JP7071283B2 - ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及び微生物 - Google Patents
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Description
本発明により鞭毛タンパク質をコードする遺伝子を不活性化する微生物は特に限定されず、細菌、酵母、糸状菌などが例示され、好ましくは、細菌である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア(Ralstonia)属、カプリアビダス(Cupriavidus)属、ワウテルシア(Wautersia)属、アエロモナス(Aeromonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomonas)属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)である。
形質転換により導入されるPHA合成酵素遺伝子としては特に限定されず、例えば、Aeromonas caviaeやAeromonas hydrophila、PseuromonasSP 61-3、Cupriavidus necator由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、1以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたPHA合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。具体的には、配列番号8に記載のアミノ酸配列で示されるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子、及び、配列番号8に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつポリヒドロキシアルカン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。上記配列相同性としては好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上である。
本発明の鞭毛破壊株が生産するPHAの種類としては、微生物が生産し得るPHAである限り特に限定されないが、炭素数4~16の3-ヒドロキシアルカン酸から選択される1種のモノマーの単独重合体、炭素数4~16の3-ヒドロキシアルカン酸から選択される1種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸(例えば、炭素数4~16の4-ヒドロキシアルカン酸)の共重合体、及び、炭素数4~16の3-ヒドロキシアルカン酸から選択される2種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、3-ヒドロキシ酪酸(略称:3HB)のホモポリマーであるP(3HB)、3HBと3-ヒドロキシ吉草酸(略称:3HV)の共重合体P(3HB-co-3HV)、3HBと3-ヒドロキシヘキサン酸(略称:3HH)の共重合体P(3HB-co-3HH)(略称:PHBH)、3HBと4-ヒドロキシ酪酸(略称:4HB)の共重合体P(3HB-co-4HB)、並びに、乳酸(略称:LA)を構成成分として含むPHA、例えば3HBとLAの共重合体P(LA-co-3HB)などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、PHBHが好ましい。なお、生産されるPHAの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたPHA合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
本発明の鞭毛破壊株は、微生物が本来有する鞭毛タンパク質をコードする遺伝子を不活性化したものである。鞭毛タンパク質とは、鞭毛繊維(フラジェリン)を構成するタンパク質を指す。鞭毛とは細胞の運動に関与する細胞器官であり、細胞外に伸びた鞭毛タンパク質、フックタンパク質、及び、細胞表層膜中のリポ多糖体膜、ペプチドグリカン層、ペリプラズム層、脂肪質膜に存在するリング、ロッドを構成する各タンパク質から構成される。バクテリアにおいては、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、及び、Cupriavidus属細菌のように数本の鞭毛を有する属、及び、ビブリオ属細菌のように、単鞭毛のものが存在することが知られている。不活性化する鞭毛タンパク質遺伝子は、微生物が本来的に有する鞭毛タンパク質遺伝子であればよく、特に限定されない。微生物がカプリアビダス・ネカトールである場合、鞭毛タンパク質は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する。本発明においては、配列番号1に記載のアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子、または、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化されることが好ましい。上記配列相同性としては好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上である。
本発明において、鞭毛タンパク質遺伝子を不活性化する方法としては、鞭毛タンパク質の合成を妨げる方法、又は、細胞内で合成された鞭毛タンパク質の細胞外への輸送を妨げる方法が挙げられる。より具体的には、例えば、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子、又はそのプロモーター配列の塩基配列の全体または一部を欠失させる方法、前記塩基配列の途中に終始コドンを導入する方法、前記遺伝子の転写を阻害する方法や、鞭毛タンパク質を細胞外に輸送するシステム(シャペロンタンパク質、シグナル配列、トランスポータータンパク質など)の機能を停止または抑制する方法などが挙げられる。また、遺伝子工学的手法を用いて不活性化してもよいし、突然変異を誘導する手法を用いて不活性化してもよい。
本発明の鞭毛破壊株では、PHA産生能の顕著な向上が確認されたが、それと共に、微生物の培養中に細胞外に蓄積するタンパク質の濃度が低下することが確認された。これらの効果は、鞭毛タンパク質遺伝子の不活性化により達成されるが、鞭毛タンパク質遺伝子に加えて他のタンパク質遺伝子を不活性化することで前記効果をより高めることができる。
本発明の鞭毛破壊株を培養することで、菌体内にPHAを蓄積させることができる。本発明の鞭毛破壊株を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、培地に適切な炭素源を添加して培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
培養終了後、培養液10mlを量り取り、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定することにより、乾燥菌体重量(X g/L)を取得した。
各実施例及び比較例では、培養液の上清中のタンパク質濃度を以下の方法で測定した。
(1)培養液1mlを1.5ml容のマイクロチューブに入れ、15000gにて5分間遠心分離を行なった。
(2)遠心後の上清を分離した。
(3)分離した培養上清中のタンパク質濃度をタンパク質測定キット(Quick Startプロテインアッセイ:BIO-RAD社製)にて定量した。なお、検量線作成用タンパク質としてはBSAを使用した。
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。C.necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号9及び配列番号10で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。PCRは(1)98℃で2分、(2)98℃で15秒、(3)60℃で30秒、(4)68℃で2分を25サイクル繰り返し、ポリメラーゼはKOD-plus-(東洋紡社製)を用いた。また同様に、配列番号11及び配列番号12で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種類のDNA断片をテンプレートとして、配列番号9及び配列番号12で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。C.necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号13及び配列番号14で示されるプライマーを用いて、製造例1に記載の条件でPCRを行った。また同様に、配列番号15及び配列番号16で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種類のDNA断片をテンプレートとして、列番号13及び配列番号16で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。
製造例1の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、製造例1で作製したKNK-252/dfliC株を親株として、製造例2で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターpNS2X-sacB+plcN4UDを用いて、染色体上のplcN4遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株KNK-252/dfliC/dplcN4株を作製した。KNK-252/dfliC/dplcN4株はKNK-252株の染色体上のfliC遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにplcN4遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。phoA1構造遺伝子とphoA2構造遺伝子はC.necator H16株のゲノム上でオペロンを形成しており、このphoAオペロンを破壊するようにプラスミドを設計した。作製は以下のように行った。C.necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号17及び配列番号18で示されるプライマーを用いて、製造例1に記載の条件でPCRを行った。また同様に、配列番号19及び配列番号20で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種類のDNA断片をテンプレートとして、配列番号17及び配列番号20で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。
C.necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号21及び配列番号22で示されるプライマーを用いて、製造例1に記載の条件でPCRを行った。また同様に、配列番号23及び配列番号24で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種類のDNA断片をテンプレートとして、配列番号21及び配列番号24で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。
C.necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号25及び配列番号26で示されるプライマーを用いて、製造例1に記載の条件でPCRを行った。また同様に、配列番号27及び配列番号28で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種類のDNA断片をテンプレートとして、配列番号25及び配列番号28で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。
C.necator H16株の染色体DNAをテンプレートとして配列番号30及び配列番号31で示されるプライマーを用いて、製造例1に記載の条件でPCRを行った。また同様に、配列番号32及び配列番号33で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種類のDNA断片をテンプレートとして、配列番号30及び配列番号33で示されるプライマーを用いて同様の条件でPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。
製造例1~7で作製した微生物、C.necator H16株(ATCC17699株)、及びKNK-252株を用いた培養検討を行なった。
Claims (5)
- 形質転換によって導入されたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された、カプリアビダス属に属する微生物を培養して、当該微生物にポリヒドロキシアルカン酸を生産させる工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、配列番号8に記載のアミノ酸配列で示されるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子、又は、配列番号8に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で示され、かつポリヒドロキシアルカン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、
前記鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子、又は、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子である、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 - 前記微生物は、さらに、配列番号2又は3に記載のアミノ酸配列で示されるリパーゼ、配列番号4又は5に記載のアミノ酸配列で示される脱リン酸化酵素、配列番号6又は7に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質、及び、配列番号2~7のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で示されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子が不活性化されたものである、請求項1に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸は、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシヘキサン酸の共重合体である、請求項1又は2に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 形質転換によって導入されたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された、カプリアビダス属に属する微生物であって、
前記ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、配列番号8に記載のアミノ酸配列で示されるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子、又は、配列番号8に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で示され、かつポリヒドロキシアルカン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、
前記鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子、又は、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子である、微生物。 - 前記微生物がCupriavidus necatorである、請求項4に記載の微生物。
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