CN102575234A - 使用多羟基链烷酸酯合酶突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够合成乳酸酯聚合物(PLA)和乳酸酯共聚物(PLA共聚物)的多种多羟基链烷酸酯(PHA)合酶的突变体，以及使用所述突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法。更具体而言，本发明提供了以SEQ ID NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，以及使用所述合酶的突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法。以SEQ ID NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶，通过影响合成乳酸酯聚合物的活性的氨基酸序列突变可以具有合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性，并且通过使用所述合酶的突变体可以分别产生具有不同特征的乳酸酯聚合物和共聚物。

Description

使用多羟基链烷酸酯合酶突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法
技术领域
本发明涉及能够使用乳酰辅酶A(lactyl-CoA)作为底物合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的多种多羟基链烷酸酯合酶的突变体。而且，本发明还涉及一种使用多羟基链烷酸酯合酶的突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法，所述多羟基链烷酸酯合酶的突变体具有提高的合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性。
背景技术
聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解的聚合物，其非常适合作为用于医学用途或一般用途的聚合物。目前，PLA由微生物发酵制得的乳酸酯的聚合来制备，但是，这种乳酸酯的直接聚合只能制备具有低分子量(1000～5000道尔顿)的PLA。有一种使用链偶联剂由乳酸酯的直接聚合制得的低分子量PLA聚合得到高分子量PLA的方法，以合成具有至少100,000道尔顿的PLA。但是，上述方法的缺点在于，加入有机溶剂和链偶联剂使工艺更复杂，并且有机溶剂和链偶联剂还难以去除。作为目前商业化的制备高分子量PLA的方法，有一种在将乳酸酯转化为丙交酯之后通过该丙交酯环的开环缩合反应来合成PLA的方法。
当通过化学合成由乳酸酯合成PLA时，可以容易地制得PLA均聚物，但是，具有多种单体组成的PLA共聚物的合成是困难的，且具有非常低的工业效率。
同时，多羟基链烷酸酯(PHA)是一种在碳源过量但如磷、氮、镁和氧等其它营养物缺乏时，在微生物中作为能量或碳源储存物质积聚的聚酯。由于PHA与来源于常规石油的合成聚合物具有相似的物理性能，所以PHA被公认作为常规合成塑料的替代材料。
为了在微生物中制备PHA，需要将微生物的代谢产物转化为PHA单体的酶和利用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。另外，为了使用微生物合成PLA和PLA共聚物，需要该相同的体系，并且除了能够提供羟酰辅酶A的酶之外还需要一种能够另外提供乳酰辅酶A的酶，所述羟酰辅酶A是原始PHA合酶的底物。
即，这说明为了使用微生物有效地制备PLA和PLA共聚物，通过表达活化的类型而不抑制细胞生长来引入能够平稳地提供乳酰辅酶A的单体供给酶，以及能够有效地识别乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶是非常重要的。
发明内容
因此，本发明人研究了与来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.)6-19、已经被用于常规体系的多羟基链烷酸酯合酶具有高度氨基酸序列同源性的多羟基链烷酸酯合酶。于是，本发明人证明，乳酸酯聚合物和其共聚物可以通过如下方法高效率地制得：在具有高度同源性的合酶中从四个典型的假单胞菌(Pseudomonas)菌株克隆多羟基链烷酸酯合酶，然后制备改变能够影响乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的合成活性的氨基酸序列的突变体。因此，基于上述事实完成了本发明。
本发明的一个目的是提供一种能够利用多种多羟基链烷酸酯合酶的突变体产生乳酸酯聚合物或其共聚物的重组微生物和一种使用该重组微生物制备乳酸酯聚合物或其共聚物的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种使用乳酰辅酶A作为底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，其中所述突变体具有在以SEQ ID NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列中包含选自以下的至少一种突变的氨基酸序列：
a)E130D和Q481K；
b)E130D、S325T和Q481K；
c)E130D、S477F和Q481K；
d)E130D、S325T、S477F和Q481K；和
e)E130D、S325T、S477G和Q481K。
此外，本发明提供一种编码多羟基链烷酸酯合酶的突变体的基因，一种含有该基因的用于合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的重组载体，一种用该重组载体转化的转化体和一种包括对该转化体进行培养的制备乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法。
有益效果
根据本发明的所有多羟基链烷酸酯合酶通过影响合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性的氨基酸序列突变可以具有合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性，然后当使用合酶的突变体时，可以分别产生具有不同特征的乳酸酯共聚物。
附图说明
图1显示构建重组表达载体的过程的图，该重组表达载体包含本发明的具有与来源于假单胞菌MBEL 6-19的多羟基链烷酸酯合酶高度氨基酸序列同源性的II型多羟基链烷酸酯合酶、来源于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶突变体(Pct540Cp)和具有提高合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性、来自所述重组表达载体的多羟基链烷酸酯合酶的突变体；和
图2显示以下的氨基酸序列的多重比对：来源于用于本发明的假单胞菌MBEL 6-19的多羟基链烷酸酯合酶、来源于绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)的多羟基链烷酸酯合酶、来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2440的多羟基链烷酸酯合酶、来源于食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)的多羟基链烷酸酯合酶和来源于绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1的多羟基链烷酸酯合酶，其中被推测为催化残基的氨基酸残基(Cys296、Asp451和His479)以“*”标记，使底物特异性改变为乳酰辅酶A的氨基酸残基(Glu130、Ser325、Ser477和Gln481)分别以氨基酸序列中的编号标记。
具体实施方式
本发明通过同时包含乳酰辅酶A供给酶基因和来源于绿针假单胞菌的多羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO：1)、来源于恶臭假单胞菌KT2440的多羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO：3)、来源于食树脂假单胞菌的羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO：5)或来源于绿脓假单胞菌PAO1的多羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO：7)，提供一种具有产生乳酸酯聚合物及其共聚物的能力的重组微生物。
本发明提供一种使用乳酰辅酶A作为底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，其中所述突变体具有在以SEQ ID NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列中包含选自以下的至少一种的氨基酸序列：
a)E130D和Q481K；
b)E130D、S325T和Q481K；
c)E130D、S477F和Q481K；
d)E130D、S325T、S477F和Q481K；和
e)E130D、S325T、S477G和Q481K。
E130D突变是指第130个氨基酸谷氨酸被天门冬氨酸置换；S325T突变是指第325个氨基酸丝氨酸被苏氨酸置换；S477F突变是指第477个氨基酸丝氨酸被苯丙氨酸置换；Q481K突变是指第481个氨基酸谷氨酰胺被赖氨酸置换；S477G突变是指第477个氨基酸丝氨酸被甘氨酸置换。由于氨基酸序列中的上述突变，利用多羟基链烷酸酯合酶的突变体产生乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的活性可以新形成或提高。
SEQ ID NO：2、4、6和8的氨基酸序列分别是指来源于绿针假单胞菌的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列、来源于恶臭假单胞菌KT2440的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列、来源于食树脂假单胞菌的羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列和来源于绿脓假单胞菌PAO1的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列。本发明人证明当使用来源于上述四种假单胞菌菌株的PHA合酶的突变体时，使用乳酰辅酶A作为底物可以以高效率产生乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物。因此，基于上述事实完成了本发明。
另外，本发明提供编码多羟基链烷酸酯合酶的突变体的基因。
此外，本发明提供一种包含这些基因的用于合成乳酸酯聚合物或共聚物的重组载体。
而且，对于本发明，所述重组载体还包括SEQ ID NO：77的来源于丙酸梭菌(pctCp)的丙酰辅酶A转移酶基因。所述丙酰辅酶A转移酶是一种分别将乳酸酯和3-羟基丁酸酯转化为乳酰辅酶A和3-羟基丁酸酯辅酶A的酶。
优选地，所述丙酰辅酶A转移酶基因可以包括丙酰辅酶A转移酶的突变基因，该突变基因包含选自以下的至少一种突变：
a)在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
b)在SEQ ID NO：77碱基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C突变；
c)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Gly335Asp突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
d)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Ala243Thr突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
e)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Asp65Gly突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C突变；
f)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Asp257Asn突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
g)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Asp65Asn突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T699C、A1125G和T1158C突变；
h)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Thr199Ile突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T699C、A1125G和T1159C突变；和
i)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Val193Ala突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T78C、T699C和T1158C突变。
在SEQ ID NO：77碱基序列中，A1200G突变是指第1200个碱基腺嘌呤被鸟嘌呤置换的突变；T78C突变是指第78个碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶置换的突变；T669C突变是指第669个碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶置换的突变；A1125G突变是指第1125个碱基腺嘌呤被鸟嘌呤置换的突变；T1158C突变是指第1158个碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶置换的突变。在SEQ ID NO：78氨基酸序列中，Gly335Asp突变是指第335个氨基酸甘氨酸被天门冬氨酸置换的突变；Ala243Thr突变是指第243个氨基酸丙氨酸被苏氨酸置换的突变；Asp65Gly突变是指第65个氨基酸天门冬氨酸被甘氨酸置换的突变；Asp257Asn突变是指第257个氨基酸天门冬氨酸被天门冬酰胺置换的突变；Asp65Asn突变是指第65个氨基酸天门冬氨酸被天门冬酰胺置换的突变；Thr199Ile突变是指第199个氨基酸苏氨酸被异亮氨酸置换的突变；Val193Ala突变是指第193个氨基酸缬氨酸被丙氨酸置换的突变。
优选地，丙酰辅酶A转移酶的突变基因可以是包括SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Val193Ala突变和SEQ ID NO：77碱基序列中的T78C、T699C和T1158C突变的丙酰辅酶A转移酶(pct 540Cp)的突变基因。
此外，本发明提供一种用所述重组载体中的任何一个转化的转化体，通过使用上述重组载体中的任何一个对没有丙酰辅酶A转移酶的转化菌株进行转化而得到的转化体包括在本发明的范围内。
可以采用常规方法将根据本发明的重组载体转化到适合的宿主细胞中。细菌、酵母和真菌等可以用作宿主细胞，但本发明不限于此。根据本发明优选的宿主细胞是原核细胞，且优选是大肠杆菌。适合的原核细胞的实例包括大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12 294、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene)和大肠杆菌B等。但是，也可以使用例如FMB101、NM522、NM538和NM539的大肠杆菌菌株以及其它种和属的原核细胞。除了上述大肠杆菌之外，农杆菌属菌株，例如农杆菌A4，杆菌属，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，肠杆菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，以及各种假单胞菌属菌株可以用作宿主细胞，但本发明不限于此。
可用于本发明的用于转化的目标植物可以是烟草、番茄、辣椒、豆、水稻和玉米等，但本发明不限于此。此外，尽管用于转化的植物是有性繁殖的植物，但本领域普通技术人员可以理解，所述植物可以通过组织培养等而被无性地重复繁殖。
另外，本发明提供一种制备乳酸酯聚合物或其共聚物的方法，该方法包括培养转化体。
更优选地，本发明提供一种制备乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法，其中所述培养在含有羟基链烷酸酯的环境下进行，且所制得的共聚物是羟基链烷酸酯-Co-3-乳酸酯，该羟基链烷酸酯-Co-3-乳酸酯是包含羟基链烷酸酯单体单元和乳酸酯单体单元的共聚物。
在本发明中，所述共聚物是指具有两种类型的单体的二元共聚物，具有三种类型的单体的三元共聚物和具有四种类型的单体的四元共聚物等。
在本发明中，所述羟基链烷酸酯可以是选自以下化合物中的至少一种：3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、含有6～14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-6-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-7-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基已酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸甲酯、3-羟基己二酸甲酯、3-羟基辛二酸甲酯、3-羟基壬二酸甲酯、3-羟基癸二酸甲酯、3-羟基辛二酸乙酯、3-羟基癸二酸乙酯、3-羟基庚二酸丙酯、3-羟基癸二酸苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基庚酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二碳烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基2，6-二甲基-5-庚烯酸。
对于本发明，术语“载体”是指一种能够在宿主内表达DNA的DNA构建体，该DNA构建体包含可操作地连接至适合的控制序列的DNA序列。载体可以是质粒、噬菌粒或者只是潜在的基因组插入物。当载体被转化到适合的宿主中时，它可以被复制或起作用而不管宿主基因组，或者在一些情况中，它可以被整合到基因组本身中。质粒是最常被用作载体的类型，所以本发明中质粒和载体有时可替换地使用。然而，本发明还包括其它类型的载体，该载体具有与本领域已知或将要知道的功能相同的功能。
术语“表达控制序列”是指对可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达必要的DNA序列。所述控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、用于编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列和用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，适合于原核细胞的控制序列包括启动子、任何操纵子序列和核糖体结合结构域。在真核细胞中，所述控制序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。启动子是对基因在质粒中的表达具有最大影响的因素。因此，SRα启动子或源自巨噬细胞病毒的启动子等优选用作高表达启动子。
为了表达本发明的DNA序列，各种表达控制序列中的任一种可以用作载体。可用的表达控制序列的实例包括，例如，SV40或腺病毒的早期启动子和后期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子或其它二醇降解酶的启动子、磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配体系的启动子、已知用于控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的用于诱导和构建的其它序列、以及上述的各种组合。
当核酸与其它核酸序列以功能关系排列时，核酸被可操作地连接。当适当的分子(例如转录激活蛋白)与控制序列连接时，基因和控制序列可以以允许基因表达的方式连接。例如，当表达参与多肽分泌的前体蛋白时，前体序列或分泌前导区的DNA与多肽的DNA可操作地连接；当影响序列的转录时，启动子或增强子与编码序列可操作地连接；当影响序列的转录时，核糖体结合结构域与编码序列可操作地连接；或者当要易于翻译时，核糖体结合结构域与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列的接触，或者分泌前导区是接触的并且存在于前导阅读框中。但是，增强子不必接触。当不存在结构域时，根据常规方法的合成寡核苷酸接头或连接体如上述来使用。
用于本发明的术语“表达载体”通常是指插入有异源DNA片段的作为常规重组载体的双链DNA片段。此处，异源DNA是指异质DNA，其在宿主细胞中未被天然发现。表达载体在宿主细胞内，可以被复制而不管宿主染色体DNA，并且可以产生载体和插入在该载体中的(异源)DNA的几个拷贝。
如本领域中已知的，为了提高转化基因在宿主细胞中的表达水平，将有关基因与在所选择的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，所述表达控制序列和有关基因包括在包含细菌选择标记和复制起点的一个表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，该表达载体在真核表达宿主中应该进一步包括有用的表达标记。
在本发明中，所述重组载体可以是包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体或酵母人工染色体(YAC)载体的多种载体。质粒载体优选用于本发明的目的。可以用于所述目的的典型质粒载体具有包含如下的结构：(a)使得复制能有效进行，以在每个宿主细胞中包含几百个质粒载体的复制起点，(b)使得能够筛选质粒载体转化了的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)其中可插入外源DNA片段的限制性内切酶的限制性位点。即使没有合适的限制性内切酶的限制性位点，当根据常规方法使用连接体或合成的寡核苷酸接头时，载体和外源DNA也可以容易地连接。
此外，原核细胞的转化可以使用上述Sambrook等人的1.82章中描述的氯化钙法容易地实现。任选地，电穿孔法(Neumann et al.，EMBO J.，1：841(1982))也可以用于细胞的转化。
用于制备包含转化酶的基因和本发明的合酶的基因的植物的植物转染可以通过使用农杆菌和病毒载体等的常规方法来实现。例如，用包含本发明的基因的重组载体对农杆菌属微生物进行转化，然后将经转化的农杆菌属微生物转染到目标植物的组织等中，以得到经转染的植物。更具体而言，可以通过以下步骤来制备经转染的植物：(a)通过预培养目标植物的外植体然后与经转化的农杆菌共培养来转染目标植物；(b)通过在愈伤组织诱导培养基中培养上述经转染的外植体而得到愈伤组织；和(c)通过切下上述得到的愈伤组织然后在芽诱导培养基中培养而长成芽。
本发明中的术语“外植体”是指来自于植物的组织切割物的片段，并且包括子叶和胚轴。用于本发明的方法的外植体可以是子叶和胚轴，并且更优选使用对植物种子进行消毒和洗涤后通过在MS培养基中发芽而得到的子叶。
下文，将参考实施例更详细地描述本发明。实施例仅是用于更具体地说明，而本发明的范围不限于实施例。
尤其是，以下实施例只公开了使用II型PHA合酶的突变体通过将3-羟基丁酸酯(3-HB)加入到乳酸酯共聚物的合成中来合成聚(3-羟基丁酸酯-共-乳酸酯)(P(3HB-co-LA))，但对于本领域普通技术人员显而易见的是，除了3-HB之外，可以通过加入多羟基链烷酸酯来制备多羟基链烷酸酯和乳酸酯的共聚物。
<实施例1>与来源于假单胞菌MBEL 6-19的PHA合酶的氨基酸序列具有高度同源性的PHA合酶的基因克隆和研究
为了研究与来源于用于本发明的假单胞菌MBEL 6-19(KCTC 11027BP)的多羟基链烷酸酯合酶(PhaC1Ps6-19)具有高度氨基酸序列同源性的多羟基链烷酸酯合酶，使用由美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))提供的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，在结果中显示相对高的氨基酸序列同源性的合酶示于表1中。所有的酶包括在II型多羟基链烷酸酯合酶的组中，II型多羟基链烷酸酯合酶是用于使具有相对长的碳链的底物聚合的中链长(MCL)-PHA合酶。
[表1]显示与PhaC1Ps6-19具有氨基酸序列高度同源性的多羟基链烷酸酯合酶
Figure BDA0000139504990000101
Figure BDA0000139504990000111
为了进行本发明，在多羟基链烷酸酯合酶中选择以下四种典型的多羟基链烷酸酯合酶[绿针假单胞菌(KCTC 12349)、恶臭假单胞菌KT2440(ATCC47054)、食树脂假单胞菌(KCTC 12498)和绿脓假单胞菌PAO1(KCTC 1637)]。为了分离用于本发明的多羟基链烷酸酯合酶的基因，从各个假单胞菌菌株提取全部DNA，基于NCBI Genbank中保存的合酶基因序列，通过设计表2中所示的引物用PCR进行克隆。
[表2]用于克隆多羟基链烷酸酯合酶的引物
Figure BDA0000139504990000112
SEQ ID NO：9：5’-gca atg ccc gga gcc ggg cta gct ag-3’
SEQ ID NO：10：5’-gtc atc gtt att ctt gtt act cat gat ttg att gtc tct ctg-3’
SEQ ID NO：11：5’-Cag aga gac aat caa atc atg agt aac aag aat aac gat gac-3’
SEQ ID NO：12：5’-gca ctc atg caa gcg tta acg ttc atg gac ata agt acc-3’
SEQ ID NO：13：5’-ggt act tat gtc cat gaa cgt taa cgc ttg cat gag tgc-3’
SEQ ID NO：14：5’-ctc atc gtt gtt ctt gtt act cat gat ttg att gtc tct ctg-3’
SEQ ID NO：15：5’-cag aga gac aat caa atc atg agt aac aag aac aac gat gag-3’
SEQ ID NO：16：5’-gca ctc atg caa gcg tca acg ctc gtg aac gta ggt g-3’
SEQ ID NO：17：5’-cac cta cgt tca cga gcg ttg acg ctt gca tga gtg c-3’
SEQ ID NO：18：5’-gtc ttc att gtt ctt gtt gct cat gat ttg att gtc tct ctg-3’
SEQ ID NO：19：5’-cag aga gac aat caa atc atg agc aac aag aac aat gaa gac-3’
SEQ ID NO：20：5’-gca ctc atg caa gcg tca tcg ctc gtg cac ata ggt g-3’
SEQ ID NO：21：5’-cac cta tgt gca cga gcg atg acg ctt gca tga gtg c-3’
SEQ ID NO：22：5’-ctc gtt att gtt ctt ctg act cat gat ttg att gtc tct ctg-3’
SEQ ID NO：23：5’-cag aga gac aat caa atc atg agt cag aag aac aat aac gag-3’
SEQ ID NO：24：5’-gca ctc atg caa gcg tca tcg ttc atg cac gta ggt tc-3’
SEQ ID NO：25：5’-gaa cct acg tgc atg aac gat gac gct tgc atg agt gc-3’
SEQ ID NO：26：5’-gaa att gtt atc cgc ctg cag g-3’
作为PCR反应物的琼脂凝胶电泳的结果，发现对应于多羟基链烷酸酯合酶的1.7kbp大小的基因片段得到了证明。为了各个合酶的表达，引入组成型表达系统，该系统是操纵子型的形式，以与来源于丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(其是单体供给酶)的突变基因(pct540Cp)一起表达。在这之前，从NCBIGenbank中保存的多羟基链烷酸酯合酶的基因序列发现，用作常规操纵子型的组成型表达系统中的克隆位点的许多BstBI位点被包括在新克隆的一些多羟基链烷酸酯合酶中。为了解决上述问题，采用定点诱变(SDM)法，基于pPs619C1300-CpPCT540(WO09/022797)制备了pPs619C1300N-CpPCT540载体，在该载体中BstBI位点被转换成独特的克隆位点NheI位点(见图1)。
用NheI/SbfI对所制得的pPs619C1300N-CpPCT540载体进行切割以除去phaC1300Ps6-19，phaC1300Ps6-19是多羟基链烷酸酯合酶的常规基因，然后使用SEQ ID NOS：11至32将得到的四种合酶基因插入到NheI/SbfI识别域中，以完成各重组载体。所制得的四种合酶基因PCR反应物用作模板，并且使用表2中所列出的“识别位点插入引物”进行重叠PCR，以制备包括起始密码子上游的RBS区的多羟基链烷酸酯合酶基因片段，同时一个NheI/SbfI识别位点被包括在各末端上。
包含四种所制得的多羟基链烷酸酯合酶基因的重组载体(pPchC1-CpPCT540、pPpuC1-CpPCT540、pPreC1-CpPCT540和pPaeC1-CpPCT540)的合酶基因的碱基序列通过DNA测序来确认(SEQ IDNOS：1、3、5和7)，且由该碱基序列编码的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NOS：2、4、6和8。在本发明中，在四种新克隆的多羟基链烷酸酯合酶中，除了由绿针假单胞菌得到的多羟基链烷酸酯合酶(PhaC1Pch)之外的三种合酶的基因序列与NCBI Genbank中保存的常规基因相同(见表1)，而PhaC1Pch含有几个不同的核苷酸序列，因此PhaC1Pch被保存在Genbank中(登录号FJ693714)。
作为来源于假单胞菌6-19的多羟基链烷酸酯合酶PhaC1Ps6-19的氨基酸序列与四种多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列进行多重对比分析的结果，证实了据报道引起底物特异性改变为乳酰辅酶A的所有氨基酸残基(Glu130、Ser325、Ser477和Gln481)和被推测为催化残基的氨基酸残基(Cys296、Asp451和His479)是共同保守的(见图2)。而且，来源于假单胞菌菌株61-3的多羟基链烷酸酯合酶PhaC1Ps61-3(Matsusaki et al.，J.Bacterio1.，1998，180：6459-6469；基因序列同源性84.3％，氨基酸序列同源性88.7％)在本发明的实施例中没有被描述但表现出与PhaC1Ps6-19的高度同源性，证明了其也具有对乳酰辅酶A的提高的底物特异性和上述催化残基，以及氨基酸残基的高度保守性(见图2)。
<实施例2>具有高活性的乳酸酯聚合物和共聚物的产生的突变体的制备
II型多羟基链烷酸酯合酶被认为是使具有相对长的碳链的底物聚合的MCL-PHA合酶，报道了通过研究各种突变而对具有合成短链长度(SCL)-PHA的提高活性的突变体的研究(WO08/062999；Takase et al.，J.Biochem.，2003，133：139-145；Takase et al.，Biomacromolecules，2004，5：480-485；Matsumoto etal.，2005，Biomacromolecules，6：99-104；Matsumoto et al.，2006，Biomacromolecules，7：2436-2442)。
对于本发明，下面表3中所示的突变体通过如下来制备：利用SDM法，用SEQ ID NOS：27至74的引物将由先前发明(WO08/062999)所确定的影响乳酸酯聚合物和共聚物的合成活性的氨基酸序列突变引入到四种新制得的II型多羟基链烷酸酯合酶(PhaC1Pch、PhaC1Ppu、PhaC1Pre和PhaC1Pae)中。
[表3]II型多羟基链烷酸酯合酶的突变体
Figure BDA0000139504990000131
Figure BDA0000139504990000141
Figure BDA0000139504990000151
Figure BDA0000139504990000161
SEQ ID NO：27：5’-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc-3’
SEQ ID NO：28：5’-ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat-3’
SEQ ID NO：29：5’-ctg acc ttg ctg gtg acc gtg ctt gat acc acc-3’
SEQ ID NO：30：5’-ggt ggt atc aag cac ggt cac cag caa ggt cag-3’
SEQ ID NO：31：5’-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc-3’
SEQ ID NO：32：5’-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc-3’
SEQ ID NO：33：5’-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c-3’
SEQ ID NO：34：5’-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c-3’
SEQ ID NO：35：5’-atc aac ctg atg acc gat gcc atg gcg ccg acc-3’
SEQ ID NO：36：5’-ggt cgg cgc cat ggc atc ggt cat cag gtt gat-3’
SEQ ID NO：37：5’-ggg cat atc aaa agc atc ctc aac ccg c-3’
SEQ ID NO：38：5’-gcg ggt tga gga tgc ttt tga tat gcc c-3’
SEQ ID NO：39：5’-gaa ttc gtc ctc tcc agc ttt ggg cat atc-3’
SEQ ID NO：40：5’-gat atg ccc aaa gct gga gag gac gaa ttc-3’
SEQ ID NO：41：5’-ctg acc ctg ctg gtc acc gtg ctc gat acc acc-3’
SEQ ID NO：42：5’-ggt ggt atc gag cac ggt gac cag cag ggt cag-3’
SEQ ID NO：43：5’-gaa ttc gtc ctc tcc agc ggc ggg cat atc-3’
SEQ ID NO：44：5’-gat atg ccc gcc gct gga gag gac gaa ttc-3’
SEQ ID NO：45：5’-atc aac ctg atg acc gat gcc atg gcg ccg acc-3’
SEQ ID NO：46：5’-ggt cgg cgc cat ggc atc ggt cat cag gtt gat-3’
SEQ ID NO：47：5’-ggg cat atc aaa agc atc ctc aac ccg c-3’
SEQ ID NO：48：5’-gcg ggt tga gga tgc ttt tga tat gcc c-3’
SEQ ID NO：49：5’-gaa ttc gta ctg tcc aac ttt ggg cat atc-3’
SEQ ID NO：50：5’-gat atg ccc aaa gtt gga cag tac gaa ttc-3’
SEQ ID NO：51：5’-ctg acc ctg ctg gtc acc gtg ctg gac acc acc-3’
SEQ ID NO：52：5’-ggt ggt gtc cag cac ggt gac cag cag ggt cag-3’
SEQ ID NO：53：5’-gaa ttc gta ctg tcc aac ggc ggg cat atc-3’
SEQ ID NO：54：5’-gat atg ccc gcc gtt gga cag tac gaa ttc-3’
SEQ ID NO：55：5’-atc aac ctg atg acc gat gcg atg gcg ccc acc-3’
SEQ ID NO：56：5’-ggt ggg cgc cat cgc atc ggt cat cag gtt gat-3’
SEQ ID NO：57：5’-ggc cac atc aaa agc att ctc aac cca c-3’
SEQ ID NO：58：5’-gtg ggt tga gaa tgc ttt tga tgt ggc c-3’
SEQ ID NO：59：5’-gag ttc gtg ctg tcc aac ttt ggc cac atc-3’
SEQ ID NO：60：5’-gat gtg gcc aaa gtt gga cag cac gaa ctc-3’
SEQ ID NO：61：5’-ttc acc cag atg gtc acc gtg ctc gac ttc aac-3’
SEQ ID NO：62：5’-gtt gaa gtc gag cac ggt gac cat ctg ggt gaa-3’
SEQ ID NO：63：5’-gag ttc gtg ctg tcc aac ggc ggc cac atc-3’
SEQ ID NO：64：5’-gat gtg gcc gcc gtt gga cag cac gaa ctc-3’
SEQ ID NO：65：5’-atc aac ctg ctg acc gat gcg atg tcg ccg acc-3’
SEQ ID NO：66：5’-ggt cgg cga cat cgc atc ggt cag cag gtt gat-3’
SEQ ID NO：67：5’-ggt cac atc aaa agc atc ctc aac ccac-3’
SEQ ID NO：68：5’-gtg ggt tga gga tgc ttt tga tgt gac c-3’
SEQ ID NO：69：5’-gag ttc atc ctc tcc aac ttt ggt cac atc-3’
SEQ ID NO：70：5’-gat gtg acc aaa gtt gga gag gat gaa ctc-3’
SEQ ID NO：71：5’-ttc acc caa ctg gtc acc gtg ctc gac ttc gaa-3’
SEQ ID NO：72：5’-ttc gaa gtc gag cac ggt gac cag ttg ggt gaa-3’
SEQ ID NO：73：5’-gag ttc atc ctc tcc aac ggc ggt cac atc-3’
SEQ ID NO：74：5’-gat gtg acc gcc gtt gga gag gat gaa ctc-3’
将由来源于假单胞菌MBEL 6-19的多羟基链烷酸酯合酶PhaC1Ps6-19和根据本发明制得的四种II型多羟基链烷酸酯合酶制得的合酶的突变体引入到操纵子形式的组成型表达系统中，其与单体供给酶丙酰辅酶A转移酶的突变基因(pct540Cp；WO09/022797)一起被表达。为了证明所制得的合酶突变体显示出乳酸酯共聚物[P(3HB-co-LA)]的合成活性，表3中列出的重组载体转化E.coliXL-1 Blue，然后在P(3HB-co-LA)测定培养基(LB琼脂，葡萄糖20g/L，3HB 2g/L，尼罗红0.5μg/mL)中生长。结果，发现在用重组载体转化的所有E.coliXL-1 Blue中产生了乳酸酯共聚物，所述重组载体包含具有所述氨基酸突变的合酶突变体，尽管取决于突变体而稍微有所不同，而在没有引入氨基酸突变的表达野生型合酶的E.coli XL-1 Blue中没有产生乳酸酯共聚物。即，如实施例1中所述的，发现除了PhaC1Ps6-19之外，用于本发明的PhaC1Pch、PhaC1Ppu、PhaC1Pre和PhaC1Pae由于在Glu130、Ser325、Ser477和Gln481位置处的氨基酸突变，均具有新形成的或提高的产生乳酸酯共聚物的活性。
<实施例3>使用合酶突变体产生乳酸酯聚合物和共聚物
为了定量分析实施例2中制备的五种野生型II型多羟基链烷酸酯合酶(PhaC1Ps6-19、PhaC1Pch、PhaC1Ppu、PhaC1Pre和PhaC1Pae)的合成活性和其突变体的乳酸酯共聚物[P(3HB-co-LA)]，在30℃下在含有补充葡萄糖(20g/L)和3HB(2g/L)的MR培养基的烧瓶中对用包含上述合酶的重组表达载体(表3)转化的E.coli XL-1 Blue培养4天。用于本发明的MR培养基的组成列于表4中。通过离心、用蒸馏水洗涤三次，然后在100℃烘箱中干燥24小时来收集经培养的细菌。通过气相色谱法分析在干细胞中合成的聚合物的组成和含量，结果示于表5中。
[表4]用于重组大肠杆菌的培养的MR培养基的组成
  成分   改性R(MR)(/L)
  KH2PO4   6.67g
  (NH4)2HPO4   4g
  柠檬酸盐   0.8g
  MgSO4H2O   0.8g
  微量成分*   5mL
*微量成分(/L)：FeSO4·H2O，10g；ZnSO4·H2O，2.25g；CuSO4·H2O，1g；MnSO4·H2O，0.5g；CaCl2·H2O，2g；Na2B4O7·H2O，0.23g；(NH4)6Mo7O24，0.1g；35％HCl，10mL。
[表5]利用合酶突变体的乳酸酯共聚物的合成
Figure BDA0000139504990000191
作为气相色谱法分析的结果，尽管在表达五种野生型II型多羟基链烷酸酯合酶(PhaC1Ps6-19、PhaC1Pch、PhaC1Ppu、PhaC1Pre和PhaC1Pae)的重组E.coliXL-1 Blue中没有产生或产生非常少的量(1.4wt％)的乳酸酯共聚物，但在Glu130、Ser325、Ser477和Gln481位置处具有氨基酸突变的突变体的情况中，因为新产生(或提高)了能够接受作为底物的乳酰辅酶A的活性，所以乳酸酯共聚物[P(3HB-co-LA)]在细胞中累积。对于细胞中合成的乳酸酯共聚物的组成和含量，同时引入E130D、S325T、S477G和Q481K突变的突变体表现出细胞中聚合物的高累积率和共聚物的高合成活性，从而取决于各多羟基链烷酸酯合酶的类型而表现出高乳酸酯含量。另外，在表3所列出的突变体中，分析了引入E130D和Q481K的突变体和同时引入E130D、S325T、S477G和Q481K的突变体的乳酸酯聚合物合成活性。为了实现这个，在30℃下，在含有补充葡萄糖(20g/L)的MR培养基的烧瓶中培养表达各个突变的E.coli XL-1 Blue 4天。作为分析结果，当用于合成乳酸酯共聚物时，具有所有的E130D、S325T、S477G和Q481K的突变体产生约2～7wt％乳酸酯共聚物，而来源于食树脂假单胞菌的合酶的突变体活性最高(见表6)。
[表6]利用合酶突变体的乳酸酯聚合物合成
Figure BDA0000139504990000211
Figure BDA0000139504990000221
Figure IDA0000139505060000011
Figure IDA0000139505060000031
Figure IDA0000139505060000041
Figure IDA0000139505060000051
Figure IDA0000139505060000061
Figure IDA0000139505060000071
Figure IDA0000139505060000081
Figure IDA0000139505060000091
Figure IDA0000139505060000101
Figure IDA0000139505060000111
Figure IDA0000139505060000121
Figure IDA0000139505060000131
Figure IDA0000139505060000151
Figure IDA0000139505060000161
Figure IDA0000139505060000171
Figure IDA0000139505060000181
Figure IDA0000139505060000191
Figure IDA0000139505060000201
Figure IDA0000139505060000211
Figure IDA0000139505060000221
Figure IDA0000139505060000231
Figure IDA0000139505060000241
Figure IDA0000139505060000261
Figure IDA0000139505060000271
Figure IDA0000139505060000281

Claims (9)

1.一种使用乳酰辅酶A作为底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，其中所述突变体在以SEQ ID NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列中具有选自以下的至少一种突变：
a)E130D和Q481K；
b)E130D、S325T和Q481K；
c)E130D、S477F和Q481K；
d)E130D、S325T、S477F和Q481K；和
e)E130D、S325T、S477G和Q481K。
2.一种编码权利要求1的多羟基链烷酸酯合酶的突变体的基因。
3.一种包含权利要求2的基因的用于合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其还包含SEQ ID NO：77的丙酰辅酶A转移酶基因(pct)。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述SEQ ID NO：77的丙酰辅酶A转移酶基因包括丙酰辅酶A转移酶突变体基因，该丙酰辅酶A转移酶突变体基因包含选自以下的突变：
a)在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
b)在SEQ ID NO：77碱基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C突变；
c)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Gly335Asp突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
d)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Ala243Thr突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
e)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Asp65Gly突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C突变；
f)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Asp257Asn突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的A1200G突变；
g)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Asp65Asn突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T699C、A1125G和T1158C突变；
h)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Thr199Ile突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T699C、A1125G和T1159C突变；和
i)在SEQ ID NO：78氨基酸序列中的Val193Ala突变和在SEQ ID NO：77碱基序列中的T78C、T699C和T1158C突变。
6.一种用权利要求3～5中任一项所述的重组载体转化的转化体。
7.一种制备乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法，该方法包括培养权利要求6所述的转化体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述培养在含有羟基链烷酸酯的环境中进行，且所述共聚物是羟基链烷酸酯-co-3-乳酸酯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯是选自以下中的至少一种：3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、含有6～14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-6-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-7-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基己酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸甲酯、3-羟基己二酸甲酯、3-羟基辛二酸甲酯、3-羟基壬二酸甲酯、3-羟基癸二酸甲酯、3-羟基辛二酸乙酯、3-羟基癸二酸乙酯、3-羟基庚二酸丙酯、3-羟基癸二酸苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基庚酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二碳烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基2，6-二甲基-5-庚烯酸。
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