CN101679983A - 能够产生聚乳酸酯或其共聚物的重组微生物和使用该重组微生物制备聚乳酸酯或其共聚物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够产生聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯－乳酸酯共聚物的重组微生物和使用该重组微生物制备PLA或羟基链烷酸酯－乳酸酯共聚物的方法。该重组微生物同时具有来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因。将来自埃氏巨球形菌的丙酰辅酶A转移酶引入到该重组微生物中来有效地提供乳酰辅酶A，从而确保了PLA或PLA共聚物的有效制备。

Description

能够产生聚乳酸酯或其共聚物的重组微生物和使用该重组微生物制备聚乳酸酯或其共聚物的方法
技术领域
本发明涉及一种重组微生物和使用该重组微生物制备PLA或其共聚物的方法，所述重组微生物同时具有来自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的编码丙酰辅酶A转移酶的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因，并且能够产生聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
背景技术
聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解聚合物，其极大地应用于商业和生物医学领域中。目前，虽然PLA的制备涉及微生物发酵制得的乳酸酯的聚合，但是通过乳酸酯的直接聚合仅仅制得具有大约1000～5000道尔顿的低分子量的PLA。为了合成具有100,000道尔顿以上分子量的PLA，可以使用链偶联剂聚合由乳酸酯的直接聚合制得的具有低分子量的PLA。然而，在该方法中，由于不容易除去的有机溶剂或链偶联剂的加入，使整个过程变得复杂。
目前，制备高分子量的PLA的商业上可用的方法可包括将乳酸酯转化成交酯并利用交酯环的开环缩聚作用合成PLA。
在通过乳酸酯的化学合成来合成PLA时，PLA均聚物容易获得，但是由多种类型的单体组成的PLA共聚物难以合成并且是商业上无法利用的。
同时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在如磷(P)、氮(N)、镁(Mg)和氧(O)等的其它营养物质缺乏而碳源过量时在微生物中储藏作为能量或碳储存物质的聚酯。由于PHA与通常的来自石油的合成聚合物具有相似的物理性质，并且呈现出完全的生物降解性，所以其被认为是常规合成塑料的替代品。
为了使用微生物生产PHA，需要将微生物代谢产物转化成PHA单体的酶和使用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。当使用微生物合成PLA和PLA共聚物时，需要相同的体系，并且除了用于提供羟酰辅酶A(其为PHA合酶的最初底物)的酶以外，还需要用于提供乳酰辅酶A的酶。
因此，本发明人能够成功地使用来自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的用于提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶和来自假单胞菌属(Pseudomonas)sp.6-19的使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的变体(在韩国专利申请No.10-2006-0116234中公开)来合成PLA和PLA共聚物。
此外，韩国专利申请No.10-2007-0081855已公开了可以使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的变体通过在大肠杆菌中解决细胞生长的抑制和低效表达(与来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶有关)来有效地生产PLA和PLA共聚物。
从韩国专利申请No.10-2006-0116234和No.10-2007-0081855中可以看出，与传统体系相比，为了更加有效地使用微生物合成PLA或PLA共聚物，非常重要的是引入提供单体的酶，所述酶平稳地提供乳酰辅酶A并且以不会极大抑制细胞生长的激活态而被高度表达。
发明内容
技术问题
因此，本发明人设法从微生物中寻找除了在常规体系中使用的来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶以外的转化乳酰辅酶A的酶，并且发现来自埃氏巨球形菌的丙酰辅酶A转移酶具有如在WO 02/42418A2中所公开的乳酰辅酶A转化活性。然后，本发明人发现，使用大肠杆菌通过克隆来自埃氏巨球形菌的丙酰辅酶A转移酶的基因可以高效制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物，并完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种使用来自埃氏巨球形菌的丙酰辅酶A转移酶作为用于有效提供乳酰辅酶A的酶而能够高效产生PLA或PLA共聚物的重组微生物以及使用该重组微生物制备PLA或PLA共聚物的方法。
技术方案
本发明提供了一种能够产生PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组微生物，该重组微生物同时具有来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因(me-pct)和编码使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因。
此外，本发明提供了一种制备PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法，其包括：在包含选自葡萄糖、乳酸酯和羟基链烷酸酯中的至少一种碳源的培养基中培养所述重组微生物；和从该培养的微生物中收集PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
本发明还提供了一种用于制备PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组载体，该重组载体同时具有来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因。
有益效果
根据本发明，在其中引入了来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因的重组微生物中可有效地提供乳酰辅酶A，从而能够有效地制备PLA和PLA共聚物。
附图说明
图1为使用葡萄糖、乳酸酯和3HB在细胞中合成PLA共聚物(P(3HB-共-乳酸酯))的途径的示意图。
图2为说明根据本发明包含来自假单胞菌属sp.6-19的编码PHA合酶的基因和来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因的重组表达载体的构建方法的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种能够产生聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组微生物，该重组微生物同时具有来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因(me-pct)和编码使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因。
根据示范性的实施方式，所述能够产生PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组微生物可通过用来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因转化不含有编码PHA合酶的基因的微生物而得到。
所述不含有编码PHA合酶的基因的微生物可为大肠杆菌。
所述编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因可为phaC1Ps6-19。
所述重组微生物可用含有me-pct的重组载体转化，并且同时用含有phaC1Ps6-19的载体转化，或者可将phaC1Ps6-19插入到该重组微生物的染色体中。
根据另一示范性的实施方式，所述重组微生物可通过用来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因转化具有编码PHA合酶的基因的微生物而得到。
所述编码PHA合酶的基因可为phaC1Ps6-19。
此外，所述具有编码PHA合酶的基因的微生物可为大肠杆菌。
另外，本发明提供了一种制备PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法，其包括：在包含选自葡萄糖、乳酸酯和羟基链烷酸酯中的至少一种碳源的培养基中培养所述重组微生物；和从该培养的微生物中收集PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
此外，本发明提供了一种用于制备PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组载体，该重组载体同时具有编码ME-PCT的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因。
所述编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因可为phaC1Ps6-19。
在下文中，将详细描述本发明。
能够产生PLA或PLA共聚物(聚(羟基链烷酸酯-共-乳酸酯))的微生物可通过以下方法得到：(i)用将乳酸酯转化成乳酰辅酶A的酶的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因转化不含有编码PHA合酶的基因的微生物；(ii)用将乳酸酯转化成乳酰辅酶A的酶的基因转化具有编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因的微生物；或者(iii)用编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因转化具有编码将乳酸酯转化成乳酰辅酶A的酶的基因的微生物，但本发明不限于此。
例如，根据本发明，当微生物具有两种基因(将乳酸酯转化成乳酰辅酶A的酶的基因和编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因)中的种时，能够产生PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的微生物可通过扩增被包含的两种基因中的一种并用不含有的另一种基因转化微生物而得到。
根据本发明，将乳酸酯转化成乳酰辅酶A的酶的基因可为来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因(SEQ ID NO：24；me-pct)。
根据本发明的微生物可用含有me-pct的重组载体转化并同时用含有phaC1Ps6-19(其为来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的基因)的载体转化，或者可将phaC1Ps6-19插入到该微生物的染色体中。就此，可以使用选自葡萄糖、乳酸酯和各种羟基链烷酸酯中的至少一种作为碳源来生产PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
根据本发明，所述重组微生物可在包含选自葡萄糖、乳酸酯和羟基链烷酸酯中的至少一种作为碳源的培养基中培养，并且可以从该培养的微生物中收集PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
为了制备PLA共聚物，所述微生物可在包含羟基链烷酸酯的环境中培养。所述羟基链烷酸酯可为选自3-羟丁酸酯、3-羟戊酸酯、4-羟丁酸酯、具有6～14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二烯酸、3-羟基-6-顺式-十二烯酸、3-羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-7-顺式-十四烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种。但是，本发明不限于此。
优选地，所述羟基链烷酸酯可为选自3-羟丁酸酯、4-羟丁酸酯、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、具有6～14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、3-羟戊酸酯、4-羟基戊酸和5-羟基戊酸中的至少一种。更优选地，而不是必需的，所述羟基链烷酸酯可为3-羟丁酸酯(3-HB)(见图1)。
本发明的PLA或PLA共聚物可为聚乳酸酯、聚(羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(羟基链烷酸酯-共-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)和聚(羟基链烷酸酯-共-羟基链烷酸酯-共-聚羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)等，但本发明不限于此。
例如，PLA共聚物可为聚(4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(4-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(中链长(MCL)3-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-MCL 3-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟戊酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)等，但本发明不限于此。
如图1中所示，根据本发明的示范性实施方式，所述微生物可在包含3-羟丁酸酯(3HB)的环境中培养，并且PLA共聚物可为聚(3HB-共-LA)。
在本发明中，载体指的是一种DNA构件，其包含DNA序列，该DNA序列可操作地连接至在适合的宿主内表达DNA的适合控制序列。载体可为质粒、噬菌体颗粒或者简单地潜在的基因组插入片段。当将载体转化到适合的宿主时，载体可以不顾宿主基因组而自我复制或者运行，或者在某些情况下，载体可整合到宿主基因组中。质粒是最常见类型的载体，因此在这里交替地使用“质粒”和“载体”。但是，本发明还包括其它类型的载体，其为本领域技已知的或者被认为与传统载体具有相同功能。
术语“表达控制序列”指的是用于在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。这种控制序列包括：用于起始转录的启动子；用于控制转录的任意操纵基因序列；编码适合的mRNA核糖体结合位点(RBS)的序列；和用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，针对原核生物的控制序列包括启动子、任意操纵基因序列和RBS。对于真核生物，控制序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。在质粒中，启动子是对基因的表达量具有最大影响的一个因素。为了高度表达，使用SRα启动子、源于巨细胞病毒的启动子。
为了表达本发明的DNA序列，各种表达控制序列中的任何一种都可以用在载体中。例如，有用的表达控制序列包括SV40或腺病毒的早期或者后期启动子、lac体系、trp体系、TAC或TRC体系、T3和T7启动子、λ噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、用于3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶的启动子、例如Pho5的磷酸酶的启动子、酵母α交配系统的启动子和已知控制原核生物、真核生物或其病毒的基因表达的组成型或诱导型序列及它们的组合。
当将核酸置入与其它核酸序列的功能关系中时，其被“可操作地连接”。核酸可为被连接以在适合的分子(例如转录激活蛋白)与控制序列结合时能够表达基因的基因和控制序列。例如，当编码前肽序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，其可操作地连接至编码该多肽的DNA；当启动子或者增强子影响编码序列的转录时，其可操作地连接至该编码序列；以及当RBS影响序列的转录时或者当设置RBS以便有利于翻译时，其可操作地连接至编码序列。总体而言，“可操作地连接”指的是被连接的DNA序列为毗邻的，而且在分泌前导的情况下，是毗邻的且在阅读框内。但是，增强子不必为毗邻的。这些序列间连接是通过在方便的限制性内切酶酶切位点的连接实现的。但是，在不存在这些位点的情况下，则根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体。
此处使用的术语“表达载体”一般指的是作为重组载体的双链DNA片段，其中插入了异源DNA片段。这里，所述异源DNA指的是不是在宿主细胞中天然产生的异型DNA。一旦将该表达载体引入到宿主细胞中，其可以不顾宿主染色体DNA而进行自我复制，并且可产生几个拷贝的载体和插入它们中的(异源)DNA。
如本领域众所周知的，为了提高宿主细胞中转染的基因的表达水平，相应的基因应当可操作地连接至在选择的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。优选地，将表达控制序列和相应的基因包含在一个表达载体中，所述载体同时包含细菌筛选标记和复制起点。当表达宿主是真核生物时，表达载体应当进一步包含在真核生物表达宿主中有用的表达标记。
在本发明中，重组载体可不同，并且包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体和酵母人工染色体(YAC)载体，但优选质粒载体。例如，典型质粒载体具有：(a)复制起点，用于有效复制以使各个宿主细胞包含几百个拷贝；(b)抗生素抗性基因，用于筛选用质粒载体转化了的宿主细胞；和(c)用限制性内切酶切开的能够插入外源DNA片段的限制性酶切位点。即使在没有适合的限制性内切酶酶切位点的情况下，根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体可以容易地连接载体与外源DNA。
根据本发明的重组载体可以根据常规方法转化到特定的宿主细胞中。作为宿主细胞，可以使用细菌、酵母或真菌细胞，但本发明不限于此。在本发明中优选的宿主细胞包括：原核细胞，例如大肠杆菌。优选的大肠杆菌菌株包括：大肠杆菌菌株DH5a、大肠杆菌菌株JM101、大肠杆菌K12菌株294、大肠杆菌菌株W3110、大肠杆菌菌株X1776、大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)和大肠杆菌B。此外，可以使用例如FMB101、NM522、NM538和NM539的其它大肠杆菌菌株和其它原核细胞种属。
除了上述大肠杆菌以外，在这里还可以使用例如农杆菌(Agrobacterium)A4的农杆菌属菌株、例如枯草杆菌(Bacillus subtilits)的杆菌属菌株、例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)的其它肠细菌和各种假单胞菌属菌株作为宿主细胞，但是本发明并不限于此。
另外，原核细胞的转化可以根据描述在Sambrook等人(supra)的章节1.82中的氯化钾法容易地进行。或者，也可以使用电穿孔法(Neumann等人，EMBOJ.，1：841(1982))来转化原核细胞。
现将参照实施例更加详细描述本发明。然而，本领域技术人员将清楚理解，提供实施例仅仅用来解释本发明，而不是用来限制本发明的范围。
制备实施例1：从假单胞菌属sp.6-19中克隆PHA合酶基因并且构建表 达载体
为了分离本发明中使用的源自假单胞菌属sp.6-19(KCTC 11027BP)的PHA合酶基因(phaC1Ps6-19)，提取假单胞菌属sp.6-19的总DNA。基于phaC1Ps6-19序列(Ae-jin Song，Master′s Thesis，Department of Chemical andBiomolecular Engineering，KAIST，2004)制备引物(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2)，并且用该引物进行聚合酶链式反应(PCR)，从而得到phaC1Ps6-19。
5′-GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG-3’(SEQ ID NO：1)
5′-CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC-3’(SEQ IDNO：2)
当在琼脂糖凝胶上电泳分析PCR产物时，鉴定到对应于phaC1Ps6-19基因的1.7-kbp基因片段。为了表达phaC1Ps6-19合酶，引入同时表达提供单体的酶和合酶的操纵子型的组成型表达系统。
从pSYL105载体(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，44：1337-1347)，用BamHI/EcoRI切下包含富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)H16的产生聚(羟基丁酸)(PHB)的操纵子的DNA片段，然后将其插入到pBluescript II(Stratagene)的BamHI/EcoRI位点，从而构建pReCAB重组载体。
已知pReCAB载体中的PHA合酶(phaCRE)和提供单体的酶(phaARE和phaBRE)由PHB操纵子启动子组成型表达并且甚至在大肠杆菌中有效地工作(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，44：1337-1347)。用BstBI/SbfI酶切pReCAB载体以去除富养罗尔斯通氏菌H16PHA合酶(phaCRE)，并且将得到的phaC1Ps6-19插入到BstBI/SbfI位点，从而构建pPs619C1-ReAB重组载体。
为了产生在任一端具有唯一一个BstBI/SbfI位点的phaC1Ps6-19合酶基因片段，在没有改变氨基酸的情况下，通过定点诱变(SDM)去除内源BstBI位点，并且使用下列引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQID NO：6；以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)进行重叠PCR从而加入BstBI/SbfI位点。
5′-atg ccc gga gcc ggt tcg aa-3’(SEQ ID NO：3)
5′-CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC-3’(SEQID NO：4)
5′-GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG-3’(SEQ ID NO：5)
5′-CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC-3’(SEQID NO：6)
5′-GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG-3’(SEQID NO：7)
5′-aac ggg agg gaa cct gca gg-3’(SEQ ID NO：8)
通过序列测定确认了构建的pPs619C1-ReAB重组载体的phaC1Ps6-19的碱基序列并且用SEQ ID NO：9表示，SEQ ID NO：9的碱基序列编码的氨基酸序列用SEQ ID NO：10表示。
根据基因相似性分析，可以证实，phaC1Ps6-19与源自假单胞菌属sp.菌株61-3(Matsusaki等人，J.Bacteriol.，180：6459，1998)的phaC1具有84.3％的序列同源性以及88.9％的氨基酸序列同源性。换句话说，这两种合酶是非常相似的酶。结果，可以得出根据本发明得到的phaC1Ps6-19合酶是II型PHA合酶的结论。
为了确认使用phaC1Ps6-19合酶的PHB的生产，将pPs619C1-ReAB重组载体转化到大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene)中。在PHB检测培养基(LuriaBertani(LB)琼脂，葡萄糖20g/L，尼罗红0.5μg/ml)中培养转化体。结果，未观察到PHB的产生。
制备实施例2：来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的底物特异性变体 的制备
在各种PHA合酶中，II型PHA合酶已知为用于聚合具有相对较多个碳原子的底物的中链长PHA(MCL-PHA)合酶，并且预期MCL-PHA合酶可应用于PLA共聚物的生产。尽管源自假单胞菌属sp.61-3的phaC1合酶是II型PHA合酶，其与根据本发明得到的phaC1Ps6-19合酶具有高度同源性，但是已报道，II型PHA合酶的底物特异性的范围相对较宽(Matsusaki等人，J.Bacteriol.，180：6459，1998)，并且也报道了适合生产短链长PHA(SCL-PHA)的突变中的研究结果(Takase等人，Biomacromolecules，5：480，2004)。基于上述研究，本发明人通过氨基酸序列分析发现了影响SCL激活的三个氨基酸位点，并且使用表1中所示的引物(SEQ ID NO：11～16)通过SDM方法制得了phaC1Ps6-19合酶的变体。
[表1：phaC1Ps6-19合酶的变体]
Figure A20088001555900161
Figure A20088001555900171
5′-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC-3’(SEQ IDNO：11)
5′-GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG-3’(SEQID NO：12)
5′-CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC-3’(SEQ ID NO：13)
5′-GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG-3’(SEQ ID NO：14)
5′-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc-3’(SEQ ID NO：15)
5′-ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat-3’(SEQ ID NO：16)
将这些重组载体转化到大肠杆菌XL-1Blue中，并将转化体在PHB检测培养基(LB琼脂，葡萄糖20g/L，尼罗红0.5μg/ml)中进行培养。结果，在用pPs619C1200-ReAB转化的大肠杆菌XL-1Blue和用pPs619C1300-ReAB转化的大肠杆菌XL-1Blue中都观察到了PHB的产生。也即是说，用提供单体的酶(phaARE和phaBRE)从葡萄糖制成了3HB-辅酶A，并且phaC1Ps6-19合酶的SCL变体(phaC1Ps6-19200和phaC1Ps6-19300)使用3HB-辅酶A作为底物来生产PHB。为了进行定量分析，在大约37℃的温度下在包含20g/L葡萄糖的LB培养基中培养转化了的重组大肠杆菌XL1-Blue 4天。将培养后的重组大肠杆菌进行蔗糖休克(sucrose shock)并用尼罗红染色，并对重组大肠杆菌进行荧光激活细胞分选(FACS)分析。
结果，用包含野生型合酶的pPs619C1-ReAB载体转化的XL1-Blue没有被尼罗红染色，而用pPs619C1200-ReAB载体转化的XL1-Blue和用pPs619C1300-ReAB载体转化的XL1-Blue因为在细胞中积累的PHB被尼罗红染色而显示出高荧光性。此外，将细胞培养物离心来收集细胞提取物。将该提取物在大约80℃的温度的干燥器中干燥大约48小时。其后，通过气相色谱分析来测量细胞中合成的PHB的含量。结果，基于细胞干重，用pPs619C1200-ReAB转化的大肠杆菌和用pPs619C1300-ReAB转化的大肠杆菌分别具有29.7％(w/w)和43.1％(w/w)的PHB含量，而用pPs619C1-ReAB转化的大肠杆菌中没有检测到PHB。
制备实施例3：能够表达来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的重组载体 的构建
为了提供作为合成PLA或PLA共聚物所需的单体的乳酰辅酶A，使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(cp-pct)。已知，cp-pct对微生物具有毒性。通常，在使用tac或T7启动子的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的表达系统(该系统广泛用于表达重组蛋白)中，在加入诱导物之后，所有重组微生物都很快死亡。为此，认为使用其中cp-pct较弱表达但是随着微生物的生长连续表达的组成型表达系统是适合用来生产PLA或PLA共聚物的。使用引物(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)对丙酸梭菌的染色体DNA进行PCR得到的片段用作cp-pct。就此，通过SDM方法去除存在于野生型cp-pct中的NdeI位点以便于克隆。
5′-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3’(SEQ IDNO：17)
5′-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg-3′(SEQ ID NO：18)
另外，使用引物(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)进行重叠PCR来添加SbfI/NdeI位点。
5′-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg-3’(SEQ ID NO：19)
5′-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c-3’(SEQ ID NO：20)
用SbfI/NdeI酶切含有phaC1Ps6-19300(其为phaC1Ps6-19合酶的SCL变体)的pPs619C1300-ReAB载体来去除源自富养罗尔斯通氏菌H16的提供单体的酶(phaARE和phaBRE)，并且将PCT-克隆的cp-pct插入到SfbI/NdeI位点，从而构建了pPs619C1300-CPPCT重组载体。
实施例1：来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因的克隆和 表达载体的构建
为了从本发明中所用的埃氏巨球形菌中分离丙酰辅酶A转移酶基因(me-pct)，在厌氧条件下，在30ml蛋白胨酵母葡萄糖(PYG)液体培养基中培养埃氏巨球形菌(DSM 20460)菌株大约18小时并离心。而后，用100mlTris-EDTA缓冲液洗涤沉淀物。然后，使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega，Catalog No.A 1120)提取菌株的总DNA。PYG培养基的组成和制备方法示于表2中。
[表2]
PYG培养基*的组成
  胰蛋白酶解酪蛋白胨   5g
  蛋白胨   5g
  酵母提取物   10g
  牛肉膏   5g
  葡萄糖   5g
  K2HPO4   2g
  吐温80   1ml
  刃天青   1mg
  盐溶液**   40ml
  蒸馏水   950ml
  氯化血红素溶液(Haemin solution)*** 10ml
  维生素K1溶液   0.20ml
  半胱氨酸-HCl x H2O   0.50g
*在CO2气体饱和的环境中加热维生素K1溶液和氯化血红素溶液以及半胱氨酸来创造厌氧条件，然后将其冷却并加入到PYG液体培养基中，并且使用10N NaOH将PYG液体培养基调至pH 7.2。
**盐溶液；
  CaCl2x 2H2O   0.25g
  MgSO4x 7H2O   0.50g
  K2HPO4   1g
  KH2PO4   1g
  NaHCO3   10g
  NaCl   2g
  蒸馏水   1000ml
***氯化血红素溶液：将50mg的氯化血红素溶于1ml的1N NaOH中。加入蒸馏水以补足100ml溶液，并且将该溶液冷藏。
基于ME-PCT基因序列(WO 02/42418A2)，制备碱基序列为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物，并且该使用引物进行PCR，从而得到me-pct。
5′-act gaa ttc atg aga aaa gta gaa atc att aca gct g-3’(SEQ ID NO：21)
5′-agt cat atg tct aga tta ttt ttt cag tcc cat ggg acc gtc-3’(SEQ ID NO：22)
在琼脂糖凝胶上电泳分析PCR产物后，确认对应me-pct的1.6-kbp基因片段。为了制备me-pct表达载体，使用其中同时表达PHA合酶和提供单体的酶(CP-PCT)的操纵子型的组成型表达载体，即pPs619C1300-CPPCT(在韩国专利申请No.110-2006-0116234中公开)。用SbfI/NdeI酶切pPs619C1300-CPPCT载体来去除其内含有的cp-pct，并且将得到的me-pct插入到SbfI/NdeI位点，从而构建pPs619C1300-MEPCT重组载体(见图2)。为了生成在任一端具有唯一一个SbfI/NdeI位点且在起始密码子前具有RBS区域的me-pct片段，使用me-pct的PCR产物作为模板以及使用碱基序列为SEQID NO：22和SEQ ID NO：23的引物进行PCR。
5′-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gga aac aga att cat gag aaa agt ag-3’(SEQ ID NO：23)
通过序列测定确认制备的pPs619C1300-MEPCT重组载体的me-pct的碱基序列，其与WO 02/42418A2中公开的碱基序列相同。为了确认me-pct的正常表达，将pPs619C1300-MEPCT重组载体引入到大肠杆菌JM109中，然后在包含3HB的PHB检测培养基(LB琼脂，葡萄糖20g/L，3HB 2g/L，尼罗红0.5μg/ml)中培养。结果，证实了PHB的产生。就是说，在培养基中包含的3HB被ME-PCT转化成3HB-辅酶A，并且通过phaC1Ps6-19300合酶聚合3HB-辅酶A以使PHB可在细胞中积累。
实施例2和比较实施例：使用来自埃氏巨球形菌的丙酰辅酶A转移酶制 备PLA共聚物
为了定量分析实施例1中制备的me-pct的活性，在37℃的温度下在含有包含葡萄糖(20g/L)和3HB(2g/L)的LB培养基的烧瓶中将用重组表达载体pPs619C1300-MEPCT转化的大肠杆菌JM109(见图2)和用pPs619C1300-CPPCT转化的大肠杆菌JM109培养4天。离心收集培养的细胞并在大约100℃的温度的干燥器中干燥大约24小时。其后，如表3中所示通过气相色谱分析来测量细胞中合成的聚合物的含量。
[表3]
菌株名称   聚合物含量％(w/w)   聚合物中的LA mol％
  实施例2   pPs619C1300-Mepct/JM109   19.4％   13.3％
  比较实施例   pPs619C1300-Cppct/JM109   6.7％   15.0％
根据气相色谱分析，可以看出，与含有野生型cp-pct的pPs619C1300-CPPCT载体相比，根据本发明制备的含有me-pct的重组表达载体具有大约3倍高的PLA共聚物合成活性以及几乎与其相同的PLA mol％。
序列表
<110>LG化学株式会社
<120>能够产生聚乳酸酯或其共聚物的重组微生物和使用该重组微生物制备聚乳酸酯或其共聚物的方法
<130>IP09-1509-XC37
<150>KR10-2008-0004785
<151>2008-01-16
<160>24
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg                                        35
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac                                          33
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
atgcccggag ccggttcgaa                                                         20
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc                                        35
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg                                  35
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac                                    33
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg                                    33
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
aacgggaggg aacctgcagg                                                   20
<210>9
<211>1677
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重组DNA phaC1Ps6-19
<400>9
atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt    60
aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg    120
caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc    180
aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc    240
gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg    300
cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt    360
gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac    420
ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg    480
cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca    540
ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg    600
ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg    660
gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg    720
cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag    780
gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc    840
gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc    900
acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg    960
accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat    1020
gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc    1080
gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc    1140
aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac    1200
accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca    1260
ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg    1320
gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac    1380
aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc    1440
cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg    1500
gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg    1560
cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg    1620
ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg       1677
<210>10
<211>559
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PHA合成酶
<400>10
Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn
  1               5                  10                  15
Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu
             20                  25                  30
Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His
         35                  40                  45
Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu
     50                  55                  60
Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr
                 85                  90                  95
Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn
            100                 105                 110
Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met
        115                 120                 125
Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val
    130                 135                 140
Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser
145                 150                 155                 160
His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val
                165                 170                 175
Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly
            180                 185                 190
Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro
        195                 200                 205
Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln
    210                 215                 220
Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala
225                 230                 235                 240
Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg
                245                 250                 255
Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu
            260                 265                 270
Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys
        275                 280                 285
Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala
    290                 295                 300
Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu
305                 310                 315                 320
Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala
                325                 330                 335
Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr
            340                 345                 350
Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp
        355                 360                 365
Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu
    370                 375                 380
Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp
385                 390                 395                 400
Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe
                405                 410                 415
Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr
            420                 425                 430
Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly
        435                 440                 445
Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln
    450                 455                 460
Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile
465                 470                 475                 480
Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr
                485                 490                 495
Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr
            500                 505                 510
Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln
        515                 520                 525
Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala
    530                 535                 540
Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg
545                 550                 555
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg                                  36
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atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc                                    33
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ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat                                    33
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agtcatatgt ctagattatt ttttcagtcc catgggaccg tc                       42
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aggcctgcag gcggataaca atttcacaca ggaaacagaa ttcatgagaa aagtag        56
<210>24
<211>1575
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重组DNA me-pct
<400>24
atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat    60
acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta    120
gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct    180
caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt    240
tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa    300
atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct    360
cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc    420
ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt    480
caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac    540
gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca    600
gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta    660
aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt    720
gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta    780
tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa    840
gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt    900
ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact    960
ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct    1020
tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc    1080
ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt    1140
tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca    1200
cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat    1260
ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag    1320
attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa    1380
agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt    1440
gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca    1500
aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag    1560
gaaatgaagt cctaa                                                     1575

Claims (13)

1、一种能够产生聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组微生物，该重组微生物同时具有来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因(me-pct)和编码使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因。
2、如权利要求1所述的重组微生物，该重组微生物是通过用me-pct和编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因转化不含有编码PHA合酶的基因的微生物而得到。
3、如权利要求2所述的重组微生物，其中，所述不含有编码PHA合酶的基因的微生物为大肠杆菌。
4、如权利要求1所述的重组微生物，其中，所述编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因为phaClPs6-19。
5、如权利要求4所述的重组微生物，其中，所述重组微生物是通过以下方法制备：用含有me-pct的重组载体转化，并同时用含有phaClPs6-19的载体转化，或者将phaClPs6-19插入到其染色体中。
6、如权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物是通过用me-pct转化含有编码PHA合酶的基因的微生物而得到。
7、如权利要求6所述的重组微生物，其中，所述编码PHA合酶的基因为phaClPs6-19。
8、如权利要求6所述的重组微生物，其中，所述含有编码PHA合酶的基因的微生物为大肠杆菌。
9、一种制备聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法，其包括：
在包含选自葡萄糖、乳酸酯和羟基链烷酸酯中的至少一种碳源的培养基中培养根据权利要求1～8中任一项所述的重组微生物；和
从该培养的微生物中收集PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
10、如权利要求9所述的方法，其中，用来产生所述羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的羟基链烷酸酯为选自3-羟丁酸酯、3-羟戊酸酯、4-羟丁酸酯、具有6～14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二烯酸、3-羟基-6-顺式-十二烯酸、3-羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-7-顺式-十四烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种。
11、如权利要求9所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物为选自聚(4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(4-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(中链长(MCL)3-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-MCL 3-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟戊酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)和聚(3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)中的一种。
12、一种用于制备聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组载体，该重组载体同时具有来自埃氏巨球形菌的编码丙酰辅酶A转移酶的基因(me-pct)和编码使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因。
13、如权利要求12所述的重组载体，其中，所述编码使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因为phaClPs6-19。
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