JP6233765B2 - キメラ被毛微生物 - Google Patents
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Description
以下の発明は、主として上記の成果に基づく。
[1]アシネトバクター属微生物の三量体オートトランスポーターアドヘシンのシグナルペプチドからパッセンジャードメインまでをコードするDNAと、大腸菌の三量体オートトランスポーターアドヘシンのメンブレンアンカードメインをコードする領域を含むDNAとを、アシネトバクター属微生物由来パッセンジャードメインのカルボキシ末端側近傍コイルドコイルをコードする領域内と大腸菌由来メンブレンアンカーからその上流にまたがるコイルドコイルをコードする領域内で連結した構造を有するキメラDNAを、標的大腸菌に導入するステップを含む、標的大腸菌に対して非特異的付着性を付与又は増強する方法。
[2]アシネトバクター属微生物の三量体オートトランスポーターアドヘシンが、アシネトバクターsp. Tol5株のAtaAである、[1]に記載の方法。
[3]前記シグナルペプチドからパッセンジャードメインまでをコードするDNAが、以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAである、[2]に記載の方法:
(a)配列番号6で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号6で表される塩基配列からなるDNAと70%以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号6で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
[4]前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAが、以下の(A)〜(C)のいずれかのDNAである、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法:
(A)配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、
(B)配列番号7で表される塩基配列からなるDNAと70%以上の相同性を有する塩基配列からなり、外膜でベータバレルを形成し、パッセンジャードメインを分泌する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(C)配列番号7で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、外膜でベータバレルを形成し、パッセンジャードメインを分泌する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
[5]前記メンブレンアンカードメインをコードする領域を含むDNAが、以下の(A)〜(C)のいずれかのDNAである、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の方法:
(A)メンブレンアンカー上流のコイルドコイルをコードする領域である配列番号8で表される塩基配列またはその部分配列が、前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAの5’側にリンカーとしてつながっているDNA、
(B)配列番号8で表される塩基配列からなるDNAと70%以上の相同性を有する塩基配列からなり、リンカーとして三量体オートトランスポーターアドヘシンのパッセンジャードメインとメンブレンアンカードメインを微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を保持しながらつなぐことができるペプチドをコードする塩基配列が、前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAの5’側にリンカーとしてつながっているDNA、
(C)配列番号8で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リンカーとして三量体オートトランスポーターアドヘシンのパッセンジャードメインとメンブレンアンカードメインを微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を保持しながらつなぐことができるペプチドをコードする塩基配列が、前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAの5’側にリンカーとしてつながっているDNA。
[6]前記キメラDNAが、以下の(A)〜(C)のいずれかのDNAである、[1]に記載の方法:
(A)配列番号9で表される塩基配列からなるDNA、
(B)配列番号9で表される塩基配列からなるDNAと70%以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号9で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
[7]前記キメラDNAが、メンブレンアンカードメインをコードする領域の下流に以下の(i)〜(iii)のいずれかのDNAも含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法:
(i)配列番号3で表される塩基配列からなるDNA、
(ii)配列番号3で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA、
(iii)配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
[8]前記標的大腸菌が、三量体オートトランスポーターアドヘシン欠損株である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9][1]〜[8]のいずれかの方法によって得られた、非特異的付着性が付与又は増強された大腸菌。
(1)AtaAのパッセンジャードメインとEib(大腸菌TAA)のメンブレンアンカー(トランスロケータードメイン)とのキメラ蛋白質の作製(図2)
オーバーラップPCR法を組み合わせることによりAtaAオペロン(ataA-omlT)上のataA遺伝子の膜アンカードメインのコード領域を、大腸菌ECOR9株由来のTAAであるEibAの膜アンカードメインのコード領域と置換した。最初のPCRはpARP3::ataAおよびECOR9染色体DNAを鋳型とし、図2中に示したプライマーセット((i)(ii)及び(iii)(iv))を用いて目的遺伝子領域を増幅した。次のPCRでは、最初のPCRで増幅した断片とプライマーセット(iii)(ii)を用いることでataA-eib断片を増幅した。また、pARP3::ataA-omlTを鋳型とした別のPCRでataA-eib断片とオーバーラップPCRするためのomlT遺伝子断片をプライマーセット(v)(vi)を用いて増幅した。最後のPCRではataA-eib断片とomlT断片およびプライマーセット(iii)(vi)を用いることで、ataA-eib-omlT断片を増幅した。増幅断片をpETベクターにいったんクローニングし、pET::ataA-eib-omlTを作製した。その後、pARP3ベクターに移し替えpAtaA-eib-omlT(配列番号10の配列からなるAtaA-eib-omlT遺伝子を保持する)を得た。さらにPCRによりomlT(配列番号3の配列からなり、配列番号4のアミノ酸配列をコードする)を除きpAtaA-eibを得た。尚、pAtaA-eibが保持するataA-eibA遺伝子の配列を配列番号9に、それがコードするアミノ酸配列を配列番号11にそれぞれ示す。
連結部位は、シグナル−パッセンジャー側は、パッセンジャードメインのコイルドコイルをコードする領域(ataA遺伝子の10534位〜10671位)内(境界を含む)、メンブレンアンカー側はその上流からメンブレンアンカーの始まりの部分にかけてまたがるコイルドコイルをコードする領域(eibA遺伝子の834位〜960位)内で、それぞれ領域内で切断しコイルドコイル同士を連結した。具体的にはataA遺伝子を10534位の前で切断し、またeibA遺伝子を915位の後ろで切断し連結した。
pARP3上にクローニングされたキメラ遺伝子により、大腸菌DH10B株、JM109株、及びBL21株を形質転換した。
フローサイトメトリー又は共焦点レーザー顕微鏡解析により、キメラAtaAファイバーが大腸菌の細胞表面に提示されていることを確認した(図5〜6)。AtaAファイバーを発現させた場合(pAtaA)よりも、キメラAtaAを発現させた場合(AtaA-eib)の方が格段に高い付着性を示した(図4)。キメラAtaA遺伝子の導入は、宿主として用いる大腸菌株によってその効果は異なるものの(図5、6)、大腸菌に付着性を付与する手段として有効であることが確認された。
配列番号9:人工配列の説明:ataA-eibA
配列番号10:人工配列の説明:AtaA-eib-omlT
配列番号11:人工配列の説明:ataA-eibA
配列番号20:人工配列の説明:断片配列
Claims (6)
- アシネトバクター属微生物の三量体オートトランスポーターアドヘシンのシグナルペプチドからパッセンジャードメインまでをコードするDNAと、大腸菌の三量体オートトランスポーターアドヘシンのメンブレンアンカードメインをコードする領域を含むDNAとを、アシネトバクター属微生物由来パッセンジャードメインのカルボキシ末端側近傍コイルドコイルをコードする領域内と大腸菌由来メンブレンアンカーからその上流にまたがるコイルドコイルをコードする領域内で連結した構造を有するキメラDNAを、標的大腸菌に導入するステップを含む、標的大腸菌に対して非特異的付着性を付与又は増強する方法であって、
アシネトバクター属微生物の三量体オートトランスポーターアドヘシンが、アシネトバクターsp. Tol5株のAtaAであり、
前記シグナルペプチドからパッセンジャードメインまでをコードするDNAが、以下の(a)〜(c)、即ち、
(a)配列番号6で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号6で表される塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号6で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、のいずれかのDNAであり、
前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAが、以下の(A)〜(C)、即ち、
(A)配列番号7で表される塩基配列からなるDNA、
(B)配列番号7で表される塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、外膜でベータバレルを形成し、パッセンジャードメインを分泌する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(C)配列番号7で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、外膜でベータバレルを形成し、パッセンジャードメインを分泌する活性を有する蛋白質をコードするDNA、のいずれかのDNAである、方法。 - 前記メンブレンアンカードメインをコードする領域を含むDNAが、以下の(A)〜(C)のいずれかのDNAである、請求項1に記載の方法:
(A)メンブレンアンカー上流のコイルドコイルをコードする領域である配列番号8で表される塩基配列またはその部分配列(但し、メンブレンアンカー上流のコイルドコイルをコードするもの)が、前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAの5’側にリンカーとしてつながっているDNA、
(B)配列番号8で表される塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、リンカーとして三量体オートトランスポーターアドヘシンのパッセンジャードメインとメンブレンアンカードメインを微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を保持しながらつなぐことができるペプチドをコードする塩基配列が、前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAの5’側にリンカーとしてつながっているDNA、
(C)配列番号8で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リンカーとして三量体オートトランスポーターアドヘシンのパッセンジャードメインとメンブレンアンカードメインを微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を保持しながらつなぐことができるペプチドをコードする塩基配列が、前記メンブレンアンカードメインをコードするDNAの5’側にリンカーとしてつながっているDNA。 - 前記キメラDNAが、以下の(A)〜(C)のいずれかのDNAである、請求項1に記載の方法:
(A)配列番号9で表される塩基配列からなるDNA、
(B)配列番号9で表される塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号9で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA。 - 前記キメラDNAが、メンブレンアンカードメインをコードする領域の下流に以下の(i)〜(iii)のいずれかのDNAも含む、請求項1又は2に記載の方法:
(i)配列番号3で表される塩基配列からなるDNA、
(ii)配列番号3で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA、
(iii)配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - 前記標的大腸菌が、三量体オートトランスポーターアドヘシン欠損株である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかの方法によって得られた、非特異的付着性が付与又は増強された大腸菌。
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