KR101554762B1 - 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 방법 및 유전자 - Google Patents

미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 방법 및 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비특이적 부착성 또는 응집성이 없는 또는 약한 미생물에 대하여, 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 수단을 제공한다. 본 발명은 표적 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 방법으로서, 비특이적 부착성을 갖는 미생물 유래의 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 상기 표적 미생물에 도입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 방법 및 유전자{METHOD AND GENE FOR IMPARTING OR ENHANCING NONSPECIFIC ADHERENCE AND/OR AGGREGABILITY TO MICROORGANISM}
본 발명은 표적 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 방법, 상기 방법에 이용하는 DNA, 상기 DNA에 의해서 코딩되는 단백질, 상기 방법에 의해서 얻어지는 미생물, 및 상기 미생물의 배양 방법에 관한 것이다.
미생물은 우수한 촉매 작용에 의한 물질 변환 능력을 갖고 있다. 그 때문에, 양조나 발효 식품의 생산, 폐수나 배기 가스 처리 등의 분야에서 널리 이용되어 왔다. 최근에는 유전자 재조합 미생물에 의한 의약품의 생산, 바이오 에탄올의 발효 생산부터, 미생물을 이용한 화학품의 합성까지 실시, 또는 연구되어와, 미생물 이용 기술은 중요한 산업 기술이 되어 있다. 그러나, 반응의 담당자인 미생물 세포를 생산하기 위해서는 배지나 에너지 등의 비용이 든다. 또한, 미생물 반응은 수용액 중에서 행해지는 경우가 많아, 물질 생산 후에는 미생물을 반응액으로부터 분리할 필요가 있다. 분리 방법으로서는 종래에 원심 분리나 여과가 주된 수법이었다.
분리를 쉽게 하고, 또한 귀중한 미생물 세포를 연속적으로 또는 반복하여 이용하기 위해서, 미생물 세포의 고정화나 자기 응집이 유효한 것으로 되어 왔다. 종래의 고정화 기술로서, 알긴산 등의 겔을 이용한 포괄 고정법과, 다공질 담체의 표면에 흡착시키는 표면 고정법이 있다. 그러나, 포괄 고정법에는 산소나 기질의 겔 내부로의 수송이 율속이 되는 경우가 많은 점, 겔의 기계적 강도가 약하여 교반 등에 의해서 파괴되기 쉬운 점, 미생물 세포가 겔 내부로부터 누설되어 나오는 점 등의 결점이 있다. 또한, 종래의 표면 고정법은 목적으로 하는 미생물을 표면에 집적시키는 방법이 아니라, 다공질 담체 등을 잡다한 미생물이 많이 존재하는 폐수 처리나 환경 정화의 현장에 투입하여, 부착되기 쉬운 미생물을 바이오 필름으로서 표면에 담지시키고 있는 것에 불과하다. 즉, 원하는 미생물을 고체 표면에 자유롭게 부착시키는 기술은 존재하지 않는다. 한편, 응집에 대해서는, 고분자 중합체 등의 응집 침전제를 이용하는 방법이 폐수 처리에서 널리 사용되고 있는 외에, 원래 응집성인 미생물을 스크리닝하여 이용한다고 하는 방법이 취해지고 있지만, 비응집성의 미생물 세포, 특히 세균을 자발적으로 응집시키는 기술은 존재하지 않는다.
본 발명은 비특이적 부착성 또는 응집성이 없는 또는 약한 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 비특이적 부착성을 갖는 미생물로부터 부착 관련 유전자를 단리하는 것에 성공하여, 상기 유전자가 오토트랜스포터 어드헤신(autotransporter adhesin) 유전자인 것, 및 상기 유전자를 표적 미생물에 도입함으로써 상기 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강시킬 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 비특이적 부착성을 갖는 미생물 유래의 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 표적 미생물에 도입하는 것을 포함하는 표적 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강시키는 방법.
(2) 비특이적 부착성을 갖는 미생물이 Acinetobacter속 세균인, (1)에 기재된 방법.
(3) 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA가 이하의 (a), (b) 또는 (c)의 DNA인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 70％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열의 일부를 포함하고, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(4) 표적 미생물이 Escherichia속 세균인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(5) Escherichia속 세균이 대장균인, (4)에 기재된 방법.
(6) 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA와 함께, 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA를 도입하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법:
(a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA.
(7) 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA를 표적 미생물에 도입하는, (6)에 기재된 방법:
(a) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열과 70％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 숙주 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 DNA.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해서 얻어지는, 비특이적 부착성 및/또는 응집성이 부여 또는 증강된 미생물.
(9) 이하의 (a), (b) 또는 (c)의 DNA:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 70％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는, 미생물에 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA,
(c) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열의 일부를 포함하고, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(10) (9)에 기재된 DNA가 도입된, 비특이적 부착성 및/또는 응집성이 부여 또는 증강된 미생물.
(11) Escherichia속 세균인, (10)에 기재된 미생물.
(12) 대장균인, (11)에 기재된 미생물.
(13) 이하의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 미생물에 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 일부를 포함하고, 미생물에 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질.
(14) (8), (10), (11) 또는 (12)에 기재된 미생물을 담체에 부착시키거나 및/또는 응집시킴으로써 상기 미생물을 회수하는 것을 포함하는 미생물의 배양 방법.
본 발명에 의해서, 비특이적 부착성 또는 응집성이 없거나 또는 약한 미생물에 대하여, 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 것이 가능해진다. 그에 따라, 미생물 반응에 있어서, 미생물의 분리가 용이하게 되어, 귀중한 미생물 세포를 효율적으로 회수하여 연속적으로 또는 반복하여 이용하는 것이 가능해진다.
도 1은 실시예 1에서 얻어진 서열 단편의 위치 관계를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서의 클로닝과 시퀀스의 결과 얻어진 전체 염기 서열을 나타낸다.
도 3은 AadA의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 오토트랜스포터 어드헤신의 시그널 펩티드, 헤드 도메인, 네크 도메인, 멤브레인 앵커 도메인의 도메인 각각에 대하여 ClustalW를 이용하여 멀티플 얼라인먼트를 작성하고, 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 Tol5-OmpA의 서열과 상동성을 나타낸 외막 단백질의 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 aadA 유전자 및 aadA-ompA 오페론을 도입한 것에 의한 형태의 변화를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 폴리우레탄 표면에 부착하는 DH5α::aadA의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 8은 폴리우레탄 표면에 부착하는 DH5α::aadA-ompA의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 9는 폴리우레탄 표면 상에 존재하는 DH5α(WT)의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 10은 DH5α::aadA-ompA, DH5α::aadA 및 DH5αWT의 배양액의 사진을 나타낸다.
도 11은 DH5α::aadA 및 DH5αWT의 자기 응집 시험의 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 1에서 이용한 프라이머에 대해서 정리한 표를 나타낸다.
본 발명의 방법은 비특이적 부착성을 갖는 미생물 유래의 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA(오토트랜스포터 어드헤신 유전자)를 상기 표적 미생물에 도입하는 것을 특징으로 한다.
병원성 미생물 등에는, 특정한 생물 계면(예를 들면, 특정한 세포, 생물 또는 그 조직의 표면)에 부착하여 콜로니를 형성하는 것이 존재하는데, 본 발명에 있어서의 비특이적 부착성을 갖는 미생물은 특정한 생물 계면에 한정되지 않고, 담체 등의 비생물 계면을 포함해서, 임의의 생물 계면 및 비생물 계면에 부착하는 능력을 갖는 미생물을 가리킨다. 비특이적 부착성을 갖는 미생물은, 예를 들면, 유리, 플라스틱 및 금속 등의 담체에 부착할 수 있다.
비특이적 부착성을 갖는 미생물로서는 그램 음성 세균, 예를 들면, Acinetobacter속 세균, Pseudomonas속 세균, Escherichia속 세균, Caulobacter속 세균, Xanthomonas속 세균, Haemophilus속 세균, Yersinia속 세균, Bartonella속 세균, Neisseria속 세균, Actinobacillus속 세균 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 Acinetobacter속 세균이 특히 바람직하다.
비특이적 부착성을 갖는 미생물의 구체예로서는 Acinetobacter sp. Tol5주를 들 수 있다. 해당 균주는 배기 가스 처리 리액터로부터 분리된 톨루엔 분해능을 갖는 주이고, 수탁번호 FERM P-17188로서, 도꾸리쯔 교우세이 호우진 산교 기쥬쯔 소우고우 겐뀨쇼 독꾜 세이부쯔 기타꾸 센터(일본국 이바라기현 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 쯔꾸바 센터 쥬오우 다이6)에 기탁되어 있다.
미생물의 비특이적 부착성은 크리스탈 바이올렛 염색에 의한 부착 시험(CV 부착 시험)을 이용하여 평가할 수 있다. 구체적으로는, 균체 배양액을 원심 분리시키고, 배양 상청을 제거하고, 무기염 배지를 균체 펠릿에 가하고, 초음파 처리에 의해 균체 현탁액을 얻고, 균체 현탁액의 탁도 OD660을 일정(0.5 이하)하게 되도록 배지에서 조정하고, 48 웰의 플라스틱제 플레이트의 각 웰에 현탁액을 1 ml씩 첨가하고, 미생물의 가장 적합한 온도에서 2 시간 인큐베이트하고, 웰 중의 현탁액을 피펫으로 전부 제거하고, 1 ml의 무기염 배지로 웰을 세정한 후, 풍건하고, 1％의 크리스탈바이올렛 수용액을 웰에 가하고, 실온에서 15분간 인큐베이트하고, 피펫으로 크리스탈바이올렛을 제거하고, 1 ml의 무기염 배지로 웰을 2회 세정한 후, 풍건하고, 1 ml의 무기염 배지를 가하여 웰 내벽에 부착하고 있었던 염색 균체를 박리하고, 초음파 처리에 의해 분산시켜, 흡광도 A590을 측정한다. 그리고, 흡광도 A590이 0.15 이상, 바람직하게는 0.18 이상, 보다 바람직하게는 0.2 이상의 미생물은 비특이적 부착성을 갖는 미생물이라고 평가할 수 있다.
오토트랜스포터 어드헤신이란 그램 음성 세균이 갖는 점착성 나노파이버로서 보고되어 있는 단백질로서, 숙주의 조직이나 세포 표층 분자, 세포외 매트릭스와 특이적으로 상호 작용하는 것이 알려져 있지만, 여러가지 고체 표면에 비특이적으로 점착한다는 보고는 없다. 오토트랜스포터 어드헤신은 부착, 침입, 세포 독성, 혈청 내성, 세포 간 전파와 같은 기능을 갖는다고 전해지고 있다. 오토트랜스포터 어드헤신은 N 말단 시그널 펩티드, 내부 패신저 도메인(internal passenger domain), C 말단 트랜스로케이터 도메인이라는 공통의 영역 편성을 갖고 있다. 그 중에서도 C 말단 트랜스로케이터 도메인은 그 속(屬)을 정의하는 도메인이다. 오토트랜스포터 어드헤신의 분비는 시그널 펩티드에 의해서 개시되고, Sec 시스템에 의한 내막의 통과로부터 시작된다. 계속해서, 트랜스로케이터 도메인이 외막에 삽입되어 β 배럴 구조를 형성한다. 최종적으로 패신저 도메인은 외막을 통과하여 균체 표면에 그 모습을 나타낸다. 오토트랜스포터 어드헤신은 단량체 오토트랜스포터 어드헤신과 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신으로 분류된다(Shane E. Cotter, Neeraj K.Surana and Joseph W. St GemeⅢ 2005. Trimeric autotransporters: a distinct subfamily of Autotransporter proteins. TRENDS in Microbiology. 13: 199-205). 단량체 오토트랜스포터 어드헤신의 트랜스로케이터 도메인은 14의 막관통 역평행 β 시트와 막관통 α 헬릭스로 이루어지는 친수성의 경로인 β 배럴 구조를, 하나의 서브 유닛으로 형성하고 있다고 생각되고 있다. 그러나 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신의 트랜스로케이터 도메인은, 외막 중에서 열에 안정적이고 SDS에 강한 삼량체를 형성하고 있고, 4개의 β 시트를 갖는 서브 유닛이 올리고머화하여 3개의 서브 유닛으로부터 12 스트랜드의 β 배럴 구조를 형성하고 있는 것이 알려져 있다. 또한, 많은 통상 오토트랜스포터 어드헤신은 분자 내 샤페론 영역을 갖는데, 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신 서브패밀리에는 그것은 존재하지 않는다. 또한, 사실상 모든 단량체 오토트랜스포터 어드헤신의 패신저 도메인은 트랜스로케이터 도메인과 비공유 결합으로 박테리아 표면에 연결되거나, 세포 밖으로 방출되는 데 비하여, 모든 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신 단백질에서의 패신저 도메인은 트랜스로케이터 도메인과 공유 결합으로 연결되어 있는 채이라고 생각되고 있다.
삼량체 오토트랜스포터 어드헤신은 TAA(트라이머릭 오토트랜스포터 어드헤신)라고 약칭되고, 공통 올리고머 구조의 이중 나선을 만드는 새로운 클래스로서 Oca 패밀리(Oligomeric Coiled-coil Adhesin Family)라고도 불리고 있다(Andreas Roggenkamp, Nikolaus Ackermann, Christoph A. Jacobi, Konrad Truelzsch, Harald Hoffmann, and Jurgen Heesemann 2003. Molecular analysis of transport and oligomerization of the Yersinia enterocolitica adhesin YadA. J Bacteriol. 185: 3735-3744).
본 발명에서는, 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신이 바람직하다. 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신으로서는 예를 들면, Yersina enterocolitica의 어드헤신인 YadA(Yersina adhesin A) (El Tahir Y, Skurnik M.2001. YadA, the multifaceted Yersinia adhesin. Int J Med Microbiol. 291: 209-218), 수막염을 야기하는 Haemophilus influenzae의 Hia(St Geme JW 3rd, Cutter D. 2000. The Haemophilus influenzae Hia adhesin is an autotransporter protein that remains uncleaved at the C terminus and fully cell associated. J Bacteriol. 182: 6005-13), 치주병의 원인이 되는 Aggregatibacter(Actinobacillus) actinomycetemcomitans의 EmaA(Mintz, K. P. 2004. Identification of an extracellular matrix protein adhesin, EmaA, which mediates the adhesion of Actinobacillus actinomycetemcomitans to collagen. Microbiology. 150, 2677-2688), 호흡기 감염증의 주요한 병원균인 Moraxella catarrhalis의 UpsA1, A2(Lafontaine ER, Cope LD, Aebi C, Latimer JL, McCracken GH Jr, Hansen EJ. 2000. The UspA1 protein and a second type of UspA2 protein mediate adherence of Moraxella catarrhalis to human epithelial cells in vitro. J Bacteriol. 182: 1364-73), 고양이 할큄병의 원인이 되는 Bartonella henselae의 BadA(Riess T, Andersson SG, Lupas A, Schaller M, Schaefer A, Kyme P, Martin J, Waelzlein JH, Ehehalt U, LindroosH, Schirle M, Nordheim A, Autenrieth IB, Kempf VA.,. 2004. Bartonella adhesin mediates a proangiogenic host cell response. J Exp Med. 200: 1267-78), 수막염균 Neisseria meningitides의 NadA(Capecchi B, Adu-Bobie J, Di Marcello F, Ciucchi L, Masignani V, Taddei A, Rappuoli R, Pizza M, Arico B. 2005. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol Microbiol. 55: 687-98), 식물 병원성 세균인 Xanthomonas oryzae의 XadA(Ray SK, Rajeshwari R, Sharma Y, Sonti RV. 2002. A high-molecular-weight outer membrane protein of Xanthomonas oryzae pv. oryzae exhibits similarity to non-fimbrial adhesins of animal pathogenic bacteria and is required for optimum virulence. Mol Microbiol. 46: 637-47) 등을 들 수 있다.
바람직한 오토트랜스포터 어드헤신의 예로서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 상기 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 들 수 있다. 기능적으로 동등한 단백질이란 해당 단백질이 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 기능, 생화학적 기능을 갖는 것을 가리킨다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질로서는 서열 번호 2에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질로서, 미생물에 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 또한, (c) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 일부를 포함하고, 미생물에 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질, 바꾸어 말하면, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로부터 수십 내지 수백, 경우에 따라서는 천 이상의 연속하는 아미노산 서열을 1부분 또는 수부분에서 삭제한 아미노산 서열을 포함하고, 미생물에 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 잃지 않는 결손 단백질을 들 수 있다.
1개 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가는 상용되는 기술, 예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법(Zoller 등, Nucleic Acids Res. 10 6478-6500, 1982)에 의해, 상기 단백질을 코딩하는 DNA의 서열(예를 들면, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열)을 개변함으로써 실시할 수 있다.
여기서, 단백질의 구성 요소가 되는 아미노산의 측쇄는, 소수성, 전하, 크기 등에 있어서 각각 다른 것인데, 실질적으로 단백질 전체의 3차원 구조(입체 구조라고도 함)에 영향을 주지 않는다는 의미로 보존성이 높은 몇개의 관계가 경험적으로 또한 물리 화학적인 실측에 의해 알려져 있다. 예를 들면, 다른 아미노산 잔기 사이의 보존적 치환의 예로서는 글리신(Gly)과 프롤린(Pro), 글리신과 알라닌(Ala) 또는 발린(Val), 류신(Leu)과 이소류신(Ile), 글루탐산(Glu)과 글루타민(Gln), 아스파라긴산(Asp)과 아스파라긴(Asn), 시스테인(Cys)과 트레오닌(Thr), 트레오닌과세린(Ser) 또는 알라닌, 리신(Lys)과 아르기닌(Arg) 등의 아미노산 간의 치환이 알려져 있다. 따라서, 아미노산의 치환은 보존적 치환인 것이 바람직하다.
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 시그널 펩티드, 헤드 도메인, 네크 도메인, 스토크 도메인(stalk domain), 및 멤브레인 앵커 도메인을 갖는 삼량체 오토트랜스포터 어드헤신인 점에서, 아미노산의 변이는 해당 도메인 구조를 유지하는 것인 것이 바람직하다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 시그널 펩티드는 1 내지 57 위치의 아미노산에 상당하고, 헤드 도메인은 108 내지 269 위치 및 2997 내지 3148 위치의 아미노산에 상당하고, 네크 도메인은 296 내지 319 위치 및 3149 내지 3172 위치의 아미노산에 상당하고, 스토크 도메인은 406 내지 2966 위치 및 3173 내지 3537 위치의 아미노산에 상당하고, 멤브레인 앵커 도메인은 3538 내지 3630 위치의 아미노산에 상당한다.
수개란 통상 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 2 내지 3개를 말한다. 기능적으로 동등한 단백질은, 통상, 아미노산 서열 레벨에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란 아미노산 레벨에 있어서, 통상 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 99％ 이상의 상동성(또는 동일성)을 가리킨다.
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 일부을 포함하는 단백질에 있어서, 삭제하는 것이 가능한 수십 내지 수백의 연속하는 아미노산 서열이란, 바람직하게는 한쪽 또는 양쪽의 스토크 도메인, 한쪽의 헤드 도메인, 한쪽의 네크 도메인에 상당하는 서열 부위에서, 그 중의 하나의 연속 서열 또는 복수의 연속 서열을 삭제할 수도 있다. 보다 바람직하게는 상술한 각 도메인의 부위 중 아미노 말단에 가까운 헤드 도메인으로부터 스토크 도메인까지의 전체 영역(108 내지 2966위치) 또는 카르복시 말단에 가까운 헤드 도메인으로부터 스토크 도메인까지의 전체 영역(2997 내지 3537위치)를 삭제하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 스토크 도메인에 복수 보이는 반복 영역을 반복을 없애고 각 1회씩 나오도록 삭제하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 스토크 도메인에 복수 보이는 반복 영역의 어느 1부분을 삭제하는 것이 바람직하다.
바람직한 오토트랜스포터 어드헤신 유전자, 즉, 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA의 예로서는 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA, 및 상기 DNA와 기능적으로 동등한 DNA를 들 수 있다. 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA와 기능적으로 동등한 DNA로서는 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상의 상동성(또는 동일성)을 갖는 염기 서열을 포함하고, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 또는, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하여, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열의 일부를 포함하고, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA, 바꾸어 말하면, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로부터 수십 내지 수천의 연속하는 염기 서열을 1부분 또는 수부분에서 삭제한 염기 서열을 포함하고, 그것에 의하여 번역되는 단백질이 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 잃지 않는 결손 유전자의 DNA를 들 수 있다.
스트린젠트한 조건이란 특이적인 혼성이 형성되고, 비특이적인 혼성이 형성되지 않는 조건을 말하며, 낮은 스트린젠트한 조건 및 높은 스트린젠트한 조건을 들 수 있는데, 높은 스트린젠트한 조건이 바람직하다. 낮은 스트린젠트한 조건이란 혼성화 후의 세정에 있어서, 예를 들면 42℃, 5×SSC, 0.1％ SDS로 세정하는 조건으로서, 바람직하게는 50℃, 5×SSC, 0.1％ SDS로 세정하는 조건이다. 높은 스트린젠트한 조건이란 혼성화 후의 세정에 있어서, 예를 들면 65℃, 0.1×SSC 및 0.1％ SDS로 세정하는 조건이다.
염기 서열에 있어서의 변이도 시그널 펩티드, 헤드 도메인, 네크 도메인, 스토크 도메인 및 멤브레인 앵커 도메인으로 이루어지는 해당 도메인 구조를 유지하는 것인 것이 바람직하다. 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 있어서, 시그널 펩티드는 1 내지 171 위치의 염기에 상당하고, 헤드 도메인은 322 내지 807 위치 및 8989 내지 9444 위치의 염기에 상당하고, 네크 도메인은 886 내지 957 위치 및 9445 내지 9516 위치의 염기에 상당하고, 스토크 도메인은 1216 내지 8898 위치 및 9517 내지 10611 위치의 염기에 상당하고, 멤브레인 앵커는 도메인 10612 내지 10890 위치의 염기에 상당한다.
서열 번호 1로 표시되는 염기 서열의 일부을 포함하는 DNA에서, 삭제하는 것이 가능한 수십 내지 수백의 연속하는 염기 서열은, 바람직하게는 한쪽 또는 양쪽의 스토크 도메인, 한쪽의 헤드 도메인, 한쪽의 네크 도메인을 코딩하는 서열 부위로서, 그 중의 하나의 연속 서열 또는 복수의 연속 서열을 삭제할 수도 있다. 보다 바람직하게는 상술한 각 도메인의 부위 중 아미노 말단에 가까운 헤드 도메인으로부터 스토크 도메인까지의 전체 영역을 코딩하는 영역(322 내지 8898위치) 또는 카르복시 말단에 가까운 헤드 도메인으로부터 스토크 도메인까지의 전체 영역을 코딩하는 영역(8989 내지 10611위치)를 삭제하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 스토크 도메인의 코드 영역에 복수 보이는 반복 영역을, 반복을 없애고 각 1회씩 나오도록 삭제하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 스토크 도메인의 코드 영역에 복수 보이는 반복 영역의 어느 1부분을 삭제하는 것이 바람직하다.
오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA와 함께, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 표적 미생물에 도입함으로써, 표적 미생물의 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 더욱 향상시킬 수 있다. 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA는 Acinetobacter속 세균 등이 갖는 외막 단백질 OmpA 유전자와 상동성을 갖는 점에서, 외막 단백질을 코딩하는 것이다. 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA와 기능적으로 동등한 유전자를 도입할 수도 있다. 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA와 기능적으로 동등한 DNA로서는 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 95％ 이상, 보다 바람직하게는 98％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 또는, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하는 DNA를 들 수 있다.
비특이적 부착성을 갖는 미생물에서 유래되는, 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 포함하는 오페론을 표적 미생물에 도입할 수도 있다. 예를 들면, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 표적 미생물에 도입함으로써, 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA와 함께 상기 외막 단백질을 코딩하는 DNA를 표적 미생물에 도입할 수 있다. 상기 오페론과 기능적으로 동등한 오페론을 도입할 수도 있다. 기능적으로 동등한 오페론으로서는 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 숙주 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 DNA로 이루어지는 오페론을 들 수 있다.
오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 도입하는 표적 미생물로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 비특이적 부착성 및/또는 응집성이 없는 또는 약한 미생물을 들 수 있다. 예를 들면, Escherichia속 세균, 예를 들면, Escherichia coli(대장균), Acinetobacter속 세균, 예를 들면, Acinetobacter calcoaceticus, Ralstonia속 세균, 예를 들면 Ralstonia eutropha, Pseudomonas속 세균, 예를 들면, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas속 세균, 예를 들면, Aeromonas caviae, Alcaligenes속 세균 Alcaligenes latus, Xanthomonas속 세균, 예를 들면, Xanthomonas campestris 등을 들 수 있다.
오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 표적 미생물에 도입하여 형질 전환함으로써, 비특이적 부착성 및/또는 응집성이 부여 또는 증강된 미생물이 얻어진다. 전형적으로는, 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 적당한 벡터에 연결하고, 상기 벡터로 표적 미생물(숙주 미생물)을 형질 전환함으로써, 비특이적 부착성 및/또는 응집성이 부여 또는 증강된 미생물을 얻을 수 있다. 구체적으로는, 숙주 미생물에 상기 DNA를 복수의 카피로 도입하거나, 구성적으로 발현하는 프로모터 지배 하에 상기 DNA를 연결하거나, 또는 유도 효소계 프로모터 지배 하에 상기 DNA를 연결하거나 하여, 비특이적 부착성 및/또는 응집성이 부여 또는 증강된 미생물을 얻을 수 있다. 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA와 함께 외막 단백질을 코딩하는 DNA를 도입하는 경우, 및 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를 포함하는 오페론을 도입하는 경우도 동일하다.
우선, 목적으로 하는 DNA를 벡터 중에 연결하여 재조합 벡터를 제조한다. 상기 벡터에는 숙주 세포에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지, 코스미드, 인공 염색체 또는 플라스미드가 사용되는 외에, 예를 들면, 플라스미드를 발현 카세트로 하여 염색체에 도입하는 경우에는 그 발현 카세트의 구축에 필요한 숙주(예를 들면, 대장균)에서의 자율 복제능은 필요하지만, 그 발현 카세트를 도입하는 숙주(예를 들면, 효모)에서의 자율 복제능은 반드시 필요한 것은 아니다. 이들 재조합 벡터는 예를 들면, 대장균과 효모의 양쪽에서 사용 가능하도록 설계한 셔틀 벡터 등도 사용 가능하다.
플라스미드로서는 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면, pET21a(+), pET32a(+), pET39b(+), pET40b(+), pET43.1a(+), pET44a(+), pKK223-3, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19 등), 고초균 유래의 플라스미드(예를 들면, pUB110, pTP5 등), 효모 유래의 플라스미드(예를 들면, YEp13, YEp24, YCp50 등), 또한 효모에서도 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)용의 플라스미드(예를 들면, pPICZ, pPICZα, pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1, pPIC9, pPIC6, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pFLD) 등을 들 수 있고, 파지 DNA로서는 λ 파지(λgt11, λZAP 등)을 들 수 있다. 또한, 백시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 바큘로 바이러스 등의 곤충 바이러스 벡터를 이용할 수도 있다. 또한, 클로닝, 시퀀스 확인용으로 pCR4-TOPO(등록상표) 등의 시판되고 있는 클로닝용 벡터를 이용할 수도 있다.
벡터에 DNA를 삽입하기 위해서는, 우선, 정제된 DNA를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA의 제한 효소 부위 또는 멀티클로닝 사이트에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법 등이 채용된다. 예를 들면, 목적으로 하는 DNA는 통상 알려져 있는 방법에 의해 합성할 수 있고, 벡터에 조립되기 때문에, 적당한 제한 효소의 절단 부위를 양쪽 말단에 포함하도록, 프라이머를 이용하여 PCR법에 의해 증폭할 수도 있다. PCR 반응의 조건은 당업자가 적절하게 결정할 수 있다.
기타, 재조합 벡터에는 프로모터 및 본 발명의 DNA에 추가로, 소망에 따라 인핸서 등의 시스엘레멘트, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, 리보솜 결합 서열(SD 서열) 등이 연결되어 있을 수도 있다. 선택 마커의 예로서는 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등의 약제 내성 마커, 류신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 우라실 등의 영양 요구성 마커를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.
프로모터는 특별히 제한되지 않고, 숙주 미생물에 따라서 당업자가 적절하게 선택하면 된다. 예를 들면, 숙주가 대장균인 경우에는, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, λ-PL 프로모터 등을 사용할 수 있다. 서열 번호 28로 표시되는 염기 서열을 포함하는 프로모터, 및 그것과 기능적으로 동등한 프로모터, 예를 들면, 서열 번호 28로 표시되는 염기 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 95％ 이상, 보다 바람직하게는 98％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 프로모터도 바람직하게 이용된다.
DNA 단편과 벡터 단편을 연결시키기 위해서는, 공지된 DNA 리가아제를 이용한다. 그리고, DNA 단편과 벡터 단편을 어닐링시킨 후 연결시켜 재조합 벡터를 제조한다. 바람직하게는 시판되고 있는 라이게이션 키트, 예를 들면, 라이게이션 high(도요보 가부시끼가이샤 제조)를 이용하고, 규정의 조건에서 라이게이션 반응을 행함으로써 재조합 벡터를 얻을 수 있다.
클로닝, 연결 반응, PCR 등을 포함하는 재조합 DNA 기술은, 예를 들면, Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press (1989) 및 Short Protocols In Molecular Biology, Third Edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.에 기재된 것을 이용할 수 있다.
얻어진 벡터를 필요하면 보일법, 알칼리 SDS법, 자성 비드법 및 이들의 원리를 사용하여 시판되고 있는 키트 등에 의해 정제하고, 또한 예를 들면 에탄올 침전법, 폴리에틸렌글리콜 침전법 등의 농축 수단에 의해 농축할 수 있다.
표적 미생물에의 재조합 벡터의 도입 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기 천공법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.
목적으로 하는 DNA를 포함하는 형질 전환 미생물은 그 재조합 벡터가 갖는 마커 유전자에 의해, 예를 들면, 암피실린, 카나마이신 등의 항생 물질을 포함하는 LB 배지 한천 플레이트 상에서 콜로니를 형성함으로써 선발할 수 있는데, 클로닝된 숙주 미생물이 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 것인지 아닌지를 확인하기 위해서, 일부를 이용하여, PCR법에 의한 인서트의 증폭 확인, 또는 시퀀서를 이용한 다이디옥시법에 의한 서열 해석을 할 수도 있다. 자율 복제 가능한 플라스미드를 도입하는 형식 외에, 염색체의 유전자와 상동인 영역을 벡터 내에 배치하여, 상동 재조합을 일으켜 목적 유전자를 도입시키는 염색체 조립형의 도입 방법을 사용할 수도 있다.
얻어진 형질 전환 미생물을 배지에서 배양하는 방법은 표적 미생물의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다. 대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환 미생물을 배양하는 배지로서는 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하고, 형질 전환 미생물의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중의 어느 것을 이용해도 된다. 구체적으로는, M9 배지, M9G 배지, BS 배지, LB 배지, Nutrient Broth 배지, 육(肉) 엑기스 배지, SOB 배지, SOC 배지, PDA 배지 등을 들 수 있다.
탄소원으로서는 자화 가능한 탄소 화합물이면 되고, 예를 들면, 글루코오스 등의 당류, 글리세린 등의 폴리올류, 메탄올 등의 알코올류, 또는 피루브산, 숙신산 또는 시트르산 등의 유기산류를 사용할 수 있다. 또한, 질소원으로서는 이용 가능한 질소 화합물이면 되고, 예를 들면, 펩톤, 육 엑기스, 효모 엑기스, 카제인 가수 분해물, 대두박 알칼리 추출물, 메틸아민 등의 알킬아민류, 또는 암모니아 또는 그의 염 등을 사용할 수 있다. 기타, 인산염, 탄산염, 황산염, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 철, 망간, 아연 등의 염류, 특정한 아미노산, 특정한 비타민, 소포제 등도 필요에 따라서 사용할 수도 있다. 또한, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등의 단백질 발현 유도제를 필요에 따라서 배지에 첨가할 수도 있다.
배양은, 통상, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하, 바람직하게는 0 내지 40℃, 보다 바람직하게는 10 내지 37℃, 특히 바람직하게는 15 내지 37℃에서 행한다. 배양 기간 중, 배지의 pH는 숙주의 발육이 가능하고, 오토트랜스포터 어드헤신의 활성이 손상되지 않는 범위에서 적절하게 변경할 수 있는데, 바람직하게는 pH4 내지 8 정도의 범위이다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 이용하여 행한다. 배양 중에는 필요에 따라서 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
상기한 바와 같이하여, 비특이적 부착성 및/또는 응집성(자기 응집성)이 부여 또는 증강된 미생물을 얻을 수 있다. 얻어진 미생물의 비특이적 부착성에 대해서는, 상기 크리스탈바이올렛 염색에 의한 부착 시험(CV 부착 시험)에 의해 평가할 수 있고, 응집성에 대해서는, 예를 들면, 이하와 같이 평가할 수 있다. 균체 배양액을 원심 분리시켜 배양 상청을 제거하고, 무기염 배지를 균체 펠릿에 가하고, 초음파 처리에 의해 균체 현탁액을 얻고, 균체 현탁액의 탁도 OD660을 일정하게 되도록 배지로 조정하고, 이 때의 OD660을 초기 OD660으로 하여, 유리 원심관 중의 균체 현탁액을 실온에서 정치함으로써 형성된 세포 자기 응집체를 침강시키고, 상청의 OD660의 시간 변화를 측정한다. 그리고, OD660의 감소가 초기 OD660의 10％ 이상, 바람직하게는 15％ 이상, 보다 바람직하게는 20％ 이상인 미생물은 응집성을 갖는 미생물이라고 평가할 수 있다.
얻어진 미생물을 배양한 후, 통상 알려져 있는 방법, 예를 들면, 균체 또는 세포를 기계적 방법, 리소자임 등을 이용한 효소적 방법 또는 계면 활성제 등을 이용한 화학적 처리에 의해 파괴함으로써 오토트랜스포터 어드헤신 단백질을 단리할 수도 있다.
본 발명은 전통적인 발효 산업이나 폐기물 처리에 그대로 이용 가능할 뿐만 아니라, 바이오매스 에너지의 생산이나 미생물 세포를 이용하는 그린 바이오테크놀로지에 매우 유효하다. 특히 에너지나 화학품의 생산은 저비용이 요구되고 있고, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 및/또는 응집성을 부여 또는 증강함으로써, 고정화 및 자기 응집시키는 것은 생산 공정의 효율화로 직결되어, 이들 산업의 발전의 기반이 될 수 있다.
[실시예]
실시예 1 부착 관련 유전자의 해석
1-1 부착성 저하 변이주 T1 및 인버스 PCR 용 프라이머의 제조
Acinetobacter sp. Tol5주의 부착 관련 유전자를 해석하기 위해서 트랜스포존 랜덤 삽입법을 이용하여 부착성 저하 변이주를 제조하였다. Tol5 WT(Tol5 야생주)를 레시피언트 세포, 트랜스포존 벡터를 갖는 E.coli S17-1을 도너 세포로 하여, 28℃에서 22 내지 24 시간 접합하였다. 톨루엔과 테트라사이클린를 포함하는 배지로 선택 배양하고, 얻어진 주의 부착 시험을 행하였다. 그 결과, 부착성이 저하된 주 몇개를 얻는 것에 성공하였다. 이들 게놈 DNA를 채취하고, 제한 효소 HindⅢ로 처리한 것을 주형으로 하고, DIG-labeled tetA를 프로브로서 이용하여 서던 혼성화를 행하였다. 그 결과, 약 5 kb의 위치에 강하게 밴드가 검출된 주가 있고, 그것을 부착성 저하주 T1로 하였다. T1주의 표면 구조를 전자현미경으로 관찰한 바, 어펜디지(appendage, 세포 표층의 돌기물)를 결손하고 있는 모습이 관찰되었다.
계속해서, T1주의 트랜스포존 삽입 부위를 해석하기 위해서, 서던 혼성화로 검출된 약 5 kb의 DNA 단편을 아가로스겔로부터 추출하였다. 이 단편을 T1-5 kb로 하였다. T1-5 kb를 pUC118 벡터에 조립하고, E.coli DH5α에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드 DNA의 인서트 부분의 양끝을 시퀀스한 결과, T1-5 kb의 내부에 Tn5의 서열 외에 Tol5 WT주 유래의 염기 서열 68 bp의 존재를 확인하였다(서열 번호 6).
1-2 부착 관련 유전자의 클로닝
부착성 저하 변이주 T1의 트랜스포존 삽입 부위의 염기 서열을 해석하기 위해서, T1의 해석에 의해서 명확해진 삽입 부위 68 bp의 서열을 바탕으로, WT주의 염색체 DNA의 인버스 PCR을 시도하였다. 우선 Tol5 야생주를 BS 배지로 배양하고, DNA 추출·RNase 처리를 행하였다. 얻어진 게놈 DNA를 pUC118의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 HindⅢ 이외의 제한 효소(AccⅠ, HaeⅢ, HincⅡ, KpnⅠ, PstⅠ, PvuⅡ, SalⅠ, Sau3AⅠ, SmaⅠ, XbaⅠ)로 처리하고, 아가로스겔 전기 영동(이하 E.P.)으로 확인하였다. 제한 효소 HindⅢ은 T1의 해석 시에 사용하고 있고, 68 bp 내에 HindⅢ 사이트를 확인하고 있기 때문에 목적 영역을 얻기 위해서는 부적절하다고 판단하여, 여기서는 제외하였다. E.P.의 결과, 게놈과 동등한 고분자량의 위치에 밴드가 남아 있는 것은, 제한 효소 반응 위치가 적고 단편의 길이가 너무 길기 때문에 적당하지 않다. 또한, 저분자량 밴드가 나와 있는 것은 단편이 너무 짧아, 시퀀스하더라도 얻어지는 서열 정보가 적기 때문에 적당하지 않다. 따라서, 1,500 bp 내지 5,000 bp에 시그널이 나와 있는 HincⅡ를 선택하여, 게놈 DNA를 HincⅡ 처리하였다(Tol5/HincⅡ). DNA의 정제를 행한 Tol5/HincⅡ를 셀프라이게이션(자기 환화)시키도록 라이게이션하였다(Tol5/HincⅡ/circular). 계속해서 그것을 주형으로 하여 인버스 PCR을 행하였다. HincⅡ 처리한 벡터에 라이게이션하기 위해서 HincⅡ 링커를 붙인 프라이머를 이용하였다. 조건은 하기한 바와 같다. 얻어진 5 kb의 PCR 산물을 Tol5-5 kb로 하였다.
인버스 PCR 조건
폴리머라아제: KOD-plus-
템플릿 DNA: Tol5/HincⅡ/circle
프라이머 F: T1-5 kb R3
프라이머 R: T1-5 kb RC
어닐링: 66℃
신장: 5분
얻어진 PCR 산물을 정제하고, 제한 효소 HincⅡ로 처리하였다. 이 조작은 클로닝의 성공율을 높이기 위해서 단편을 짧게 하는 것, 그리고 링커를 HincⅡ 절단면으로 하는 것을 목적으로 하고 있다. 각각의 샘플을 분취하기 위해서 아가로스겔로부터의 DNA 추출(QIAquick Gel Extraction Kit)을 행하였다. 2.8 kb 단편 및 1.8 kb 단편을 각각 Tol5-2.8 kb 및 Tol5-1.8 kb로 하였다. Tol5-2.8 kb 및 Tol5-1.8 kb를 벡터와 라이게이션시켰다. 그 후, 트랜스포메이션(화학법; 청백 콜로니 선별법)을 행하였다. 백 콜로니를 픽업하고, LB 액체 배지에서 배양한 후, 플라스미드 DNA 소량 추출을 행하였다. 플라스미드 DNA를 제한 효소 HincⅡ로 처리하고, E.P.로 확인하였다. 제한 효소 처리의 결과, 벡터+2.8 kb 및 1.8 kb라는 이상적인 밴드가 얻어졌다. 또한, PCR에서 단편의 크기와 삽입 방향을 확인하였다. 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
폴리머라아제: Blend Taq
템플릿 DNA: Tol5-1.8 kb, Tol5-2.8 kb
프라이머 F: T1-5 kb R3, pUC118F
프라이머 R: T1-5 kb RC, pUC118R
어닐링: 62℃
신장: 2분
PCR의 결과, Tol5-2.8 kb에서는 pUC118R×T1-5 kb R3의 프라이머쌍으로 2.8 kb의 단편이 증폭하고, Tol5-1.8 kb에서는 pUC118F×T1-5 kb RC의 프라이머쌍으로 1.8 kb의 단편을 증폭하였다. 이 결과로부터 삽입 단편의 크기를 확인함과 동시에, 단편 삽입의 방향을 결정하는 것에 성공하였다. 이들 2주를 시퀀스하였다. 시퀀스는 프라이머 워킹법에 의하였다. 그러나 시퀀서의 시그널이 흐트러지고, 또한 컴퓨터에 의한 어셈블리에 있어서도, 오버랩 영역이라고 생각되는 부위에서도 일치하지 않는 염기가 나오는 등의 문제가 생겼다. 해석의 결과, 서열 중에 긴 복수의 반복 서열이 있는 것을 알았다. 그 때문에, 어셈블리 후의 길이도 목적으로 하는 삽입 단편의 길이인 2.8 kb 또는 1.8 kb에 못미치는 등의 곤란도 생겼다. 따라서 프라이머의 설계와 시퀀스를 반복하여, 겨우 삽입 단편의 길이 분의 염기 서열의 결정에 이르렀다. 그러나, 이러한 반복 서열 때문에, 결과의 신뢰성이 낮았다. 따라서 시퀀스의 확실성을 높이기 위해서 Tol5-5 kb를 직접 클로닝하고 재차 시퀀스하는 것으로 하였다. TA 클로닝을 행하기 위해서, Taq계에서 정확성이 높은 DNA 폴리머라아제 Easy-A를 이용하여 PCR하여, Tol5-5 kb를 증폭하였다. PCR 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
폴리머라아제: Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Enzyme
템플릿 DNA: Tol5/HincⅡ/circular
프라이머 F: T1-5 kb R3-2
프라이머 R: T1-5 kb RC-2
어닐링: 67.9℃
신장: 5분
얻어진 PCR 산물을 이용하여 TA 클로닝을 행하였다. 트랜스포메이션은 화학법으로 행하고, LB/Km 한천 배지에 스프레딩하였다. 콜로니를 LB/Km 액체 배지에서 배양하고, 배양 후 플라스미드 DNA의 추출을 행하였다. 인서트를 확인하기 위해서 DNA를 제한 효소 EcoRⅠ로 처리하였다. 그 결과, 벡터와 5 kb의 단편의 존재를 확인할 수 있었다. 또한, PCR에 의해 삽입 단편의 크기를 확인하였다. 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
폴리머라아제: Blend Taq
템플릿 DNA: Tol5-5 kb 플라스미드 No.5
프라이머 F: pUC118F
프라이머 R: pUC118R
어닐링: 65 내지 71℃
신장: 5분
PCR의 결과, 인서트의 밴드 5 kb를 확인할 수 있었다. 이것을 시퀀스 해석하였다. 시퀀스는 다시 프라이머 워킹법에 따랐지만, 리피트 구조 때문에 다시 극도로 곤란했다. 앞선 1.8 kb와 2.8 kb의 서열 정보를 기초로, 신중히 프라이머 설계와 시퀀스를 반복하고, 수고와 시간을 들인 끝에, 거대한 리피트 구조를 갖는 4907 bp의 서열을 얻는 것에 성공하였다. 이 Tol5-5 kb의 서열과 Tol5-2.8 kb 및 Tol5-1.8 kb의 서열은 완전히 일치함으로써 시퀀스의 확실성은 높아졌다. 얻어진 Tol5-5 kb의 서열을 서열 번호 7에 나타내었다. 이 서열을 바탕으로 번역 단백질을 BLAST에 의해 호몰로지 검색을 행한 바, 다른 세균으로 보고되어 있는 오토트랜스포터 어드헤신과 20 내지 30％의 상동성을 나타내는 4026 bp의 ORF를 발견하고, 트랜스포존도 이 ORF 내에 삽입되어 있었다. 이것에 의해서, Tol5주의 높은 부착성과 어펜디지의 생산에 관여하는 ORF의 존재를 분명하게 할 수 있었다. 그러나 이 ORF는 Tol5-5 kb의 3' 말단에서 도중에서 끊겨 있고, 전체 ORF를 분명하게 하기 위해서는 Tol5-5 kb에 계속되는 하류 영역을 새롭게 클로닝할 필요가 있었다. 또한, 세균의 점착에 관한 오토트랜스포터 어드헤신이 호몰로지 검색으로 나타내어졌다고는 하지만, 상동성은 낮고, 이 그룹을 특정하는 결정적 수단이 되는 카르복시 말단의 멤브레인 앵커 도메인도 나타나 있지 않은 점에서, 부분적으로 서열이 닮은 별도의 단백질일 가능성도 충분히 생각되었다.
얻어진 시퀀스의 결과를 기초로 더욱 하류의 서열 정보를 얻기 위해서 서던 혼성화에 의한 특정 단편의 취득을 시도하였다. DIG 라벨된 프로브 제조를 위해 리피트 부분을 피하여 프라이머를 제조하였다. 그 프라이머를 이용하여, Tol5주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 목적 밴드 160 bp를 증폭하였다. PCR 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
폴리머라아제: Blend Taq
템플릿 DNA: Tol5 게놈
프라이머 F: Tol5-ad-probe2F
프라이머 R: Tol5-ad-probe2R
어닐링: 66 내지 72℃
신장: 1초
복수의 밴드가 증폭되었기 때문에, 해석한 부분에서는 반복이 없었던 프로브의 서열 부분도 미해석의 하류 영역에서 추가로 리피트하고 있을 것이 추정되었지만, 시퀀스를 진행시키기 위해서 160 bp의 목적 밴드만을 QIAquick Gel Extraction Kit로 추출하였다. 그것을 주형으로, PCR을 이용하여 프로브를 제조하였다. PCR 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
PCR DIG Probe Synthesis Kit
템플릿 DNA: Tol5 160 bp probe Gel Extraction
프라이머 F: Tol5-ad-probe2F
프라이머 R: Tol5-ad-probe2R
어닐링: 67.9℃
신장: 2분
얻어진 프로브를 이용하여, Tol5주의 염색체 DNA를 여러가지 제한 효소로 처리한 소화물에 대하여 서던 혼성화를 행하였다. 그 결과, 제한 효소 PstⅠ의 소화물에 있어서 3 kb와 2.3 kb의 위치에 프로브가 혼성화한 시그널이 검출되었다. 따라서 이들 두개의 DNA 단편을 아가로스겔로부터 잘라내어 추출(QIAquick Gel Extraction Kit)하였다. 이들을 Tol5-3 kb 및 Tol5-2.3 kb로 하였다. 잘라낸 DNA와 PstI로 소화한 pUC118을 라이게이션하였다. 얻어진 재조합 벡터로 대장균 DH5α를 형질 전환하였다(화학법; 청백 콜로니 선별법). 또한 콜로니 혼성화에 의해, 이들 단편이 도입된 형질 전환체를 선별하였다. 그 결과, 시그널이 나온 것은 Tol5-3 kb를 도입한 콜로니만이었다. 시그널이 나온 부분의 콜로니(Tol5-CC, -C1, -C2, -C3)을 픽업하여, LB/Amp 액체 배지에서 배양한 후, 플라스미드 DNA 소량 추출을 행하였다. 각각에 대하여 제한 효소 PstⅠ로 처리하였다. 그것을 서던 혼성화하면, Tol5-CC, -C2, -C3에 시그널이 나왔다. 이들의 시퀀스를 행하였다. 인서트의 양끝의 시퀀스의 결과, 기지 서열과 일치하는 단편은 존재하지 않았다. 또한, 이들 서열은 각각 달랐다. 즉, 먼저 염기 서열을 결정한 5 kb 영역(Tol5-5 kb)에 계속되는 하류 영역의 클로닝은 실패하였다. 이 시점에서는 그 원인을 특정할 수는 없었다. 그러나, Tol5주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 행한 서던 혼성화에서 나온 복수의 시그널로부터 억지로 하나를 선택하여 단편을 잘라내고, 그로부터 프로브를 제조한 점에 문제가 있었던 것은 아닌 가라고 생각하였다. 따라서 이들 클로닝주는 일시 보류로 하고, Tol5-5 kb에 연속하는 단편의 취득 목표로 하였다.
주형을 Tol5 염색체로부터 pUC118::Tol5-5 kb 플라스미드 DNA로 변경하고, PCR법에 의해 새로운 DIG 표지 프로브를 제조하였다. 이 플라스미드는 프로브 영역을 1부분에 밖에 포함하지 않기 때문에, DIG 표지된 증폭 단편도 1개가 된다고 생각하였다. PCR 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
PCR DIG Probe Synthesis Kit
템플릿 DNA: pUC118::Tol5-5 kb 플라스미드 DNA
프라이머 F: Tol5-ad-probe2F
프라이머 R: Tol5-ad-probe2R
어닐링: 68℃
신장: 2분
예상대로 증폭된 단편은 목적으로 하는 크기(160 bp)의 것만으로서, 순도가 높은 새로운 프로브를 제조하는 것에 성공하였다. 이 프로브를 이용하여, 상술한 Tol5-3 kb 및 Tol5-2.3 kb를 포함하는 벡터로 형질 전환 조작한 후에 얻은 플레이트에 대하여 콜로니 혼성화를 행하였다. 시그널을 내었다고 생각되는 콜로니를 픽업하고, 플레이트에 배양하고 재차 콜로니 혼성화하여 확인하였다. 시그널이 나온 부분의 콜로니(3 kb의 No.3 및 2.3 kb의 No.6, 12, 13, 21, 22)를 픽업하고, LB/Amp 액체 배지에서 배양한 후, 플라스미드 DNA 소량 추출을 행하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 제한 효소 PstⅠ로 처리하였다. 그 결과, 각 플라스미드는 목적으로 하는 3 kb(No.3) 또는 2.3 kb(No.6, 12, 13, 21, 22)를 포함하고 있고, 이들 삽입 단편은 전부 160 bp의 프로브와 혼성화하였다. 이들 단편이 혹시 기대대로 Tol5-5 kb에 계속되는 하류 영역을 포함한다면, PstI 사이트와 HincII 사이트의 사이에 끼워진 약 1.5 kb의 염기 서열을 Tol5-5 kb와 중복하는 영역으로서 포함할 것이다. 따라서 멀티클로닝 사이트의 PstI 사이트에 이들 단편을 삽입한 상술한 플라스미드를 제한 효소 HincⅡ로 처리하면, 1.5 kb의 중복 단편에 멀티클로닝 사이트의 극히 일부가 부가된 약 1.5 kb의 DNA 단편이 얻어질 것이다. 따라서 No.3, 6, 22의 플라스미드를 HincII에서 소화한 바, 어느 것으로부터이든 약 1.5 kb의 DNA 단편이 얻어졌다. 그러나 그 크기는 각각 약간 달랐다. 이 중에서, 1.5 kb 단편 외에, 3.1 kb의 벡터 단편을 포함한다고 생각되는 3.3 kb 단편과 600 bp의 단편으로 절단된 No.6의 플라스미드를 우선은 시퀀스하는 것으로 하였다. 그러나, 지금까지의 시퀀스나 서던 혼성화의 결과로부터, 반복 서열의 부분이 많고, 현재 하이스루풋의 수법으로서 정착되어 있는 프라이머 워킹법에서는 복수의 부분에 어닐링하여 바르게 시퀀스할 수 없는 것으로 생각되었다. 또한, 컴퓨터에서의 어셈블리에도 지장이 생긴다고 상정되었다. 즉, Tol5-5 kb의 경우에 경험한 곤란이 반복될 우려가 있었다. 따라서 이번에는 프라이머 워킹법이 아니라, 수고와 시간은 들지만 딜리션 뮤턴트(deletion mutants) 시리즈를 제조하는 것으로 하였다. No.6에 삽입된 2.3 kb의 Tol5의 DNA 단편을 전번의 1.5 kb의 중복 단편 측으로부터 순차 삭제한 뮤턴트를 제조하기 위해서 이 플라스미드를 3' 돌출의 SacI와 5' 돌출의 XbaI로 처리한 후, 엑소뉴클레아제Ⅲ으로 소화하였다. 엑소뉴클레아제Ⅲ을 작용시키는 시간을 다르게 한 일련의 시료를 만듦으로써 깎인 길이가 서로 다른 딜리션 산물을 얻었다. 그 후 추가로 Mung Bean Nuclease에 의한 말단 평활화와 Klenow 단편에 의한 말단 수복을 행하고, 마지막으로 블런트 엔드 라이게이션시킴으로써 딜리션 플라스미드 시리즈를 얻었다. 에탄올 침전에 의한 정제 후, 엑소뉴클레아제Ⅲ 소화에 의해서 소멸하고 있을 XbaI로 처리함으로써 미반응된 플라스미드의 영향을 배제하고, 이 DNA로 대장균 DH5α를 형질 전환함으로써 딜리션 뮤턴트 시리즈를 얻었다. 형질 전환체 콜로니를 다수 선택하여 배양하고, 추출한 플라스미드를 제한 효소 HincⅡ로 처리하였다. 시퀀스의 1패스의 크기(800 bp 내지)를 고려하여 적절한 간격으로 딜리션 뮤턴트를 선택하여 각각 시퀀스하였다. 각 시퀀스 결과를 서로 연결하여, 2280 bp의 염기 서열을 결정하였다. 이 서열을 서열 번호 8로 나타낸다(Tol5-No.6). Tol5-No.6은 Tol5-5 kb와 중복하는 약 1.5 kb의 서열을 포함하고 있고, 이것에 의해서 Tol5-5 kb에 계속되는 약 750 bp의 염기 서열을 결정할 수 있었다. 이것에 의해서, 전술한 오토트랜스포터 어드헤신과 낮은 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 ORF는 4707 bp로 연장되고, 그것에 의하여 코딩되는 단백질의 아미노산 서열도 1569 잔기가 되었다. 그러나 그것으로도 ORF는 종결하지 않고, 3' 말단에서 끊어져 있었다. 따라서 Tol5-No.6에 연결되는 하류 영역도 또한 클로닝하지 않으면 안되게 되었다. 또한 Actinobacillus actinomycetemcomitans의 EmaA와 가장 높은 상동성을 나타내었지만, 그래도 아미노산 레벨로 26％로 낮은 상동성이고, 멤브레인 앵커 도메인의 코드 영역에 달하고 있지 않기 때문에, TAA 패밀리에 속하는 단백질이라고는 결론지어지지 않았다. 어떻든 간에, 트랜스포존의 삽입에 의해 파괴된 부착 관련 유전자를 코딩하는 단백질은 매우 거대하고, 더구나 긴 반복 서열이 복잡하게 혼잡하는 신규의 점착 단백질이라고 추정되었다.
Tol5-No.6에 계속되는 하류 영역의 서열 정보를 얻기 위해서 새롭게 분명해진 서열을 기초로 다시 리피트를 피하여 158 bp의 프로브를 Tol5-No.6가 들어간 플라스미드를 주형으로 PCR법에 의해 제조하였다. PCR 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
PCR DIG Probe Synthesis Kit
템플릿 DNA: pUC118::Tol5-No.6
프라이머 F: Tol5-ad-probe5F
프라이머 R: Tol5-ad-probe6R
어닐링: 65℃
신장: 2분
합성한 프로브 영역의 바로 상류에 제한 효소 HindⅢ 사이트가 존재하였기 때문에, Tol5의 염색체 DNA를 HindⅢ로 소화한 후, E.P.를 행하고, 또한 158 bp 프로브에 의해 서던 혼성화를 행하였다. 그 결과, 또 다시 3개의 시그널이 확인되었기 때문에, 모든 시그널 부분을 아가로스겔로부터 잘라내고, DNA를 추출하였다(DEAE 페이퍼). 분자량이 큰 순으로, Tol5-B(2500 bp), Tol5-M(1200 bp), Tol5-S(600 bp)로 하였다. 잘라낸 DNA와 HindⅢ로 처리한 pUC118을 라이게이션하였다. 라이게이션 후의 DNA를 정제하고, 계속해서 트랜스포메이션(전기 천공; 청백 콜로니 선별법)을 행하였다. 콜로니가 형성된 플레이트를 상기 158 bp의 프로브를 이용하여 콜로니 혼성화시켰다. 시그널이 나온 부분의 콜로니를 픽업하고, LB/Amp 액체 배지에서 배양하였다. 플라스미드 DNA 소량 추출을 행하고, 제한 효소 HindⅢ로 처리하여 삽입 단편의 길이를 확인한 바, 2500 bp, 1200 bp, 600 bp의 길이의 Tol5주 DNA 단편의 삽입이 확인되었기 때문에, 이들 플라스미드를 시퀀스하였다. M 단편 및 S 단편은 짧기 때문에, 1 패스시퀀스에 의해, 각각 1185 bp 및 603 bp의 염기 서열을 결정할 수 있었다. 또한, B 단편의 시퀀스를 위해 딜리션 뮤턴트를 제조하였다. B 단편을 포함하는 플라스미드를 3' 돌출의 SacI와 5' 돌출의 XbaI로 처리한 후, 엑소뉴클레아제Ⅲ으로 소화시켰다. 엑소뉴클레아제Ⅲ을 작용시키는 시간을 변경시킨 일련의 시료를 만듦으로써 깎인 길이가 서로 다른 딜리션 산물을 얻었다. 그 후 추가로 Mung Bean Nuclease에 의한 말단 평활화와 Klenow 단편에 의한 말단 수복을 행하고, 마지막으로 블런트 엔드 라이게이션에 처함으로써 딜리션 플라스미드 시리즈를 얻었다. 에탄올 침전에 의한 정제 후, 엑소뉴클레아제Ⅲ 소화에 의해서 소멸하고 있을 XbaI로 처리함으로써 미반응된 플라스미드의 영향을 배제하고, 얻어진 DNA 시료로 대장균 DH5α를 형질 전환함으로써 딜리션 뮤턴트 시리즈를 얻었다. 형질 전환체 콜로니를 다수 선택하여 배양하고, 추출한 플라스미드를 제한 효소 HindⅢ와 EcoRⅠ로 이중 소화하였다. 시퀀스의 1패스의 크기(800 bp 이상)를 고려하여 적절한 간격으로 딜리션 뮤턴트를 선택하여 각각 시퀀스하였다. 각 시퀀스 결과를 서로 연결해서, 2540 bp의 B 단편의 염기 서열을 결정하였다. 결정한 Tol5-B, Tol5-M, Tol5-S의 서열을 서열 번호 9 내지 11에 각각 나타낸다. 이 중 Tol5-M 단편은 Tol5-No.6과 100％ 서열이 일치하는 중복 영역으로서, 533 bp의 염기 서열을 포함하고 있었다. 그러나 동일한 HindⅢ 단편인 Tol5-B, -M, -S의 각 단편은 서로 중복 영역을 포함하고 있지 않고, -M 단편이 Tol5-No.6에 계속되는 것이 추정되었을 뿐이고, 다른 두개의 단편의 위치 관계는 알 수 없었다. 이들 단편은 상호 거의 동일 염기 서열 영역을 포함하고 있고, 158 bp의 프로브 영역도 거기에 위치하고 있었다. 즉 이들 단편도 반복 서열을 형성하는 거대한 단편의 일부라고 추정되었다. Tol5-M 단편의 중복에 의해서 ORF는 5358 bp로 연장되고, 그것에 의하여 코딩되는 단백질의 아미노산 서열도 1785 잔기가 되었다. 그러나 그래도 ORF는 종결하지 않고, 3' 말단에서 끊어져 있었다. 따라서 Tol5-M 단편에 연결되는 하류 영역의 염기 서열도 추가로 명확하게 하지 않으면 안되게 되었다. 가장 높은 상동성을 나타낸 것은 역시 Actinobacillus actinomycetemcomitans의 EmaA인데, 아미노산 레벨에서 25％의 상동성 밖에 나타내지 않고, 아직 멤브레인 앵커 도메인의 코드 영역에 달하고 있지 않기 때문에, 동일 패밀리에 속하는 단백질인지 어떤지는 여전히 명확하게 하지 않은 상태였다.
여기서, 최초에 Tol5-5 kb에 계속되는 하류 영역을 클로닝하려고 하여 서던 혼성화에 의해 얻었지만, Tol5-5 kb에 연결되지 않은 Tol5의 DNA 단편, Tol5-CC, Tol5-C2를 다시 시퀀스하는 것으로 하였다. 함께 반복 서열을 포함하는 것이 상정되기 때문에, 각각 딜리션 뮤턴트를 제조하였다. 플라스미드를 3' 돌출의 SacI와 5' 돌출의 XbaI로 처리한 후, 상술한 것과 동일 절차에 의해 딜리션 뮤턴트 시리즈를 제조하고, 시퀀스를 행하여 서로 연결해서, Tol5-CC와 Tol5-C2의 염기 서열을 결정하였다. 얻어진 Tol5-C2, Tol5-CC의 서열을 서열 번호 12 및 13에 나타내었다.
Tol5-B, M, S 단편 및 Tol5-CC, C2 단편의 서열의 중복 해석에 의해서 위치 관계를 결정하였다. 서열이 100％ 일치하는 곳만을 중복으로 하였다. 158 bp 프로브에 의한 서던 혼성화로 검출된 시그널은 3개인데, 중복 해석 및 Tol5-C2의 해석의 결과로부터, 실제는 4개의 단편이었던 것이 판명되었다. 4개째의 단편은 Tol5-S와 크기 및 서열이 거의 동일하였기 때문에, 약 600 bp의 시그널에 중첩되어 존재하고 있었던 것으로 된다. 그 영역을 Tol5-S'로 하였다. 이상을 정리하면, Tol5-M, Tol5-S', Tol5-S, Tol5-C2, Tol5-B, Tol5-CC 단편의 순으로 중복하면서 배열되는 것이 분명해졌다. 그 결과, ORF는 10798 bp로 연장되고, 그것에 의하여 코딩되는 단백질의 아미노산 서열도 3598 잔기가 되었다. 그러나 그래도 ORF는 종결하지 않고, 3' 말단에서 끊어져 있었다. 따라서 Tol5-CC에 연결되는 하류 영역도 추가로 클로닝하지 않으면 안되게 되었다. 가장 높은 상동성을 나타낸 것은 Burkholderia phymatum의 TAA이었는 데, 아미노산 레벨에서 25％의 상동성 밖에 나타내지 않았다. 멤브레인 앵커 도메인의 서열을 일부 포함하고 있는 것 같았지만, 모두가 포함되어 있는 것은 아니고, 이 부분의 고차 구조의 예측도 불가능하였기 때문에, 이 시점에서도 TAA 패밀리에 속한다고 결론지을 수 없었다. 또한 그 크기도 이미 보고된 TAA에서는 최대였던 Bartonella henselae의 BadA(3036 아미노산)보다도 훨씬 큰 것도 분명해졌다.
지금까지의 시퀀스의 결과, Tol5-CC의 C 말단 영역은 리피트 서열이 인정되지 않았다. 따라서 C 말단 영역에서 507 bp의 프로브를 제조하고, 제한 효소 HindⅢ으로 처리한 Tol5주의 DNA를 주형으로 하여 서던 혼성화를 행하였다. 그 결과, 5 kb의 위치에 시그널이 검출되고, 이 단편을 Tol5-C5kb로 하였다. 이 DNA를 아가로스겔로부터 잘라내어 추출(DEAE 페이퍼)하고, 그것을 HindⅢ로 소화한 pUC118 벡터와 라이게이션하여 트랜스포메이션(전기 천공; 청백 콜로니 선별법)을 행하였다. 백 콜로니를 픽업하고, LB/Amp 액체 배지에서 배양하였다. 액체 배지 중의 균체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 제한 효소 HindⅢ로 처리하여 인서트를 확인하였다. Tol5-C5kb 내에는 리피트 구조가 없다고 추측하고, 프라이머 워킹으로 서열을 결정하였다. 얻어진 Tol5-C5kb의 서열을 서열 번호 14에 나타내었다. Tol5-C5kb는 Tol5-CC의 서열과 중복하고 있어, Tol5-CC에 연결되는 하류 영역인 것이 판명되었다. 그리고 이것이 연결됨으로써 10,893 bp(서열 번호 1)에도 미치는 거대한 ORF가 완결하고, 그것에 의하여 코딩되는 3,630 아미노산(서열 번호 2)으로 이루어지는 거대 단백질이 분명해졌다. 이것이 트랜스포존의 삽입에 의해서 파괴된 부착에 관련한 유전자의 본체이다. 여기까지 나타낸 서열 단편의 위치 관계를 도 1에 나타내었다. 이렇게 해서 점착에 관련한 단백질을 코딩하는 거대한 ORF를 포함하는 Tol5주의 유전자 단편 15011 bp의 염기 서열이 결정되었다.
1-3 부착 관련 유전자의 서열
각종 클로닝주를 시퀀스한 결과 얻어진 서열 단편을 연결할 수 있는 조작은, GENETYX를 이용하여 행하였다. 많은 복잡한 리피트 구조를 갖는 유전자인 것이 판명되었기 때문에, 서열과 서열을 연결할 수 있는 때에는 서열이 100％ 일치하는 경우만을 중복 부분으로 간주하였다. 본 실시예에서의 클로닝과 시퀀스의 결과 얻어진 전체 염기 서열을 도 2 및 서열 번호 15에 나타내었다.
1-4 바이오인포매틱스 해석
염기 서열 중에서 어떤 영역이 단백질을 코딩하고 있는 지를 검색할 필요가 있다. ORF finder 및 GeneMark을 이용하여, 단백질을 코딩하는 영역을 예측하였다. 그 결과, 취득한 유전자 중에 ORF가 4개 존재한다고 추찰되었다. 트랜스포존 이 삽입되어 있던 것은 상술한 거대 ORF이고, 이 ORF가 코딩하는 단백질이 부착 인자라고 할 수 있다. 또한, 5' 말단 및 3' 말단의 ORF는 종지 코돈이 확인되어 있지 않기 때문에, 도중에서 끊어져 있게 된다. 단백질을 코딩하는 경우, 개시 코돈의 상류에는 리보솜 결합 부위 및 프로모터 부위가 존재한다. 이들의 서열은 보존되어 있는 경우가 많기 때문에, 부착 관련 유전자의 거대 ORF에 대해서 프로모터 부위의 존재를 검색하였다. 그 결과, 이들의 존재가 확인되었다. 이하에 그 영역을 나타낸다. 이에 따라, 개시 코돈은 925의 위치가 아니라 949의 위치의 것이 옳다고 예측되었다.
Figure 112010061316800-pct00001
각 ORF에 대해서, NCBI-BLAST를 이용하여 상동성 검색을 행하였다. 그 결과, 부착 관련의 거대 ORF가 코딩하는 거대한 단백질 전체에 걸쳐 상동성을 나타내는 단백질은 존재하지 않았다. 그러나, 부분적으로는, TAA 패밀리에 속하는 단백질과 상동성을 나타내는 영역을 포함하고 있었다.
TAA 패밀리에 속하는 단백질은 시그널 펩티드, 헤드 도메인, 네크 도메인, 스토크 도메인, 멤브레인 앵커 도메인이라는 도메인을 갖고 있다. 따라서, 각 도메인 각각에 대하여 ClustalW를 이용하여 멀티플 얼라인먼트를 작성하고, 서열을 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 멤브레인 앵커에 대해서는, PredictProtein을 이용하여 이차 구조 예측한 결과도 함께 나타내었다. 비교 대상은 TAA 패밀리의 멤버이다. 그 결과, 시그널 펩티드, 헤드 도메인, 네크 도메인으로서는 Aggregatibacter(Actinobacillus) actinomycetemcomitans의 EmaA의 각 도메인과 가장 상동성이 높고, 각각 34％, 44％, 52％의 상동성을 나타내었다. 또한, TAA 패밀리 중에서는 가장 연구가 이루어져서 이 단백질 패밀리의 원형이라고도 할 수가 있는 Yersina enterocolitica의 YadA는, 각각, 11％, 23％, 40％의 상동성을 나타내었다. 멤브레인 앵커에 대해서는 Haemophilus somnus의 오토트랜스포터 어드헤신과 48％의 YadA와 25％의 상동성을 나타내었다. 한편, 2591 아미노산으로 이루어지는 스토크 도메인에 대해서는, 부분적으로는 TAA 패밀리의 멤버와 상동성을 나타내는 것이 BLAST 해석에 의해서 나타내어졌지만 그 상동성은 낮았다. 예를 들면 가장 높은 상동성을 나타낸 것은 Actinobacillus succinogenes의 YadA 모양 단백질인데, 2591 아미노산 중의 800 아미노산의 부분이 이 단백질과 33％의 상동성을 나타낸 것에 불과하다. 이상, 각 도메인으로서는 상동성이 있는 단백질로서 TAA 패밀리의 단백질이 BLAST 해석에 의해서 나타내어졌지만, 이들의 상동성은 높은 레벨이 아니다. 그러나, TAA 패밀리를 가장 특징짓는 것은, 멤브레인 앵커 도메인의 입체 구조이다. TAA는 호모 삼량체이고, 각 폴리펩티드쇄는 1개의 α 헬릭스와 4개의 β 스트랜드를 갖고, 이것이 3개 모여 12β 스트랜드가 되고, 그램 음성 세균의 외막 내에 β 배럴 구조를 형성하여 단백질 분비용의 터널이 된다. 따라서 Tol5의 부착 관련 단백질의 멤브레인 앵커 상당 영역의 아미노산 서열로부터 이차 구조를 예측한 바, 1개의 α 헬릭스와 4개의 β 스트랜드를 갖고 있을 것이 추정되었다. 이것과 각 도메인의 서열 등을 함께 생각하면, Tol5주의 부착 단백질은 TAA 패밀리에 속하는 신규 단백질이라고 추정되고, Acinetobacter속 세균의 어드헤신을 의미하는 AadA라고 명명하였다. AadA 유전자의 염기 서열을 서열 번호 1에, AadA의 아미노산 서열을 도 3 및 서열 번호 2에 나타내었다. AadA는 10,893 bp의 유전자로 코딩되는 3,630 아미노산으로 구성되어 있다. AadA는 이미 보고된 TAA 패밀리의 단백질보다 훨씬 크고, 복수의 긴 반복 구조가 복잡하게 배치되는 스토크 도메인은 다른 단백질과도 상동성이 낮고, 또한 헤드 도메인과 네크 도메인이 아미노 말단측뿐만아니라 멤브레인 앵커 도메인이 있는 카르복시 말단 쪽에도 존재하는 등, 이미 보고된 멤버와 비교하여 특이한 TAA이다. 이 특이성이 Tol5주의 높은 부착성이나 비특이적 부착능을 제공하고 있는지의 여부에 대해서는, 현 시점에서는 모른다. 단지 지금까지 보고되어 있는 TAA는 전부 병원성 세균이 감염할 때에 숙주의 세포나 세포외 매트릭스에 특이적으로 부착되기 위한 것이고, 높은 점착력을 나타내는 것 등의 보고도 없다.
ORF의 상동성 검색의 결과, aadA 유전자의 바로 하류에 다른 Acinetobacter속 세균 등이 갖는 외막 단백질 OmpA와 상동성을 나타내는 단백질의 ORF를 발견하였다. 이것을 Tol5-OmpA라고 명명하였다. Tol5-OmpA의 염기 서열을 서열 번호 3에 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타내었다. Tol5-OmpA는 795 bp의 유전자로 코딩되는 264 아미노산으로 이루어진다. ClustalW를 이용하여 멀티플 얼라인먼트를 작성하고, Tol5-OmpA의 서열과 상동성을 나타낸 외막 단백질의 서열과 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 대장균 E.coli의 OmpA와 비교하면, C 말단 영역에서는 상동성이 높지만 N 말단 영역에서는 상동성이 낮다. 한편, Acinetobacter속 세균이 갖는 외막 단백질과는 전체에 걸쳐서 상동성이 높다. 그러나 이들의 기능에 대한 보고는 없다. 단지, AadA의 ORF와 근접하고 있는 점에서 aadA와 Tol5-ompA는 동일 오페론 상에 있을 가능성이 높다. 또한 외막 단백질이라는 것이기 때문에, Tol5-ompA도 부착이나 점착성의 어펜디지 생산에 관여하고 있을 가능성이 있다.
염기 서열을 결정한 Tol5주의 유전자 단편 15011 bp의 5' 말단에 존재하는 ORF는 Acinetobacter sp. ADP1 등이 갖는 메티오닐-tRNA 포르밀트랜스페라아제와 높은 상동성을 나타내었다. 또한, 3' 말단에 존재하는 ORF는, Acinetobacter sp. ADP1 등이 갖는 디히드록시산디히드라타아제와 높은 상동성을 나타내었다. 어느 의 단백질도 부착에 관련한 기능을 가진다는 보고는 없기 때문에, Acinetobacter sp. Tol5에 있어서도 부착에는 관련이 없다고 추정되었다.
1-5 AadA 유전자 전체 길이의 클로닝
지금까지의 시퀀스가 옳은 것을 확인하기 위해서, 추정 프로모터 부위를 포함하는 aadA 전체 길이를 PCR에 의해 증폭하고 그 길이를 확인하였다. 이용한 프라이머 Tol5-TKD-F 및 Tol5-TKD-R의 영역을 이하에 나타내었다.
Figure 112010061316800-pct00002
PCR의 조건은 하기와 같다.
PCR 조건
폴리머라아제: Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Enzyme
템플릿 DNA: Tol5 genome
프라이머 F: Tol5-TKD-F
프라이머 R: Tol5-TKD-R
어닐링: 55 내지 64.5℃
신장: 11분
PCR의 결과, 지금까지의 클로닝 및 시퀀스로 얻어진 서열 11,145 bp(약 11 kb)에 상당하는 밴드가 얻어지고, 이것을 Tol5-11 kb로 하였다. 계속해서 얻어진 산물을 이용하여 TA 클로닝을 행하였다. 트랜스포메이션은 전기 천공으로 행하고, LB/Km 한천 배지에 스프레딩하였다. 형성된 콜로니를 LB/Km 액체 배지에 배양하고, 배양 후 플라스미드 DNA의 추출을 행하였다. 인서트를 확인하기 위해서 DNA를 제한 효소 EcoRⅠ로 처리하였다. 또한, PCR로 확인하였다. 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
폴리머라아제: Blend Taq
템플릿 DNA: pCR-XL-TOPO::Tol5-11 kb 플라스미드
프라이머 F: pUC118F
프라이머 R: pUC118R
어닐링: 56 내지 68℃
신장: 11분
제한 효소 처리의 결과, 벡터 및 AadA의 이상적인 밴드를 샤프하게 확인할 수 있었다. 또한, PCR의 결과로부터도 AadA의 크기로 밴드를 확인할 수 있었다. 또한, 플라스미드 DNA를 시퀀스한 결과, 삽입한 단편의 양끝의 서열이 먼저 결정한 염기 서열과 완전히 일치하였다. 따라서, 지금까지의 시퀀스의 정밀도를 확인함과 함께, 추정 프로모터 서열을 포함하는 aadA 유전자 약 11 kb의 클로닝에 성공하였다.
또한, 추정 프로모터를 포함하는 aadA 및 Tol5-ompA를 포함한 유전자 약 12,505 bp(약 13 kb)의 클로닝을 시도하였다. PCR로 단편을 증폭하였다. 조건은 하기한 바와 같다.
PCR 조건
폴리머라아제: Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Enzyme
템플릿 DNA: Tol5 genome
프라이머 F: Tol5-TKD-F
프라이머 R: Tol5-ad-op-R3
어닐링: 50 내지 60℃
신장: 14분
이용한 프라이머 Tol5-ad-op-R3의 영역을 이하에 나타내었다.
Figure 112010061316800-pct00003
얻어진 약 13 kb의 단편을 Tol5-13 kb로 하고, 이것을 이용하여 TA 클로닝을 행하였다. 트랜스포메이션은 전기 천공으로 행하고, LB/Km 한천 배지에 스프레딩하였다. 콜로니를 LB/Km 액체 배지에 배양하고, 배양 후 플라스미드 DNA의 추출을 행하였다. 인서트를 확인하기 위해서 DNA를 제한 효소 EcoRⅠ로 처리하였다. 또한, PCR로 확인하였다. 조건을 이하에 나타내었다.
PCR 조건
폴리머라아제: Blend Taq
템플릿 DNA: pCR-XL-TOPO::Tol5-13 kb 플라스미드
프라이머 F: pUC118F
프라이머 R: pUC118R
어닐링: 50 내지 60℃
신장: 14분
제한 효소 처리 및 PCR에서는 이론대로의 길이의 인서트 밴드가 확인되었다. 이 플라스미드 DNA를 시퀀스한 결과, 삽입 단편의 양끝의 서열은 기지의 서열과 완전히 일치하였다. 따라서, 추정 프로모터를 포함하는 aadA 및 Tol5-ompA 포함하는 유전자, 즉 11,858 bp의 aadA-ompA 오페론(서열 번호 5)를 포함하는 약 13 kb의 유전자의 클로닝에 성공하였다. 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열에 있어서는, 1 내지 106 위치가 프로모터/리보솜 결합 부위이고(서열 번호 29), 107 내지 10999 위치가 aadA 유전자이고, 11064 내지 11858 위치가 Tol5-ompA 유전자이다.
실시예 2 Acinetobacter sp . Tol5 주의 부착 관련 유전자를 도입한 대장균의 성상 평가
aadA 유전자 및 aadA-ompA 오페론을 조립한 벡터로 형질 전환한 E.coli DH5α(각각 DH5α::aadA 및 DH5α::aadA-ompA로 명명), 그리고 컨트롤로서 E.coli DH5α 야생주(WT)의 성상을 비교하였다. aadA-ompA 오페론을 조립한 벡터로 형질 전환한 E.coli DH5α는, 「DH5α-XLTOPO::aadA-ompA」로서, 도꾸리쯔 교우세이 호우진 세이힝 효까 기쥬쯔 기반 기꼬우 바이오테크놀러지 혼부 독쿄 비세이부쯔 기타꾸 센터(일본국 치바현 기사라즈시 가즈사가마따리 2-5-8)에 수령번호 NITE ABP-490(수령일 2008년(평성 20년) 2월 19일)로서 수령되어 있다.
2-1 광학현미경에 의한 형태 관찰
aadA 유전자 및 aadA-ompA 오페론을 도입한 것에 의한 형태의 변화를 관찰하기 위해서, DH5α::aadA, DH5α::aadA-ompA, DH5αWT의 3종의 주에 대해서 그램 염색을 실시하고, 광학현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
aadA-ompA 오페론을 도입한 주 DH5α::aadA-ompA에서는, 균체 외에 균체 간을 연결하는 선상의 구조물을 관찰할 수 있었다. EPS(균체 외 중합체)와 같이도 보이는 이 물질은 부착력의 부가에 관계가 있다고 생각된다. aadA를 도입한 주 DH5α::aadA에서는, 균체가 가늘고 길고, 극에서 연결되어 있는 모습이 관찰되었다. 모두 야생주와는 분명히 다른 형태를 하고 있고, 부착 관련 유전자의 도입에 의해서 형태가 변화한 것을 알 수 있었다.
2-2 전자현미경에 의한 형태 관찰
유전자 도입에 의한 형태의 변화를 보다 자세히 관찰하기 위해서 DH5α::aadA, DH5α::aadA-ompA, DH5αWT의 3종의 주에 대해서 주사형 전자현미경 FE-SEM 및 투과형 전자현미경 TEM을 이용하여 형태를 관찰하였다. FE-SEM에 의한 관찰의 결과를 도 7 내지 9에 나타내었다.
DH5α::aadA에서는, 균체가 부착하고 있는 폴리우레탄 담체 표면과, 부착하지 않은 폴리우레탄 담체 표면이 분명히 나뉘어져 있는 모습이 관찰되었다. 즉, 응집체 같은 것을 형성하고 그 응집체 단위에서의 부착이 일어나는 것처럼 관찰되었다. 응집체 내에서는 다량의 EPS 모양 구조물을 생산하고, 다층에 걸쳐 균체끼리가 쌓아 올려져서 부착하고 있는 모습이 관찰되었다. 또한, DH5α::aadA의 균체의 중에는 형상이 가늘고 길게 변화하고 있는 것이 비교적 많이 관찰되었다. 이것은, 광학현미경에 의한 관찰의 결과 얻어진 상과 일치하였다. 확대하여 보면, 가늘고 긴 형상 중에는 마디같은 것을 확인할 수 있고, 균체가 극으로 연속해있는 것 같은 모습이 관찰되었다. 또한, 가늘고 길게 변화한 균체로부터도 어펜디지와 같은 구조물이 관찰되었다(도 7).
DH5α::aadA-ompA는 매우 많은 균체가 폴리우레탄 담체에 부착되어 있는 모습이 관찰되었다. 그 모습은 균체 하나 하나가 담체에 부착하고 있는 것 같고, 담체 표면에 균일하게 단층의 필름을 형성하는 것 같았다. 또한, DH5α::aadA-ompA는 EPS 모양의 구조물을 생산하고 있는 모습도 관찰되었다. 이것은, 광학현미경에서의 관찰과 일치한다. 또한, DH5α::aadA-ompA에는 균체와 담체를 연결하는 어펜디지 같은 것이 많이 관찰되었다(도 8).
2개의 재조합주와 비교하여, E.coli DH5α WT는 폴리우레탄 담체에 부착하고 있는 균체가 거의 없고, 「부착」이라고 하기 보다도 「우연히 올려져 있는」 것처럼 보였다. 또한, 어펜디지와 같은 구조물을 생산하고 있는 균체는 적었다(도 9).
이와 같이, E.coli DH5α에 Acinetobacter sp.Tol5의 aadA 유전자 및 aadA-ompA 오페론을 도입함으로써 그 부착 형태를 변화시키는 것에 성공하였다.
또한, DH5α::aadA-ompA와 DH5α::aadA와의 사이에도 차이가 관찰되었다. DH5α::aadA-ompA는 개개의 균체 세포가 뿔뿔이 담체에 부착하여 균일한 층을 형성 하였지만, 균체끼리 응집하여 다층을 형성하는 경우는 없었다. 그에 비하여 DH5α::aadA는 균체 세포가 거대한 응집체를 형성하여, 담체에 다층으로 되어 부착하고 있었지만, 개개의 세포가 뿔뿔이 담체에 부착하는 모습은 관찰되지 않았다.
2-3 부착 시험 및 응집 시험
aadA 및 aadA-ompA 오페론을 조립한 것에 의한 부착성의 변화를 확인하기 위해서, 크리스탈바이올렛 염색에 의한 부착 시험(CV 부착 시험)을 행하였다. 부착 시험은 다음 시험법에 의해 평가하였다.
<부착 시험>
1. 균체 배양액을 3,400 rpm, 실온, 10분간 원심 분리한다.
2. 데칸트로 배지를 제거하고, 적량의 MATS 테스트용 BS 배지를 가한다.
3. 초음파 처리(UD-200; TOMY)를 OUTPUT=5, TIME=20초로 실시하여 균체를 현탁시키고, OD660이 대략 0.2가 되도록 조정한다.
4. 48웰 마이크로플레이트(IWAKI)의 각 웰에 현탁액을 1 ml씩 첨가하고, 37℃에서 2 시간 인큐베이트한다.
5. 웰 중의 현탁액을 전부 흡입한다. 그 때, 칩의 선단으로 플레이트를 긋지 않도록 주의한다.
6. 1 ml의 MATS 테스트용 BS 배지로 웰을 세정한다. 그 후 플레이트를 풍건한다.
7. 1％ 크리스탈바이올렛을 웰에 가하고, 실온에서 15분간 인큐베이트한다.
8. 1％ 크리스탈바이올렛을 전부 흡입하고, 1 ml의 MATS 테스트용 BS 배지로 웰을 2회 세정한다. 그 후 플레이트를 풍건한다.
9. 1 ml의 MATS 테스트용 BS 배지를 가하고, 초음파 처리를 OUTPUT=4, TIME=20초로 실시하여 염색 균체를 BS 배지 중에 분산시킨다.
10. A590을 측정한다.
M9 배지에서 배양한 균체의 부착 시험의 결과를 이하에 나타내었다.
샘플 A590
13 kb
11 kb
WT		 0.226
0.173
0.081
부착 관련 유전자를 도입한 대장균은 야생주와 비교하여 고체 표면에의 부착력이 향상하였다. 이 결과는 부착 관련 유전자를 도입함으로써 부착 능력이 낮은 균에 부착 능력을 부가하는 것에 성공한 것을 나타내고 있다. 또한, 본 연구에서 취득한 aadA 유전자 및 aadA-ompA 오페론이 미생물의 부착에 관계하고 있는 것을 증명하고 있다.
각 주의 배양액을 관찰하면, 각 주 간에 차이가 나타나고 있었다(도 10). 야생주는 균일하게 백탁하는 데 비하여, DH5α::aadA-ompA, DH5α::aadA는 육안으로 관찰할 수 있는 정도로 약간 응집하여 투명도를 유지하고 있었다.
응집성을 정량적으로 나타내기 위해서 응집 시험을 행하였다. 응집 시험은 다음 시험법에 의해 평가하였다.
<자기 응집 시험>
1. 균체 배양액을 원심 분리시키고, 배양 상청을 제거하였다.
2. 무기염 배지를 균체 펠릿에 가하고, 초음파 처리에 의해 균체 현탁액을 얻었다.
3. 균체 현탁액의 탁도 OD660을 일정하게 되도록 배지로 조정하였다. 이 때의 OD660을 초기 OD660으로 하였다.
4. 유리 원심관 중의 균체 현탁액을 실온에서 정치함으로써, 형성된 세포 자기 응집체를 침강시키고, 상청의 OD660의 시간 변화를 측정하였다.
5. 자기 응집율을 하기의 식에 의해 산출하였다.
Figure 112010061316800-pct00004
그 결과를 도 11에 도시하였다.
그래프에 도시한 바와 같이, DH5αWT와 비교하여 DH5α::aadA는 응집성이 향상하고 있었다. 이 결과는 배양액의 투명도, FE-SEM 관찰의 결과와 일치한다. 이들 결과로부터, aadA 유전자의 도입은 균체 세포에 응집성도 제공하는 것이 증명되었다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.
도꾸리쯔 교우세이 호우진 세이힝 효까 기쥬쯔 기반 기꼬우 독쿄 비세이부쯔 기타꾸 센터 NITEBP00490 20080219
SEQUENCE LISTING <110> National University Corporation Nagoya Institute of Technology <120> Method and Gene Providing or Increasing Nonspecific Adhesive Property and/or Agglomerating Property for Microorganisms <130> PH-3507-PCT <160> 29 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 10893 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. <400> 1 atgaataaaa tctacaaagt gatttggaat gcgactttgt tggcatgggt tgcagtatct 60 gaattggcaa aagggaaaac caaatctacg acatcaaaat ccaaagctaa atcattatct 120 tcatctgtaa tagttggtgg gataatatta acaacacctt tatctttaat agcagctact 180 gttcaagttg gagggggaac taattctgga acaactgcta cagcttctac gaattgtgca 240 gacttatata attatcaaaa tcctgagaac tcaggctctg gagcggctgg gaattataat 300 gcaggaaatc caagtgtgtg ttcgatcgct ataggtgaaa acgcacaagg tggtacttct 360 ggaactggag ggtcgccagg gatagcgata ggtggaaatt ctaaagctac gggtggttta 420 tctgttgcta taggcggata tgctcaagcg acaaatgttg gaagtattgc tttaggcaca 480 gcagctttat caagtggttt taacagttta gcaatatcca gacaagctgc tgcaacgaat 540 aactattcaa tagctatagg tacaacttca gtttcgaaag 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cattaccgtg 5640 aacgatggaa ccaatggcac aaatggttca actgtgattg gtaaagatgg tatttcggtt 5700 aaagatggtt caggtaatac cattgcaggt gtagataaca cagcgttgac agttaaagat 5760 ggcagtggca acacagaaac cagcattaac caagcgatca acacgttaaa tgcagcgcaa 5820 ggtgaaactg ataagtttgc agtgaagtac gacaaaaatg ctgatggcag tgtgaactac 5880 aacaacatca cattggcagg tacgactgca agcagtacac aagatgcaac tacaggcaag 5940 atcaccacaa caggtggaac aagcttgaac aatgttgcaa gtgcgggtga ctacaaagat 6000 gttgccaatg caagcaaagg tgtaaacgca ggtgacttaa acaatgcagt tgttgatgca 6060 accaatgcag caaccagcaa aggctttgca ttacaagcag cagatggcgc taaagttcag 6120 aagaacctag gcgaagcagt tgaagttgtc ggtgccgaca gcaacatcac cacaaaagtt 6180 gcaggcggtc aggttgcaat tgagttaaat aaaaacctca acaacttaac tggcattacc 6240 gtgaacgatg gaaccaatgg caccaatggt tcaactgtga ttggtaaaga tggtatttca 6300 gttaaagacg gttcaggcaa taccattgca ggtgtagata acacagcgtt gacagttaaa 6360 gatggcagtg gcaacacaga aaccagcatt aaccaagcga tcaacacgtt aaatgcagcg 6420 caaggtgaaa ctgataagtt tgcagtgaag tacgacaaaa atgctgatgg 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atagccctgt ttttgtggct ggatatactg atcgtttagg atcatttcag 600 tataaccaac gtttatctgc ccaaagagcg aatacagtcg ttgaactctt gaagcaacaa 660 ggcattcgtg gcgagcaaat tcagtacagt gctgaaaata aaacagatgt gtaccaaaag 720 tgcgcaggga tcaataaaaa gatccaactg gttgaatgtc tagcacctaa ccgtcgtgtg 780 aatatcacgt ggtaa 795 <210> 4 <211> 264 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 4 Met Lys Ala Phe Asn Lys Lys Ile Met Phe Gly Val Phe Ser Gly Leu 1 5 10 15 Val Met Ser Leu Ser His Ala Ala Glu Val Glu Ser Ala Asn Thr Gln 20 25 30 Glu Ile His Phe Pro Glu Ile Lys Asp Ser Tyr Leu Lys Gln Val Asn 35 40 45 Arg Tyr Glu Tyr Asp Asp Val Ala Arg Leu Asp Lys Gly Leu Thr Lys 50 55 60 Asp Gln Ile Arg His Ile Leu Gly Asn Pro Gln Phe Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Phe Ala Val Lys Thr Trp Asn Tyr Val Leu Asp Ile Arg Glu Pro Asn 85 90 95 Ser Asn Gln Tyr Lys Arg Cys Gln Leu Arg Ile Asp Phe Asp Lys Gln 100 105 110 Tyr Arg Ser Asp Asn Leu Tyr Trp Lys Gly Glu Gln Cys Gln Gly Leu 115 120 125 Met Ala Trp Gly Ile Asn Asn Gln Ser Glu Thr Glu Gln Thr 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aagttggagg 300 gggaactaat tctggaacaa ctgctacagc ttctacgaat tgtgcagact tatataatta 360 tcaaaatcct gagaactcag gctctggagc ggctgggaat tataatgcag gaaatccaag 420 tgtgtgttcg atcgctatag gtgaaaacgc acaaggtggt acttctggaa ctggagggtc 480 gccagggata gcgataggtg gaaattctaa agctacgggt ggtttatctg ttgctatagg 540 cggatatgct caagcgacaa atgttggaag tattgcttta ggcacagcag ctttatcaag 600 tggttttaac agtttagcaa tatccagaca agctgctgca acgaataact attcaatagc 660 tataggtaca acttcagttt cgaaaggagt tggatcgatt gctatggggc attcaacgaa 720 tgcttctgga gatcaatcga tagcaattgg tagctcggat gctgttaatt cagcaacagc 780 aacaacaaca tacgatggta caacaaatac tcaagcatca ggtagtaaat cgattgctat 840 aggtgcaagc gcaaaggcat caaccaataa cagcattgca ctaggtgcag gatcggtaac 900 ttctgcacaa tctggtaatt cttatcttac tggtgtaggt gcatcagcta caaatggtgt 960 tgtatctgtt ggaacttcaa ctgcaacacg tcgtatccaa aatgtagcag atggttcagc 1020 cgcttcagat gctgtgacag ttgctcagtt ggataaagct tatgatgata caaatggtcg 1080 tttagctgct gctttaggta caggtagtgg tgctgcctat aatgcagcaa acaatacata 1140 taccgctcca acgaatattg ggggaacagg taaaaatacg attgatgatg caattaaagc 1200 aactcaacga agtgtagtcg ctggatcaaa tattgtcgtt accccgacga cagcttctga 1260 tggttcaata tcgtattcgg ttgctacaag cgcaacaccg acgtttacaa gtataactgt 1320 aaacaatgca ccaacggcag gtacagatgc gaccaacaag acttatgtag actcaaaagc 1380 agcagcatcg agaacagaag tagcagctgg aagcaatgta tctggtgtag taaaaacgac 1440 aggcgcaaac ggtcaagacg tttatacagt aaatgccaat ggtacgactg catcagcagg 1500 ttcttcagca gttaccgtaa caccaggcac gaaagatgca aataatgtca ctgactataa 1560 agtagactta tcagcgacta caaaaaccga tatccaaaaa ggtgtagatg caaaaaatgc 1620 tgtagatacc gcaggtctaa aatttaaagg tgatacagca accacaagca ataccaagaa 1680 attaggtgac accgtttcga ttacgggtga tacgaacatt agtacagttg cgacaacaga 1740 tggtgtacag gttaagttaa atccaaactt ggatttagga gcaactggta gcgttaaaac 1800 gggtaatacc acgattaaca atgcaggtgt aacagctgat caagttacgg ttggtggtgt 1860 tgttattaac aacacatcag gtattaatgc tggtggtaaa gcgattacta atgtagcagc 1920 accaacaaat aacacagatg ctgctaacaa gaagtatgta gatgatgcag gtacagcatt 1980 aaccaatttg ggctttggat taaaagcaca agatggtacg actgtgaaca agaaattagg 2040 tgaagcagtt gatattgttg gttcaaacag caacatcagt acaaaagtaa atgcaggcaa 2100 agtagaagtt gcactatcca atacattgga cttaggtact acaggtagcg ttactacggg 2160 ttcaactgta attaacaata ctggtgttac ggcaactcag gttaccgcaa acaaagtcac 2220 aataaacaat gcaccaacag caggtacaga tgcgaccaac aagacttatg tagactcaaa 2280 agcagcagca tcaagaacag aagtcgcagc tggaagcaat gtatctggtg tagtaaaaac 2340 gacaggcgca aacggtcaag atatttatgc agtaaatgcc aatggtacga ctgcatcagc 2400 aggttcttca gcagttaccg taacaccagg cacgaaagat gcaaataatg tcactgacta 2460 taaagtagac ttgtcagcga ctacaaaaac cgatattcaa aaaggtgtag atgcaaaaaa 2520 tgctgtagat actgcaggtc taaaatttaa aggtgataca gcaaccacaa gcaataccaa 2580 gaaattaggt gacaccgttt cgattacggg tgatacgaac attagtacag ttgcaacaac 2640 tgatggtgta caggttaagt taaatccaaa cttagattta ggagcaactg gtagcgttaa 2700 aacgggtaat accacgatta acaatgcagg tgtaacagct gaccaagtta cggttggtgg 2760 tgttgttatt aacaacacat caggtattaa tgctggtggt aaagcgatta ccaatgtagc 2820 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tggtgttgtt attaacaaca catcaggtat taatgctggt ggtaaagcga ttaccaatgt 3720 agcagcacca acaaataaca cagatgctgc taacaagaag tatgtagatg atgcaggtac 3780 agcattaacc aatttgggct ttggattaaa agcgcaagat ggtacgactg tgaacaagaa 3840 attaggcgaa gcagttgaag ttgttggtgc ggacagtaac atcaccacga aagttgcagg 3900 cggtcaggtt gcaattgagt taaataaaaa cctcaacaac ttaactggca ttaccgtgaa 3960 cgatggaacc aatggcacca atggttcaac tgtgattggt aaagatggta tttcggttaa 4020 agatggttca ggcaatacca ttgcaggtgt agataacaca gcgttgacag ttaaagatgg 4080 cagtggcaac acagaaacca gcattaacca agcgatcaac acgttaaatg cagcgcaagg 4140 tgaaactgat aagtttgcag tgaagtacga caaaaatgct gatggcagtg tgaactacaa 4200 caacatcaca ttggcaggta cgactgcaag cagtacacaa gatgcaacta caggcaagat 4260 caccacaaca ggtggaacaa gcttgaacaa tgttgcaagt gcgggtgact acaaagatgt 4320 tgccaatgca agcaaaggtg taaacgcagg tgacttaaac aatgcagttg ttgatgcaac 4380 caatgcagca accagcaaag gctttgcatt acaagcagca gatggcgcta aagttcagaa 4440 gaacctaggc gaagcagttg aagttgtcgg tgccgacagc aacatcacca caaaagttgc 4500 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tatttcggtt aaagatggtt caggcaatac 360 cattgcaggt gtagataaca cagcgttgac agttaaagat ggcagtggca acacagaaac 420 cagcattaac caagcgatca acacgttaaa tgcagcgcaa ggtgaaactg ataagtttgc 480 agtgaagtac gacaaaaatg ctgatggcag tgcaaactat aacaatgtca ctttagctgg 540 tacaaatggc acaataatca gcaatgttaa agcgggtgct gtgacctcaa catctactga 600 tgcgatcaat ggtagccaat tatatggtgt tgcaaacagc gtgaagaatg caattggtgg 660 ttcaaccaca attgatgcaa cgactggtgc aatcacgacg accaatattg gtggtacagg 720 ttcaaatacg attgatggtg caatcagcag tattaaagat tcagcgacta aagcgaaaac 780 cacggtaagt gctggggata atgttgtcgt tacatcgggt accaatgcag atggctcaac 840 aaactatgaa gttgcgacag cgaaagacgt taactttgac aaagtgactg taggtagtgt 900 tgttgtagat aaatcaagca atacaatcaa aggattaagt aataccactt ggaacggaac 960 agcagtatca ggtcaagcgg cgacagaaga ccagttaaaa acggtcagcg atgcgcaagg 1020 tgaaactgat aagtttgcag tgaagtacga caaaaatgct gatggcagtg cgaactacaa 1080 cagtattact gcaggcaatg gtaacggtac tgcagcaacg atcggaactg acacagcagg 1140 taatagtgtt gtgaccagtg gcggaactaa aattagtaat 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cattaccgtg aacgatggaa ccaatggcac 300 caatggttca actgtgattg gtaaagatgg tatttcagtt aaagacggtt caggcaatac 360 cattgcaggt gtagataaca cagcgttgac agttaaagat ggcagtggca acacagaaac 420 cagcattaac caagcgatca acacgttaaa tgcagcgcaa ggtgaaactg ataagtttgc 480 agtgaagtac gacaaaaata cggatggtag taccaactac aacagtatta ctgcaggcaa 540 tggtaacggt actgcagcaa cgatcggaac tgacacagca ggtaatagtg ttgtgaccag 600 tggcggaact aaaattagta atgttgcgaa tggtgtcaat gcaagtgatg cagtaaacaa 660 aggtcaattg gatagcttaa gtacaggtct taccaataca ggctttggtt taaaagcagc 720 agatggcaac accgttaaca aaaaattagg cgaagcagta gacgttgtcg gtgctgacag 780 caacatcacc acgaaagttg caggcggtca ggttgcgatt gagttaaata aaaacctcaa 840 caacttaact ggcattaccg tgaacgatgg aaccaatggc accaatggtt caactgtgat 900 tggtaaagat ggtatttcga ttaaagatgg ttcaggcaat accattgcag gtgtagataa 960 cacagcgttg acagttaaag atggcagtgg caacacagaa accagcatta accaagcgat 1020 caacacgtta aatgcagcgc aaggtgaaac tgacaagttt gcagtgaagt acgacaagaa 1080 tgctgatggc agtgcaaact acaacaacat cacattggca 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cagaaaccag cattaaccaa gcgatcaaca cgttaaatgc agcgcaaggt 7980 gaaactgata agtttgcagt gaagtacgac aaaaatgctg atggcagtgc aaactataac 8040 aatgtcactt tagctggtac aaatggcaca ataatcagca atgttaaagc gggtgctgtg 8100 acctcaacat ctactgatgc gatcaatggt agccaattat atggtgttgc aaacagcgtg 8160 aagaatgcaa ttggtggttc aaccacaatt gatgcaacga ctggtgcaat cacgacgacc 8220 aatattggtg gtacaggttc aaatacgatt gatggtgcaa tcagcagtat taaagattca 8280 gcgactaaag cgaaaaccac ggtaagtgct ggggataatg ttgtcgttac atcgggtacc 8340 aatgcagatg gctcaacaaa ctatgaagtt gcgacagcga aagacgttaa ctttgacaaa 8400 gtgactgtag gtagtgttgt tgtagataaa tcaagcaata caatcaaagg attaagtaat 8460 accacttgga acggaacagc agtatcaggt caagcggcga cagaagacca gttaaaaacg 8520 gtcagcgatg cgcaaggtga aactgataag tttgcagtga agtacgacaa aaatgctgat 8580 ggcagtgcga actacaacag tattactgca ggcaatggta acggtactgc agcaacgatc 8640 ggaactgaca cagcaggtaa tagtgttgtg accagtggcg gaactaaaat tagtaatgtt 8700 gcgaatggtg tcaatgcaag tgatgcagta aacaaaggtc aattggatag cttaagtaca 8760 ggtcttacca 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gtgaacgttg cacagttaaa agcggtgggt aaccaagttg taacgactca aactacattg 10500 gtgaacagtt tgggtggtaa cgctaaagta aatgcagacg gtacgattac aggaccaact 10560 tataatgttg ctcaaggtaa tcagaccaat gttggtgatg cattaactgc gcttgataac 10620 gcaattaata ctgcggcaac aacatctaaa tcgactgttt ctaatggtca gaatattgtt 10680 gtcagcaaga gcaaaaatgc agatggttca gacaactatg aagtatcaac agcaaaagac 10740 ttgacagttg attctgtcaa agcgggtgat acggttctga ataatgcagg tattacaatt 10800 ggcaataacg cagttgtatt gaacaacact ggattaacca ttagtggtgg accaagtgtt 10860 accttggcag gcatcgatgc aggcaataaa accattcaaa atgttgcgaa tgcagtaaat 10920 gcaacagatg cagtcaacaa agggcaattg gacagcgcaa ttaacaatgt gaataacaat 10980 gtaaatgagc ttgccaacaa cgctgttaaa tatgacgatg catcaaaaga taagatcaca 11040 cttggtggtg gggcaactgg tacaacaatc accaatgtga aagatggtac tgttgcgcaa 11100 ggttctaaag atgctgtgaa tggcggtcaa ttgtggaatg ttcaacaaca agttgatcag 11160 aacacaactg atattagcaa tatcaaaaat gatattaaca acggtactgt tggtttggtt 11220 caacaagcag gtaaagatgc accagtgacg gttgcaaaag atactggcgg tacaacggtg 11280 aatgtcgctg gaacagatgg caaccgagta gtgacaggtg ttaaggaagg tgcagtgaat 11340 gcaacatcta aagatgctgt caatggtagt caattgaata caaccaacca agcggtagtc 11400 aattatcttg gtggtggggc aggttatgac aacattacag gtagcttcac agcgccaagt 11460 tatacggtag gtgactcgaa atacaacaat gttggtggcg caattgatgc attgaatcaa 11520 gcagatcaag cattgaatag caaaattgac aatgtcagta acaagttgga taacgcattc 11580 cgtattacca acaaccgtat tgatgatgta gagaaaaaag ccaatgctgg tattgccgct 11640 gcgatggctc tggaatcagc accatatgtc ccaggtaaat atacctatgc agcaggcgca 11700 gcttaccacg gtggtgaaaa tgcggtaggt gtgactttac gtaaaactgc agacaatggt 11760 cgttggtcga ttacaggcgg tgtagctgca gcgtctcaag gcgatgcaag tgttcgtatc 11820 ggtatcagcg gtgtgattga ctaattcact cgacagggaa gatcttcggg tcttcctttt 11880 tcttcgaaaa ttttttaaga gagaaaaaat gaaagcattt aacaaaaaaa ttatgtttgg 11940 tgtattcagc ggtcttgtga tgtcattgag ccatgctgct gaagtcgaaa gtgcaaatac 12000 gcaagaaatc cattttcctg aaatcaaaga cagctattta aaacaagtga accgttatga 12060 atatgacgat gtcgcacgtt tagacaaggg attaaccaaa gatcagattc gccatatttt 12120 gggaaatcct caattctctg aaggtctttt tgcggttaag acatggaatt atgtattgga 12180 tattcgtgag cctaactcaa accaatataa gcgttgccaa ttacgcatag attttgataa 12240 gcaataccgt tcagacaatc tatattggaa aggtgaacaa tgccaaggct taatggcttg 12300 ggggattaat aatcagtctg agactgagca aacgactcta gcacctggtg ggcagtctgc 12360 aagtgttttg ttttattttg atcatgcgga taaaaatggt gtaaagaacg ctgaagtgat 12420 tcgtaaaatc gcagatcaga ttaaacaatc tgatgcgaat agccctgttt ttgtggctgg 12480 atatactgat cgtttaggat catttcagta taaccaacgt ttatctgccc aaagagcgaa 12540 tacagtcgtt gaactcttga agcaacaagg cattcgtggc gagcaaattc agtacagtgc 12600 tgaaaataaa acagatgtgt accaaaagtg cgcagggatc aataaaaaga tccaactggt 12660 tgaatgtcta gcacctaacc gtcgtgtgaa tatcacgtgg taagtcttat ttattcaatc 12720 taattttgga taatccaaac aaaaaacgat atgtgttcca cattatcgtt ttttgttttt 12780 tgagcaggtg ttgattaaaa aatcaaggag ctgatgagat tgcaaaaatt tccaattaat 12840 ttaaaacaat aaagtacgca aatgatgaaa aaacagttgt gttaatgatt ggcttggggt 12900 ttacctttct ggcacaagca tttgataaaa aagtaatgat atttcgatta tcaatatttg 12960 agcttctatg aatagagatc ttttataaaa ttaaatttag tgattattgt taaatgataa 13020 atattattta ttaaaaaata aaaaattatt catagaagtt ttgtgtctaa tctggcgtgt 13080 tagcgttata ttaaatatca atattcattt atctctaaac cctgttgaaa tataagtaaa 13140 cacgtcttgt ttaaaaaaag atcatactca aggtcattgg ttctacgtta acttatagta 13200 tgatgtgtac atatttcgac tgatttattg ctatatcagt tttatttagc cagagtgaat 13260 ctgattcatt tcaagctcaa acaatgtngg aaatacaaat gccngactat cgttcaaaaa 13320 catcgacaca tggaagaaat atggctggtg cacgtggctt atggcgtgca acaggaatga 13380 aagatgaaga tttcggtaag ccgattattg cggtagtcaa ctcatttacc cagtttgtgc 13440 ctggtcatgt ccaccttaaa gatttaggtc aactggttgc ggaacaaatc caagcagctg 13500 gtggtgtggc aaaagaattt aataccattg ccgtggatga tggtatcgca atggggcatg 13560 atggcatgct gtattcattg ccttcacgtg atttgattgc agactctgtc gaatatatgg 13620 tcaatgcaca ctgcgcagat gccatggtgt gtatttcaaa ctgtgacaaa attaccccag 13680 ggatgttaat ggcagcgatg cgcttaaaca ttccagtggt gtttgtgtcg ggtggaccaa 13740 tggaagcggg taaagttaaa atccgtggta cagaacgtgc aattgactta gttgatgcga 13800 tggtggttgc agccgatgat aattttacag atgaagaagt aaaagaatac gagcgttcag 13860 catgcccaac atgtggttca tgttcaggta tgttcacagc aaattcgatg aactgtttga 13920 cagaagcatt ggggttgtcg ttaccaggaa atggttcaac attagcaacg catgctaacc 13980 gtaagaaact attcgaaaaa gcaggtcaat tggttgttga attggcaaaa cgccattatg 14040 aacaagatga ttacacggta ttaccacgtt cgatcgcaac caaagcatct tatgaaaatg 14100 ccatgacgct cgatattgcg atgggtggtt caaccaatac cgtattgcat ttattggctg 14160 ctnccagtga agcaggtgtt gactttacca tggatgacat tgatcgttta tcgcgtaaag 14220 tgcctgtatt atgtaaagtt gctcctgcaa agcaggatgt gcatatggaa gatgtgcatc 14280 gtgccggtgg catcatgtcc attctcggtg aattggatcg tgcaggttta ttagatacat 14340 cggtacacac tgtgcatgag cacaccttaa aagatgcatt ggataaatgg gatattattc 14400 gtacagaaga cccagtggta tatgagttct tccgctcagc gccaggtggt gttccaactc 14460 aaacagcatt ctcacaaaat cgctattacc agactttgga tggcaatcgt gaaacaggtg 14520 tgattcgtaa tgctgaacat gctttctcta aagatggtgg cttggcagta ttgtatggca 14580 acattgctgt agatgggtgt attgttaaaa cagcaggtgt tgatgattca attttaaaat 14640 ttaatggaac tgcacgagta tttgaaagcc aagatgctgc agtagattca attttaggac 14700 atgaaattaa ggctggtgat gtggttgtga tccgttatga aggaccacgt ggtggaccgg 14760 gtatgcagga aatgctttat ccgaccagtt atttaaaatc aaaaggctta ggtaaagaat 14820 gtgctttact gacagatgga cgtttctctg gaggttcttc tggcctttca attggtcatg 14880 tatcacctga agctgctgaa ggtggtgtga ttggattggt tgaagatggt gatttgattg 14940 aaattgatat tccaaatcgt accatcaatc ttgctgtgga tgaggcgacc ttagctgctc 15000 gacgtaagct t 15011 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 16 gtcgactaaa cgaccatttg tatcatcata agc 33 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 17 taaacgacca tttgtatcat cataagc 27 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 18 gtcgacggta caggtagtgg tgctgccta 29 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 19 ggtacaggta gtggtgctgc cta 23 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 20 aatttcaaaa aaattaaacc aattgg 26 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 21 gttaaatgct ttcatttttt ctctc 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 22 cacgaaagtt gcaggcggtc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 23 acaatgttgc aagtgcgggt g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 24 tgcaatggta ttgcctgaac c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 25 gttcttctga actttagcgc ca 22 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 26 tgtttgagct tgaaatgaat caga 24 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 27 caggaaacag ctatgaccat ga 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. <400> 28 gttttcccag tcacgacgtt g 21 <210> 29 <211> 106 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. <400> 29 ttgctttaat tgtatgtaaa ttgttaaata aaaaaaattg tacattttat atgcattgct 60 aaagcagaac ctactgccca aaatgcatct cctaaggaaa agcgat 106

Claims (16)

  1. 표적 미생물에 대하여 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성을 부여 또는 증강시키는 방법으로,
    아시네토박터(Acinetobacter)속 세균 유래의 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA를, 상기 표적 미생물에 도입하는 것을 포함하며,
    오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA가 이하의 (a)의 DNA인 방법:
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA이며, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 표적 미생물이 에세리키아(Escherichia)속 세균인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 에세리키아(Escherichia)속 세균이 대장균인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA와 함께, 이하의 (a)의 DNA를 도입하는 방법:
    (a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA이며, 오토트랜스포터 어드헤신을 코딩하는 DNA와 함께 도입함으로써 숙주 미생물에 대하여 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 외막 단백질을 코딩하는 DNA.
  5. 제4항에 있어서, 이하의 (a)의 DNA를 표적 미생물에 도입하는 방법:
    (a) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA이며, 숙주 미생물에 대하여 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 DNA.
  6. 제1항에 기재된 방법에 의해서 얻어지는, 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성이 부여 또는 증강된 미생물.
  7. 이하의 (a)의 DNA:
    (a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA이며, 미생물에 대하여 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
  8. 제7항에 기재된 DNA가 도입된, 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성이 부여 또는 증강된 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 에세리키아(Escherichia)속 세균인 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 대장균인 미생물.
  11. 이하의 (a)의 단백질:
    (a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이며, 미생물에 비특이적 부착성 또는 응집성 또는 이들 둘다의 특성을 부여 또는 증강하는 활성을 갖는 단백질.
  12. 제6항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 미생물을 담체에 부착시키거나, 응집시키거나, 또는 부착과 응집을 둘다 시킴으로써 상기 미생물을 회수하는 것을 포함하는 미생물의 배양 방법.
  13. 제6항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 미생물을 이용한 화학품의 생산방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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