는 히스티딘으로 치환되었고, 반면, 두개의 다른 잔기인 S146/S148 및 K163/K165은 7-α-HSDH-유사 메타게놈 ENRs 사이에 고도로 보존되어 있었다. RINA-유사 서열은 막대로 표시하였는데, 보존된 트레오닌은 삼각형으로 표시하였다. c, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 및 헬리코박터 파일로리(Heliocbacter pylori) 유래의 7-α-HSDH와 바실러스 서틸리스(B. subtilis) 유래의 FabL 및 대장균 유래의 FabI의 부분적인 다중 정렬을 나타낸다. 티로신 및 라이신 잔기의 촉매 자리는 *로 나타내었다. d, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 및 헬리코박터 파일로리(Heliocbacter pylori) 유래의 7-α-HSDH와 대장균(E. coli) 및 코마모나스 테스토스테로니(C. testosteroni) 유래의 7-α-HSDH의 부분적인 다중 정렬을 나타낸다. 효소의 촉매 기능과 연관된 잔기는 *로 표시하였다. 메타게놈 7-α-HSDH-유사 ENRs와 유사한 Y159/Y161 잔기(대장균 및 코마모나스 테스토스테로니 각각)는 기본적인 촉매자로, 히스티딘으로 치환되었고, 반면 다른 두개의 잔기 S146/S148 및 K163/K165은 이들 7-α-HSDH-유사 ENRs 사이에서 고도로 보존되었다. 반응 방향에 필수적인 RINA-유사 서열은 막대로 표시하였고, 반면 보존된 트레오닌은 삼각형으로 표시하였다.
도 3은 본 발명의 메타게놈에서 선발한 aHSD와 유사한 유전자가 ENR 활성을 보이는지 확인하기 위해서 대장균의 ENR 중 한가지인 FabI 유전자가 변이된 대장균 변이주 JP1111를 이용하여 ENR 활성의 상보성(complementation)을 조사한 결과이다. 각각의 플레이트의 상단 왼쪽은 FabI을 가지는 대장균에 pGEM-T Easy를 형질전환시킨 JP1111, 상단 오른쪽은 pGEM-T Easy만을 형질전환시킨 JP1111, 하단 왼쪽은 aHSD(pBF1-4)을 가지는 JP1111, 하단 오른쪽은 FabG (pD-1-6)을 가지는 JP1111이다. 각 플레이트는 30℃에서 24시간, 42℃에서 48시간 배양하였다.
도 4는 본 발명에서 발현시켜 순수분리된 융합단백질 ENR-HSD14의 크기(33.56 kDa)를 쿠마시 블루 염색으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 소듐 포스페이트 컨쥬케이트 버퍼에서 ENR-HSD14 정제 단백질의 생화학적 특성을 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabL-h(FabL-homolog)를 제공한다.
본 발명의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabL-h는 트리클로산(triclosan)에 저항성을 부여한다. 트리클로산(triclosan, 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)-phenol)은 많은 미생물을 죽일 수 있는 광범위 항생제로서 다양한 생활용품의 성분으로 오랜 기간 사용되고 있으며, 세균에게는 제2유형의 지방산 합성과정에 중요한 마지막 효소인 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase)에 결합하여 지방산 합성을 억제하여 항생효과를 나타내는 것으로, 현재까지 네 가지 종류의 ENR 동질효소(isozyme)들인 FabI, FabL, FabV, FabK이 보고되어 있다.
본 발명의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabL-h은 대장균 및 바실러스 서틸리스 FabL와 서열 유사성을 나타내어, FabL-h(FabL-homolog)로 명명한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabL-h에서, 상기 ENR 변이체 FabL-h는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에 대한 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 아미노산 서열과 유사한 기능을 갖는 아미노산 서열이다. 구체적으로, ENR 변이체 FabL-h는 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 FabL-h를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, ENR 변이체 FabL-h 코딩 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 작동가능하게 연결된 하기 서열을 포함하는 형질전환 숙주세포 선발 마커 발현 카세트를 제공한다:
(i) 프로모터 서열;
(ii) ENR 변이체 FabL-h 코딩 폴리뉴클레오티드; 및
(iii) 3' 비번역(untranslated) 터미네이터 서열.
발현된 단백질이 트리클로산 내성을 부여할 수 있는 식으로 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 본 발명에 따른 ENR 변이체 FabL-h 코딩 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 그것이 숙주의 생화학적 기계류에 의해 인지되는 것을 가능하게 하고 오픈 리딩 프레임이 숙주 세포 내에 전사 및 해독되도록 하는 조절 인자를 갖는 발현 카세트로 제공될 것이다. 그것은 일반적으로 선택 숙주 세포 내에 발현될 수 있는 임의의 유전자로부터 적당하게 유래될 수 있는 전사 개시 영역뿐만 아니라 리보좀 인식 및 부착을 위한 전사 개시 영역을 포함할 것이다. 진핵 식물 세포에서, 발현 카세트는 일반적으로 전사가 종결되고 일차 전사체의 폴리아데닐화가 일어나도록 하는, 상기 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 위치된 전사 종결 영역을 추가로 포함한다. 또한, 코돈 사용량은 선발 숙주의 허용된 코돈 사용량에 적합할 수 있다. 선발된 숙주 세포에서 잡종 DNA 작제물의 발현을 좌우하는 원리는 일반적으로 당업자에 의해 이해되며 발현할 수 있는 잡종 DNA 작제물의 작제는 원핵 또는 진핵 생물인 임의 종류의 숙주 세포에 대해 일반적이다.
본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 발현 카세트에서, (i) 프로모터 서열; (ii) 목적 단백질 코딩 서열; 및 (iii) 3' 비번역(untranslated) 터미네이터 서열을 포함하는 목적 단백질 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 발현 카세트에서, 상기 목적 단백질 발현 카세트는 상기 선발 마커 발현 카세트와 함께 하나의 발현 카세트로서 직렬로(in tandem) 구축될 수 있다. 즉, 하나의 발현 카세트에 목적 단백질 발현 카세트와 선발 마커 발현 카세트가 함께 나란히 연결되는 것이다. 또한, 상기 목적 단백질 발현 카세트와 선발 마커 발현 카세트는 각각 별개의 발현 카세트에 존재하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 오픈 리딩 프레임이 숙주 세포 내에 유지되도록 하기 위하여, 그것은 일반적으로 선발된 숙주 세포에 의해 인지되고 복제되는 DNA에 연결된 본 발명에 따른 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 레플리콘 형태로 제공될 것이다. 따라서, 레플리콘의 선발은 선발 숙주 세포에 의해 많이 좌우된다. 선발된 특별한 숙주에 적합한 레플리콘의 선발을 좌우하는 원리는 당업자의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 세포일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 그람 음성 세균, 트리클로산에 민감한 그람 양성 세균 또는 진균일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 그람 음성 세균, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)인 그람 양성 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 뉴로스포라 크라쎄(Neurospora crassa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)인 진균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환체를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 선발 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 당업자들이 이용하는 일반적인 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환체를 트리클로산 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함한다. 형질전환체는 트리클로산 함유 배지에서 생존할 것이며, 비형질전환체는 상기 배지에서 살아남지 못하고 죽을 것이다. 따라서, 형질전환 숙주세포를 간단하게 선발할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 제조 방법을 제공한다. 형질전환체는 트리클로산 함유 배지에서 생존할 것이며, 비형질전환체는 상기 배지에서 살아남지 못하고 죽을 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체를 코딩하는 FabL -h(FabL - homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물을 제공한다. 본 발명의 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물은 FabL -h(FabL - homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하며, 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주세포는 트리클로산 함유 배지에서 살아남기 때문에, 형질전환체의 선발이 가능한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 토양 메타게놈 DNA의 분리
본 발명자들은 부산광역시 사상구 학장동에 위치한 감전수로의 인근에 위치한 공단으로부터 산업적으로 오염된 토양으로부터 만들어진 메타게놈 라이브러리(Tao 등 2011, J. Microbiol. Biotechnol. 21:1203-1210) 외에 낙동강 하구의 을숙도 퇴적토양을 메타게놈 라이브러리 작성에 사용하였다. 상기 채취한 토양은 각 구멍이 2 mm 직경인 체에 쳐서 1.5 mm 이상의 입자와 식물 잔재물 등을 제거하고 메타게놈 추출을 위하여 5 g씩 사용하였다. 메타게놈 추출은 토양에 SDS와 프로테나제 K(proteinase K)를 처리하여 DNA를 추출하였다.
구체적으로, 채취한 토양 5 g을 완충용액 15 ml에 넣어 섞어주었다. 상기 완충용액의 조성은, 100 mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM의 EDTA(pH 8.0), 100 mM의 인산나트륨(sodium phosphate)(pH 8.0), 1.5 M의 NaCl 및 1%의 CTAB로 구성하였다. 상기 완충용액에 현탁이 된 토양에 100 mg/ml 농도의 프로테나제 K를 100 ㎕ 첨가하고 37℃ 진탕배양기에서 90 rpm의 속도로 30분간 진탕하였다. 이후에 20%의 SDS를 1.5 ml 첨가하고 잘 흔들어 섞어주었다. 이를 65℃ 항온수조에서 30분마다 한번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다. 이후에 7,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하고 같은 부피의 클로로포름/아이소아밀알코올(24:1)을 첨가하여 섞어준 후 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 상등액의 부피의 0.6배에 해당하는 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 섞은 후, 11,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻은 다음, 이를 70% 에탄올을 첨가하여 재원심분리하고 침전물을 말려서 0.5 ml의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹여서 4℃에 보관하였다. 그 결과, 해당 토양 시료로부터 메타게놈을 분리하여 토양 1 g당 약 1~1.5 ㎍의 DNA를 회수하였고 분리된 DNA 크기는 약 20~100 kb로 분리가 가능하였다.
실시예 2. 메타게놈 라이브러리의 작성
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 추출해낸 메타게놈으로부터 라이브러리를 구축하였다. 이때, DNA의 전기영동, 플라스미드(plasmid) 분리 및 DNA의 절단은 기준이 되는 분자생물학적 방법으로 수행하였다.
구체적으로, 추출해낸 메타게놈을 저융점 아가로즈겔(low melting point agarose gel)에서 전기영동한 후, 25kb 이상의 DNA를 포함하는 아가로즈 블락(agarose block)만을 회수하였고, 이를 GeLase(Epicentre, USA)를 처리하여 DNA를 순화하였다. 상기 과정을 통하여 부식산(humic acid)을 제거할 수 있었다. 순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA 말단 회복(DNA end-repair) 효소를 이용하여 수리하고, 25kb 이상의 메타게놈을 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드 벡터 pEpi-FOS5와 pCC1FOS(Epicentre, USA)에 라이게이션(ligation)한 후 packaging extract(Epicentre. USA)를 이용하여 대장균(E. coli)에 도입하여 형질전환체를 선발하였다. 선발한 형질전환체로부터 재조합 효율을 검정하기 위하여 전통적인 SDS-알칼리 용해(SDS-alkali lysis) 방법으로 플라스미드를 분리한 후 제한효소로 절단하여 전기영동하였다.
그 결과, 검정한 30여 개의 모든 형질전환체들은 모두 재조합 플라스미드로 확인되어 라이브러리가 잘 작성됨을 알 수 있었다. 작성된 라이브러리는 400~1,000 클론씩 풀(pool)로 -80℃에서 보관하였다. 을숙도 퇴적토양으로부터 작성된 라이브러리는 총 48,800 클론이었다. 삽입된 메타게놈 DNA의 평균 크기는 무작위로 메타게놈 라이브러리 클론 플라스미드를 추출하여 BamHI으로 절단한 후 전기영동하여 확인한 결과 35 kb 이상으로 나타났다. 한편, 기존에 구축한 산업적으로 오염된 인공수로 퇴적토양으로부터는 기존에 구축한 메타게놈 라이브러리를 사용하였다(Tao 등 2011. J. Microbiol. Biotechnol. 21:1203-1210). 이 라이브러리는 총 78,600 클론으로 구성된 라이브러리였다(Khan 등, 2016. Scientific Reports 6:32322).
실시예 3. 메타게놈 라이브러리의 트리클로산 저항성 활성 클론 선발
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 구축한 메타게놈 라이브러리와 기 구축된 라이브러리로부터 트리클로산 저항성을 보이는 클론을 선발하였다. 우선 먼저 메타게놈 라이브러리의 숙주인 대장균의 트리클로산 저항성을 결정하기 위해 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 다음과 같이 결정하였다. 대장균 EPI-300 (pCC1FOS 플라스미드를 포함), DH5α(pUC119 플라스미드를 포함) 균주를 먼저 600 nm에서 흡광도 1.0까지 배양한 후 이 대장균 배양액을 희석하여 105 cfu/ml이 되도록 하여 0.1-5 ㎍/ml의 다양한 농도의 트리클로산과 적정 항생제가 포함된 LB 배지에 도말하였다. 이 LB 배지에서 대장균이 자라는지 여부를 37℃에서 배양하며 매일 관찰하였다. 그 중 대장균의 배양을 억제하는 최소농도인 0.9 ㎍/ml 트리클로산을 최소저해 농도로 결정하였다.
메타게놈 라이브러리로부터 트리클로산 저항성 유전자를 탐색하기 위해 구체적으로, 저장된 각 라이브러리 풀(library pool)을 희석 평판법을 사용하여 알맞은 희석배수를 결정하고, 정해진 희석 배수에서 한 개의 풀(pool)당 저장된 클론수의 3배수 정도가 되도록 플레이트(plate)에 배양하여 자라나는 클론을 트리클로산 저항성으로 간주하였다. 라이브러리 클론의 희석을 위해서는 희석 완충용액(diluent buffer)[NaCl: 8.5 g, KH2PO4: 0.3 g, Na2HPO4: 0.6 g, 젤라틴(gelatin): 0.1 g]을 사용하였다. 작성된 메타게놈 라이브러리로부터 트리클로산 저항성 클론의 탐색을 위해 5 ㎍/ml의 트리클로산이 첨가된 LB 아가(agar) 배지 위에 적정 희석배수를 정해서 라이브러리 클론들을 도말한 후에 3~4일간 37℃에 배양하여 배지에서 자라는 클론들을 선발하였다. 트리클로산 저항성 활성을 나타내는 클론은 동일한 배지에 순수 배양하여 2차적으로 활성을 검정하였다. 최종 선발된 클론들은 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 BamHI을 사용해 삽입 DNA를 분석하고 동일한 클론들은 제외시켰다. 선발된 활성 클론은 플라스미드를 재분리하고 대장균 EPI-100 및 EPI-300에 형질전환하여 트리클로산 저항성 활성을 재검정하고 -80℃에 보관하였다.
실시예 4. 트리클로산 저항성 유전자 부위 결정 및 염기서열 결정
<4-1> 트리클로산 저항성 활성 유전자 부위 결정
본 발명자들은 토양으로부터 분리된 메타게놈에서 트리클로산 저항성 유전자 부위를 결정하였다. 구체적으로, 트리클로산 활성이 우수한 32개의 클론으로부터 플라스미드 DNA를 대량으로 분리하였고, 플라스미드 DNA를 제한효소 Sau3AI으로 부분 절단하거나, EcoRI, HindIII, BamHI 등으로 절단하여 절단된 DNA를 무작위로 서브클론하였다. 상기 DNA 절편들을 동일한 제한효소로 절단한 pUC119(Vieira 및 Messing, Methods Enzymol . 153: 3-11, 1987)에 라이게이션하여 2차 숏건 라이브러리(shot gun library)를 작성하였다. 작성된 라이브러리를 암피실린(ampicillin)과 트리클로산이 첨가된 LB 배지에 도말하고 37℃에서 3일간 배양하여 트리클로산 저항성 활성 서브클론들을 분리하였다. 그 결과, 분리한 활성 서브클론 중 삽입 DNA가 가장 적은 서브클론들을 선발하였다.
<4-2> 염기서열 분석
상기 실시예 4-1에서 결정한 트리클로산 저항성 활성 서브클론의 DNA의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, 앞서 선발된 32종류 aHSD를 암호화하는 유전자 클론들이 7개 선발되었다. 이들 7개 클론들에 대하여 모두 활성 서브클론들을 획득하여 염기서열을 분석하였는데 모두 활성 유전자가 90% 이상 염기서열이 동일하였다. 서브클론의 DNA 염기서열 결정은 코스모진텍(Seoul, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 밝혀진 DNA 염기서열은 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여서 분석하였다.
그 결과, 트리클로산 저항성을 보이는 서브클론들의 염기서열은 다음과 같이 분석되었다. 염기서열의 분석결과 서열번호 3은 총 1,749 염기서열을 포함하는 활성 서브클론 pBF1-4로 777 bp의 염기서열(서열번호 1)로 이루어지는 aHSD(7-α-hydroxysteroid dehydrogenase) 효소와 유사한 단백질을 암호화하는 유전자 부위를 포함하였다. 상기 서열번호 3의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 585 내지 1361 부위(1359-1361: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)은 aHSD 효소 단백질을 암호화하는 부위로 결정되었다. 상기 서열번호 3의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 585 내지 1361 부위(1359-1361: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)은 aHSD 효소 단백질을 암호화하는 부위로서 서열번호 2로 기재되는 258개 아미노산을 암호화하는 것으로 예측되었다. 상기 aHSD 효소의 염기 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 다수의 미생물에서 유래된 aHSD와 매우 높은 상동성을 보였다.
그러나, 해당 유전자는 본 발명에서 다음과 같은 후속의 분석 결과, aHSD 효소가 아니라 새로운 종류의 ENR임을 입증하여 새로운 ENR 활성을 암호화하고 그 결과 트리클로산에 저항성을 부여하는 신규한 유전자로 확인되었다.
<4-3> 아미노산 서열 분석
상기 실시예 <4-2>에서 결정한 염기서열들을 이용하여 이로부터 암호화되는 아미노산 서열들을 분석하였다. 구체적으로, 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열로부터 암호화되는 서열번호 2의 258개 아미노산 서열로 구성된 aHSD 유사 ENR 단백질의 분자량이 27,809 Da으로 유추된 아미노산 서열을 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 사용하여서 분석하였다.
그 결과, aHSD 유사 ENR 단백질의 아미노산 서열은 많은 미생물 유전체 정보에서 유래한 HSD와 높은 아미노산 유사도를 보였으며 대장균의 FabI와 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)의 FabL과 부분적인 유사도를 보였다(도 2a). aHSD 유사 ENR 단백질은 FabI와 FabL이 가지는 ENR의 효소 활성화 부위의 아미노산인 티로신 및 라이신(별표)이 존재하는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 5. 트리클로산 저항성 유전자의 ENR 활성 검정을 위한 상보성(complementation) 분석
본 발명자들은 메타게놈에서 선발한 aHSD와 유사한 유전자가 ENR 활성을 보이는지 확인하기 위해서 대장균의 ENR 중 한가지인 FabI 유전자가 변이된 대장균 변이주 JP1111를 이용하여 ENR 활성의 상보성(complementation)을 조사하였다. JP1111은 FabI 유형의 ENR에 변이를 가지고 있으며 이로 인해 정상적인 야생형 대장균에 비해 42℃의 온도에서는 생장을 할 수 없는 변이체이나 30℃의 온도에서는 야생형 대장균처럼 생장하는 변이체이다(Egan and Russell, 1973; Genet. Res. 21:139-152). 따라서 본 발명자들이 선발한 aHSD와 유사한 ENR 활성 유전자를 가진 클론 pBF1-4를 대장균 JP1111에 도입하고 이 형질전환된 대장균을 LB 고체배지에 접종하여 30℃와 42℃에서 배양하였다. 대조구로는 pGEM-T Easy를 가진 JP1111와 대장균의 원래 FabI 유전자를 도입한 JP1111을 각각 사용하였다.
구체적으로, 각 플라스미드 pGEM-T Easy, pBF1-4를 콤피턴트 대장균 세포 JP1111 50㎕와 혼합한 후 얼음에서 20분간 정치시킨 다음, 42℃에서 45초간 열처리하여 서브클론을 콤피턴트 세포내로 도입한 후, LB 배지 400 ㎕를 가하여 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 이로부터 형질전환체들을 선별하기 위하여 암피실린이 100 ㎍/㎖ 함유된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양된 플레이트로부터 형성된 콜로니들을 선별하고 pGEM-T Easy, pBF1-4 도입여부를 플라스미드 DNA를 분리하고 각각의 알맞은 제한효소로서 절단양상을 판별하여 확인하였다.
선별된 대장균 형질전환체들을 IPTG가 포함된 LB 배지에서 3 반복으로 배양할 때 각각 30℃와 42℃에서 배양하며 세균의 배양여부를 48시간 후에 관찰하였다. 42℃에서 대장균의 콜로니 형성여부가 ENR 활성의 상보적 현상(complementation)으로 간주하였다. 그 결과 pGEM-T Easy를 함유한 대장균 JP1111은 30℃에서만 성장한 반면 42℃에서는 콜로니를 형성하지 못하였다. 양성 대조구로 대장균의 fabI 유전자가 도입되었거나 또 다른 ENR 활성 유전자 pD-1-6 이 도입된 대장균 JP1111은 30℃와 42℃에서 모두 대장균이 콜로니를 형성하였다. 그리고 pBF1-4를 함유한 대장균 JP1111도 30℃와 42℃에서 모두 정상적으로 성장하여 콜로니를 형성하였다(도 3). 이는 pBF1-4에 클로닝된 유전자가 ENR 활성의 유전자임을 유전적으로 입증한 결과이다.
실시예 6. ENR 활성 유전자 과발현과 단백질 분리
본 발명자들은 플라스미드 pBF1-4에 존재하는 ENR 활성 유전자를 효소활성 단백질로 순수분리하였다. 구체적으로, 히스티딘 태킹(histidine tagging)하는 과발현 벡터인 pET-30b(+)(NOVAGEN, Germany)에 클로닝(cloning)하기 위해서 종결코돈이 그대로 위치하면서 양쪽 말단에 각각의 유전자에 맞는 제한효소 영역을 가질 수 있도록 해주는 프라이머(primer)를 제작하여 pBF1-4에 존재하는 유전자를 주형으로 PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기와 같다: FW2-BF1-4-HSDH : 5'-ATTCAAGGATCCTAGAGACATGACAAATATGAAAGGCAA-3' <BamHI 포함, 서열번호 4>, RV2-BF1-4-HSDH : 5'-TTGAAAGTCGACCATCTATTATATGTTAAAAGATGATAA-3' <SalI 포함, 서열번호 5>.
PCR 반응물은 25 ㎕ 용액에 10X Taq DNA 버퍼, dNTPs, Taq DNA 폴리머라제, 2 mM MgSO4, 약 1~5 ng의 주형(template) DNA를 조합하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분의 초기 변성을 실시하고, 총 30 사이클(cycle)의 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링(annealing), 및 72℃에서 50초간 확장반응을 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장 반응을 실시하였다.
증폭된 PCR 산물은 pET-30b(+) 벡터로의 클로닝 효율을 높이기 위해서 pGEM-T Easy 벡터에 1차적으로 라이게이션을 실시한 후에 각각의 유전자에 알맞은 제한효소로 절단하고 동일한 제한 효소로 잘려진 pET-30b(+) 벡터에 클로닝하였다. 재조합된 플라스미드는 'pENR-HSD14'이라고 명명하였다. 그리고 숙주(host) 균주인 대장균 BL21(DE3) 또는 대장균 BL21(DE3)pLysS에 형질전환해서 카나마이신(kanamycin) 및 1 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 LB 트라이뷰티린 아가 배지에서 활성을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 최종 선발된 대장균 BL21 (DE3) pENR-HSD14은 과발현된 단백질을 분리하기 위해 사용되었다.
ENR-HSD14 융합단백질을 분리하기 위해, 항생제가 포함된 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 종균 배양을 한 후에 다음날 새로운 LB 액체배지 500 ㎖에 신선한 균을 접종하여 O.D.600값이 0.6이 될 때까지 배양을 했다. ENR-HSD14 융합단백질의 발현을 유도하기 위해, 1 mM의 IPTG를 첨가한 후에 25℃로 옮겨서 추가적으로 4시간을 배양하고 세포를 원심분리하여 회수하였다.
융합단백질을 분리하는 방법은 다음과 같다: 회수된 세포에 용리 완충용액(20 mM Tris-Cl, pH 8.0)을 첨가하여 세척한 후 세포를 다시 단백질 완충액 (20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.5 M NaCl and 30 mM Imidazole)에 현탁하였다. 이 세포현탁액을 호모믹서(sonic dismembrator Model 500, Fisher Scientific)를 사용하여 세포를 파괴하였다. 반응이 끝난 후에 용해물(lysate)은 4℃ 조건에서 10,000 g로 10분간 원심분리를 실시하고 세포 잔해(cell debris)를 제거한 상등액을 ENR-HSD14 융합단백질을 분리하기 위해서 사용하였다. 세포용해물의 상등액 1 ㎖ HisTrapTM HP affinity column(GE Healthcare)이 설치된 AKTA prime liquid chromatography system (GE Healthcare)을 이용하여 히스티딘이 태깅된 융합단백질을 순수 분리하였다.
분리된 융합단백질은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해서 확인하였다. SDS-PAGE 전기영동 후 단백질의 검출은 쿠마시블루(coomassie blue) 염색 방법을 통해서 확인하였다. 상기 방법으로 확인된 융합단백질 ENR-HSD14는 가용성 분획(soluble fraction)으로 축적되어 순수 분리된 융합단백질이 확인되었다. 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 예상했던 크기의 33.56 kDa의 융합단백질을 회수할 수 있었다(도 4). 다음 실험부터는 순수분리된 융합단백질 ENR-HSD14을 사용하여 효소활성을 분석하였다.
실시예 7. 순수분리한 단백질의 효소활성 측정
순수 분리한 ENR-HSD14 단백질의 ENR 효소로서 활성을 검정하기 위하여 아래와 같이 수행하였다. 먼저 정제된 450 nM의 융합단백질을 총 100 ul 부피의 반응물에 혼합하였다. 반응을 위한 완충용액은 100 mM의 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0)이나 100 mM의 소듐 시트레이트 완충액 (pH 5.2, 6.2)를 사용하였으며 반응물에는 250 uM의 NADPH를 포함하였다. 융합단백질을 포함하는 반응물을 기질없이 4℃에서 5시간 유지하다가 25℃에서 10분 유지한 후 기질인 크로토닐-CoA를 200 uM 되도록 첨가하였다. 기질 첨가 전 그리고 기질 첨가 후 매 25초 단위로 2분30초까지 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 기질대신 기질의 용매인 멸균증류수만을 첨가한 반응물을 사용하였고 모든 반응은 2회 반복하여 평균을 측정하였다.
반응 결과, ENR 효소의 활성은 pH 7.0에서 최적이었으며 조효소로는 NADPH가 필요하였으며 NADH를 이용하면 효소활성이 나타나지 않았다. 낮은 pH의 소듐 시트레이트 완충액이나 대조구에서는 효소활성이 검출되지 않았다. ENR 효소의 활성은 pH 7에서 0.866 Unit/ml로 나타났으며 비활성(specific activity)은 0.234로 확인되었다(도 5).
실시예 8. 트리클로산 저항성 유전자의 다른 미생물에서 활성 확인
ENR 활성을 가진 aHSD 유사 ENR 효소 유전자가 대장균 외의 다른 미생물의 트리클로산의 선발 마커로 사용가능한지 확인하기 위해 광범위 숙주 플라스미드인 pRK415 (Keen 등 1988, Gene 70:191-197)에 클로닝하여 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonis solanacearum)에 도입하여 트리클로산 저항성을 검정하였다. pBF1-4에 있는 ENR 활성 유전자를 자체의 프로모터를 포함하도록 아래의 프라이머로 증폭하여 pRK415에 클로닝하였다: FW2PAT7A: 5’-TGATGCGGATCCACTACGCCATCCTCGCTTGT-3’(BamHI 포함, 서열번호 6), RV2PAT7A: 5’-CCCTTCGACAGGCTCAGGGCGAATTCGGGAAT-3’(EcoRI 포함, 서열번호 7)
PCR 반응물은 25 ㎕ 용액에 10X Taq DNA 버퍼, dNTPs, Taq DNA 폴리머라제, 2 mM MgSO4, 약 1~5 ng의 주형(template) DNA를 조합하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분의 초기 변성을 실시하고, 총 30 사이클(cycle)의 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링(annealing), 및 72℃에서 1분 20초간 확장반응을 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 확장반응을 실시하였다.
증폭된 PCR 산물은 직접 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후 동일한 제한효소로 절단한 pRK415에 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드 산물을 대장균 DH5a에서 형질전환을 통해 클로닝하여 테트라사이크린 15 ㎍/ml과 트리클로산 5 ㎍/ml이 첨가된 LB 배지에서 콜로니를 형성하는 대장균을 선발하여 서브클론을 선발하였다. 선발된 클론은 'pRK-ENR14'로 명명하였다. pRK-ENR14은 분리하여 제한효소 절단을 통해 pBF1-4의 유전자가 서브클로닝됨을 확인하였다. 해당 플라스미드 pRK-ENR14은 삼친교배법(triparental mating)을 통해 랄스토니아 솔라나세아룸으로 도입되었다. 슈도모나스 푸티다의 경우에는 상당히 높은 농도의 트리클로산 배지에서도 자라므로 이 미생물에서는 선발한 유전자가 선발 마커로 사용이 불가능하였다. 이는 슈도모나스 푸티다의 경우에 유전체에 트리클로산 저항성 유전자를 보유하기 때문으로 판단된다.
삼친교배법은 우선 공여자(donor)로 대장균 DH5a (pRK-ENR14)를 테트라사이클린이 15 ㎍/ml 포함된 LB 배지에서 24시간 배양하고, 헬퍼(helper)로 대장균 HB101 (pRK2013)을 카나마이신이 50 ㎍/ml 포함된 LB 배지에서 24시간 배양하며 수용자(recipient)로 랄스토니아 솔라나세아룸을 CPG 배지에서 36시간 각각 배양하였다. 세 세균을 각각 생리식염수 1 ml에 긁어 모아 현탁하고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 이와 같은 세척을 2회 더 반복한 후 세균세포 침전물을 동일한 생리식염수에 현탁하여 100 ul씩 세 세균을 혼합하여 YDC 배지에 떨어뜨리고 배양하였다. 30℃에서 3일간 배양된 삼친교배법 혼합물은 다시 생리식염수로 재현탁하고 테트라사이클린이 15 ㎍/ml 포함된 MG 최소배지에 현탁하였다. 대장균은 최소배지에 자라지 못하며 테트라사이클린이 포함된 배지에서는 pRK-ENR14가 도입된 랄스토니아 솔라나세아룸만 자라서 선발되었다. 선발된 랄스토니아 솔라나세아룸 (pRK-ENR14)에 대한 대조구로는 동일한 삼친교배법으로 선발한 pRK415만을 가지는 랄스토니아 솔라나세아룸(pRK415)을 이용하였다.
트리클로산이 다양한 농도로 포함된 CPG 배지에서 랄스토니아 솔라나세아룸(pRK415)은 0.5 ㎍/ml의 트리클로산 농도에서도 성장이 안되었으나 랄스토니아 솔라나세아룸(pRK-ENR14)은 15 ㎍/ml 농도의 트리클로산에서도 정상적인 콜로니를 형성하였다. 즉 aHSD 유사한 ENR 효소 활성을 가진 유전자는 트리클로산 저항성 선발 마커로 다른 세균에서도 활용이 가능함을 확인하였다.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Novel FabL-h gene resistant to triclosan from soil metagenome and uses thereof <130> PN17040 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Soil metagenome <400> 1 atgacaaata tgaaaggcaa aacactggta attaccggag ccacaaaggg tattggtcaa 60 gccatcgctg aaaaatttgc tcaaaacggt gtcaatatcg catttaccta caattcgaat 120 gccgaaacgg cagccgtatt ggcacaagag ctggaagcta aatacggtat caaggcgcgt 180 tcctaccctc tcaatatctt ggaaaccgat gagtttaaac cgctgtttga agccattgat 240 gccgattttg accgtgtcga tttcttcgta agcaatgcga tgatttacgg ccgtcctgtt 300 gttggcggat acggtaaatt tatgcgcctc aaacctcgcg gtcttaacaa tatctatacg 360 gcaaccgtca atgcgtttgt cgtcggaacc caagaagccg ctaaacggat ggaaaaagtg 420 ggtggcggtg ccgtcgtcac catgtccagt acgggcaatc tcatctacat cgaaaactat 480 gcaggtcatg gaaccaacaa agccgcagta gaagcgatga gccgctatgc agccgttgaa 540 ctaggcgaaa tgaacatccg tgtcaacgcc gtttcaggcg gtccgatcga caccgatgcc 600 ctcaaagcat tcaccaacta cgaagaggtc 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Thr Asn Lys Ala Ala Val Glu Ala Met Ser Arg Tyr 165 170 175 Ala Ala Val Glu Leu Gly Glu Met Asn Ile Arg Val Asn Ala Val Ser 180 185 190 Gly Gly Pro Ile Asp Thr Asp Ala Leu Lys Ala Phe Thr Asn Tyr Glu 195 200 205 Glu Val Lys Ala Glu Thr Ile Arg Arg Ser Ala Met Asn Arg Met Gly 210 215 220 Ser Pro Asn Asp Ile Ala Gly Ala Val Tyr Phe Leu Cys Thr Glu Glu 225 230 235 240 Ala Ser Trp Ile Thr Gly Gln Thr Ile Val Val Asp Gly Gly Thr Thr 245 250 255 Phe Arg <210> 3 <211> 1749 <212> DNA <213> Soil metagenome <400> 3 tggctccgta ttacaataaa ccttcccaag aggggctcta tcagcactac aaagccattg 60 ctcagtgcgt tcctgatctt cctttcatgc tctacaatgt tccgggacgt accgttgtag 120 acatcagtgc cgataccgtt atccgccttt ttgatgatgt agaaaatatt tacggcatca 180 aagaggcaac aggaagtatc gagcgtacca tcgagctttt atcccgaaga cctgagctga 240 aagttttctc aggggatgat gcgattgact acgccatcct cgcttgtggc ggtgcgggaa 300 tcacctcggt cacctccaac cttttgcctg atttgaaaag tcaattggtt gccaaagcgt 360 tgtcaggtga ctttaaaggt tccaaagaga tcaatgatgc ccttttccct atcaacaaag 420 ccctcttttt ggaatccaat cccgtcatga tcaaagccgc catgtacata gcaggactca 480 ttgacacact ggagtatcgc cttcccctcg tagcgccaag tacagccaac ctaaaagcga 540 tcgaagagat catgaaaaat tatactattc aaggagcata aagaatgaca aatatgaaag 600 gcaaaacact ggtaattacc ggagccacaa agggtattgg tcaagccatc gctgaaaaat 660 ttgctcaaaa cggtgtcaat atcgcattta cctacaattc gaatgccgaa acggcagccg 720 tattggcaca agagctggaa gctaaatacg gtatcaaggc gcgttcctac cctctcaata 780 tcttggaaac cgatgagttt aaaccgctgt ttgaagccat tgatgccgat tttgaccgtg 840 tcgatttctt cgtaagcaat gcgatgattt acggccgtcc tgttgttggc ggatacggta 900 aatttatgcg cctcaaacct cgcggtctta acaatatcta tacggcaacc gtcaatgcgt 960 ttgtcgtcgg aacccaagaa gccgctaaac ggatggaaaa agtgggtggc ggtgccgtcg 1020 tcaccatgtc cagtacgggc aatctcatct acatcgaaaa ctatgcaggt catggaacca 1080 acaaagccgc agtagaagcg atgagccgct atgcagccgt tgaactaggc gaaatgaaca 1140 tccgtgtcaa cgccgtttca ggcggtccga tcgacaccga tgccctcaaa gcattcacca 1200 actacgaaga ggtcaaagcc gaaaccatcc gacgctccgc gatgaaccgc atgggaagtc 1260 ccaacgatat cgcaggagcc gtttattttc tctgtaccga ggaagcgagc tggattacgg 1320 gtcaaacgat cgtcgttgat ggcggaacta cgtttagata aattcccgtt cgccctgagc 1380 ctgtcgaagg gctacaacac ggaacgtatt ccccctttta tcccctctaa agctataaat 1440 cattatcatc ttttaacata taatagatgg tgattttcaa aaaagcaatt tatatcctga 1500 caggaaaaaa taccctgatc gtatcagaat ttgatgggta ttgcgaaata tttctcgatt 1560 ctcgttccca cttagaaagt gggaacgagt aatatgacgg gaaaataata tccttttgac 1620 atttgtacaa ccgattttaa aatgatagta atttgaattt aaaatgatag taacgtacca 1680 ttttaacctc tcatgggtgc aaaacactat catttcatat tcaaataaaa ataatgcata 1740 atctacata 1749 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 attcaaggat cctagagaca tgacaaatat gaaaggcaa 39 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgaaagtcg accatctatt atatgttaaa agatgataa 39 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgatgcggat ccactacgcc atcctcgctt gt 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cccttcgaca ggctcagggc gaattcggga at 32

Claims (10)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는, 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체 FabL-h(FabL-homolog).
  2. 제1항의 FabL-h를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 뉴로스포라 크라쎄(Neurospora crassa) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  8. 제4항에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 선발 방법.
  9. 제4항에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 숙주세포를 트리클로산(triclosan) 함유 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 형질전환 숙주세포의 제조 방법.
  10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토양 메타게놈(metagenome) 유래의 트리클로산(triclosan)과 결합하지 않는 ENR(enoyl-acyl-carrier protein reductase) 변이체를 코딩하는 FabL -h(FabL - homolog) 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 숙주세포의 형질전환체를 선발하기 위한 마커 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US1999274A (en) * 1934-06-21 1935-04-30 Benjamin S Bernhard Door closer and check

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