TWI386486B - 極端高鹽古菌之聚羥基烷酯生合成基因群組及酵素於生物塑膠生產的應用 - Google Patents

Description

極端高鹽古菌之聚羥基烷酯生合成基因群組及酵素於生物塑膠生產 的應用

本發明係關於一種用於生產聚羥基烷酯之基因、蛋白質、重組微生物。本發明亦有關於一種用於生產聚羥基烷酯之方法。本發明亦有關於一種篩選極端高鹽古菌(extreme halophilic archaea)之聚羥基烷酯生合成相關基因之方法。

細菌及古菌生長於營養不平衡的狀態下時，會將胞內多餘的碳源以聚羥基烷酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA)的型式累積於細胞內；所累積的PHA會在生物缺乏碳源時，降解為乙醯輔酶A(Acetyl-CoA)，再經由代謝途徑被提供作為細胞生長所需要的碳源及能量來源。PHA特性類似於常見的塑膠材料聚丙烯(polypropylene,PP)，因而可取代傳統石油化學塑膠製品。PHA這類生物可降解塑膠(biodegradable plastic)，自1970年代已藉由傳統發酵方式由微生物大量生產，但其成本較石化合成塑膠貴，相對的較不普遍；近年來無法降解的塑膠所造成的地球環境災難，使得由微生物生產的可降解塑膠的重要性更加突顯。因此，如何降低生產與純化成本，以製造多樣化的塑膠材料是相當重要的(Gross,R.A.and Kalra,B.,Science ,(2002),297：803-807；Madison,L.L.and Huisman,G.W.,Microbiol.Mol.Biol.Rev., (1999),63：21-53；Taguchi,S.,and Doi,Y.,Macromol.Biosci. ,(2004),4：146-156)。此外，由於PHA具有很好的生物相容性，近年來在組織工程、組織再生及組織修復上 應用，吸引相當的注意(Chen,G.Q.and Wu,Q.,Biomaterials ,(2005),26：6565-6578)。

PHA的生產與研究主要是以細菌中的富養雷爾氏菌(Ralstonia eutropha )、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )、酒色變型著色菌(Allochromatium vinosum )、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium )等為主，近年來也有許多研究嘗試將細菌的PHA生合成(PHA biosythesis)相關基因轉殖於大腸焊菌中藉以表現與生產，但對與細菌同為單細胞原核生物的古菌(Archaea)(或稱太古生物)之相關探討相當有限。古菌中的極端高鹽古菌需生長於至少1.5 M NaCl的高鹽環境(如死海、鹽田或鹽湖)，且這些高鹽生態環境通常陽光曝曬強烈、蒸發旺盛，溫度可高達50℃至60℃。又，極端高鹽古菌適應胞外高濃度氯化鈉(NaCl)的分子滲透適應機制是在胞內累積大量的鉀離子，藉以平衡胞內外的滲透壓與保護蛋白質的正常功能，因此高鹽生物的蛋白質能耐高溫及高鹽，甚至在有機化學溶劑中仍然具有活性，符合工業生產之需求(Mevarch,M.etal. ,Biophys.Chem. ,(2000),86：155-164)。相較於其他古菌，極端高鹽古菌培養容易、生長快速且不易受其他微生物的污染。極端高鹽古菌在分子生物技術的開發研究是古菌中最早的，其轉型作用、基因突變及發酵等技術皆完善(Allers,T.and Mevarch,M.,Nat.Rev.Genet. ,(2005),6：58-73)，將其應用於發展PHA生合成上具有相當優勢。

Feranandez-Castillo等人於1986年最早報導極端高鹽 古菌地中海富鹽菌(Haloferax mediterranei )會利用PHA顆粒的方式儲存碳源為(Feranandez-Castillo,R.et al. ,Appl.Environ.Microbio. (1986),51：214-216)。申請人先前的研究顯示鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)會累積PHA顆粒(賴美津，(1995)，行政院國科會專題研究計畫成果報告)，並進一步分析評估此聚酯特色及其在生醫材料的應用(賴美津，(1999)，行政院國科會專題研究計畫成果報告)，結果顯示Haloterrigena sp.H13於低磷高醣誘導下能大量累積極端高鹽古菌型聚酯顆粒(hPHA)，其經由化學結構分析鑑定得知，其單體組成為-[-O-CH(C≡CH)-CH(C₂ H₅ )-CHO-]_n -，而且此新型的hPHA具有特殊的不飽和乙炔基(C≡C)，和已發表的細菌型PHA不同，此新型聚酯亦已獲中華民國專利證書第198121號之發明專利。纖維母細胞毒性測試顯示hPHA對細胞沒有毒性，可以應用於生醫材料上。且細胞貼附性遠勝於目前已大量生產的氫氧菌之聚羥基丁酯(PHB)，和組織工程上已應用的聚乳酸聚酯(PLGA及PLLA)的細胞貼附量相同。無毒性，相容性高，細胞貼附性強，顯示hPHA是高潛力的生醫材料，這部分成果亦已獲准專利(中華民國專利證書第I270376號之發明專利)。

綜上所述，雖然現有技術已有利用極端高鹽古菌以發酵技術來生產PHA，但由於高鹽且高溫的發酵系統成本較高，因此以極端高鹽古菌本身來生產PHA仍有製造成本較高以及操作條件不易控制等缺點。

發明概要

基於上述，發明人有鑒於現有技術在生產製造聚羥基烷酯(PHA)上發酵系統成本較高以及操作條件不易控制等缺點，致力於研究開發可降低聚羥基烷酯製造成本、大量穩定且有效率的生產聚酯之技術。

於是，在第一方面，本發明提供一種經分離的核酸分子，其包含有選自於由下列所構成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：4之核苷酸序列；(ii)具有與SEQ ID NO：4之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列；(iii)編碼SEQ ID NO：10之胺基酸序列的核苷酸序列；以及(iiii)編碼和SEQ ID NO：10實質上相同之胺基酸序列的核苷酸序列。

在第二方面，本發明亦提供一種經分離的核酸分子，其包含有選自於由下列所構成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：5之核苷酸序列；(ii)具有與SEQ ID NO：5之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列；(iii)編碼SEQ ID NO：11之胺基酸序列的核苷酸序列；以及(iiii)編碼和SEQ ID NO：11實質上相同之胺基酸序列的核苷酸序列。

在第三方面，本發明係提供一種多肽，其係具有如前述第一方面之核酸分子所編碼出之胺基酸序列，並且具有PhaC_H13 之活性。

本發明亦提供一種多肽，其係具有如前述第二方面所述之核酸分子所編碼出之胺基酸序列，並且具有PhaD_H13 之活性。

在第四方面，本發明係提供一種載體，其包含如前述第一至六方面所述之核酸分子以及一非鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)之同源性控制序列的控制序列，其中該核酸分子係可操作地與該控制序列相連接。

在第五方面，本發明係提供一種重組微生物，其包含如前所述之載體。

在第六方面，本發明係提供一種如前述第一至二方面之任一核酸分子在生產聚羥基烷酯上的應用。

在第七方面，本發明提供一種用於生產聚酯之方法，其包含：提供一如第一方面所述之核酸分子所編碼出的PhaC蛋白質與一如第二方面所述之核酸分子所編碼出的PhaD蛋白質；以及利用該PhaC蛋白質以及該PhaD蛋白質於活體外(in vitro )生產聚酯。前述聚酯至少包含聚羥基烷酯。

在第八方面，本發明提供一種用於生產聚酯之方法，其包含：提供一前述之重組微生物；以及令該重組微生物於一適合的環境中生長，藉以產生聚羥基烷酯。

申請人經過詳細試驗研究證實，本發明所篩選出之極端高鹽古菌株H13的PHA生合成相關基因，包含phaC 以及phaD ，進行進一步分析結果證實其等在生產聚酯之應用上具有極高地潛力與優勢。

發明之詳細說明

為了使本發明更易於明瞭，係進一步說明本發明相關用語，除非另有指明，係具有如此技術領域中具有通常知 識者所瞭解之意義。

塑膠如此技術領域中所知係指以高分子聚合物為主要組分，加入適當添加劑，如增塑劑、穩定劑、阻燃劑、潤滑劑、着色劑等，經加工成型的塑性(柔韌性)材料，或固化交聯形成的剛性材料。生物塑膠係指以來自生物之高分子聚合物為主要組份，經過如前述處理所得之材料。

一核酸分子除了於本文中所揭示的特定序列外，其亦涵蓋該特定序列之互補序列(complementary sequences)，以及保守性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體或合成的非自然存在的類似物，諸如：經簡併性密碼子取代(degenerative codon substitutions)的同源性序列(homologous sequences)。特定的，如本文中所揭露的特定序列的一個核苷酸殘基可以另一個核苷酸殘基取代，而不會影響該特定序列所編碼出之多肽或其本身作為啟動子之活性。

依據本發明，用語「相似度(Similarity)」於本文定義為二序列之間相關連的程度，其可以序列間相同及/或保守(conservative)比率定之。

依據本發明，用語「實質上相同」意指在不同物種之中，由於胺基酸序列之變異並不必然影響其所構成蛋白質之活性，因此只要胺基酸序列之具有一定程度的相似度而不影響該蛋白質之活性。上述一定程度的相似度較佳的是70%以上；更佳的是80%以上；以及又更佳的是90%以上。

依據本發明，極端高鹽古菌(extreme halophilic archaea) 意指可於高鹽環境生長之古菌，其具有耐高溫、高鹽之蛋白質，甚至於有機溶劑中仍具有活性。

關於本發明之用於篩選極端高鹽古菌(extreme halophilic archaea)之聚羥基烷酯生合成相關基因之方法，其包含下列步驟：提供一引子對，其中之一引子具有如SEQ ID NO：1之序列，另一引子具有如SEQ ID NO：2之序列；提供一含有聚羥基烷酯合成酶基因之樣品以及一含嗜鹽古菌DNA之樣品；利用該引子對擴增該聚羥基烷酯合成酶基因，藉以得到一聚羥基烷酯合成酶核酸片段；以及以該聚羥基烷酯合成酶核酸片段為探針偵測該含嗜鹽古菌DNA之樣品中之一基因體片段，其中該基因體片段係具有至少一聚羥基烷酯生合成相關基因。

在前述方法的一個實施例中，所述的極端高鹽古菌是為屬於選自於由下列所構成之群組之菌屬的古菌：Haladaptatus 、Halalkalicoccus 、Haloarcula 、Halobacterium 、Halobaculum 、Halobiforma 、Halococcus 、Haloferax 、Halogeometricum 、Halomicrobium 、Halopiger 、Haloplanus 、Haloquadratum 、Halorhabdus 、Halorubrum 、Halosimplex 、Halostagnicola 、Haloterrigena 、Halovivax 、Natrialba 、Natrinema 、Natronobacterium 、Natronococcus 、Natronolimnobius 、Natronomonas 以及Natronorubrum 。

依據本發明，用語「聚羥基烷酯合成酶」如此處所使 用，意指可將羥基烷基輔酶A轉換成聚羥基烷酯與輔酶A之酵素，其可能由一個或數個同族(homo)或異族(hetero)次單元所組成。PHA合成酶(PHA synthase)是聚酯生合成的關鍵酵素，能催化(R)-hydroxyacyl-CoA thioester轉化成聚酯，並釋放出CoA。多樣性的PHA合成酶依單體組成及受質專一性分為四個類型：(1)第一型PHA合成酶(Class I PHA synthase)：以富養雷爾氏菌(Ralstonia eutropha )為代表菌株，由PhaC蛋白質組成，分子量為60至73 kDa，利用C3~C5的β-HB-CoA為受質，合成短碳鏈型PHA。(2)第二型PHA合成酶(Class II PHA synthase)：以假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)為代表菌株，由PhaC1與PhaC2蛋白質組成，分子量為60至65 kDa，利用C5~C16的β-HB-CoA為受質，合成長碳鏈型PHA。(3)第三型PHA合成酶(Class III PHA synthase)：以酒色變型著色菌D(Allochromatium vinosum D)為代表菌株，由PhaC與PhaE蛋白質組成，PhaC分子量為40 kDa，與第一型及第二型PHA合成酶胺基酸序列相似度約21%至28%。PhaE分子量為40 kDa，未與任何PHA合成酶序列相似第三型PHA合成酶，利用C3~C5的β-HB-CoA為受質，合成短碳鏈型PHA。(4)第四型PHA合成酶(Class IV PHA synthase)：以Bacillus 這屬為代表菌株，由PhaC與PhaR蛋白質組成，PhaC分子量為40 kDa，PhaR分子量為20 kDa，未與任何PHA合成酶序列相似，利用C3~C5的β-HB-CoA為受質，合成短碳鏈型PHA(Rehm,Biochem.J. ,376：15-33,2003；Rehm,Biotechnol.Lett. ,28： 207-213,2006；Rehm,Curr.Issues.Mol.Biol. ,9：41-62,2007)。本發明提供的極端高鹽古菌(太古生物)一般認為可能屬於第三型，但我們的研究認為應是獨立的特殊高鹽古菌型。

依據本發明，前述含有聚羥基烷酯合成酶基因之樣品可以是任何源自於具有產生聚羥基烷酯能力的微生物的核酸樣品，因此，在本發明之用於篩選極端高鹽古菌(extreme halophilic archaea)的聚羥基烷酯生合成相關基因之方法中含有聚羥基烷酯合成酶基因之樣品可以來自下列微生物，其包括但不限於：嗜鹽古菌屬(Haloarcula sp.)菌株，諸如嗜鹽古屬HLR2菌株Haloarcula sp.Strain HLR2；嗜鹽死海古菌(Haloferax mediterranei )，諸如寄存編號為ATCC43049之嗜鹽死海古菌菌株；鹽陸生屬菌(Haloterrigena sp.)；富養雷爾氏菌(Ralstonia eutropha )；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )；酒色變型著色菌(Allochromatium vinosum )；以及巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium )。

在本發明之用於篩選極端高鹽古菌(extreme halophilic archaea)的聚羥基烷酯生合成相關基因之方法的具體實施例中，所述的極端高鹽古菌是屬於鹽陸生屬菌株H13(Haloterrigena sp.H13)。

依據本發明，前述含極端高鹽古菌去氧核醣核酸(DNA)之樣品是源自於極端高鹽古菌之基因體DNA片段，以及該基因體DNA片段可以是經由限制酶切割或其他生物技術方 法所得，具體而言，該含極端高鹽古菌去氧核醣核酸(DNA)之樣品是經NotI切割的極端高鹽古菌基因體片段。

依據本發明，用語「聚羥基烷酯生合成相關基因」如此處所使用，意指參與聚羥基烷酯生合成途徑的相關基因，其包括但不限於：酵素基因(enzyme gene)、轉錄調控蛋白(PHA biosynthesis transcriptional regulating protein)以及調控單元(regulatory element)。

依據本發明，前述的酵素基因可以是諸如phaC_H13 、phaD_H13 的聚羥基烷酯合成酶(polyhydroxylalkanate sythetase)、諸如maoC_H13 的烯醯基輔酶A水解酶(enoyl-CoAhydratase)或者諸如phaB_H13 的菸鹼醯胺腺二核苷酸磷酸-依賴乙醯乙醯基輔酶A還原酶(NADP-depentent acetoacetyl-CoA reductase)；前述轉錄因子基因可以是聚羥基烷酯生合成轉錄調控蛋白(PHA biosynthesis transcriptional regulating protein)，諸如phaRH₁₃ 及phaT_H13 ；而前述調控單元(regulatoray element)可以是前述基因的啟動子(promoter)、增強子(enhancer)、聚腺苷酸化訊號(polyadenylation signal)、終止子(terminator)以及類似物。

依據本發明之用於篩選極端高鹽古菌之聚羥基烷酯生合成相關基因之方法，在該方法之偵測步驟中可以是藉由一般的生物技術領域中常見的方式(諸如聚合酶鏈鎖反應、北方墨漬法、南方墨漬法或即時聚合酶鏈鎖反應等)來進行。

依據本發明之載體，其包含如前述所述之核酸分子以及一非鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)同源性控 制序列的控制序列，其中該核酸分子係可操作地與該控制序列相連接。

用語「同源性」如此處所使用，意指具有基因位置(genetic loci)通常被配置成相同順序之相同基因或對偶基因(same or allelic genes)。

用語「非鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)之同源性控制序列」如此處所使用，意指除了鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)的同源性控制序列之外的控制序列，諸如，在大腸桿菌BL21(DE3)中大量異源基因的pET21b之T7啟動子(T7 promoter)等之控制序列。

用語「控制序列」如此處所使用，意指一種能使一基因之核酸序列啟動或關閉，從而影響該基因核酸序列表現之序列；例如該控制序列可為一啟動子、增強子(enhancer)、聚腺苷酸化訊號(polyadenylation signal)、終止子(terminator)以及類似物，它們可以令一蛋白或多肽編碼序列於一宿主細胞內表現。用語「載體」是指任何一種重組載體，其可為一種重組型表現系統，它可於活體外(in vitro )或活體內(in vivo )，在任何一種宿主細胞內恆常地(constitutively)或誘導性地(inducibly)表現一選定的核酸序列。該表現載體可以是呈線性或環狀形式、離體(episomal)形式的表現系統，或是被併入至宿主細胞的基因組內的表現系統。該表現系統可具備或不具備自我複製之能力，而且在一宿主細胞內可能僅啟動暫態表現(transient expression)。

用語「可操作地相連接」如此處所使用，意指一第一 序列被配置於充分接近一第二序列的位置，以使得該第一序列可影響該第二序列或處於該第二序列控制之下。例如，一啟動子序列可被可操作地連接至一基因序列，且通常是在該基因序列的5’端位置，而使得該基因序列的表現是在該啟動子序列的控制之下。此外，一調節序列可被可操作地連接至一啟動子序列，俾以增強該啟動子序列啟動轉錄的能力。在這種情況下，該調節序列通常是位在該啟動子序列的5’端處。

依據本發明之載體，其可包含一依據本發明之前述核酸分子以及一除了鹽陸生屬H13菌株之同源性基因以外的目標基因，其中該核酸分子係可操作地與該目標基因相連接。在本發明的一具體實施例中，前述目標基因係編碼一PHA生合成相關基因。

依據本發明之重組微生物，其係可供異源表現PHA生合成相關基因，該重組微生物係包含有前述之任一載體，其中所適用的微生物是所有細菌或古菌；更具體而言，前述的細菌可以是大腸桿菌、富養雷爾氏菌(Ralstonia eutropha )、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )、酒色變型著色菌(Allochromatium vinosum )或是巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium )。而前述的古菌可以是屬於下列菌屬之古菌：Haladaptatus 、Halalkalicoccus 、Haloarcula 、Halobacterium 、Halobaculum 、Halobiforma 、Halococcus 、Haloferax 、Halogeometricum 、Halomicrobium 、Halopiger 、Haloplanus 、Haloquadratum 、Halorhabdus 、Halorubrum 、Halosimplex 、Halostagnicola 、Haloterrigena 、Halovivax 、Natrialba 、Natrinema 、Natronobacterium 、Natronococcus 、Natronolimnobius 、Natronomonas 以及Natronorubrum 。

依據本發明之用於生產聚酯之方法，其中該重組微生物之適合的環境是此技術領域中所知可令該重組微生物適當增殖且表現與產生聚酯之環境，諸如分子生物技術領域、微生物發酵領域中所熟知的技術；諸如賴美津於1999年於行政院國科會專題研究計畫成果報告、中華民國專利案第00579390號以及中華民國專利案I270376號中所述的方法。

由於利用極端高鹽古菌於高鹽且高溫的發酵系統成本較高，申請人注意到若能將PHA的生合成相關基因轉殖到大腸桿菌中表現，則不僅可以用以了解這些酵素的功能活性，且可用以轉殖到工業生產PHA的菌株如富養雷爾氏菌(Ralstonia eutropha )以獲得較佳的聚酯產值，或可產生新型的聚酯的此等優勢。

綜上所述，本發明係提供極端高鹽古菌包含phaC 以及phaD 的PHA生合成相關基因於生產聚酯上之相關應用，以下更進一步詳細說明本發明之特點：

(1)由於本發明提供關於利用專利菌株極端高鹽古菌菌株Haloterrigena sp.H13(中華民國食品工業發展研究所菌種中心之專利寄存株BCRC 910151)的基因與蛋白的應用。Haloterrigena sp.H13屬太古生物界(Archaea，古菌)，不具病原性，是高鹽極端生物。高鹽太古生物的極端酵素具耐 鹽、耐高溶劑濃度、抗氧化且高溫穩定的特性，因此，適合工業與胞外(試管內)(in vitro )生產應用。

(2)本發明係可應用於研發生物可降解塑膠PHA各式產品，有助於幫助全球加速以生物可降解塑膠取代對地球不友善的石化製塑膠。

(3)本發明提供一種新穎的PHA合成酶PhaC_H13 ，其和已知PhaC有很大的差異。目前以微生物生產可降解塑膠PHA以細菌為主，但其聚合的單體(monomer)與鏈長有限，因此近年來許多針對PHA聚合酶的研究，希望以分子技術改變其對受質的選擇性等改變，以方便聚合成更多樣式的PHA。本發明與既有技術的差異是採用極端高鹽古菌菌株Haloterrigena sp.H13，申請人先前的研究已證實此菌會生產新型具有特殊的不飽和乙炔基(C≡C)的單體之特殊古菌型PHA(hPHA)。此新型hPHA貼附性高適於作為生醫材料。此外，本發明發現Haloterrigena sp.H13的PHA聚合酶PhaC和已知的細菌第一型或第二型PhaC的胺基酸序列相似度約為20%，第三型或第四型PhaC的胺基酸序列相似度約為40%；和其他極端高鹽太古生物的PhaC相似度也都低於60%，顯示此PhaC_H13 和已知PhaC有很大的差異，其聚合的單體(monomer)與鏈長等亦應有差異，應可發展出更多樣化的PHA產品。

(4)本發明提供Haloterrigena sp.H13的與PHA合成相關的基因與序列包含生合成相關的phaC、phaD ，及將Haloterrigena sp.H13的phaD、phaC 等基因用表現載體 pET21b或pET28a在大腸桿菌BL21(DE3)異源大量表現的技術，且在大腸桿菌中表現的PhaC_H13 、PhaD_H13 、，均可以可溶性的蛋白呈現。

(5)本發明提供一種生產聚酯之方法，其中異源共表現的PhaDC_H13 蛋白，在PhaD_H13 和PhaC_H13 同時存在時具有PHA合成酶活性。且此PHA合成酶能耐高溫、高鉀、鈉離子濃度且長時間(三週)的保存，仍保有90%的活性。有關太古生物的PHA合成酶基因的開發研究，不僅可提高phaC 基因庫以供構築更多樣化的PhaC及更多新型的PHA，並可開發利用高鹽太古生物的極端酵素。

申請人實驗室利用一全基因體定序已完成的嗜鹽死海古菌(Haloarcula marismortui )ATCC43049所具有之一被命名為phaC 的PHA合成酶(polyhydroxyalkanoate sythetase)基因之ORF序列設計一引子對(SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2)(林姿伶，國立中興大學生命科學系碩士論文，2006)，以申請人實驗室於苗栗縣通霄曬鹽場的鹽山中所純化出的Haloarcula sp. strain HLR2的染色體DNA進行聚合酶連鎖反應以擴增phaC _HLR2 (SEQ ID NO：3)(游詒婷，國立中興大學生命科學系碩士論文，2006)。phaC _HLR2 與嗜鹽死海古菌(Haloarcula marismortui )的PHA合成酶胺基酸序列有97.1%的相似度，且其序列上具有與PHA聚合反應相關的(Cys-162)-(Asp-317)-(His-346)所組成之催化三元殘基(catalytic triad residues)，因此應與真細菌型PHA合成酶同 歸屬於α/β-羥化酶超家族(α/β-hydroxylase superfamily)，證實該phaC _HLR2 確為PHA合成酶基因(林姿伶，同上述，2006)。

申請人係利用phaC _HLR2 當作探針以南方墨漬法針對鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)基因體篩選出一段經NotI切割的片段，其全長為4599 bp，具有5個完整的ORF，其等依序為maoC、phaR、phaT、phaD、phaC 以及phaB 之基因片段(如第一圖所示)。phaB 基因之完整序列隨後以聚合酶鏈鎖反應(PCR)方法以及DNA定序方法予以補齊。由分析結果證實Haloterrigena sp.H13的聚羥基烷酯合成酶基因群組(PHA synthetase gene cluster)包含phaC (SEQ ID NO：4)、phaD (SEQ ID NO：5)、maoC (SEQ ID NO：6)、phaB (SEQ ID NO：7)、phaR (SEQ ID NO：8)和phaT (SEQ ID NO：9)，其等之功能與命名係藉由與NCBI基因庫比較分析後，根據相似的蛋白質胺基酸序列評估分析所得。其中，PhaC與PhaD為共轉錄的PHA合成酶；PhaB_H13 為NADP-依賴的乙醯乙醯基輔酶A還原酶(NADP-dependent acetoacetyl-CoA reductase)；MaoC為烯醯基輔酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase)，PhaR為轉錄調控蛋白，具有與DNA鍵結區域，可調節phasins蛋白表現，控制PHA顆粒大小；PhaT似應為轉錄調控蛋白質。

這六個PHA生合成相關基因的基因長度、G+C%、預估等電點、轉譯出的胺基酸及預估的分子量結果於表一。分析這些蛋白質的胺基酸組成，如表一所示，可以發現等 電點皆約介於3至4之間，酸性胺基酸比例高，疏水性的胺基酸比例也高，顯示自Haloterrigena sp.H13的PHA生合成蛋白質具有耐高鹽蛋白質的特性，在表面帶負電，有助於抵抗高離子濃度及有機溶劑等低水活性的環境。

鹽陸生屬H13菌株之PhaC_H13 為PHA合成酶，經由序列比對結果，PHA聚合酶PhaC_H13 和已知的細菌第一型或第二型PhaC的胺基酸序列相似度約為20%，與細菌的第三型或第四型PHA合成酶相似度較高，約為40%；和其他極端高鹽太古生物的PhaC相似度也都低於60%，顯式此PhaC_H13 和已知PhaC有很大的差異。

phaC _H13 上游為phaD _H13 ，與phaC _H13 有4鹼基對(b.p)的重疊，且只在phaD _H13 上游有發現推測為啟動子的區域。而第三型或第四型的PHA合成酶是需要與由phaEC 或phaRC 基因所分別編碼(encode)出的酵素組成異族次單元PHA合成酶(hetero-subunits PHA synthetase)，所以初步判斷PhaD_H13 是扮演PhaE或PhaR角色。分析PhaC_H13 胺基酸 序列發現具有PHA合成酶進行聚合反應須具備的胺基酸殘基(Cys-151)-(Asp-306)-(His-334)所組成的活化中心(如附件一所示)。以北方墨漬法分析發現，phaC 與phaD 是共轉錄表現。

依據序列分析與蛋白質體學分析，鹽陸生屬H13菌株之PHA生合成基因群組和一般細菌型PHA生合成基因群組不同的是maoC 。MaoC功能為烯醯基輔酶A水解酶(enoyl-CoA hydratase)，其應為PHA生合成的上游途徑的基因產物，是產生PHA生合成之單體來源的主要蛋白質，主要是將脂肪酸β-氧化作用(Fatty acid β-oxidation)的中間產物反式2-烯醯基輔酶A(trans-2-enoyl CoA)轉化成(R)-3-羥醯基輔酶A[(R)-3-hydroxyacyl-CoA]之後經由PHA合成酶作用成PHA。不同的MaoC及其突變蛋白可改變其受質專一性並生成不同種類與碳鏈長的單體，因此鹽陸生屬H13菌株的MaoC_H13 的基因以及蛋白質具有在生產各種新穎生物可降解之聚酯上的潛力。

PhaB功能為菸鹼醯胺腺二核苷酸磷酸-依賴乙醯乙醯基輔酶A還原酶(NADP-depentent acetoacetyl-CoA reductase)，也是PHA生合成的上游途徑的基因產物，其可將乙醯乙醯基輔酶A轉化成(R)-3-(R)-3-羥醯基輔酶A之後經由PHA合成酶作用成PHA。PhaR_H13 為類AbrB蛋白質(AbrB-like protein)，為轉錄調控蛋白，具有與DNA鍵結區域，調節Phasins蛋白表現，控制PHA顆粒大小；PhaT似應為轉錄調控蛋白質。PhaT_H13 與phaR_H13 有重疊，所以在 基因轉錄上的表現有相關，目前PhaT_H13 的真實功能是未知，但由分子量與厭水性分布等資料，PhaT_H13 可能為Phasins功能是與PHA結合形成顆粒。

本發明係將目前所得到這些PHA生合成相關蛋白質進一步利用大腸桿菌異源表現，其主要係以引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)將特定的限制酶酵素切位引入序列兩端，並進行選殖後再利用同樣的限制酶酵素作用，將基因片段選殖到同樣的切位的表現載體pET21b或pET28a。之後，予以轉形至大腸桿菌BL21(DE3)進行表現，利用不同的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside,IPTG)濃度以及不同的時間進行誘導，作為該等基因之異源蛋白質表現之分析，PhaC_H13 、PhaD_H13 、PhaB_H13 、MaoC_H13、 PhaR_H13 和PhaT_H13 ，都可以在IPTG誘導下於大腸桿菌中表現(如第二及三圖所示)。這些重組蛋白均以可溶性的蛋白(soluble proteins)呈現。結果證實藉由大腸桿菌之異源表現可以大量表現出PhaC_H13 和PhaD_H13 ，針對這大量表現的蛋白質進行活性測試，進而確定PhaC_H13 和PhaD_H13 蛋白質的功能。在活性測試方面，主要是利用(R,S)-3-羥基丁醯基輔酶A[(R,S)-3-Hydroxybutyryl-CoA,3HB-CoA]與酵素進行反應，如果具有PHA合成酶之活性，其會將(R)-3HB-CoA，聚合成PHB並釋放出輔酶A。再以二硫二硝基苯甲酸(5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic Acid),DTNB)與CoA進行鍵結分解成硫基硝基苯甲酸(thionitrobenzoate,TNB)；利用OD₄₁₂ 偵測黃色的TNB量以估算CoA的釋放量，藉由CoA 的釋放量回推PHA聚合酵素的活性(Müh,U.,etal.,Biochem. 38：826-837,1999；Valentin,H.E.,and Steinbüchel.A.,Appl.Microbiol.Biotechnol. ,40：699-709,1994)。

本發明係利用大腸桿菌異源表現所得且經純化的PhaD_H13 與PhaC_H13 蛋白質(第二圖)，以3-羥基丁醯基輔酶A為受質，進行PhaDC_H13 合成酶特性分析，如第四圖顯示只有PhaD_H13 和PhaC_H13 同時存在(以PhaDC_H13 表示)才有活性，PhaDC_H13 比活性約為5 U/mg，其中酵素活性單位(unit,U)為每分鐘可轉換1 μmol的受質量(1μ mol/min)(Müh et al.,同上述，1999)。以不同溫度測試結果發現，PhaDC_H13 在45℃為最適反應溫度，依據熱穩定測試結果，發現PhaDC_H13 經過75℃處理5分鐘，依然保有50%的酵素活性(如第五圖所示)。以不同離子濃度測試，發現PhaDC_H13 在1 M至4 M的鉀離子或鈉離子存在下，都保有活性，在4M的鉀離子濃度下，有最高的酵素活性(如第六圖所示)。在高鹽環境下透過長時間(三週)之保存測試之結果顯示PhaDC_H13 仍保有90%的活性(如第七圖所示)。

綜合上述結果顯示自Haloterrigena sp.H13的PHA生合成酶具有耐高鹽蛋白質的特性，可適應高離子濃度等低水活性的環境，且對熱也有良好的穩定性，適合工業與胞外生產應用，所以對將來在PHA生產與開發上有很好的應用性。

PHA合成酶為PHA生合成的關鍵酵素，其中PHA合成 酶的活性以及對受質的專一性，更是決定PHA的產量與單體的多樣性。所以目前在於PHA的發明專利多著重於PHA合成酶上，如美國專利案第5968805，6475734 B1，6903220 B2和6972192 B2號等。但是不同的PHA單體代謝途徑，搭配PHA合成酶，也是產生不同單體組成的PHA關鍵，所以近年來有些發明專利也針對PHA代謝途徑的蛋白質，如美國專利案第7183987 B2號。所以本發明，針對Haloterrigena sp.H13基因體中，找到PHA合成酶的基因序列外，也找到PHA生合成途徑上游的基因，將來可以利用異源表現的方式，搭配PHA合成酶，可以在試管中或是異源表現的宿主內，更有效的生合成出PHA，之後可以建立依不同用途的需求，量身訂做不同單體組成的PHA。

綜上所述，本發明提供一篩選古菌PHA生合成基因的分子方法，可用以篩選、重組進行PHA生合成蛋白，訂製受質專一與高效率的PHA生合成酵素；本發明也提供極端高鹽古菌Haloterrigena sp.H13的聚羥基烷酯(PHA)生合成基因群組的基因序列，做為PHA生合成與調控的研發基礎。更重要的是本發明提供將Haloterrigena sp.H13的maoC、phaD、phaC、phaB 與phaR 等基因用表現載體pET21b或pET28a在大腸桿菌BL21(DE3)異源大量表現的技術，且在大腸桿菌中表現的PhaC_H13 、PhaD_H13 、PhaB_H13 、MaoC_H13 和PhaR_H13 ，均以可溶性的蛋白呈現。不同的MaoC及其突變蛋白可改變其受質專一性並生成不同種類與碳鏈長的單體，因此Haloterrigena sp.H13的MaoC_H13 的基因與蛋白提 供了很好的研發之分子材料。

異源共表現的PhaDC_H13 蛋白，在PhaD_H13 和PhaC_H13 同時存在時具有PHA合成酶活性。且此PHA合成酶能耐高溫、高鉀、鈉離子濃度且長時間(三週)的保存，仍保有90%的活性。太古生物的PHA合成酶基因的開發研究，不僅可提高phaC 基因庫以供構築更多樣化的PhaC及更多新型的PHA，並可開發利用高鹽太古生物的極端酵素。一個能在大腸桿菌大量表現且具有活性的古菌PHA生合成酵素PhaD_H13 和PhaC_H13 的基因與載體，純化的重組PhaD_H13 和PhaC_H13 蛋白具有穩定、耐鹽、耐低水活性與耐高溫的PHA生合成，可以用來在胞內或胞外進行生物塑膠(聚酯、聚羥基烷酯、PHA)的生產。

本發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明知範疇。

實施例 實施例1：極端高鹽古菌Haloterrigena sp.H13之培養

極端高鹽古菌Haloterrigena sp.H13(中華民國食品工業發展研究所菌種中心之專利寄存株CCRC 91015)由單一菌落分離後，挑單一菌落接種至5 mL的含25% NaCl之NHA液體培養基(每公升水中含有250 g NaCl、10 g MgSO₄ .7H₂ O、5 g KCl、0.2 g CaCl₂ .2H₂ O、1 g KNO₃ 以及5 g酪蛋白胺基酸(Casamino acid)，並以1 N NaOH調整pH值為7.22)以45℃恆溫震盪水浴培養槽(TKS Shaking Bath,SB302)以 80 rpm震盪培養2至3天。利用已滅菌的微量分注器，吸取1mL菌液已培養至中對數期(OD₆₀₀ 值為0.5至0.6)的菌液，並以1：20比例接種至含25% NaCl的NHB液體培養基中以45℃恆溫震盪水浴培養槽(TKS Shaking Bath,SB302)以80 rpm震盪培養2至3天。

實施例2：極端高鹽古菌染色體DNA的萃取

將培養至中對數期的菌液，高速離心機(Sorvall RC5C,DuPont Co.)以6761 xg(8000 rpm)在4℃下離心20分鐘。移去上清液後，以適量的基本鹽類培養基(basal salt medium)(同上述NHA液體培養基以及酪蛋白胺基酸懸浮細胞，使最後的懸浮液為1 mL。將9 mL配置好的溶解溶液(lysis solution)(由8 mL TE緩衝液(TE buffer)與1 mL之10% SDS所配製)予以加入細胞懸浮液中，輕輕搖晃混合均勻，再加入100μ L蛋白酶(proteinase K)(100μ g/mL)並以55℃處理3小時或至隔夜。加入1 mL的5 M NaCl(使最後濃度為0.5M)，混合均勻後置於冰上冰浴1小時。需每15分鐘拿起搖晃均勻一次，使溫度能均勻下降並讓SDS與蛋白質沉澱，加入後會有白色沉澱乃鹽度瞬間改變所導致的蛋白質析出。以離心機(Sigma,2K15)以20,000 xg於4℃下離心20分鐘，回收上清液，加入等體積異丙醇(isopropanol)並混合均勻以沉澱DNA。利用滅過菌的玻璃棒將染色體DNA撈起，自然風乾5分鐘，在浸泡於70%酒精中5分鐘，在自然風乾5分鐘，重複3次，以確保完全洗去鹽類及異丙醇或其他物質。加入100μ L TE緩衝液(TE buffer)(10 mM Tris-HCl,pH 8.0；1 mM EDTA,pH 8.0)，使DNA回溶入溶液。再加1μ L核糖核酸酶A(RNase A)。放置4℃存放。待DNA完全回溶，稀釋後以分光光度計(Ultropspec 1000,Pharmacia Biotech)測定OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 的比值，DNA及RNA的OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 的比值應該為1.8及2.0，如果比值太低，則顯示有蛋白質雜質的存在，須重新純化，並計算DNA含量。OD₂₆₀ 的比值為1時，雙股DNA濃度為50μ g/μ L，同時利用0.8%瓊脂醣凝膠(agarose gel)以50V進行電泳歷時1小時。並以λ/Hin d III Digest DNA Marker(Protec Biotech)作為標記(marker)。最後照相存檔。

實施例3：DNA探針的製備

利用已知的利用全基因體定序完成的極端高鹽古菌Haloarcula marismortui ATCC43049被命名為PHA合成酶的基因(Polyhydroxyalkanoate synthase,phaC )的ORF序列設計引子對(SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2)(林姿伶，，國立中興大學生命科學系碩士論文，2006)，以苗栗縣通霄曬鹽場的鹽山中所純化出的Haloarcula sp. strain HLR2(已公開寄存於食品工業研究所生物資保存及研究中心，寄存編號為BCRC AR10013)的染色體DNA為模板進行聚合酶連鎖反應得到phaC _HLR2 (SEQ ID NO.3)之產物做為探針(游詒婷，國立中興大學生命科學系碩士論文，2006)。之後利用DIG系統(Roche,DIG Labeling Kit)進行標記(labeling)，而此段經標記的DNA係於下面實施例中作為核酸探針。

實施例4：南方墨漬法偵測極端高鹽古菌PHA合成酶

先將Haloterrigena sp H13染色體核酸經限制酶酵素NotI作用後跑核酸電泳分析，之後將凝膠加入0.25 N HCl緩衝液歷時20分鐘之後，去除液體，加入變性緩衝液(denature buffer)(0.5 N NaOH；1.5 M NaCl)20分鐘之後，去除液體，加入中和緩衝液(neutralization buffer)[1.5 M NaCl；1 M Tris]歷時20分鐘，最後保存在中和緩衝液中。準備HybondTM-N+Nylon膜(Amersham,Co.)，利用真空轉漬器(Vacuum Blotter,GHE5560)，以真空抽氣方式進行轉漬。轉漬結束後，由紫外線固定儀(XL-1000 UV Crosslinker Linker^TM )以自動交聯模式(auto cross-link)(1200 X 100μ J/cm² )處理兩次，將核酸固定於膜上。利用前述所製備的核酸探針，進行雜合與免疫偵測(Roche)。利用Roche公司DIG Labeling Kit取300 ng的模板DNA(phaC _HLR2 )，且以滅過菌的二次去離子水定量到15 μL，於100℃水浴下加熱10分鐘後隨即置於冰上5分鐘，接著加入2 μL Hexanucleotide Mix 10X(vial 5)、2 μL dNTP Labeling Mix(vial 6)及1 μL Klenow enzyme labeling grade(vial 7)，混合均勻後，置於37℃水浴中作用20小時。之後以65℃水浴加熱10分鐘後，再置於冰上5分鐘終止反應，保存於-20℃。探針製備完成之後再依Roche公司的DIG Labeling Kit說明書進行探針標定效率測定及DNA雜合反應(DNA hybridization)。之後將有訊號的核酸片段回收選殖到經相同限制酶酵素作用過的載體中保存，藉以建立所欲的基因庫。

實施例5：基因庫搜尋與核酸定序

由上述所建立之基因庫中，挑選個別選殖株擴增，並抽取出質體核酸，先利用加熱使其成為單股核酸，予以點漬於HybondTM-N⁺ Nylon(Amersham,Co.)膜上，以紫外線固定儀處理兩次，藉以將核酸固定於膜上。利用前述所製備的核酸探針，進行雜合與免疫偵測(Roche)。之後將有訊號的質體核酸，以ABI3700定序儀進行定序，以得到完整的序列。將所得的序列利用BLAST(NCBI)進行分析與註解。

實施例6：蛋白質的異源表現

經過設計有NdeI及HindIII切位的引子，以特定的質體做為模板進行PCR反應後，可以增幅出兩端含有NdeI及HindIII切位的引子的產物，選殖到pGEM^® -Easy vector(Promega Co.)。後利用NdeI及HindIII切位選殖到片段並與經由相同酵素切割作用表現載體pET-21b或pET-28a進行黏合反應作用16小時，再轉形到大腸桿菌JM101進行篩選，經由抗藥性基因的篩選之後，抽取質體利用NdeI及HindIII進行切割利用電泳分析確認。將確認過的質體轉型到表現菌株大腸桿菌BL21(DE3)，經由不同的濃度的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside,IPTG)誘導，並利用蛋白質電泳分析。蛋白質的異源表現情形。

蛋白質純化的方式參考自Amersham Biosciences的「6-組胺酸標記之蛋白質的高量表現以及純化手冊(A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins)」操作手冊，其詳細步驟如下所示：挑選含特定基 因的表現載體的E.coli BL21(DE3)之單一菌落至5 mL的含相對應抗生素的LB液體培養基[含50至100μ g/mL青黴素(ampicillin)或康那黴素(kanamycin)]於37℃，以200 rpm進行震盪培養過夜。取5 mL至500 mL含相對應抗生素之LB液體培養基[含50至100μ g/mL青黴素(ampicillin)或康那黴素(kanamycin)]於37℃，以200 rpm進行震盪培養歷時約2小時，於OD₆₀₀ 為0.5時，加入IPTG，使最終濃度為50μ M，接而於37℃以200 rpm進行誘導作用歷時5至6小時後收菌，並置冰上10分鐘，於4℃下離心收菌，去除上清液，以50 mM Tris buffer(含25% NaCl、0.2% KCl、0.5% MgSO₄ ‧7H₂ 0)懸浮，並以超音波震盪器(Sonics& Materials,Inc.VCX-750 Watt)破菌[40%強度(amplitude)，脈衝開啟1秒，脈衝關閉2秒)]，於4℃以12599 xg離心20分鐘，取上清液。加入2 mL的Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow resin(Amersham Co.)，放置冰上，輕微搖晃20分鐘。打開管柱收集溢流液(flow through,FT)，之後依序加入10 mL[5倍管柱體積(column volume)]之50 mM Tris buffer(含25% NaCl、0.2% KCl、0.5% MgSO₄ ‧7H₂ 0及0 mM imidazole)，收集上清液。之後使用濃度為10、20、50、100、200、300及500 mM imidazole進行沖提(elution)，並收集於試管內，隨imidazole之濃度不同所沖提出之不同目標蛋白質。所收集之各管蛋白質樣品，以12.5% SDS-PAGE分析，並選出純度最高與產量高的樣品進行下述的活性分析。

實施例7：PHA合成酶的活性測試

PHA聚合酵素活性分析，主要是偵測PHA聚合反應進行，會將CoA釋放出來，利用DTNB會與CoA進行鍵結，而分解成TNB，而TNB呈現黃色，在OD₄₁₂ nm有明顯的吸收峰，因此利用分光光度計(Ultropspec 1000,Pharmacia Biotech)便可以測的TNB的量，進而推算CoA的含量，藉由CoA的釋放量回推PHA聚合酵素的活性(Valentin and Steinbuchel,1994)。活性測試分為連續式與非連續式。連續式反應的緩衝液為50 mM Tris buffer，25% NaCl，0.2% KCl，0.5% MgSO₄ .7H₂ 0，添加1 mM DTNB、1 mM HBCoA和PHA聚合酵素，於室溫下反應，偵測OD₄₁₂ mm的變化量。非連續式的反應為，在320μ L的反應總體積中，包含50 mM Tris buffer，25% NaCl，0.2% KCl，0.5% MgSO₄ .7H₂ 0，1mM HBCoA，與PHA聚合酵素，於45℃下進行反應，依特定時間取出40μ L的上清液，添加100μ L 10% TCA終止反應。離心取上清液，添加800μ L 1 mM DTNB混和均勻，偵測OD₄₁₂ mm的變化量，來推算PHA聚合酵素的活性(Mühet al. ，同上述，1999)。CoA在OD₄₁₂ mm的ε412=13600 cm^-1 M^-1 (Ellamn,1959)。酵素活性單位為每分鐘可以轉換1μ mol的受質量(1μ mol/min)(Mühet al. ,1999)。本研究採非連續式反應進行，添加用純化得到的PhaC_H13 與PhaD_H13 比例1：1混合，利用羥基丁醯基輔酶A(3-Hydroxybutyryl-CoA)做為受質總反應體積為320μ L，於45℃下進行反應。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地 在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。

第一圖顯示Haloterrigena strain H13之PHA生合成基因群組的排列。

第二圖顯示以大腸桿菌BL21(DE3)大量表現Haloterrigena strain H13中與PHA生合成及調控相關聯基因所得之產物的蛋白質電泳圖。

第三圖顯示以大腸桿菌BL21(DE3)大量表現Haloterrigena strain H13中與PhaT蛋白質電泳圖，其中徑1(Lane 1)係為來自大腸桿菌(DE3)之細胞粗萃取可溶蛋白質、徑2及3(Lane 2 and 3)係分別為來自具有pET28a-PhaT_H13 之大腸桿菌以50 μM及500 μM IPTG誘導後所得之細胞粗萃取可溶蛋白質。

第四圖顯示經純化的PhaD_H13 和PhaC_H13 藉由PHA生合成測試測定CoA釋放量，以CoA釋放量對時間作圖所得之結果。

第五圖顯示PhaDC_H13 之PHA生合成活性與溫度之關係圖。

第六圖顯示PhaDC_H13 之PHA生合成活性與離子強度之關係圖。

第七圖顯示PhaDC_H13 之PHA生合成活性與保存時間之關係圖。

【附件簡單說明】

附件一顯示PhaC_H13 胺基酸序列催化三元殘基(Cys-151)-(Asp-306)-(His-334)所組成的活化中心之排列比較。

<110> 國立中興大學

<120> 極端高鹽古菌之聚羥基烷酯生合成基因群組及酵素於生物塑膠生產的應用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> syntheic DNA

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic DNA

<400> 2

<210> 3

<211> 1434

<212> DNA

<213> Haloarcula sp.HLR2

<400> 3

<210> 4

<211> 1617

<212> DNA

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 4

<210> 5

<211> 549

<212> DNA

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 5

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 6

<210> 7

<211> 744

<212> DNA

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 7

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 8

<210> 9

<211> 486

<212> DNA

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 9

<210> 10

<211> 538

<212> PRT

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 10

<210> 11

<211> 182

<212> PRT

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 11

<210> 12

<211> 213

<212> PRT

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 12

<210> 13

<211> 247

<212> PRT

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 13

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 14

<210> 15

<211> 161

<212> PRT

<213> Haloterrigena sp.H13

<400> 15

Claims (12)

1. 一種經分離的核酸分子，其係選自於由下列所構成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：4之核苷酸序列；(ii)具有與SEQ ID NO：4之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列；(iii)編碼SEQ ID NO：10之胺基酸序列的核苷酸序列；以及(iiii)編碼和SEQ ID NO：10相似性大於90%以上之胺基酸序列的核苷酸序列。
2. 一種經分離的核酸分子，其係選自於由下列所構成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：5之核苷酸序列；(ii)具有與SEQ ID NO：5之核苷酸序列相似性大於90%以上的核苷酸序列；(iii)編碼SEQ ID NO：11之胺基酸序列的核苷酸序列；以及(iiii)編碼和SEQ ID NO：11相似性大於90%以上之胺基酸序列的核苷酸序列。
3. 一種經分離的多肽，其係具有如申請專利範圍第1項所述之核酸分子所編碼出之胺基酸序列，並且具有PhaC_H13 之活性。
4. 一種經分離的多肽，其係具有如申請專利範圍第2項所述之核酸分子所編碼出之胺基酸序列，並且具有PhaD_H13 之活性。
5. 一種載體，其包含如申請專利範圍第1或2項所述之核酸分子以及一非鹽陸生屬H13菌株(Haloterrigena sp.H13)之同源性控制序列的控制序列，其中該核酸分子係可操作地與該控制序列相連接。
6. 一種重組微生物，其包含至少一如申請專利範圍 第5項所述之載體。
7. 如申請專利範圍第6項所述之重組微生物，其中該微生物係為細菌或古菌(Archaea)。
8. 如申請專利範圍第6項所述之重組微生物，其中該微生物係選自於由下列所構成之群組：大腸桿菌、鹽陸生屬菌(Haloterrigena sp.)、富養雷爾氏菌(Ralstonia eutropha )、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )、酒色變型著色菌(Allochromatium vinosum )、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium )以及地中海富鹽菌(Haloferax mediterranei )。
9. 一種如申請專利範圍第1或2項所述之核酸分子在生產聚羥基烷酯(polyhyroxyalkanoates,PHA)上的應用。
10. 一種用於生產聚酯之方法，其包含：提供一如申請專利範圍第1項所述之核酸分子所編碼出的PhaC蛋白質與一如申請專利範圍第2項所述之核酸分子所編碼出的PhaD蛋白質；以及利用該PhaC蛋白質以及該PhaD蛋白質於活體外(in vitro )生產聚酯。
11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該聚酯是聚羥基烷酯。
12. 一種用於生產聚酯之方法，其包含：提供一如申請專利範圍第6至8項中任一項所述之重組微生物；以及 令該重組微生物於一適合的環境中生長，藉以產生聚羥基烷酯。