CN102037126A - 赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法和基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供赋予或增强不具有或具有弱的非特异黏附性或凝集性的微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法。本发明涉及赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法，该方法包括：将编码自转运黏附素的DNA导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。

Description

赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法和基因

技术领域

本发明涉及赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法、用于该方法的DNA、由该DNA编码的蛋白、通过该方法得到的微生物、以及该微生物的培养方法。

背景技术

微生物具有基于优异的催化作用的物质转化能力。因此，在酿造或发酵食品的生产、废水或废气处理等领域被广泛使用。最近，人们在实施或研究利用基因重组微生物进行的药品生产、生物乙醇的发酵生产、以及利用微生物的化学品合成，微生物应用技术成为重要的产业技术。但是，在生产反应中发挥重要作用的微生物细胞时，消耗培养基及能量等成本。另外，微生物反应往往在水溶液中进行，生产物质后必需从反应液中分离微生物。作为分离方法，以往离心或过滤是主要方法。

为了使分离容易进行、以及连续或反复利用贵重的微生物细胞，人们认为微生物细胞的固定化或自身凝集是有效的。作为现有的固定化技术，有利用褐藻酸等凝胶的包埋固定法和使微生物细胞吸附在多孔质载体表面的表面固定法。但是，包埋固定法存在以下缺点：向凝胶内部输送氧或基质往往是限速性的；凝胶的机械强度弱，通过搅拌等容易被破坏；微生物细胞从凝胶内部漏出等。此外，现有的表面固定法并不是使目标微生物聚积在表面的方法，只不过是将多孔质载体等投入存在大量多种微生物的废水处理或环境净化的现场，使容易黏附的微生物以生物膜的形式担载在表面。即，并不存在使目标微生物自由黏附在固体表面的技术。另一方面，至于凝集，利用高分子聚合物等凝集沉淀剂的方法在废水处理中广泛应用，此外本来还采用将凝集性的微生物筛选后使用的方法，但并不存在使非凝集性的微生物细胞、特别是细菌自发凝集的技术。

发明内容

本发明的目的在于：提供赋予或增强不具有或具有弱的非特异黏附性或凝集性的微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法。

本发明人等成功地从具有非特异黏附性的微生物中分离出黏附相关基因，发现该基因是自转运黏附素基因，以及通过将该基因导入靶微生物中，可以赋予或增强该微生物非特异黏附性和/或凝集性，从而完成了本发明。

即，本发明包含以下发明。

(1)赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法，该方法包括：

将编码自转运黏附素的DNA导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。

(2)(1)所述的方法，其中，具有非特异黏附性的微生物为不动杆菌属(Acinetobacter)细菌。

(3)(1)或(2)所述的方法，其中，编码自转运黏附素的DNA为以下

(a)、(b)或(c)的DNA：

(a)包含SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA；

(c)包含SEQ ID NO：1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。

(4)(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，靶微生物为埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

(5)(4)所述的方法，其中，埃希氏菌属(Escherichia)细菌为大肠杆菌。

(6)(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，将编码自转运黏附素的DNA和以下(a)或(b)的DNA同时导入：

(a)包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA。

(7)(6)所述的方法，其中，将以下(a)或(b)的DNA导入靶微生物中：

(a)包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列、且具有赋予或增强宿主微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的DNA。

(8)赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物是通过(1)～(7)中任一项所述的方法得到的。

(9)以下(a)、(b)或(c)的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA；

(c)包含SEQ ID NO：1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。

(10)赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物中导入有(9)所述的DNA。

(11)(10)所述的微生物，该微生物为埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

(12)(11)所述的微生物，该微生物为大肠杆菌。

(13)以下(a)、(b)或(c)的蛋白：

(a)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得到的氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白；

(c)包含SEQ ID NO：2所示的一部分氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白。

(14)微生物的培养方法，该方法包括：

通过使(8)、(10)、(11)或(12)所述的微生物黏附在载体上和/或凝集来回收该微生物。

根据本发明，可以赋予或增强不具有或具有弱的非特异黏附性或凝集性的微生物非特异黏附性和/或凝集性。由此，在微生物反应中，微生物的分离变得容易，可以高效回收贵重的微生物细胞并连续或反复利用。

附图说明

图1显示实施例1得到的序列片段的位置关系。

图2显示实施例1中的克隆和测序的结果得到的全核苷酸序列。

图3显示AadA的氨基酸序列。

图4显示使用ClustalW制作自转运黏附素的信号肽、头域、颈域、膜锚定区的各结构域的序列多重对比，并比较序列的结果。

图5显示比较Tol5-OmpA的序列和与其显示出同源性的外膜蛋白的序列的结果。

图6显示在光学显微镜下观察通过插入aadA基因和aadA-ompA操纵子引起的形态变化的结果。

图7显示黏附在聚氨酯表面的DH5α::aadA的电子显微镜照片。

图8显示黏附在聚氨酯表面的DH5α::aadA-ompA的电子显微镜照片。

图9显示存在于聚氨酯表面上的DH5α(WT)的电子显微镜照片。

图10显示DH5α::aadA-ompA、DH5α::aadA和DH5αWT的培养液的照片。

图11显示DH5α::aadA和DH5αWT的自身凝集试验的结果。

图12显示汇总实施例1中使用的引物的表。

具体实施方式

本发明的方法，其特征在于：将编码自转运黏附素的DNA(自转运黏附素基因)导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。

在病原性微生物等中，存在黏附于特定的生物表面(例如特定的细胞、生物或其组织的表面)而形成菌落的微生物，但本发明中的具有非特异黏附性的微生物，是指具有黏附于并不限于特定的生物表面、还包括载体等非生物表面的、任意的生物表面和非生物表面的能力的微生物。具有非特异黏附性的微生物能够黏附在例如玻璃、塑料和金属等载体上。

具有非特异黏附性的微生物的例子有：革兰氏阴性细菌、例如不动杆菌属(Acinetobacter)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、埃希氏菌属(Escherichia)细菌、柄杆菌属(Caulobacter)细菌、黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌、嗜血杆菌属(Haemophilus)细菌、耶尔森氏菌属(Yersinia)细菌、巴尔通氏体属(Bartonella)细菌、奈瑟氏菌属(Neisseria)细菌、放线杆菌属(Actinobacillus)细菌等。在本发明中，特别优选不动杆菌属(Acinetobacter)细菌。

具有非特异黏附性的微生物的具体例子有：不动杆菌属(Acinetobacter sp.)Tol5株。该菌株具有分解从废气处理反应器中分离的甲苯的能力，其以保藏号FERM P-17188保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)。

微生物的非特异黏附性可以使用结晶紫染色的黏附试验(CV黏附试验)来评价。具体而言，将菌体培养液离心，除去培养上清，向菌体团块中加入无机盐培养基，通过超声波处理得到菌体悬浮液，用培养基进行调整，使菌体悬浮液的浊度OD₆₆₀恒定(0.5以下)，之后向48孔塑料制板的各孔中分别添加1ml悬浮液，在微生物的最适温度下培养2小时，使用移液管完全除去孔中的悬浮液，用1ml无机盐培养基清洗孔，之后风干，向孔中加入1％的结晶紫水溶液，在室温下培养15分钟，使用移液管除去结晶紫，再用1ml无机盐培养基清洗孔2次，之后风干，加入1ml无机盐培养基，剥离黏附于孔内壁上的染色菌体，通过超声波处理使之分散，测定吸光度A₅₉₀。于是，可以评价吸光度A₅₉₀为0.15以上、优选0.18以上、更优选0.2以上的微生物是具有非特异黏附性的微生物。

自转运黏附素是指作为革兰氏阴性细菌所具有的粘着性纳米纤维报道的蛋白，已知其与宿主的组织或细胞表层分子、细胞外基质发生特异性相互作用，但未见其非特异性地粘着在各种固体表面的报道。据说自转运黏附素具有黏附、浸入、细胞毒性、血清抗性、细胞间传播的功能。自转运黏附素具有N末端信号肽、内部过客结构域、C末端易位子结构域这些共通的区编成。其中，C末端易位子结构域是定义该属的结构域。自转运黏附素的分泌由信号肽介导开始，通过Sec系统穿过内膜而分泌。接着，将易位子结构域插入外膜中，形成β桶状结构。最终，过客结构域通过外膜，出现在菌体表面。自转运黏附素分为：单体自转运黏附素和三聚体自转运黏附素(Shane E.Cotter，Neeraj K.Surana和Joseph W.St GemeIII 2005.Trimericautotransporters：a distinct subfamily of Autotransporter proteins.TRENDS in Microbiology.13：199-205)。认为单体自转运黏附素的易位子结构域由1个亚单元形成β桶状结构，该β桶状结构是包含14个跨膜逆平行β-折叠和跨膜α-螺旋的亲水性路径。但是，已知三聚体自转运黏附素的易位子结构域在外膜中形成对热稳定且耐SDS的三聚体，具有4个β-折叠的亚单元发生寡聚化，由三个亚单元形成12条链的β桶状结构。另外，大多通用自转运黏附素具有分子内陪伴区，但三聚体自转运黏附素亚家族中不存在分子内陪伴区。并且，事实上所有单体自转运黏附素的过客结构域均与易位子结构域形成非共价键而连接在细菌表面、或者被释放到细胞外，相对于此，在所有三聚体自转运黏附素蛋白中，认为过客结构域与易位子结构域通过共价键连接。

三聚体自转运黏附素简称为TAA(Trimeric autotransporteradhesin)，作为形成共通寡聚物结构的卷曲螺旋型的新纲，还被称作Oca家族(寡聚卷曲螺旋型黏附素家族)(Andreas Roggenkamp，Nikolaus Ackermann，Christoph A.Jacobi，Konrad Truelzsch，HaraldHoffmann和Jurgen Heesemann 2003.Molecular analysis of transport andoligomerization of the Yersinia enterocolitica adhesin YadA.J Bacteriol.185：3735-3744)。

在本发明中，优选三聚体自转运黏附素。作为三聚体自转运黏附素，例如有：作为小肠结肠炎耶尔森菌(Yersina enterocolitica)的黏附素的YadA(Yersina adhesin A)(El Tahir Y，Skurnik M.2001.YadA，themultifaceted Yersinia adhesin.Int J Med Microbiol.291：209-218)、引起髓膜炎的流感嗜血杆菌(Haemophilus infruenzae)的Hia(St Geme JW3rd，Cutter D.2000.The Haemophilus influenzae Hia adhesin is anautotransporter protein that remains uncleaved at the C terminus and fullycell associated.J Bacteriol.182：6005-13)、引起牙周病的伴放线放线杆菌(Aggregatibacter(Actinobacillus)actinomycetemcomitans)的EmaA(Mintz，K.P.2004.Identification of an extracellular matrix proteinadhesin，EmaA，which mediates the adhesion of Actinobacillusactinomycetemcomitans to collagen.Microbiology.150，2677-2688)、作为呼吸系统感染症的主要病原菌的粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)的UpsA 1、A2(Lafontaine ER，Cope LD，Aebi C，Latimer JL，McCracken GH Jr，Hansen EJ.2000.The UspA 1protein and a secondtype of UspA2 protein mediate adherence of Moraxella catarrhalis tohuman epithelial cells in vitro.J Bacteriol.182：1364-73)、引起猫抓病的汉氏巴尔通氏体(Bartonellahenselae)的BadA(Riess T，Andersson SG，Lupas A，Schaller M，

A，Kyme P，Martin J，

JH，Ehehalt

U，Lindroos H，Schirle M，Nordheim A，Autenrieth IB，Kempf VA.，.2004.Bartonella adhesin a mediates a proangiogenic host cell response.J ExpMed.200：1267-78)、作为髓膜炎菌的脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)的NadA(Capecchi B，Adu-Bobie J，Di Marcello F，CiucchiL，Masignani V，Taddei A，Rappuoli R，Pizza M，AricòB.2005.Neisseriameningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion toand penetration into human epithelial cells.Mol Microbiol.55：687-98)、作为植物病原性细菌的水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)的XadA(Ray SK，Rajeshwari R，Sharma Y，Sonti RV.2002.Ahigh-molecular-weight outer membrane protein of Xanthomonas oryzaepv.oryzae exhibits similarity to non-fimbrial adhesins of animalpathogenic bacteria and is required for optimum virulence.Mol Microbiol.46：637-47)等。

优选的自转运黏附素的例子有：包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白、与该蛋白功能同等的蛋白。功能同等的蛋白是指，该蛋白与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白具有同等的生物学功能、生化学功能。作为与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白功能同等的蛋白，例如有包含SEQ ID NO：2中1个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得到的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性。并且，还可以列举以下蛋白：(c)包含SEQ ID NO：2所示的一部分氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白，换言之，包含从SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中删除1处或多处数十～数百、有时千以上的连续的氨基酸序列而得到的氨基酸序列、且不丧失赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的缺失蛋白。

1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入或添加可以利用常用技术、例如位点特异性诱变法(Zoller等人、Nucleic Acids Res.106478-6500，1982)，通过修饰编码该蛋白的DNA序列(例如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)来实施。

其中，作为蛋白的构成要素的氨基酸的侧链在疏水性、电荷、大小等方面各不相同，但实质上在不影响蛋白整体的三维结构(也称作立体结构)的意义上，保守性高的几种关系根据经验或通过理化实测而获悉。例如，作为不同氨基酸残基间的保守取代的例子，已知有甘氨酸(Gly)与脯氨酸(Pro)、甘氨酸与丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)与异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)与谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)与天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)与苏氨酸(Thr)、苏氨酸与丝氨酸(Ser)或丙氨酸、赖氨酸(Lys)与精氨酸(Arg)等氨基酸间的取代。因此，氨基酸的取代优选为保守取代。

由于包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白是具有信号肽、头域、颈域、茎部区域(stalk domain)和膜锚定区的三聚体自转运黏附素，所以氨基酸突变优选为维持该结构域结构的突变。在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，信号肽相当于1～57位的氨基酸，头域相当于108～269位和2997～3148位的氨基酸，颈域相当于296～319位和3149～3172位的氨基酸，茎部区域相当于406～2966位和3173～3537位的氨基酸，膜锚定区相当于3538～3630位的氨基酸。

“多个”通常是指2～10个、优选2～5个、更优选2～3个。功能同等的蛋白通常在氨基酸序列水平具有高同源性。高同源性是指，在氨基酸水平通常具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的同源性(或同一性)。

在包含SEQ ID NO：2所示的一部分氨基酸序列的蛋白中，可以删除的数十～数百个连续的氨基酸序列优选为相当于单方或两方的茎部区域、单方的头域、单方的颈域的序列部位，可以删除其中的一个连续序列或多个连续序列。更优选删除上述各结构域的部位中接近氨基末端的头域～茎部区域的全区(108～2966位)或接近羧基末端的头域～茎部区域的全区(2997～3537位)。进一步优选删除茎部区域中多个可见的重复区，使其不再重复，各出现1次。最优选删除茎部区域中多个可见的重复区中的任一处。

作为优选的自转运黏附素基因、即编码自转运黏附素的DNA的例子，例如有包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA、以及与该DNA功能同等的DNA。作为与包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA功能同等的DNA，可以列举：包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选98％以上同源性(或同一性)的核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。或者，在严格条件下和包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。可以进一步列举：包含SEQ ID NO：1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA，换言之，包含从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中删除1处或多处数十～数千个连续的核苷酸序列而得到的核苷酸序列、且由其翻译的蛋白不丧失赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的活性的缺损基因的DNA。

严格条件是指形成特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件，有低严格条件和高严格条件，优选高严格条件。低严格条件是指，在杂交后的清洗中，例如在42℃下、在5×SSC、0.1％SDS中清洗的条件，优选为在50℃下、在5×SSC、0.1％SDS中清洗的条件。高严格条件是指，在杂交后的清洗中，例如在65℃下、在0.1×SSC和0.1％SDS中清洗的条件。

核苷酸序列中的突变也优选为维持包含信号肽、头域、颈域、茎部区域和膜锚定区的该结构域结构的突变。在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，信号肽相当于1～171位的核苷酸，头域相当于322～807位和8989～9444位的核苷酸，颈域相当于886～957位和9445～9516位的核苷酸，茎部区域相当于1216～8898位和9517～10611位的核苷酸，膜锚定区相当于10612～10890位的核苷酸。

在包含SEQ ID NO：1所示的一部分核苷酸序列的DNA中，可以删除的数十～数百个连续的核苷酸序列优选为编码单方或两方的茎部区域、单方的头域、单方的颈域的序列部位，可以删除其中的一个连续序列或多个连续序列。更优选删除上述各结构域的部位中编码接近氨基末端的头域～茎部区域的全区的区(322～8898位)或编码接近羧基末端的头域～茎部区域的全区的区(8989～10611位)。进一步优选删除茎部区域的编码区中多个可见的重复区，使其不再重复，各出现一次。最优选删除茎部区域的编码区中多个可见的重复区中的任一处。

通过将编码自转运黏附素的DNA和包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA一同导入靶微生物中，可以进一步提高靶微生物的非特异黏附性和/或凝集性。由于包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA与不动杆菌属(Acinetobacter)细菌等所具有的外膜蛋白OmpA基因具有同源性，所以该DNA是编码外膜蛋白的DNA。可以导入与包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA功能同等的基因。作为与包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA功能同等的DNA，可以列举：包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列的DNA。或者，可以列举：在严格条件下和包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。

可以将含有编码自转运黏附素的DNA的操纵子导入靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。例如，通过将包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的DNA导入靶微生物中，可以将编码自转运黏附素的DNA和上述编码外膜蛋白的DNA同时导入靶微生物中。可以导入与该操纵子功能同等的操纵子。作为功能同等的操纵子，可以列举包含下述DNA的操纵子：包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选98％以上同源性的核苷酸序列、且具有赋予或增强宿主微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的DNA。

对导入编码自转运黏附素的DNA的靶微生物没有特别限定，例如有：不具有或具有弱的非特异黏附性和/或凝集性的微生物。例如有：埃希氏菌属(Escherichia)细菌、例如大肠杆菌(Escherichia coli)；不动杆菌属(Acinetobacter)细菌、例如乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)；青枯菌属(Ralstonia)细菌、例如真氧产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)；假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；气单胞菌属(Aeromonas)细菌、例如豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)；产碱杆菌属(Alcaligenes)细菌、例如广泛产碱杆菌(Alcaligenes latus)；黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌、例如野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)等。

通过将编码自转运黏附素的DNA导入靶微生物中进行转化，可以得到被赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物。典型的是，将编码自转运黏附素的DNA连接在适当的载体上，利用该载体转化靶微生物(宿主微生物)，从而可以得到被赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物。具体而言，通过多拷贝将该DNA导入宿主微生物中，或者在以组成型表达的启动子支配下连接该DNA、或者在诱导酶型启动子支配下连接该DNA，可以得到被赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物。将编码自转运黏附素的DNA和编码外膜蛋白的DNA一同导入的情形、以及导入含有编码自转运黏附素的DNA的操纵子的情形亦同。

首先，将目标DNA连接到载体中，制备重组载体。上述载体中，除了使用能够在宿主细胞中自主增殖的噬菌体、粘粒、人工染色体或质粒以外，例如在将质粒以表达盒(expression cassette)的形式导入染色体中时，必需具有在该表达盒的构建所必需的宿主(例如大肠杆菌)中自主复制的能力，但未必具有在导入该表达盒的宿主(例如酵母)中自主复制的能力。这些重组载体例如还可以使用设计成在大肠杆菌和酵母两者中能够使用的穿梭载体等。

作为质粒，例如有：来自大肠杆菌的质粒(例如pET21a(+)、pET32a(+)、pET39b(+)、pET40b(+)、pET43.1a(+)、pET44a(+)、pKK223-3、pGEX4T、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如pUB110、pTP5等)、来自酵母的质粒(例如YEp13、YEp24、YCp50等)、以及酵母中毕赤酵母(Pichiapastoris)用的质粒(例如pPICZ、pPICZα、pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-S1、pPIC9、pPIC6、pGAPZ、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pFLD)等，作为噬菌体DNA，有λ噬菌体(λgt11、λZAP等)。并且，还可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。此外，可以将pCR4-TOPO(注册商标)等市售的克隆用载体用于克隆及序列确认。

将DNA插入载体中可以采用以下方法：首先，用适当的限制酶切断已纯化的DNA，之后将其插入适当的载体DNA的限制酶切位点或多克隆位点，并与载体连接的方法等。例如，目标DNA可以利用通常已知的方法进行合成，再将其插入载体中，使用引物通过PCR法进行扩增，使两末端含有适当的限制酶的切断位点。PCR反应的条件可以由本领域技术人员适当确定。

此外，在重组载体中，除了启动子和本发明的DNA外，根据需要还可以连接有增强子等顺式元件、剪接信号、poly A添加信号、选择标志物、核糖体结合序列(SD序列)等。选择标志物的例子有：卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素等耐药性标志物；亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、尿嘧啶等营养要求性标志物，但并不限于此。

对启动子没有特别限定，本领域技术人员可以根据宿主微生物来适当选择。例如，当宿主为大肠杆菌时，可以使用T7启动子、lac启动子、trp启动子、λ-PL启动子等。还可以适当使用包含SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列的启动子、以及与其功能同等的启动子、例如包含与SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列的启动子。

连接DNA片段和载体片段时，使用公知的DNA连接酶。之后，将DNA片段和载体片段退火后连接，制作重组载体。优选通过使用市售的连接试剂盒、例如Ligation High(高效率连接试剂盒)(东洋纺株式会社制)，按照规定的条件进行连接反应，可以得到重组载体。

包含克隆、连接反应、PCR等的重组DNA技术例如可以利用Sambrook，J等人，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47-9.58，Cold SpringHarbor Lab.press(1989)和Short Protocols In Molecular Biology，ThirdEdition，A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.中记载的技术。

所得载体根据需要可以通过煮沸法、碱性SDS法、磁珠法以及利用上述原理的市售试剂盒等进行纯化，再利用例如乙醇沉淀法、聚乙二醇沉淀法等浓缩方法进行浓缩。

对向靶微生物中导入重组载体的方法没有特别限定，例如有使用钙离子的方法、电穿孔法、脂质转染法等。

含有目标DNA的转化微生物可以利用该重组载体所具有的标志物基因，通过在例如含有氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素的LB培养基琼脂板上形成菌落来进行筛选，但为了确认所克隆的宿主微生物是否是利用重组载体转化的微生物，可以使用其中一部分，进行通过PCR法插入的扩增确认、或使用序列分析仪进行的双脱氧法的序列分析。除导入能够自主复制的质粒的形式外，还可以采用下述染色体插入型的导入方法：将与染色体基因同源的区配置在载体内，使之发生同源重组以导入目标基因。

用培养基培养所得的转化微生物的方法可以按照用于培养靶微生物的常规方法来进行。作为培养以大肠杆菌或酵母菌等微生物作为宿主得到的转化微生物的培养基，只要是含有微生物能够利用的碳源、氮源、无机盐类等、且可以有效进行转化微生物的培养的培养基即可，可以使用天然培养基，也可以使用合成培养基。具体例子有：M9培养基、M9G培养基、BS培养基、LB培养基、营养肉汤(NutrientBroth)培养基、肉膏培养基、SOB培养基、SOC培养基、PDA培养基等。

作为碳源，只要是可以利用的碳化合物即可，例如可以使用：葡萄糖等糖类；甘油等多元醇类；甲醇等醇类；或丙酮酸、琥珀酸或枸橼酸等有机酸类。作为氮源，只要是可以利用的氮化合物即可，例如可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱性提取物、甲基胺等烷基胺类、或氨或其盐等。此外，根据需要，还可以使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类、特定的氨基酸、特定的维生素、消泡剂等。另外，根据需要，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等蛋白表达诱导剂。

培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等需氧条件下、优选0～40℃、更优选10～37℃、特别优选15～37℃下进行。培养期间，培养基的pH可以在宿主能够发育、且不损及自转运黏附素的活性的范围内适当变更，但优选为pH4～8左右的范围。pH的调整使用无机或有机酸、碱溶液等来进行。培养中，根据需要，可以向培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。

如上操作，可以得到被赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性(自身凝集性)的微生物。有关所得微生物的非特异黏附性，可以通过上述利用结晶紫染色进行的黏附试验(CV黏附试验)来评价，有关凝集性，可以如下评价。将菌体培养液离心，除去培养上清，向菌体团块中加入无机盐培养基，通过超声波处理得到菌体悬浮液，用培养基进行调整，使菌体悬浮液的浊度OD₆₆₀恒定，以此时的OD₆₆₀作为初期OD₆₆₀，通过将玻璃离心管中的菌体悬浮液在室温下静置，使形成的细胞自身凝集体沉淀，测定上清的OD₆₆₀的时间变化。于是，可以评价OD₆₆₀的减少为初期OD₆₆₀的10％以上、优选15％以上、更优选20％以上的微生物是具有凝集性的微生物。

培养所得的微生物后，通过通常已知的方法、例如机械方法、使用溶菌酶等的酶方法或使用表面活性剂等的化学处理破坏菌体或细胞，也可以分离自转运黏附素蛋白。

本发明不仅可以直接用于传统的发酵产业或废物处理，对生物质能的生产或使用微生物细胞的绿色生物技术也极为有效。特别是能量或化学品的生产要求低成本，通过赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性使其固定化及自身凝集，这直接关系到生产过程的效率化，能够成为这些产业发展的基础。

实施例

实施例1黏附相关基因的分析

1-1黏附性降低的突变株T1和反向PCR用引物的制作

为了分析不动杆菌属(Acinetobacter sp.)Tol5株的黏附相关基因，使用转座子随机插入法制作黏附性降低的突变株。以Tol5 WT(Tol5野生株)作为受体细胞、以具有转座子载体的E.coli S17-1作为供体细胞，在28℃下接合22～24小时。用含有甲苯和四环素的培养基进行选择培养，进行所得株的黏附试验。其结果，成功地得到了若干黏附性降低的株。采集它们的基因组DNA，以用限制酶HindIII处理的DNA作为模板，使用DIG-labeled tetA作为探针，进行DNA杂交。其结果，存在在约5kb的位置明显检测到谱带的株，以其作为黏附性降低株T1。在电子显微镜下观察T1株的表面结构时，观察到缺失附器(细胞表层的突起物)的形态。

接着，为了分析T1株的转座子插入位点，从琼脂糖凝胶中切出通过DNA杂交检测到的约5kb的DNA片段。以该片段作为T1-5kb。将T1-5kb插入pUC118载体中，之后克隆到E.coli DH5α中。测定所得质粒DNA的插入部分的两端的序列，结果确认：在T1-5kb的内部，除了存在Tn5的序列外，还存在来自Tol5WT株的68bp的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。

1-2黏附相关基因的克隆

为了分析黏附性降低的突变株T1的转座子插入位点的核苷酸序列，根据通过分析T1而明确的插入位点68bp的序列，尝试着进行WT株的染色体DNA的反向PCR。首先，用BS培养基培养Tol5野生株，之后进行DNA提取、RNase处理。用存在于pUC118的多克隆位点的HindIII以外的限制酶(Acc I、Hae III、Hinc II、Kpn I、Pst I、Pvu II、Sal I、Sau3A I、Sma I、Xba I)处理所得的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳(以下记作E.P.)来确认。分析T1时使用限制酶HindIII，但由于在68bp内确认到HindIII位点，所以判断限制酶HindIII不适合用于得到目标区，在此将其除去。E.P.的结果，在与基因组同等的高分子量的位置残留有谱带的酶，其限制酶反应位点少、片段的长度太长，所以不适合。另外，出现低分子量谱带的酶，其片段太短，即使进行测序，所得的序列信息也少，所以不适合。因此，选择在1,500bp～5,000bp出现信号的Hinc II，对基因组DNA进行Hinc II处理(Tol5/Hinc II)。连接已进行DNA纯化的Tol5/Hinc II，使其进行自身连接(自身环化)(Tol5/Hinc II/circular)。然后，以其为模板，进行反向PCR。为了连接在进行了Hinc II处理的载体上，使用带有Hinc II接头的引物。条件如下。以所得的5kb的PCR产物作为Tol5-5kb。

反向PCR条件

聚合酶：KOD-plus-

模板DNA：Tol5/Hinc II/环

引物F：T1-5kb R3

引物R：T1-5kb RC

退火：66℃

伸长：5分钟

纯化所得的PCR产物，之后用限制酶Hinc II进行处理。该操作的目的在于：缩短片段以提高克隆的成功率、以及使接头形成Hinc II切断面。为了分离收集各样品，从琼脂糖凝胶中提取DNA(QIAquickGel Extraction Kit，QIAquick凝胶提取试剂盒)。将2.8kb片段和1.8kb片段分别作为Tol5-2.8kb和Tol5-1.8kb。将Tol5-2.8kb和Tol5-1.8kb与载体连接。之后进行转化(化学法；蓝白菌落筛选法)。采集白菌落，用LB液体培养基进行培养，之后提取少量的质粒DNA。用限制酶Hinc II处理质粒DNA，通过E.P.进行确认。限制酶处理的结果，得到了载体+2.8kb和1.8kb这样的理想谱带。另外，通过PCR确认片段的大小和插入方向。条件如下所示。

PCR条件

聚合酶：Blend Taq

模板DNA：Tol5-1.8kb、Tol5-2.8kb

引物F：T1-5kb R3、pUC118F

引物R：T1-5kb RC、pUC118R

退火：62℃

伸长：2分钟

PCR的结果，在Tol5-2.8kb中，利用pUC118R×T1-5kb R3的引物对扩增了2.8kb的片段；在Tol5-1.8kb中，利用pUC118F×T1-5kb RC的引物对扩增了1.8kb的片段。根据此结果，成功地确认了插入片段的大小，同时确定了片段插入的方向。对这两株进行测序。测序采用引物步移法。但是，出现了以下问题：序列分析仪的信号混乱；而且在利用计算机进行装配(assembly)时，即使在认为是重叠区的位点也出现了不一致的核苷酸等。由分析结果可知：序列中存在多个长的重复序列。因此，还出现了以下等的困难：装配后的长度也不满足目标插入片段的长度、即2.8kb或1.8kb。于是，重复进行引物的设计和测序，终于确定了插入片段的长度分的核苷酸序列。但是，由于是这种重复序列，所以结果的可靠性低。于是，为了提高测序的确实性，决定直接克隆Tol5-5kb，并再次进行测序。为了进行TA克隆，使用在Taq系统中正确性高的DNA聚合酶Easy-A来进行PCR，扩增Tol5-5kb。PCR条件如下所示。

PCR条件

聚合酶：Easy-A High-Fidelity PCR克隆酶

模板DNA：Tol5/Hinc II/环

引物F：T1-5kb R3-2

引物R：T1-5kb RC-2

退火：67.9℃

伸长：5分钟

使用所得的PCR产物进行TA克隆。转化按照化学法来进行，涂布在LB/Km琼脂培养基上。将菌落在LB/Km液体培养基中培养，培养后提取质粒DNA。为了确认插入，用限制酶EcoR I处理DNA。其结果，可以确认载体和5kb的片段的存在。并且，通过PCR确认了插入片段的大小。条件如下所示。

PCR条件

聚合酶：Blend Taq

模板DNA：Tol5-5kb质粒No.5

引物F：pUC118F

引物R：pUC118R

退火：65～71℃

伸长：5分钟

PCR的结果，可以确认到插入的5kb谱带。对其进行序列分析。测序再次通过引物步移法来进行，但由于是重复结构，所以再次测序极为困难。根据之前的1.8kb和2.8kb的序列信息，慎重地重复进行引物设计和测序，花费了精力和时间，最终成功地得到了具有巨大的重复结构的4907bp的序列。由于该Tol5-5kb的序列与Tol5-2.8kb和Tol5-1.8kb的序列完全一致，所以测序的确实性提高。所得的Tol5-5kb的序列见SEQ ID NO：7。根据该序列，利用BLAST对翻译蛋白进行同源性检索时，发现了与在其他细菌中报道的自转运黏附素显示出20～30％的同源性的4026bp的ORF，转座子也被插入该ORF内。由此可以明确：与Tol 5株的高黏附性和附器的生产有关的ORF的存在。但是，该ORF在Tol5-5kb的3’末端被中途切断，为了明确全ORF，必需重新克隆与Tol5-5kb接续的下游域。另外，可以说与细菌的粘着有关的自转运粘附素通过同源性检索而显示出来，由于同源性低、作为特定该组的决定者的羧基末端的膜锚定区也未出现，所以充分考虑到可能是部分序列类似的其他蛋白。

为了根据所得序列的结果进一步得到下游的序列信息，尝试着获取由DNA杂交产生的特定片段。为了制作DIG标记的探针，避开重复部分来制作引物。使用该引物，以Tol 5株的染色体DNA为模板，扩增160bp的目标谱带。PCR条件如下所示。

PCR条件

聚合酶：Blend Taq

模板DNA：Tol5基因组

引物F：Tol5-ad-探针2F

引物R：Tol5-ad-探针2R

退火：66～72℃

伸长：1秒

由于有多个谱带被扩增，所以在已分析的部分中，推定不存在反复的探针的序列部分也在未分析的下游区进一步出现重复，为了推进测序的进行，使用QIAquick凝胶提取试剂盒只切出160bp的目标谱带。以其为模板，利用PCR来制作探针。PCR条件如下所示。

PCR条件

PCR DIG探针合成试剂盒

模板DNA：Tol5160bp探针凝胶提取

引物F：Tol5-ad-探针2F

引物R：Tol5-ad-探针2R

退火：67.9℃

伸长：2分钟

使用所得的探针，对用各种限制酶处理Tol 5株的染色体DNA而得到的消化物进行DNA杂交。其结果，在限制酶Pst I的消化物中，在3kb和2.3kb的位置检测到探针杂交的信号。于是，将这两个DNA片段从琼脂糖凝胶中切出并进行提取(QIAquick凝胶提取试剂盒)。将它们作为Tol5-3kb和Tol5-2.3kb。连接所切出的DNA和经PstI消化的pUC118。通过所得的重组载体转化大肠杆菌DH5α(化学法；蓝白菌落筛选法)。进一步通过菌落杂交，选择导入有这些片段的转化体。其结果，产生信号的菌落只有导入有Tol5-3kb的菌落。采集产生信号的部分菌落(Tol5-CC、-C1、-C2、-C3)，用LB/Amp液体培养基培养后，提取少量的质粒DNA。分别用限制酶Pst I进行处理。对其进行DNA杂交时，在Tol5-CC、-C2、-C3中产生信号。对它们进行测序。插入的两端的测序结果，不存在与已知序列一致的片段。另外，这些序列各自不同。即，与之前确定了核苷酸序列的5kb区(Tol5-5kb)接续的下游域的克隆失败。此时还无法确定其原因。但本发明人认为问题在于：从以Tol 5株的染色体DNA为模板进行的DNA杂交中出现的多个信号中勉强选择一个并切出片段，由此制作了探针。于是，暂时保留这些克隆株，以获取与Tol5-5kb连续的片段。

将模板由Tol5染色体变更为pUC118::Tol5-5kb质粒DNA，利用PCR法制作新的DIG标记探针。由于该质粒只含有一处探针区，所以认为只产生1种(1本)DIG标记的扩增片段。PCR条件如下所示。

PCR条件

PCR DIG探针合成试剂盒

模板DNA：pUC 118::Tol5-5kb质粒DNA

引物F：Tol5-ad-探针2F

引物R：Tol5-ad-探针2R

退火：68℃

伸长：2分钟

不出所料，被扩增的片段只有目标大小(160bp)，成功地制作了高纯度的新探针。使用该探针，与使用上述含有Tol5-3kb和Tol5-2.3kb的载体进行转化操作后得到的板进行菌落杂交。采集认为发出信号的菌落，在板中培养，再次进行菌落杂交以进行确认。采集产生信号的部分菌落(3kb的No.3和2.3kb的No.6、12、13、21、22)，用LB/Amp液体培养基培养后，提取少量的质粒DNA。所得质粒DNA用限制酶Pst I进行处理。其结果，各质粒含有目标的3kb(No.3)或2.3kb(No.6、12、13、21、22)，这些插入片段均与160bp的探针杂交。如果这些片段如期待的那样含有与Tol5-5kb接续的下游域，则应该含有夹在PstI位点与HincII位点之间的约1.5kb的核苷酸序列作为与Tol5-5kb重复的区。因此，用限制酶Hinc II处理在多克隆位点的PstI位点插入有这些片段的上述质粒时，应该得到在1.5kb的重复片段中添加有多克隆位点的一小部分的约1.5kb的DNA片段。于是，用HincII消化No.3、6、22的质粒时，从它们中均可得到约1.5kb的DNA片段。但是，其大小各自略有不同。其中，首先对No.6的质粒进行测序，所述No.6的质粒除了被切成1.5kb片段外、还被切成认为含有3.1kb的载体片段的3.3kb片段和600bp的片段。但是，根据以前进行的测序或DNA杂交的结果，由于该质粒的重复序列部分多，在多个部分发生退火，所以认为通过目前确定作为高通量的方法的引物步移法无法正确测序。另外，想定在计算机装配中也会出现故障。即，在Tol5-5kb时经历的困难有可能重复出现。于是，这次不采用引物步移法，而是决定制作缺失突变体的系列，尽管这要花费精力和时间。为了制作从之前的1.5kb的重复片段侧依次删除插入到No.6中的2.3kb的Tol 5的DNA片段的突变体，用3’突出的SacI和5’突出的XbaI处理该质粒后，用核酸外切酶III进行消化。通过制作错开核酸外切酶III作用的时间的一系列试样，得到被删除的长度不同的缺失产物。之后，再利用绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)进行末端平滑化以及利用Klenow片段进行末端修复，最后通过实施平端连接，得到缺失质粒系列。通过乙醇沉淀进行纯化后，通过用经核酸外切酶III消化应该消除的XbaI进行处理，排除了未反应的质粒的影响，通过用该DNA转化大肠杆菌DH5α，得到了缺失突变体的系列。采集多个转化体菌落进行培养，用限制酶HincII处理已提取的质粒。考虑到1通径(path)的序列的大小(800bp～)，以适当的间隔选择缺失突变体，分别进行测序。综合各测序结果，确定了2280bp的核苷酸序列。该序列见SEQ IDNO：8(Tol5-No.6)。Tol5-No.6含有与Tol5-5kb重复的约1.5kb的序列，由此可以确定与Tol5-5kb接续的约750bp的核苷酸序列。由此，编码与上述自转运黏附素显示出低同源性的蛋白的ORF与4707bp接续，由此编码的蛋白的氨基酸序列也具有1569个残基。但是，ORF尚未终结，其在3’末端中断。因此，必须进一步克隆与Tol5-No.6连接的下游域。另外，虽然该序列与伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetem comitans)的EmaA显示出最高的同源性，但其在氨基酸水平的同源性也低至26％，达不到膜锚定区的编码区，所以不能定论其是属于TAA家族的蛋白。总之，推定通过转座子的插入而被破坏的黏附相关基因所编码的蛋白是非常巨大的、而且以复杂方式混入了长的重复序列的新型粘附蛋白。

为了得到与Tol5-No.6接续的下游域的序列信息，根据重新明确的序列，再次避开重复，以含有Tol5-No.6的质粒为模板，利用PCR法制作158bp的探针。PCR条件如下所示。

PCR条件

PCR DIG探针合成试剂盒

模板DNA：pUC118::Tol5-No.6

引物F：Tol5-ad-探针5F

引物R：Tol5-ad-探针6R

退火：65℃

伸长：2分钟

由于在离合成的探针区近的上游存在限制酶HindIII位点，所以用HindIII消化Tol 5的染色体DNA后进行E.P.，再利用158bp探针进行DNA杂交。其结果，又确认到3个信号，所以从琼脂糖凝胶中切出所有信号部分，提取DNA(使用DEAE纸)。按照分子量从大到小，依次为Tol5-B(2500bp)、Tol5-M(1200bp)、Tol5-S(600bp)。连接切出的DNA和用HindIII处理的pUC118。纯化连接后的DNA，接着进行转化(电穿孔；蓝白菌落筛选法)。使用之前的158bp的探针，对形成有菌落的板进行菌落杂交。采集产生信号的部分的菌落，用LB/Amp液体培养基培养。提取少量的质粒DNA，用限制酶HindIII处理，确认插入片段的长度时，确认插入了2500bp、1200bp、600bp的长度的Tol 5株DNA片段，所以对这些质粒进行测序。由于M片段和S片段短，所以利用1通径序列可以分别确定1185bp和603bp的核苷酸序列。另外，为了B片段的测序，制作缺失突变体。用3’突出的SacI和5’突出的XbaI处理含有B片段的质粒后，用核酸外切酶III进行消化。通过制作错开核酸外切酶III的作用时间的一系列试样，得到被删除的长度不同的缺失产物。之后，进一步利用绿豆核酸酶进行末端平滑化以及利用Klenow片段进行末端修复，最后进行平端连接，从而得到缺失质粒的系列。通过乙醇沉淀进行纯化后，用通过核酸外切酶III消化应该消除的XbaI进行处理，从而排除未反应的质粒的影响，通过用所得的DNA试样转化大肠杆菌DH5α，得到缺失突变体的系列。采集多个转化体菌落进行培养，用限制酶HindIII和EcoR I双重消化已提取的质粒。考虑到1通径的序列的大小(800bp～)，以适当的间隔选择缺失突变体，分别进行测序。连接各序列结果，确定了2540bp的B片段的核苷酸序列。已确定的Tol5-B、Tol5-M、Tol5-S的序列分别见SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：11。其中，Tol5-M片段作为与Tol5-No.6的序列100％一致的重复区，含有533bp的核苷酸序列。但是，作为相同的HindIII片段的Tol5-B、-M、-S的各片段彼此不含有重复区，仅凭推定-M片段与Tol5-No.6接续，还不能明确其他两个片段的位置关系。这些片段彼此含有几乎相同的核苷酸序列区，158bp的探针区也位于此。即，推定这些片段也是形成重复序列的巨大片段的一部分。通过Tol5-M片段的重复，ORF与5358bp延续，由此编码的蛋白的氨基酸序列也含有1785个残基。但是，ORF尚未终结，其在3’末端中断。因此，与Tol5-M片段连接的下游域的核苷酸序列也必须进一步得到明确。显示出最高同源性的仍然是伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetem comitans)的EmaA，但在氨基酸水平只显示出25％的同源性，尚未达到膜锚定区的编码区，所以依然不能判定其是否是属于同家族的蛋白。

在此，对Tol 5的DNA片段、如Tol5-CC和Tol5-C2进行了重新测序，该Tol 5的DNA片段最初是通过DNA杂交尝试克隆与Tol5-5kb接续的下游域而得到的片段，但所得片段无法与Tol5-5kb连接。由于想定都含有重复序列，所以分别制作缺失突变体。用3’突出的SacI和5’突出的XbaI处理质粒后，按照与上述相同的程序制作缺失突变体的系列，进行测序并连接起来，确定了Tol5-CC和Tol5-C2的核苷酸序列。所得的Tol5-C2、Tol5-CC的序列见SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13。

通过重复分析Tol5-B、M、S片段和Tol5-CC、C2片段的序列，确定了位置关系。只将序列100％一致的情形作为重复序列。利用158bp探针进行DNA杂交而检测到的信号有3个，但根据重复分析和Tol5-C2的分析结果，判明实际上有4个片段。由于第4个片段与Tol5-S在大小和序列方面几乎相同，所以其与约600bp的信号重复存在。将该区作为Tol5-S’。整理上述片段时，发现以Tol5-M、Tol5-S’、Tol5-S、Tol5-C2、Tol5-B、Tol5-CC片段的顺序重复排列。其结果，ORF与10798bp接续，由此编码的蛋白的氨基酸序列也含有3598个残基。但ORF尚未终结，其在3’末端中断。因此，还必须进一步克隆与Tol5-CC连接的下游域。显示出最高的同源性的是Burkholderia phymatum的TAA，但其在氨基酸水平只显示出25％的同源性。虽然含有一部分膜锚定区的序列，但并不含有全部序列，也不可能预测该部分的高级结构，所以即使在此时也无法定论其属于TAA家族。另外，还明确其大小也远远大于已经报道的TAA中最大的汉氏巴尔通氏体(Bartonellahenselae)的BadA(3036个氨基酸)。

根据以前的测序结果，Tol5-CC的C末端区没有确认到重复序列。因此，在C末端区制作507bp的探针，以通过限制酶HindIII处理的Tol 5株的DNA为模板进行DNA杂交。其结果，在5kb的位置检测到信号，将该片段作为Tol5-C5kb。从琼脂糖凝胶中切出该DNA并进行提取(DEAE纸)，将其与用HindIII消化的pUC118载体连接，进行转化(电穿孔；蓝白菌落筛选法)。采集白菌落，用LB/Amp液体培养基进行培养。从液培养基中的菌体中提取质粒DNA，用限制酶HindIII进行处理，确认插入。推测Tol5-C5kb内没有重复结构，通过引物步移法确定序列。所得的Tol5-C5kb的序列见SEQ ID NO：14。Tol5-C5kb与Tol5-CC的序列重复，判明其是与Tol5-CC连接的下游域。之后通过连接所述片段，大到10,893bp(SEQ ID NO：1)的巨大ORF完成，明确了其是包含由其编码的3,630个氨基酸(SEQ ID NO：2)的巨大蛋白。其是通过转座子的插入而被破坏的、与黏附有关的基因的本体。之前显示的序列片段的位置关系见图1。如此操作，确定了包含编码与粘着有关的蛋白的巨大ORF的Tol 5株的15011 bp基因片段的核苷酸序列。

1-3黏附相关基因的序列

连接对各种克隆株进行测序的结果得到的序列片段的操作使用GENETYX来进行。为了判明是具有多个复杂的重复结构的基因，连接序列和序列时只将序列100％一致的情形视为重复部分。本实施例中的克隆和测序的结果得到的全核苷酸序列见图2和SEQ ID NO：15。

1-4生物信息学解析

必须检索在核苷酸序列中是哪个区编码蛋白。使用ORF finder和GeneMark预测编码蛋白的区。其结果，推测在取得的基因中存在4个ORF。插入有转座子的ORF是上述巨大的ORF，可以说该ORF所编码的蛋白是黏附因子。另外，由于5’末端和3’末端的ORF未确认到终止密码子，所以认为其在中途中断。编码蛋白时，在起始密码子的上游存在核糖体结合位点和启动子位点。由于这些序列往往被保留，所以检索黏附相关基因的巨大ORF中启动子位点的存在。其结果，确认到启动子位点的存在。以下显示该区。由此预测：起始密码子并不在第925位，第949位的密码子才是正确的密码子。

-35区-10区

--TATCTCATTTTTTTGATTGCTTTAATTGTATGTAAATTGTTAAATAAAAAAAATTGTACATTTTATATGCATTGCTA

AAGCAGAACCTACTGCCCAAAATGCATCTCCTAAGGAAAAGCGATATGAATAAAATCTACAAAGTGA--

                     ⁹²⁵       SD序列        ⁹⁴⁹起始密码子

使用NCBI-BLAST检索各ORF的同源性。其结果，黏附关联的巨大ORF所编码的巨大蛋白整体不存在显示出同源性的蛋白。但是，部分含有与属于TAA家族的蛋白显示出同源性的区。

属于TAA家族的蛋白具有信号肽、头域、颈域、茎部区域、膜锚定区这样的结构域。于是，使用ClustalW分别制作各结构域的序列多重对比并比较序列。其结果见图4。使用PredictProtein预测膜锚定的二次结构的结果也一并显示。比较对象为TAA家族的成员。其结果，在信号肽、头域、颈域中，与伴放线放线杆菌(Aggregatibacter(Actinobacillus)actinomycetemcomitans)的EmaA的各结构域的同源性最高，分别显示出34％、44％、52％的同源性。另外，在TAA家族中，与研究最多的、也可称作是该蛋白家族的原型的小肠结肠炎耶尔森菌(Yersina enterocolitica)的YadA分别显示出11％、23％、40％的同源性。至于膜锚定，其与睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)的自转运黏附素显示出48％的同源性、与YadA显示出25％的同源性。另一方面，有关包含2591个氨基酸的茎部区域，通过BLAST分析显示：其中一部分与TAA家族成员显示出同源性，但其同源性低。例如显示出最高的同源性的是琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的YadA样蛋白，但2591个氨基酸中的800个氨基酸的部分与该蛋白只不过显示出33％的同源性。以上，在各结构域中，作为具有同源性的蛋白，TAA家族的蛋白通过BLAST分析而显示出来，但它们的同源性水平并不高。但是，TAA家族最具特征的是：膜锚定区的立体结构。TAA为同源三聚体，各多肽链具有1个α螺旋和4个β链，三根多肽链集合起来具有12根β链，在革兰氏阴性细菌的外膜中形成β桶状结构，成为蛋白分泌用的隧道。于是，由Tol 5的黏附关联蛋白的膜锚定对应区的氨基酸序列预测二次结构时，推定具有1个α螺旋和4个β链。综合考虑上述情况和各结构域的排列等，推定Tol 5株的黏附蛋白是属于TAA家族的新型蛋白，将其命名为意味着不动杆菌属(Acinetobacter)细菌的粘附素的AadA。AadA基因的核苷酸序列见SEQID NO：1、AadA的氨基酸序列见图3和SEQ ID NO：2。AadA由10,893bp的基因编码的3,630个氨基酸构成。AadA远远大于已经报道的TAA家族的蛋白，多个长的重复结构复杂配置的茎部区域与其他蛋白的同源性低，而且头域和颈域不仅存在于氨基末端侧、还存在于靠近膜锚定区所具有的羧基末端等，与已经报道的成员相比是特异性的TAA。关于该特异性是否带来Tol 5株的高黏附性或非特异黏附能，目前还不清楚。但是，迄今为止报道的TAA全部都是在病原性细菌感染时用于特异性黏附在宿主的细胞或细胞外基质上的TAA，显示出高粘着力的TAA等还未见报道。

ORF的同源性检索结果，在aadA基因的邻近下游，发现了与其他不动杆菌属(Acinetobacter)细菌等所具有的外膜蛋白OmpA显示出同源性的蛋白的ORF。将其命名为Tol5-OmpA。Tol5-OmpA的核苷酸序列见SEQ ID NO：3、氨基酸序列见SEQ ID NO：4。Tol5-OmpA包含由795bp的基因编码的264个氨基酸。使用ClustalW制作序列多重对比，并和与Tol5-OmpA的序列显示出同源性的外膜蛋白的序列进行比较。其结果见图5。与大肠杆菌E.coli的OmpA比较时，在C末端区同源性高、但在N末端区同源性低。另一方面，与不动杆菌属(Acinetobacter)细菌所具有的外膜蛋白整体的同源性都高。但它们的功能未见报道。但是，由于与AadA的ORF接近，所以aadA和Tol5-ompA很有可能位于同一操纵子上。此外，由于是外膜蛋白，所以Tol5-ompA有可能也参与黏附或粘着性的附器生产。

存在于已确定核苷酸序列的Tol 5株的15011bp基因片段的5’末端的ORF与不动杆菌属(Acinetobacter sp.)ADP1等所具有的甲硫氨酰tRNA转甲酰基酶显示出高同源性。另外，存在于3’末端的ORF与不动杆菌属(Acinetobacter sp.)ADP1等所具有的二羟基酸脱水酶显示出高同源性。由于每一种蛋白都未见具有与黏附有关的功能的报道，所以推定不动杆菌属(Acinetobacter sp.)Tol5也与黏附无关。

1-5全长AadA基因的克隆

为了确认上述测序是正确的，通过PCR扩增含有推定启动子位点的aadA全长，确认其长度。所用引物Tol5-TKD-F和Tol5-TKD-R的区如下所示。

引物Tol5-TKD-F：

5’-AATATAGCTTAATTTCAAAAAAATTAAACCAATTGGTTTAAAAGTTAAAAAAAGTGAAATATATCTCATTTTTTTGATTGCTTT

AATTGTATGTAAATTGTTAAATAAAAAAAATTGTACATTTTATATGCATTGCTAAAGCAGAACCTACTGCCCAAAATGCATCTCCTA

AGGAAAAGCGATATGAATAAAATCTACAAAGTGATTTGGAATGCGACTTTGTTGGCATGGG-3’

引物Tol5-TKD-R(补体)：

5’--GGCGGTGTAGCTGCAGCGTCTCAAGGCGATGCAAGTGTTCGTATCGGTATCAGCGGTGTGATTGACTAATTCACTCGACAGGG

AAGATCTTCGGGTCTTCCTTTTTCTTCGAAAATTTTTTAAGAGAGAAAAAATGAAAGCATTTAACAAAAAAATTATGTTTGGTGTAT

TCAGCGGTCTTGTGATGTCATTGAGCCATGCTGCTGAAGTCGAAAGTGCAAATACGCAAGAA--3’

PCR的条件如下。

PCR条件

聚合酶：Easy-A High-Fidelity PCR克隆酶

模板DNA：Tol5基因组

引物F：Tol5-TKD-F

引物R：Tol5-TKD-R

退火：55～64.5℃

伸长：11分钟

PCR的结果，得到了与上述克隆和测序得到的11，145bp(约11kb)的序列相当的谱带，将其作为Tol5-11kb。接着，使用所得产物进行TA克隆。转化通过电穿孔来进行，涂布在LB/Km琼脂培养基上。所形成的菌落在LB/Km液体培养基中培养，培养后提取质粒DNA。为了确认插入，用限制酶EcoR I处理DNA。进一步通过PCR来确认。条件如下所示。

PCR条件

聚合酶：Blend Taq

模板DNA：pCR-XL-TOPO::Tol5-11kb质粒

引物F：pUC118F

引物R：pUC118R

退火：56～68℃

伸长：11分钟

限制酶处理的结果，可以清楚地确认到载体和AadA的理想谱带。另外，由PCR的结果还可以确认具有AadA的大小的谱带。并且，对质粒DNA进行测序的结果，插入片段的两端的序列与之前确定的核苷酸序列完全一致。因此，在确认上述测序精度的同时，成功地克隆了约11kb的含有推定启动子序列的aadA基因。

进一步尝试着克隆包括含有推定启动子的aadA和Tol5-ompA的约12,505bp(约13kb)的基因。通过PCR扩增片段。条件如下。

PCR条件

聚合酶：Easy-A High-Fidelity PCR克隆酶

模板DNA：Tol5基因组

引物F：Tol5-TKD-F    

引物R：Tol5-ad-op-R3

退火：50～60℃

伸长：14分钟

所用引物Tol5-ad-op-R3的区如下所示。

5’--TATGATGTGTACATATTTCGACTGATTTATTGCTATATCAGTTTTATTTAGCCAGAGTGAATCTGATTCATTTCAA

GCTCAAACAATGTNGGAAATACAAATGCCNGACTATCGTTCAAAAACATCGACACATGGAAGAAATATGGCTGGTGCACG

TGGCTTATGGCGTGCAAC-3’

将所得的约13kb的片段作为Tol5-13kb，使用其进行TA克隆。转化通过电穿孔来进行，涂布在LB/Km琼脂培养基上。在LB/Km液体培养基中培养菌落，培养后提取质粒DNA。为了确认插入，用限制酶EcoR I处理DNA。进一步通过PCR来确认。条件如下所示。

PCR条件

聚合酶：Blend Taq

模板DNA：pCR-XL-TOPO::Tol5-13kb质粒

引物F：pUC118F

引物R：pUC118R

退火：50～60℃

伸长：14分钟

由限制酶处理和PCR的结果，确认到具有理论长度的插入谱带。对该质粒DNA进行测序的结果，插入片段的两端的序列与已知序列完全一致。因此，成功地克隆了包括含有推定启动子的aadA和Tol5-ompA的基因、即含有11,858bp的aadA-ompA操纵子(SEQ IDNO：5)的约13kb的基因。在SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列中，1～106位是启动子/核糖体结合位点(SEQ ID NO：29)，107～10999位是aadA基因，11064～11858位是Tol5-ompA基因。

实施例2插入有不动杆菌属(Acinetobacter sp.)Tol5株的黏附相关基 因的大肠杆菌的性状评价

比较通过插入有aadA基因和aadA-ompA操纵子的载体转化的大肠杆菌(E.coli)DH5α(分别命名为DH5α::aadA和DH5α::aadA-ompA)、以及作为对照的E.coli DH5α野生株(WT)的性状。通过插入有aadA-ompA操纵子的载体转化的E.coli DH5α作为“DH5α-XLTOPO::aadA-ompA”，以接收号NITE ABP-490(接收日2008年(平成20年)2月19日)被独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部特许微生物寄托中心(日本国千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8)接收。

2-1利用光学显微镜观察形态

为了观察通过插入aadA基因和aadA-ompA操纵子而引起的形态变化，对DH5α::aadA、DH5α::aadA-ompA、DH5αWT这3种株进行革兰氏染色，并在光学显微镜下观察。结果见图6。

在插入有aadA-ompA操纵子的株DH5α::aadA-ompA中，除了观察到菌体外，还可以观察到连接菌体间的线状结构物。认为这种看起来象EPS(菌体外聚合物)的物质与黏附力的添加有关。在插入有aadA的株DH5α::aadA中，观察到菌体细长、极端连结的形态。这些株的形态均与野生株明显不同，由此可知：通过导入黏附相关基因，形态发生了变化。

2-2利用电子显微镜观察形态

为了更仔细地观察通过导入基因而引起的形态变化，对DH5α::aadA、DH5α::aadA-ompA、DH5αWT这3种株，使用扫描型电子显微镜FE-SEM和透过型电子显微镜TEM来观察形态。FE-SEM的观察结果见图7～9。

在DH5α::aadA中，观察到有菌体黏附的聚氨酯载体表面和没有菌体黏附的聚氨酯载体表面明显区分开来。即，观察到形成了凝集体这样的形态，在该凝集体单位内发生黏附。观察到在凝集体内产生大量的EPS样结构物，在多层中菌体彼此堆积、黏附。另外，在DH5α::aadA的菌体中观察到较多的形状变得细长的物质。这与光学显微镜观察的结果所得到的图像一致。若放大来看，则在细长的形状中可以确认到部分连接的形状(節目のようなもの)，观察到菌体极端连结的形态。另外，从变得细长的菌体中也观察到附器这样的结构物(图7)。

在DH5α::aadA-ompA中，观察到非常多的菌体黏附在聚氨酯载体上的情况。这种情况看起来象是菌体一个一个地黏附在载体上，在载体表面均匀地形成单层膜。另外，在DH5α::aadA-ompA中也观察到产生EPS样结构物的情况。这与光学显微镜下观察到的结果一致。并且，在DH5α::aadA-ompA中观察到许多连接菌体和载体的附器样的物质图8)。

与两个重组株相比，E.coli DH5αWT中几乎没有黏附在聚氨酯载体上的菌体，说是“黏附”，但看起来更象是“偶然搭载”。另外，生产附器这样的结构物的菌体少(图9)。

这样，通过在E.coli DH5α中插入不动杆菌属(Acinetobacter sp.)Tol5的aadA基因和aadA-ompA操纵子，成功地使其黏附形态发生了变化。

并且，在DH5α::aadA-ompA和DH5α::aadA之间也观察到了不同。在DH5α::aadA-ompA中，各个菌体细胞零散地黏附在载体上，形成均匀的层，但菌体彼此间并没有凝集形成多层。相对于此，在DH5α::aadA中，菌体细胞形成巨大的凝集体，黏附在载体上形成多层，但没有观察到各个细胞零散地黏附在载体上的情况。

2-3黏附试验和凝集试验

为了确认由于插入aadA和aadA-ompA操纵子而引起的黏附性变化，通过结晶紫染色进行黏附试验(CV黏附试验)。黏附试验通过以下试验方法来评价。

<黏附试验>

1.将菌体培养液以3,400rpm的转速在室温下离心10分钟。

2.通过倾析除去培养基，加入适量的MATS实验用BS培养基。

3.按照OUTPUT＝5、TIME＝20秒进行超声波处理(UD-200；TOMY)，使菌体悬浮，之后进行调整使OD₆₆₀达到约0.2。

4.在48孔微量培养板(IWAKI)的各孔中分别添加1ml悬浮液，在37℃下培养2小时。

5.吸取孔中的所有悬浮液。此时，注意Chip的顶端不要擦到板。

6.用1ml的MATS实验用BS培养基清洗孔。之后将板风干。

7.向孔中加入1％结晶紫，在室温下培养15分钟。

8.吸取所有的1％结晶紫，用1ml的MATS实验用BS培养基清洗孔2次。之后将板风干。

9.加入1ml的MATS实验用BS培养基，按照OUTPUT＝4、TIME＝20秒进行超声波处理，使染色菌体分散在BS培养基中。

10.测定A₅₉₀。

用M9培养基培养的菌体的黏附试验结果如下所示。

与野生株相比，插入有黏附相关基因的大肠杆菌在固体表面的黏附力提高。该结果显示：通过插入黏附相关基因，成功地对黏附能力低的菌赋予了黏附能力。进一步证明：本研究中获得的aadA基因和aadA-ompA操纵子与微生物的黏附有关。

观察各株的培养液时，发现各株间存在差异(图10)。野生株均匀白浊，相对于此，DH5α::aadA-ompA、DH5α::aadA发生肉眼可以观察到的程度的轻微凝集，并保持了透明度。

为了定量显示凝集性，进行凝集试验。凝集试验通过以下试验方法来评价。

<自身凝集试验>

1.将菌体培养液离心，除去培养上清。

2.向菌体团块中加入无机盐培养基，通过超声波处理得到菌体悬浮液。

3.用培养基进行调整，使菌体悬浮液的浊度OD₆₆₀恒定。以此时的OD₆₆₀作为初期OD₆₆₀。

4.通过将玻璃离心管中的菌体悬浮液在室温下静置，使所形成的细胞自身凝集体沉淀，测定上清的OD₆₆₀的时间变化。

5.自身凝集率由下式算出。

其结果见图11。

如图所示，与DH5αWT相比，DH5α::aadA的凝集性提高。该结果与培养液的透明度、FE-SEM观察的结果一致。上述结果证明：aadA基因的导入还赋予菌体细胞凝集性。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请以参考的形式全部纳入本说明书中。

Claims (14)

1.赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法，该方法包括：

将编码自转运黏附素的DNA导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。

2.权利要求1所述的方法，其中，具有非特异黏附性的微生物为不动杆菌属(Acinetobacter)细菌。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，编码自转运黏附素的DNA为以下(a)、(b)或(c)的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA；

(c)包含SEQ ID NO：1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。

4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，靶微生物为埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

5.权利要求4所述的方法，其中，埃希氏菌属(Escherichia)细菌为大肠杆菌。

6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，将编码自转运黏附素的DNA和以下(a)或(b)的DNA同时导入：

(a)包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA。

7.权利要求6所述的方法，其中，将以下(a)或(b)的DNA导入靶微生物中：

(a)包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列、且具有赋予或增强宿主微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的DNA。

8.赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物是通过权利要求1～7中任一项所述的方法得到的。

9.以下(a)、(b)或(c)的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA；

(b)包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA；

(c)包含SEQ ID NO：1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。

10.赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物中导入有权利要求9所述的DNA。

11.权利要求10所述的微生物，该微生物为埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

12.权利要求11所述的微生物，该微生物为大肠杆菌。

13.以下(a)、(b)或(c)的蛋白：

(a)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得到的氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白；

(c)包含SEQ ID NO：2所示的一部分氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白。

14.微生物的培养方法，该方法包括：

通过使权利要求8、10、11或12所述的微生物黏附在载体上和/或凝集来回收该微生物。

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