CN110062807A - 聚羟基链烷酸酯的制造方法及微生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高了PHA的生产性的基于微生物的PHA制造方法、以及该制造方法所利用的PHA生成微生物。所述聚羟基链烷酸酯的制造方法包括以下工序：对具有聚羟基链烷酸酯合成酶基因、且编码鞭毛蛋白的基因失活了的微生物进行培养，使该微生物生产聚羟基链烷酸酯。所述微生物是脂肪酶、去磷酸化酶、由序列号6或7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质也失活了的微生物。所述微生物可以是杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。

Description

聚羟基链烷酸酯的制造方法及微生物

技术领域

本发明涉及基于微生物的聚羟基链烷酸酯的制造方法、以及该微生物。

背景技术

以对环境问题、粮食问题、健康及安全的意识提高、崇尚天然或自然的提高等为背景，利用了微生物的物质制造(发酵生产、生物转化等)的意义及重要性日益增高，蛋白质医药品、基因治疗用的核酸等的制造中也应用了基于微生物的物质生产。例如，利用了酵母、细菌等微生物的乙醇、乙酸、医疗用蛋白质的生产等被积极地应用于工业中。

作为其一例，可以举出期待作为生物降解性塑料而在工业上应用的聚羟基链烷酸酯(以下也称为PHA)的基于微生物的生产(参照非专利文献1)。PHA是在多个微生物物种的细胞中作为储能物质而生成、积累的热塑性聚酯，具有生物降解性。目前，由于环境保护的意识提高而着眼于非石油来源的塑料，其中，特别是对于微生物在菌体内生成并积累的PHA而言，由于被纳入自然界的碳循环过程，因此预想对生态系统的不良影响很小，迫切希望其实用化。已知在利用了微生物的PHA生产中，例如，对作为细菌的杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)给予作为碳源的糖、植物油脂、脂肪酸，使PHA在细胞内积累，由此生产PHA(参照非专利文献2及3)。

然而，利用了微生物的物质生产存在因繁杂的操作、培养基成本、低生产率(低产物浓度和/或低生产速度)等问题而使生产成本增高的问题的情况。因此，提高微生物培养的生产率、增加基于微生物的物质生产效率是降低生产成本的重大课题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Anderson AJ.,et al.,Int.J.Biol.Macromol.,12,201-105(1990)

非专利文献2：Sato S.,et al.,J.Biosci.Bioeng.,120(3),246-251(2015)

非专利文献3：Insomphun C.,et al.,Metab.Eng.,27,38-45(2015)

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于，鉴于上述现状，提供一种提高了PHA的生产率的基于微生物的PHA的制造方法、以及该制造方法所利用的PHA生成微生物。

解决课题的方法

通常，微生物为了适应环境(温度、pH、营养状态、溶解氧浓度、碳源等)而表达各种各样的基因。基因被转录、翻译而生产的蛋白质在适应环境方面起到重要的作用。由于微生物中的蛋白质生产是微生物为了生存、生长及适应外部环境所必须的生命现象，因此，在使蛋白质的生产能力降低时，与此相伴的微生物的生长、基于微生物的有用物质的生产能力降低是当然可以预期的现象。

根据Raberg等(Raberg M.,et al.,App.Environ.Microbiol.,74(14),4477-4490(2008))，报告了在杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的破坏了编码转录因子的基因rpoN的菌株(HF09)中，鞭毛形成量比野生型降低，在培养终点，PHA含量也低至34％。另外，在用TSB培养基培养ΔPHAP1株时，未确认到鞭毛的形成，显示出PHA含量显著降低的结果。由此，对于破坏编码转录因子的基因rpoN而使鞭毛形成能力降低的菌株而言，显示出PHA生成能力也降低的结果。

然而，本申请发明人等惊讶地发现，在原本具有鞭毛蛋白生产能力的PHA生成微生物中，使编码鞭毛蛋白的基因失活而得到的PHA生成微生物的PHA生成能力显著提高，从而完成了本发明。

即，本发明是一种聚羟基链烷酸酯的制造方法，该方法包括以下工序：对具有聚羟基链烷酸酯合成酶基因、且编码鞭毛蛋白的基因失活了的微生物进行培养，使该微生物生产聚羟基链烷酸酯。

优选所述微生物是编码选自以下至少1种蛋白质的基因也失活了的微生物：由序列号2或3中记载的氨基酸序列表示的脂肪酶、由序列号4或5中记载的氨基酸序列表示的去磷酸化酶、由序列号6或7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质、以及由相对于序列号2～7中任一项记载的氨基酸序列具有90％以上序列相同性的氨基酸序列表示的蛋白质。

优选所述聚羟基链烷酸酯为3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。

另外，本发明是一种微生物，其具有聚羟基链烷酸酯合成酶基因，且编码鞭毛蛋白的基因失活。

优选所述微生物为杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。

发明的效果

根据本发明，在利用微生物生产PHA时，可以提高PHA的生产率。另外，可以减少微生物培养中排出至细胞外的蛋白质。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本发明的微生物是具有PHA合成酶基因的PHA生成微生物，是编码鞭毛蛋白的基因失活了的微生物(以下，也称为本发明的鞭毛破坏株)。

(微生物)

利用本发明使编码鞭毛蛋白的基因失活的微生物没有特别限定，可以示例出细菌、酵母、丝状菌等，优选为细菌。作为该细菌，例如可以举出属于罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属、贪铜菌(Cupriavidus)属、沃特斯氏菌(Wautersia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、埃希氏菌(Escherichia)属、产碱菌(Alcaligenes)属、假单胞菌(Pseudomonas)属等的细菌类作为优选的例子。从安全性及生产率的观点考虑，更优选为属于罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属、气单胞菌属、沃特斯氏菌属的细菌，进一步优选为属于贪铜菌属或气单胞菌属的细菌，进一步更优选为属于贪铜菌属的微生物，特别优选为杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。

本发明的鞭毛破坏株是具有PHA合成酶基因的PHA生成微生物，使编码鞭毛蛋白的基因失活的微生物可以是原本具有PHA合成酶基因的野生株，也可以是对这样的野生株进行人工突变处理而得到的突变株、或者利用基因工程学方法导入了外源的PHA合成酶基因的菌株。

(PHA合成酶基因)

作为通过转化导入的PHA合成酶基因，没有特别限定，可以列举例如：来自于Aeromonas caviae(豚鼠气单胞菌)、Aeromonas hydrophila(嗜水气单胞菌)、PseuromonasSP 61-3、Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌)的聚羟基链烷酸酯合成酶基因、它们的变体等。作为上述变体，可以使用编码缺失、添加、插入或取代1个以上的氨基酸残基而成的PHA合成酶的碱基序列等。具体而言，可以举出：由序列号8中记载的氨基酸序列表示的编码聚羟基链烷酸酯合成酶的基因、以及以相对于序列号8中记载的氨基酸序列具有90％以上的序列相同性的氨基酸序列表示、且编码具有聚羟基链烷酸酯合成酶活性的多肽的基因。作为上述序列相同性，优选为95％以上，更优选为97％以上，特别优选为99％以上。

(PHA)

作为本发明的鞭毛破坏株生产的PHA的种类，只要是微生物能够生产的PHA即可，没有特别限定，优选为选自碳原子数4～16的3-羟基链烷酸中的1种单体的均聚物、选自碳原子数4～16的3-羟基链烷酸中的1种单体与其它羟基链烷酸(例如，碳原子数4～16的4-羟基链烷酸)的共聚物、以及选自碳原子数4～16的3-羟基链烷酸中的2种以上单体的共聚物。可以列举例如：3-羟基丁酸(简称：3HB)的均聚物P(3HB)、3HB与3-羟基戊酸(简称：3HV)的共聚物P(3HB-co-3HV)、3HB与3-羟基己酸(简称：3HH)的共聚物P(3HB-co-3HH)(简称：PHBH)、3HB与4-羟基丁酸(简称：4HB)的共聚物P(3HB-co-4HB)、以及含有乳酸(简称：LA)作为构成成分的PHA、例如3HB与LA的共聚物P(LA-co-3HB)等，但并不限定于此。其中，从作为聚合物的应用范围广的观点考虑，优选为PHBH。需要说明的是，根据目的，生产的PHA的种类可以根据使用的微生物所具有的、或另行导入的PHA合成酶基因的种类、与其合成相关的代谢系统的基因的种类、培养条件而适当选择。

(鞭毛蛋白)

本发明的鞭毛破坏株是使微生物原本具有的编码鞭毛蛋白的基因失活而得到的菌株。鞭毛蛋白是指构成鞭毛纤维(flagellin)的蛋白质。鞭毛是与细胞运动相关的细胞器官，其由延伸至细胞外的鞭毛蛋白、Hook蛋白、以及构成存在于细胞表层膜中的脂多糖膜、肽聚糖层、周质层、脂质膜的环、杆的各种蛋白质构成。已知在细菌中存在如大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌及贪铜菌(Cupriavidus)属细菌那样具有数根鞭毛的属、以及如弧菌属细菌那样单鞭毛的属。失活的鞭毛蛋白基因可以是微生物原本具有的鞭毛蛋白基因，没有特别限定。在微生物为杀虫贪铜菌的情况下，鞭毛蛋白具有序列号1中记载的氨基酸序列。在本发明中，优选使编码由序列号1中记载的氨基酸序列表示的鞭毛蛋白的基因失活、或者使编码以相对于序列号1中记载的氨基酸序列具有90％以上序列相同性的氨基酸序列表示的鞭毛蛋白的基因失活。作为上述序列相同性，优选为95％以上，更优选为97％以上，特别优选为99％以上。

(失活)

在本发明中，作为使鞭毛蛋白基因失活的方法，可以列举：妨碍鞭毛蛋白的合成的方法、或妨碍细胞内合成的鞭毛蛋白向细胞外运送的方法。更具体可以列举例如：使编码鞭毛蛋白的基因或其启动子序列的碱基序列的全部或一部分缺失的方法、在上述碱基序列的中间导入终止密码子的方法、阻碍上述基因的转录的方法、停止或抑制将鞭毛蛋白运送至细胞外的系统(伴侣蛋白、信号序列、转运蛋白等)的功能的方法等。另外，可以使用基因工程学的方法使其失活，也可以使用诱导突变的方法使其失活。

(失活的其它基因)

在本发明的鞭毛破坏株中确认到了PHA生成能力的显著提高，与此相伴，确认到了在微生物的培养中在细胞外积累的蛋白质的浓度降低。这些效果可以通过鞭毛蛋白基因的失活而实现，但除了使鞭毛蛋白基因失活以外，还使其它蛋白质基因失活，由此可以进一步提高上述效果。

在本发明中，除了鞭毛蛋白基因以外，作为失活的蛋白质基因，没有特别限定，从提高PHA生成能力及降低细胞外蛋白质浓度的观点考虑，优选为磷脂酶等脂肪酶、碱性磷酸酶等磷酸酶、由序列号6或7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质等酶蛋白质；存在于ABC转运器的底物结合结构域(Locher KP.,et al.,Phil.Trans.R.Soc.B,346,239-245(2009))等细胞周质区域的蛋白质等。更优选为磷脂酶、碱性磷酸酶、由序列号6或7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质或其同源蛋白质、以及它们的组合，特别优选为由序列号2或3中记载的氨基酸序列表示的磷脂酶或其同源蛋白质、由序列号4或5中记载的氨基酸序列表示的磷酸酶或其同源蛋白质、由序列号6或7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质或其同源蛋白质、以及它们的组合。这里，同源蛋白质是指，相对于上述特定的氨基酸序列具有90％以上序列相同性的氨基酸序列表示、且显示出上述特定的酶活性的蛋白质。作为上述序列相同性，优选为95％以上，更优选为97％以上，特别优选为99％以上。需要说明的是，作为使这些其它蛋白质基因失活的方法，可以举出与上述的使鞭毛蛋白失活的方法相同的方法。

(PHA制造方法)

通过培养本发明的鞭毛破坏株，可以使PHA在菌体内积累。作为培养本发明的鞭毛破坏株的方法，只要按照通常的微生物培养法在培养基中添加适当的碳源进行培养即可。培养基组成、碳源的添加方法、培养规模、通气搅拌条件、培养温度、培养时间等没有特别限定。碳源优选连续或分批地添加于培养基。

进行适当时间的培养使PHA在菌体内积累之后，使用公知的方法从菌体中回收PHA。具体而言，可以通过以下的方法进行。在培养结束后，利用离心分离机等从培养液中分离菌体，通过蒸馏水及甲醇等清洗该菌体，并使其干燥。使用氯仿等有机溶剂从该干燥菌体中提取PHA。从包含该PHA的溶液中通过过滤等除去菌体成分，向该滤液中添加甲醇、己烷等不良溶剂，使PHA沉淀。进一步通过过滤、离心分离除去上清液，使其干燥，可以回收PHA。

根据使用了本发明的鞭毛破坏株的PHA制造方法，从使用了微生物的工业规模的PHA生产的观点考虑，优选PHA生产量可以达到150g/L以上，更优选为160g/L以上，进一步优选为170g/L以上。而且，优选培养液的上清中的蛋白质浓度可以达到800mg/L以下，更优选为700mg/L以下，进一步优选为500mg/L以下，最优选为300mg/L以下。通过降低上清中的蛋白质浓度，可以获得提高原料收率、减轻排水处理的负担等优点。

实施例

以下，通过实施例对本发明进一步具体地进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。

(PHA生产量的测定方法)

在培养结束后，量取培养液10ml，通过离心分离回收菌体，用甲醇清洗，进行冷冻干燥，测定干燥菌体重量，由此获得干燥菌体重量(X g/L)。

在得到的干燥菌体1g中加入100ml的氯仿，在室温下搅拌一昼夜，提取了菌体内的PHA。滤去菌体残渣之后，用旋转蒸发仪浓缩至总容量为30ml，然后逐渐加入90ml的己烷，缓慢搅拌，并放置1小时。滤去析出的PHA之后，在50℃下真空干燥3小时。测定干燥PHA的重量，计算出菌体内的聚合物含量(Y wt％)。按照X×Y/100＝Z的数学式计算出PHA的生产量(Zg/L)。

(蛋白质浓度的测定方法)

在各实施例及比较例中，通过以下的方法测定了培养液的上清中的蛋白质浓度。

(1)将培养液1ml加入1.5ml容积的微管(microtube)，以15000g进行了5分钟的离心分离。

(2)对离心后的上清进行分离。

(3)使用蛋白质测定试剂盒(Quick Start Protein Assay：BIO-RAD公司制造)对分离的培养上清中的蛋白质浓度进行定量。需要说明的是，作为校准曲线绘制用蛋白质，使用了BSA。

(制造例1)KNK-252/dfliC株的制备

首先，进行了基因破坏用质粒的制备。制备如下所述地进行。将C.necator H16株的染色体DNA作为模板，使用由序列号9及序列号10表示的引物进行了PCR。PCR重复进行25个循环：(1)98℃下2分钟、(2)98℃下15秒钟、(3)60℃下30秒钟、(4)68℃下2分钟，聚合酶使用了KOD-plus-(东洋坊株式会社制造)。另外，同样地使用由序列号11及序列号12表示的引物进行了PCR。进而，将通过上述PCR得到的2种DNA片段作为模板，使用由序列号9及序列号12表示的引物在相同的条件下进行PCR，用限制酶SmiI对得到的DNA片段进行消化。

用SmiI消化后的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋坊株式会社制造))将消化得到的DNA片段进行连接，制备了具有相对于fliC结构基因在上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+fliCUD。

接着，进行了基因破坏株的制备。制备如下所述地进行。用基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+fliCUD对大肠杆菌S17-1株(ATCC47055)进行转化，在KNK-005REP-PHAJ4bΔPHAZ1::Plac-PHACReΔPHAZ2,6株(参照国际公开第2015/146195号。以下，将该菌株称为KNK-252株)和Nutrient Agar(营养琼脂)培养基(Difco公司制造)上进行混合培养，并进行了接合转移。

需要说明的是，KNK-252株是如下菌株：Cupriavidus necator H16株的染色体上的PHAZ1基因及PHAZ6基因的全部长度缺失，PHAZ2基因的从第16号密码子至终止密码子缺失，在紧接着PHAJ4b基因的上流插入由REP启动子及PHAC1SD(REP-SD)序列构成的表达调控序列，在缺失了PHAZ1基因的区域插入lac启动子、PHAC1SD(REP-SD)序列及PHACRe结构基因序列，在染色体上具有编码序列号8中记载的PHA合成酶的基因。

进一步，将混合培养后的菌体接种于包含250mg/L卡那霉素的西蒙氏(Simmons)琼脂培养基(柠檬酸钠2g/L、氯化钠5g/L、七水合硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、琼脂15g/L、pH6.8)，对在琼脂培养基上生长的菌株进行筛选，得到了将质粒导入KNK-252株的染色体上的菌株。用Nutrient Broth培养基(Difco公司制造)将该株培养了2代，然后稀释并涂布在包含15％蔗糖的Nutrient Agar培养基上，得到了生长的菌株作为质粒脱落的菌株。

另外，通过利用PCR进行的分析，分离了1株如下所述的菌株，该菌株的染色体上的编码序列号1中记载的氨基酸序列的fliC基因(鞭毛蛋白基因)从起始密码子至终止密码子缺失。将该基因破坏株命名为KNK-252/dfliC株。

(制造例2)KNK-252/dplcN4株的制备

首先，进行了基因破坏用质粒的制备。制备如下所述地进行。将C.necator H16株的染色体DNA作为模板，使用由序列号13及序列号14表示的引物，在制造例1中记载的条件下进行了PCR。另外，同样地使用由序列号15及序列号16表示的引物进行了PCR。进一步，将上述PCR得到的2种DNA片段作为模板，使用由序列号13及序列号16表示的引物在相同的条件下进行PCR，用限制酶SmiI对得到的DNA片段进行消化。

用SmiI消化后的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋坊株式会社制造))将消化得到的DNA片段进行连接，制备了具有相对于plcN4结构基因在上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+plcN4UD。

接着，与制造例1的基因破坏株的制备方法同样地将KNK-252株作为亲本株，使用基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+plcN4UD，制备了染色体上的plcN4基因(磷脂酶基因)从起始密码子至终止密码子缺失了的染色体基因破坏株KNK-252/dplcN4株。

(制造例3)KNK-252/dfliC/dplcN4株的制备

与制造例1的基因破坏株的制备方法同样地将制造例1中制备的KNK-252/dfliC株作为亲本株，使用制造例2中制备的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+plcN4UD，制备了染色体上的plcN4基因从起始密码子至终止密码子缺失了的染色体基因破坏株KNK-252/dfliC/dplcN4株。KNK-252/dfliC/dplcN4株是KNK-252株的染色体上的fliC基因从起始密码子至终止密码子缺失、且plcN4基因从起始密码子至终止密码子缺失了的菌株。

(制造例4)KNK-252/dfliC/dplcN4/dphoA1,2株的制备

首先，进行了基因破坏用质粒的制备。phoA1结构基因和phoA2结构基因在C.necator H16株的基因组上形成了操纵子，以破坏该phoA操纵子的方式设计了质粒。制备如下所述地进行。将C.necator H16株的染色体DNA作为模板，使用由序列号17及序列号18表示的引物，在制造例1中记载的条件下进行了PCR。另外，同样地使用由序列号19及序列号20表示的引物进行了PCR。进而，将上述PCR得到的2种DNA片段作为模板，使用由序列号17及序列号20表示的引物在相同条件下进行PCR，用限制酶SmiI对得到的DNA片段进行消化。

用SmiI消化后的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋坊株式会社制造))将消化得到的DNA片段进行连接，制备了具有相对于phoA操纵子在上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+phoA1,2UD。

接着，与制造例1的基因破坏株的制备方法同样地将制造例3中制备的KNK-252/dfliC/dplcN4株作为亲本株，使用基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+phoA1,2UD，制备了染色体上从phoA1基因的起始密码子至phoA2基因(编码由序列号4及5中记载的氨基酸序列表示的去磷酸化酶的基因)的终止密码子缺失了的染色体基因破坏株KNK-252/dfliC/dplcN4/dphoA1,2株。

(制造例5)KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2株的制备

将C.necator H16株的染色体DNA作为模板，使用由序列号21及序列号22表示的引物，在制造例1中记载的条件下进行了PCR。另外，同样地使用由序列号23及序列号24表示的引物进行了PCR。进而，将上述PCR得到的2种DNA片段作为模板，使用由序列号21及序列号24表示的引物在相同条件下进行PCR，用限制酶SmiI对得到的DNA片段进行消化。

用SmiI消化后的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋坊株式会社制造))将消化得到的DNA片段进行连接，制备了具有相对于plcN1在上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+plcN1UD。

接着，与制造例1的基因破坏株的制备方法同样地将制造例4中制备的KNK-252/dfliC/dplcN4/dphoA1,2株作为亲本株，使用基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+plcN1UD，得到了染色体上的plcN1基因(磷脂酶基因)从起始密码子至终止密码子缺失了的染色体基因破坏株KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2株。

(制造例6)KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2/B1168株的制备

将C.necator H16株的染色体DNA作为模板，使用由序列号25及序列号26表示的引物，在制造例1中记载的条件下进行了PCR。另外，同样地使用由序列号27及序列号28表示的引物进行了PCR。进而，将上述PCR得到的2种DNA片段作为模板，使用序列号25及序列号28表示的引物在相同条件下进行PCR，用限制酶SmiI对得到的DNA片段进行消化。

用SmiI消化后的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋坊株式会社制造))将消化得到的DNA片段进行连接，制备了具有相对于由序列号29表示的基因在上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+B1168UD。

接着，与制造例1的基因破坏株的制备方法同样地将制造例5中制备的KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2株作为亲本株，使用基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+B1168UD，制备了染色体上的由序列号29表示的基因(编码由序列号7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质的基因)从起始密码子至终止密码子缺失了的染色体基因破坏株KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2/B1168株。

(制造例7)KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2/B1168/A3733株的制备

将C.necator H16株的染色体DNA作为模板，使用由序列号30及序列号31表示的引物，在制造例1中记载的条件下进行了PCR。另外，同样地使用由序列号32及序列号33表示的引物进行了PCR。进而，将上述PCR得到的2种DNA片段作为模板，使用由序列号30及序列号33表示的引物在相同条件下进行PCR，用限制酶SmiI对得到的DNA片段进行消化。

用SmiI消化后的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋坊株式会社制造))将消化得到的DNA片段进行连接，制备了具有相对于由序列号34表示的基因在上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+A3733UD。

接着，与制造例1的基因破坏株的制备方法同样地将制造例6中制备的KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2/B1168株作为亲本株，使用基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB+A3733UD，制备了染色体上的由序列号34表示的基因(编码由序列号6中记载的氨基酸序列表示的蛋白质的基因)从起始密码子至终止密码子缺失了的染色体基因破坏株KNK-252/dfliC/dplcN1,4/dphoA1,2/B1168/A3733株。

(实施例1～6及比较例1～3)PHA的制造

进行了使用制造例1～7中制备的微生物、C.necator H16株(ATCC17699株)及KNK-252株的培养研究。

母种培养基的组成为1w/v％Meat-extract、1w/v％Bacto-Tryptone、0.2w/v％Yeast-extract、0.9w/v％Na₂HPO₄·12H₂O、0.15w/v％KH₂PO₄、(pH6.8)。

前培养培养基的组成为1.1w/v％Na₂HPO₄·12H₂O、0.19w/v％KH₂PO₄、1.29w/v％(NH₄)₂SO₄、0.1w/v％MgSO₄·7H₂O、2.5w/v％棕榈油精油(palm olein oil)、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶解有1.6w/v％FeCl₃·6H₂O、1w/v％CaCl₂·2H₂O、0.02w/v％CoCl₂·6H₂O、0.016w/v％CuSO₄·5H₂O、0.012w/v％NiCl₂·6H₂O而得到的溶液)。作为碳源，以10g/L的浓度一次添加了棕榈油精油。

PHA生产培养基的组成为0.385w/v％Na₂HPO₄·12H₂O、0.067w/v％KH₂PO₄、0.291w/v％(NH₄)₂SO₄、0.1w/v％MgSO₄·7H₂O、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶解有1.6w/v％FeCl₃·6H₂O、1w/v％CaCl₂·2H₂O、0.02w/v％CoCl₂·6H₂O、0.016w/v％CuSO₄·5H₂O、0.012w/v％NiCl₂·6H₂O而得到的溶液)。

首先，将各株的甘油保存菌(50μl)分别接种于母种培养基(10ml)，培养24小时，进行了母种培养。接着，将1.0v/v％的母种培养液接种于装有1.8L前培养培养基的3L发酵罐(Marubishi Bio Engineering公司制造的MDL-300型)。运行条件为培养温度33℃、搅拌速度500rpm、通气量1.8L/min，将pH控制为6.7～6.8之间并培养28小时，进行了前培养。pH控制中使用了14％的氢氧化铵水溶液。

接着，将5.0v/v％的前培养液接种于装有2.5L的PHA生产培养基的5L发酵罐(Marubishi Bio Engineering公司制造的MDS-U50型)。运行条件为培养温度33℃、搅拌速度420rpm、通气量2.1L/min，将pH控制为6.7～6.8之间。pH控制中使用了25％的氢氧化铵水溶液。断续地添加了碳源。作为碳源，使用了棕榈油精油。进行48小时的培养，在培养结束时刻得到培养液样品，按照上述方法测定了PHA生产量及蛋白质浓度。将结果示于表1。

培养的结果可以确认，对于使鞭毛蛋白失活了的制造例1、3～8的菌株而言，与未使鞭毛蛋白失活的比较例的菌株相比，PHA生成能力提高。而且确认了，对于制造例1、3～8的菌株而言，与比较例的菌株相比，培养液的上清中的蛋白质浓度降低。

需要说明的是，通过HPLC分析确认了由各制造例的菌株生产的聚羟基链烷酸酯为PHBH。

表1

序列表

<110> 株式会社钟化（Kaneka Corporation）

<120> 聚羟基链烷酸酯的制造方法及微生物

<130> B160693

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 435

<212> PRT

<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

<400> 1

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435

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<212> PRT

<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

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65 70 75 80

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195 200 205

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<212> PRT

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<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

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<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

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<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

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260 265 270

Ala Asp Leu Val Pro Thr Val Leu Ala His Ala Gly Val Ala Leu Asp

275 280 285

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Gly Val Arg Ala Ile Gly Ala Ser Ile Ser Gln Tyr Asn Asp Ala Ile

305 310 315 320

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325 330 335

Leu Arg Asp Gly Val Gln Ile Ala Ser Leu Gly Pro Glu Val Arg Gln

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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Asn Gly Thr Gly Glu Pro Ile Leu Ser Asn Lys Asn Tyr Ile Ser Gly

485 490 495

Gly Asn Pro Gly Ile Ala Val Ala Leu Phe Gly Ser Cys Glu Ile Arg

500 505 510

Phe Asn Leu Gly Ser Gly Ser Gly Lys Arg Asp Asp Ile Asn Gly Met

515 520 525

Lys Val Ser Ala Asn Gln Trp Ala Tyr Leu Ala Leu Ser Val Asp Ala

530 535 540

Ala Ala Arg Arg Phe Ser Ala Tyr Val Ile Asp Pro Val Leu Gly Leu

545 550 555 560

Gln Arg Thr Glu Asn Lys Ala Ile Thr Asn Thr Asp Val Thr Lys Leu

565 570 575

Ala Gly Leu Gly Thr Gly Trp Gly Val Asn Asp Asp Ala Thr His Asn

580 585 590

Tyr Val Gly Asn Asn Pro Gly Ala Leu Lys Gly Val Met Gly Phe Asn

595 600 605

Asp Leu Ala Met Trp Thr Arg Val Leu Ser Leu Asp Glu Leu Lys Ala

610 615 620

Ile Thr Gly Ala Arg Gln Pro Leu Ser Thr Leu Asn Pro

625 630 635

<210> 8

<211> 594

<212> PRT

<213> Aeromonas caviae(豚鼠气单胞菌)

<400> 8

Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr

1 5 10 15

Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala

20 25 30

Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu

35 40 45

Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp

50 55 60

Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala

65 70 75 80

Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg

85 90 95

Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys

100 105 110

Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala

115 120 125

Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr

130 135 140

Arg Gln Tyr Val Asn Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn

145 150 155 160

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Asp Gly Gln Asn Leu Val

165 170 175

Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln

180 185 190

Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu

210 215 220

Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val

225 230 235 240

Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg

245 250 255

Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val

260 265 270

Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp

275 280 285

Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val

290 295 300

Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile

305 310 315 320

Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg

325 330 335

Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp

340 345 350

Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile

355 360 365

Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg

370 375 380

Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp

385 390 395 400

Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe

405 410 415

Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr

420 425 430

His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys

435 440 445

Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys

450 455 460

Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp

465 470 475 480

Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe

485 490 495

Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala

500 505 510

Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro

515 520 525

Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro

530 535 540

Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val

545 550 555 560

Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr

565 570 575

Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp

580 585 590

Ala Ala

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 9

gcgcgcattt aaatcagacg actacgtggt gctg 34

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 10

ggtacgactc ctatatgcaa 20

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

ttgcatatag gagtcgtacc tcgcatcggc gaatggcgca 40

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

gcgcgcattt aaatttgtcg atcaccttgg tgat 34

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

gcgcgcattt aaatgcacgc cagccgctgt ccac 34

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 14

ggattctgtg ccgggtggtt 20

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

aaccacccgg cacagaatcc cgcgcaagtc gcctgacggg 40

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

gcgcgcattt aaatggcgtt gcgcagcagg tagt 34

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 17

gggatgattt aaatgtgtcg ctggcggcca tatc 34

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 18

cagcaaggcc gcggccggca atttcctccc cgttggtttt 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 19

aaaaccaacg gggaggaaat tgccggccgc ggccttgctg 40

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 20

gggatgattt aaattcttgc gcatggcgtc gctg 34

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 21

gggatgattt aaatgtgtcg ctggcggcca tatc 34

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 22

cagcaaggcc gcggccggca atttcctccc cgttggtttt 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 23

aaaaccaacg gggaggaaat tgccggccgc ggccttgctg 40

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 24

gggatgattt aaattcttgc gcatggcgtc gctg 34

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 25

gggcccattt aaatcactgc gcttccgctc caac 34

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 26

acggccgcgc gacatccccg 20

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 27

cggggatgtc gcgcggccgt atccggccgg agcccgtttc 40

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 28

gcccggattt aaatgacaaa acggctacgc ccgc 34

<210> 29

<211> 2004

<212> DNA

<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

<400> 29

gtgctggccg ccaccatgat cgccgcactg gcggcaacac tggccggctg cggcggcggc 60

gatgacaccg cgccgacaac cgcaccgaac gacaccacca tcaagacccc gccgcctgcc 120

ggtgccggcg gcccgcgcgt gctgctggtc ggcgtggacg gtgccaccta tgcccaggtg 180

cagggcgcgc tgctgcggcg cgagctgccc aacctggccc ggctgaacct ggtgcccacc 240

gccaccggcg gcatgcccgg caccatcacc gcgcagccgc cgctggacgc gcccagctgg 300

gccacggtgc tgaccggcgc ctgggccaac cgccacggca tcgaagacga taccggcagc 360

accgcactgc aggcccccac cgtattccgc tacctgcgcg cggccggcaa acccggcctg 420

cagcaaggcg catccaccag ttcgggggtg ctgccgggcc tgctcaaggc cgagcaggaa 480

gcgggcatgc tcgatacgct ggttgactgc gccggggtcg acagctgcgt cacgcagaac 540

gccgtgcggc aggtgcagtc cggctatggc gtagtgtttg cgcaatacag cgcgccggca 600

caggcggcag aagccggcgg cttcggcaac ggcgcctatg ccacggccct ggccggcatc 660

gacaaggcgc tgggcgagct gctcggcgcc gtcgcagcgc gcagccaggg gcagccgggt 720

gaagactggc tggtgatggt caccaccagc cacggcctgg atgccaccgg cgccaccacc 780

acggtgccga cggtggagaa ccgcaccgcc ttcctcgcca ccaacaaggc gctcaacggc 840

gcgctggcca aacctggcgc agcagcgccg gacaccccgg cggacctgtc ggcgctgccg 900

accgaagccg atctcgtccc gaccgtgctg gcccacgccg gcgtggcgct tgacccggcc 960

accacgcggc tggacggttc ggcgctgacc accgccaacg caggcgtgcg agccatcggc 1020

gccagcatca gccagtacaa cgacgccatc acgctgagct ggcagaaccc gaccgaagcc 1080

ttcggcgtca cccgcgtgct gcgcgacggc gtgcagatcg cctcgctggg acctgaggtg 1140

cggcagttca ccgacaaggc cttcaacatg gccacgggcc tgtaccagtt caactacacg 1200

ctggtgcgca atgacgtgcc ggtgtcgtac ctggcgcaga tccactacgt caagccggtc 1260

atgctggcgc cgacgctgct caatggcctg gccacgtact tcagcctcga cagcaagccg 1320

ttcgccgatg cgaagaacgc cgccacgctc ggcccgtggg cggcaagcct tgacggcggc 1380

acgctggctg ccgacaactt cagcggccag tcgctgcagc tggactcgcg tgtcgacagc 1440

tacaagctgg cgtacaacgc tgccgccgat atcacgcaga gcccgcagtt caccatcggc 1500

ttctggttcc gcaccgactg cgcccagggc aacggcaccg gcgagcccat cctgtccaac 1560

aagaactaca tctcgggcgg caaccccggc attgccgtgg cgctgttcgg cagctgcgag 1620

atccgtttca acctgggcag cggcagcggc aagcgcgacg acatcaacgg catgaaggtg 1680

tcggccaacc agtgggccta cctggcgctg tcggtcgacg cggcagccag gcgcttcagc 1740

gcctatgtca tcgatccggt gctgggcctg cagaggaccg agaacaaggc gatcaccaat 1800

accgacgtga ccaagctggc cgggctcggc accggctggg gcgtgaacga cgatgccacg 1860

cacaactacg tgggcaacaa ccccggcgcg ctcaagggcg tgatgggctt caacgacctg 1920

gcgatgtgga cgcgcgtgct gtcgctggac gagctgaagg ccatcaccgg cgcacgccag 1980

ccgctgtcca cgctgaatcc ttaa 2004

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 30

gggcccattt aaatcaccgg ctacgcgcag atct 34

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 31

ggcgtggtct cctcggtttt 20

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 32

aaaaccgagg agaccacgcc gcacgctgcc aggcccgggc 40

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 33

cgcgcgattt aaatgccgtg gccgtagagc ttga 34

<210> 34

<211> 1281

<212> DNA

<213> Cupriavidus necator(杀虫贪铜菌) H16

<400> 34

atgcaacccc ttcgactgat cctgccgcgg gcctcgcgcc catccacggt gccggcgcgt 60

gcgctggccg tggccgccac cgccatgctc gccgcctgcg gtggcggcgg cggcgacgac 120

gcgccgtcca cgccggccgc ggtgcagacg cggctgtgcc cggcagcgct cgactactcc 180

accaccttta ccggcggcac cggctccggc gagctggtga aggtgcagat cgacaccacc 240

aaaaagacct ggcaggtgac cttcgtggac tcgtcggtgc cgcgccagac cggcaccgtg 300

cagcccacgc gcagcgatcc caccaacggg cagaacgtga tgcgcggcac gctgaaggcg 360

gagacggggt tgccgaccga gaagctcaac cagtgcgcgt tcgagctgag cggcgccagc 420

ctcgatccga accgtccggc caagctcttc gtcggcgaag gcgtggtggg cggcaccatc 480

ccgggcgcgc gcatccagtt caacggcgtg ctgggcgccg gcgcggtgcc ggacaccacc 540

ttcccgtatt tccagttcat cggcttcgcg cagaccgaga ccgacctgtc gaagattgcc 600

ggccagtaca acggcacggg cttccacgag gtgccgtcca agcagttcca gctggtggcg 660

caggactacc gcatggcgct ggctgccgat ggttccttca ccgtctgcga caacgccacc 720

aacacgtgcg agcgcaaggg caacaacttc gtgccgcagg cgagcggcgc gctgctgtcg 780

accaactaca aggccgagag ccagccgccc acgctgggcg gcacgctggg caaggcctac 840

ctgatcgtgg gcaagctgcg cggccagctg gtgccggtca tgatccgcgt gggctatgcc 900

aatgactcgc tcgccaacgg cccgcttggt gccgacgacg agatcggcat cggcatgatg 960

gcgccggcgg tagcgcttac tgaaggcacg gtcaacggcg aatacgtcgg cgtggacagc 1020

aacttcaact accgcgtgac ggcactggtc ggcgccgcgg ccaccatgat ggatccgttc 1080

cggccgcatg atgcctcgct cgccatcccg taccggctgg atttctcgca gcaggtgccg 1140

ggcgtggtcc gcacgtcgcg gcgcgatgcg cctgcaggct cggcgccgac cggcaagctg 1200

atgttcaccg gcggcgtgtt cggcttcctg gaacagcgcg acagcggccc gtacttcacc 1260

gtcggcgcat tcgtgcagta a 1281

Claims (5)

1.一种聚羟基链烷酸酯的制造方法，该方法包括以下工序：

对具有聚羟基链烷酸酯合成酶基因、且编码鞭毛蛋白的基因失活了的微生物进行培养，使该微生物生产聚羟基链烷酸酯。

2.根据权利要求1所述的聚羟基链烷酸酯的制造方法，其中，所述微生物是编码选自以下至少1种蛋白质的基因也失活了的微生物：

由序列号2或3中记载的氨基酸序列表示的脂肪酶、由序列号4或5中记载的氨基酸序列表示的去磷酸化酶、由序列号6或7中记载的氨基酸序列表示的蛋白质、以及由相对于序列号2～7中任一项记载的氨基酸序列具有90％以上序列相同性的氨基酸序列表示的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的聚羟基链烷酸酯的制造方法，其中，所述聚羟基链烷酸酯是3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。

4.一种微生物，其具有聚羟基链烷酸酯合成酶基因，且编码鞭毛蛋白的基因失活。

5.根据权利要求4所述的微生物，其中，所述微生物为杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)。