WO2011002220A9 - 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법 - Google Patents

폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법 Download PDF

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강혜옥
이상엽
정유경
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(주)Lg화학
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    • C12Y208/03001—Propionate CoA-transferase (2.8.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to various polyhydroxyalkanoate synthase variants capable of synthesizing lactate polymers and lactate copolymers using lactyl-CoA (lactyl-CoA) as a substrate.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of lactate polymers and lactate copolymers, using polyhydroxyalkanoate synthase variants with increased lactate polymer and lactate copolymer synthesis activity.
  • Polylactate (PLA) is a representative biodegradable polymer derived from lactate and is a polymer having high applicability as a general purpose polymer or a medical polymer.
  • PLA is produced by polymerizing lactate produced by microbial fermentation, but only low molecular weight (1000-5000 Daltons) PLA is produced by the direct polymerization of lactate.
  • the addition of ring agents complicates the process and also has the disadvantage that it is not easy to remove them.
  • commercially available high molecular weight PLA production process is used to convert the lactate to lactide (lactide), and then synthesize the PLA through the ring-opening condensation reaction of the lactide ring.
  • PLA homopolymers can be easily obtained when PLA is synthesized using lactate through chemical synthesis, but the synthesis of PLA copolymers having various monomer compositions is difficult and commercially useful.
  • polyhydroxyalkanoaste is a polyester (microorganisms) that accumulate inside as energy or carbon storage material when there is an excessive carbon source and lacks other nutrients such as phosphorus, nitrogen, magnesium and oxygen. polyester). PHA is regarded as a material to replace conventional synthetic plastics because it has properties similar to synthetic polymers derived from petroleum and shows complete biodegradability.
  • PLA and PLA copolymer using microorganisms in order to efficiently produce PLA and PLA copolymer using microorganisms, it is expressed in an activated form without inhibiting cell growth, and a monomer supply enzyme capable of smoothly supplying lactyl-CoA and efficiently recognized lactyl-CoA as substrates. It can be seen that the introduction of PHA synthase that can be very important.
  • the present inventors searched for polyhydroxyalkanoate synthetase having high amino acid sequence homology with polyhydroxyalkanoate synthase derived from Pseudomonas genus 6-19 used in the existing system.
  • Polyhydroxyalkanoate synthase was cloned from four representative Pseudomonas strains among the highly homologous synthetases, and variants were prepared in which amino acid sequences affecting lactate polymer and lactate copolymer synthesis activity were changed.
  • the lactate polymer and its copolymer can be produced with high efficiency, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is a recombinant microorganism capable of producing a lactate polymer or a copolymer thereof using various polyhydroxyalkanoate synthase variants and a method of producing a lactate polymer or a copolymer thereof using the recombinant microorganism. To provide.
  • the present invention is the amino acid sequence of polyhydroxyalkanoate synthase having SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8,
  • polyhydroxyalkanoate synthase variants having an amino acid sequence comprising one or more mutations selected from the group consisting of and synthesizing lactate polymers or lactate copolymers using lactyl-CoA as a substrate.
  • the present invention is a gene encoding the polyhydroxyalkanoate synthase variant, a recombinant vector for the synthesis of lactate polymer or lactate copolymer containing the gene, a transformant transformed with the recombinant vector, the transformation It provides a method for producing a lactate polymer or lactate copolymer, characterized by culturing the converter.
  • polyhydroxyalkanoate synthetases according to the present invention are all capable of having a lactate polymer and lactate copolymer synthesis activity by amino acid sequence variations affecting the synthesis activity of the lactate polymer and lactate copolymer, Using these synthetase variants, lactate copolymers with different properties can be prepared.
  • Recombinant expression vector comprising propionyl-CoA transferase variant (Pct540 Cp ) derived from lithium propionicum and polyhydroxyalkanoate synthesis with increased lactate polymer and lactate copolymer synthesis activity from the recombinant expression vector It is a schematic of the process of making enzyme variants.
  • 2 is a polyhydroxyalkanoate synthetase derived from Pseudomonas sp.MBEL 6-19 , Pseudomonas chlororaphis derived from Pseudomonas sp.
  • MBEL 6-19 used in the present invention, Pseudomonas chlororaphis derived polyhydroxyalkanoate synthase, Pseudomonas Polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas putida KT2440, polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas resinovorans , and polyseudomonas aeruginosa PAO1 from Pseudomonas putida KT2440 Amino acid sequence multiple alignment of hydroxyalkanoate synthase shows amino acid residues (Cys296, Asp451, His479), which are assumed to be catalytic residues, and affects substrate specificity change for lactyl-CoA. The affecting amino acid residues (Glu130, Ser325, Ser477, Gln481) contain amino acid sequence numbers Indicated.
  • the present invention provides a polyhydroxyalkanoate synthesis derived from a lactyl-CoA feed enzyme gene and Pseudodonas Chlororaphis- derived polyhydroxyalkanoate synthase gene (SEQ ID NO: 1), and Pseudomonas putida KT2440 ( Pseudomonas putida KT2440 ).
  • Polyhydroxyalkanoate synthase gene (SEQ ID NO: 5) derived from the enzyme gene (SEQ ID NO: 3), Pseudomonas resinovorans , or polyhydroxyalkano derived from Pseudomonas aeruginosa PA01 ( Pseudomonas aeruginosa PA01) Containing the eight synthase gene (SEQ ID NO: 7) at the same time to provide a recombinant microorganism having a lactate polymer and its copolymer generating ability.
  • amino acid sequence of polyhydroxyalkanoate synthase having SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 amino acid sequence of polyhydroxyalkanoate synthase having SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8
  • a polyhydroxyalkanoate having an amino acid sequence comprising at least one variation selected from the group consisting of E130D, S325T, S477G and Q481K and synthesizing a lactate polymer or lactate copolymer using lactyl-CoA as a substrate Provide synthetase variants.
  • glutamate which is the 130th amino acid
  • S325T which is serine, which is the 325th amino acid
  • S477F which is the 477th amino acid
  • Q481K is, 481 amino acid
  • glutamine is lysine.
  • S477G mutation refers to a mutation in which the 477th amino acid serine is substituted with glycine. Such variation in amino acid sequence results in new formation or increased production activity of lactate polymers or lactate copolymers of polyhydroxyalkanoate synthase variants.
  • the SEQ ID NO: 2, 4, 6, or the amino acid sequence of the 8 are each Pseudomonas chloro lapis (Pseudononas Chlororaphis), Pseudomonas footage is KT2440 (Pseudomonas putida KT2440), Pseudomonas rugi to register Novo lance (Pseudomonas resinovorans) or Pseudomonas labor PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PA01) is an amino acid sequence of a polyhydroxyalkanoate synthase.
  • the present inventors have found that the use of a variant of PHA synthase derived from the four Pseudomonas strains described above enables the production of lactate polymers and copolymers with high efficiency using lactyl-CoA as a substrate and the present invention. It was completed.
  • the present invention also provides a gene encoding the polyhydroxyalkanoate synthase variant.
  • the present invention also provides a recombinant vector for synthesizing a lactate polymer or copolymer containing the gene.
  • the present invention is also characterized in that the recombinant vector further contains propionyl-CoA transferase gene (pct Cp ) derived from Clostridium propionicum of SEQ ID NO: 77.
  • Propionyl-CoA transferase is an enzyme that converts lactate and 3-hydroxybutyrate to lactyl-CoA and 3-hydroxybutyrate-CoA, respectively.
  • the propionyl-CoA transferase gene Preferably, the propionyl-CoA transferase gene,
  • the A1200G variant is the 1200th base of adenine guanine
  • the T78C variant is the 78th base thymine is cytosine
  • the T669C variant is the 669th base thymine is cytosine
  • the A1125G variant is the 1125th base.
  • Adenine to guanine, and T1158C mutation refers to a mutation in which the thymine, the 1158th base, is replaced by cytosine.
  • the Gly335Asp mutation is the 335th amino acid glycine aspartic acid
  • the Ala243Thr variant is the 243th amino acid alanine is threonine
  • the Asp65Gly variant is the 65th amino acid aspartic acid is glycine
  • the Asp257Asn variant is the 257th amino acid Aspartic acid is asparagine
  • Asp65Asn mutation is aspartic acid is 65th amino acid asparagine
  • Thr199Ile mutation is 199 amino acid threonine isoleucine
  • Val193Ala mutation is 193 amino acid valine is substituted with alanine.
  • the variant gene of propionyl CoA-transferase is a variant of propionyl CoA-transferase containing Val193Ala variant in amino acid sequence of SEQ ID NO: 78 and T78C, T699C and T1158C variant in nucleotide sequence of SEQ ID NO: 77 Gene (pct 540 Cp ).
  • the present invention also provides a transformant transformed with any of the above recombinant vectors, wherein the transformant obtained by transforming a transformed subject without propionyl-CoA transferase with any of the aforementioned recombinant vectors Sieves are also included within the scope of the present invention.
  • the recombinant vector according to the present invention can be transformed by a conventional method into a suitable host cell.
  • Host cells include, but are not limited to, bacteria, yeast and fungi.
  • Preferred host cells in the present invention are prokaryotic cells, preferably E. coli.
  • suitable prokaryotic host cells include E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12 294, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue (Stratagene), E. coli B, and the like. do.
  • E. coli strains such as FMB101, NM522, NM538 and NM539 and other prokaryotic species and genera may also be used.
  • strains of the genus Agrobacterium such as Agrobacterium A4, bacilli such as Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium or Serratia marcescens
  • Other enterobacteria such as and various Pseudomonas strains can be used as a host cell, the present invention is not limited to the examples described above.
  • Plants to be transformed usable in the present invention may include tobacco, tomatoes, peppers, beans, rice, corn, and the like, but is not limited thereto.
  • plant used for transformation is a sexually propagating plant, it will be apparent to those skilled in the art that it can be repeatedly reproduced by tissue culture or the like.
  • the present invention also provides a method for producing a lactate polymer or a copolymer thereof, wherein the transformant is cultured.
  • the present invention is a hydroxyalkanoate wherein the culture is carried out in an environment containing hydroxyalkanoate, and the copolymer prepared is a copolymer comprising a hydroxyalkanoate monomer unit and a lactate monomer unit. It provides a manufacturing method characterized in that the -co-3- lactate.
  • the copolymer is meant to include dimers having two kinds of monomers, tripolymers having three kinds of monomers, and tetrapolymers having four kinds of monomers.
  • the hydroxyalkanoate is 3-hydroxybutyrate (3-hydroxybutyrate), 3-hydroxyvalerate (3-hydroxyvalerate), 4-hydroxybutyrate (4-hydroxybutyrate), 6 to 14 carbon atoms (D) -3-hydroxycarboxylic acids, 3-hydroxypropionic acid, 3-hydroxyhexanic acid of the individual intermediate chain length ), 3-hydroxywytanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxynonanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid (3- hydroxydecanoic acid, 3-hydroxyundecanoic acid, 3-hydroxydodecanoic acid, 3-hydroxytetradecanoic acid, 3-hydroxyhexadecane 3-hydroxyhexadecanoic acid, 4-hydroxyvaleric acid, 4-hydroxyhexanoic acid), 4-hydroxyheptanoic acid, 4-hydroxyoctanoic acid, 4-hydroxydecanoic acid, 5-hydroxy valeric acid (5 -hydroxyvaleric acid), 5-hydroxyhexanoic acid, 6-hydroxyd
  • vector is meant a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases integrate into the genome itself. Plasmids and vectors are sometimes used interchangeably in the present invention because plasmids are currently the most commonly used form of vectors. However, the present invention also encompasses other forms of vectors having functions equivalent to those known or known in the art.
  • expression control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.
  • suitable control sequences for prokaryotes include promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter.
  • an SR ⁇ promoter a promoter derived from cytomegalovirus, and the like are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • Nucleic acids are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used as described above.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells.
  • the expression vector can replicate independently of the host chromosomal DNA once it is in the host cell and produce several copies of the vector and the inserted (heterologous) DNA thereof.
  • the gene in order to raise the expression level of a transgene in a host cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function within the selected host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector containing the bacterial selection marker and the replication origin together. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • plasmid vectors including plasmid vectors, bacteriophage vectors, cosmid vectors, and YAC (Yeast Artificial Chromosome) vectors may be used as the recombinant vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for such purposes include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene and (c) a restriction enzyme cleavage site into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA.
  • prokaryotic transformation can be readily accomplished using the calcium chloride method described in section 1.82 of Sambrook et al ., Supra.
  • electroporation (Neumann et al., EMBO J., 1: 841 (1982)) can also be used to transform these cells.
  • Transfection of a plant for producing a plant containing the gene of the converting enzyme of the present invention and the gene of the synthetase can be achieved by a conventional method using Agrobacterium, a viral vector, or the like.
  • a microorganism of the genus Agrobacterium may be transformed with a recombinant vector containing a gene according to the present invention, and then the transformed Agrobacterium microorganism may be infected with tissues of a target plant to obtain a transfected plant.
  • the term "explant” refers to a slice of tissue cut out of a plant, and includes cotyledon or hypocotyl.
  • the explants of the plant used in the method of the present invention may be cotyledons or hypocotyls, it is more preferable to use the cotyledons obtained by germinating in MS medium after disinfecting and washing the seeds of the plants.
  • 3-hydroxybutyrate (3-HB) was added to synthesize a lactate copolymer using a type II PHA synthase variant, thereby preparing poly (3-hydroxybutyrate-co-lactate) ( Only the synthesis of P (3HB-co-LA)) is described, but it is possible to prepare a copolymer of the polyhydroxyalkanoate and lactate by adding polyhydroxyalkanoate other than 3-HB. It will be apparent to those skilled in the art.
  • Example 1 Screening and gene cloning of PHA synthase having high homology with amino acid sequence of PHA synthase derived from Pseudomonas genus 6-19
  • KBOS 03 87 91 AY790327 Pseudomonas chlororaphis 85 90 AB049413 Pseudomonas corrugata CFBP5454 85 89 AY910767 Pseudomonas sp.
  • polyhydroxyalkanoate synthase having the following four types of representatives was selected for the realization of the present invention.
  • Pseudomonas chlororaphis KCTC 12349
  • Pseudomonas putida KT2440 ATCC 47054
  • Pseudomonas resinovorans KCTC 12498
  • Pseudomonas aeruginosa PAO1 KCTC 1637
  • SEQ ID NO: 19 5-cag aga gac aat caa atc atg agc aac aag aac aat gaa gac-3
  • SEQ ID NO: 20 gca ctc atg caa gcg tca tcg ctc gtg cac ata ggt g-3
  • the prepared pPs619C1300N-CpPCT540 vector Nhe I / Sbf I was digested with a polyhydroxyalkanoate synthase gene phaC1300 Ps6-19 After removal of the four synthase genes obtained using SEQ ID NOs: 11-32 Nhe I / Sbf Each recombinant vector was completed by insertion at the I recognition site. Nhe I / Sbf In order to make a polyhydroxyalkanoate synthase gene fragment containing an RBS region before the initiation codon, each containing only one recognition site at each end, the four synthase PCR products prepared above were used as templates. The overlapping PCR was performed using the "recognition site insertion primer" listed in 2.
  • Synthetase gene sequences of the recombinant vectors (pPchC1-CpPCT540, pPpuC1-CpPCT540, pPreC1-CpPCT540, pPaeC1-CpPCT540) containing the four polyhydroxyalkanoate synthase genes produced were confirmed by DNA sequencing ( SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7), and the amino acid sequences encoded thereby correspond to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8, respectively.
  • Type II polyhydroxyalkanoate synthase is known as a medium-chain-length PHA (MCL-PHA) synthase that polymerizes relatively long carbon substrates, and SCL-PHA (short-chain-) has been studied through various mutant studies.
  • length PHA has been reported to study variants with increased synthetic activity (WO08 / 062999; Takase et al., J. Biochem., 2003, 133: 139-145; Takase et al., Biomacromolecules, 2004, 5 : 480-485; Matsumoto et al., 2005, Biomacromolecules, 6: 99-104; Matsumoto et al., 2006, Biomacromolecules, 7: 2436-2442).
  • PhaC1 Pch four type II polyhydroxyalkanoate synthetase (PhaC1 Pch) newly obtained amino acid sequence variations (WO08 / 062999) which have been found to affect lactate polymer and copolymer synthesis activity in the previous invention.
  • PhaC1 Ppu PhaC1 Pre
  • PhaC1 Pae were introduced into the SDM method using the primers of SEQ ID NOs: 27 to 74 to prepare the variants shown in Table 3 below.
  • Synthetase variants prepared from PseCactus 6-19 polyhydroxyalkanoate synthase PhaC1 Ps6-19 and four Type II polyhydroxyalkanoate synthetases produced in the present invention are propionyl, a monomer feed enzyme. It was introduced into an operon-type constitutive expression system expressed as a variant gene of -CoA transferase ( pct540 Cp ; WO09 / 022797). In order to confirm whether the prepared synthase variants exhibit lactate copolymer [P (3HB- co- LA)] synthetic activity, the recombinant vector of Table 3 was transformed into E.
  • PhaC1 Pch PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae used in the present invention together with PhaC1 Ps6-19 , according to amino acid variation of Glu130, Ser325, Ser477, Gln481 positions, It was confirmed that the production activity is newly formed or increased.
  • Lactate Copolymers [PhaC1 Ps6-19 , PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae ] and 5 Variant Type II Polyhydroxyalkanoate Synthetases Prepared in Example 2 (3HB- co- LA)]
  • E. coli XL-1 Blue transformed with a recombinant expression vector containing these synthetases (Table 3) to quantitatively analyze synthetic activity was synthesized with glucose (20 g / L) and 3HB ( The flask was incubated for 4 days in 30 ° C. of MR medium containing 2 g / L).
  • the composition of the MR medium used in this example is shown in Table 4.
  • the cultured cells were recovered by centrifugation, washed three times with distilled water, and dried in a 100 ° C. dryer for 24 hours.
  • the polymer content and composition synthesized in the dry cells were analyzed by gas chromatography, and the results are shown in Table 5.
  • the intracellular content and composition of the synthesized lactate copolymers depend on the type of polyhydroxyalkanoate synthetase, but the high-molecular cells of the polymer in the case of the variants in which the mutations of E130D, S325T, S477G, and Q481K were simultaneously introduced. It showed high copolymerization ability with high accumulation rate and lactate content.
  • lactate polymer synthesis activity of the variants of E130D, Q481K and E130D, S325T, S477G and Q481K at the same time were analyzed.
  • E. coli XL-1 Blue expressing each variant was flask cultured in 30 ° C.

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Abstract

본 발명은 락테이트 중합체 (PLA) 및 락테이트 공중합체 (PLA copolymer)를 합성할 수 있는 다양한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)의 변이체들과 그것을 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 서열번호가 2, 4, 6 또는 8인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체, 그리고 상기 합성효소 변이체를 이용하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 서열번호가 2, 4, 6 또는 8인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들은 락테이트 중합체 합성 활성에 영향을 미치는 아미노산 서열 변이에 의해 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성을 가질 수 있게 되며, 이들 합성효소 변이체들을 이용하면 각기 다른 성질을 가지는 락테이트 중합체 및 공중합체를 제조할 수 있다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법
본 발명은 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체를 합성할 수 있는 다양한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성이 증가된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체들을 이용하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
폴리락테이트(PLA)는 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 연쇄커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 유기용제(solvent)나 연쇄커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어 있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
화학합성을 통하여 락테이트를 이용하여 PLA를 합성할 경우 PLA 호모폴리머는 쉽게 수득할 수 있지만 다양한 모노머 조성을 지닌 PLA 공중합체의 합성은 어렵고 상업적으로 효용성이 매우 떨어지는 단점이 있다.
한편, 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoaste, PHA)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. 미생물을 이용하여 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 때도 같은 시스템이 필요하며 원래의 PHA 합성효소의 기질인 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소 이외에 추가로 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소가 필요하다.
즉, 미생물을 이용하여 효율적으로 PLA 및 PLA 공중합체를 생산하기 위해서는 세포 성장을 저해하지 않으면서 활성화 형태로 발현되어 락틸-CoA를 원활히 공급할 수 있는 단량체 공급효소와 효율적으로 락틸-CoA를 기질로 인식할 수 있는 PHA 합성효소의 도입이 매우 중요함을 알 수 있다.
이에, 본 발명자들은 기존 시스템에서 사용되고 있는 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소와 아미노산 서열 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들을 탐색하였다. 상기 상동성이 높은 합성효소들 가운데 대표적인 4 종의 슈도모나스 균주들로부터 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 클로닝하고 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성에 영향을 미치는 아미노산 서열을 변화시킨 변이체들을 제조하여 락테이트 중합체 및 그 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 다양한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용하여 락테이트 중합체 또는 그 공중합체를 생성할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 락테이트 중합체 또는 그 공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호가 2, 4, 6 또는 8인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열에서,
a) E130D 및 Q481K;
b) E130D, S325T 및 Q481K;
c) E130D, S477F 및 Q481K;
d) E130D, S325T, S477F 및 Q481K; 및
e) E130D, S325T, S477G 및 Q481K; 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지며 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체 합성용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들은 모두 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 합성 활성에 영향을 미치는 아미노산 서열 변이에 의해 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성을 가질 수 있게 되며, 이들 합성효소 변이체들을 이용하면 각기 다른 성질을 가지는 락테이트 공중합체를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 슈도모나스 속 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소와 아미노산 서열 상동성이 높은 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들과 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 변이체(Pct540 Cp )를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로부터 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성이 증가된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체들을 제작하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에 사용된 슈도모나스 속 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 슈도모나스 레지노보란스 (Pseudomonas resinovorans) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 그리고 슈도모나스 에루기노사 PAO 1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열 multiple alignment를 나타낸 것으로 촉매 잔기 (catalytic residues)로 추정되는 아미노산 잔기들 (Cys296, Asp451, His479)에는 * 표시를, 락틸-CoA에 대한 기질 특이성 변화에 영향을 미치는 아미노산 잔기들 (Glu130, Ser325, Ser477, Gln481)에는 아미노산 서열 번호를 표시하였다.
본 발명은 락틸-CoA 공급 효소 유전자와 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudononas Chlororaphis) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 1), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 3), 슈도모나스 레지노보란스 (Pseudomonas resinovorans) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 5), 또는 슈도모나스 에루기노사 PAO 1 (Pseudomonas aeruginosa PA01) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 7)를 동시에 함유하여 락테이트 중합체 및 그 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 가 2, 4, 6 또는 8인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열에서,
a) E130D 및 Q481K;
b) E130D, S325T 및 Q481K;
c) E130D, S477F 및 Q481K;
d) E130D, S325T, S477F 및 Q481K; 또는
e) E130D, S325T, S477G 및 Q481K 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지며 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 제공한다.
상기 E130D 변이는 130번째 아미노산인 글루타메이트가 아스파르트산으로, S325T 변이는 325번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로, S477F 변이는 477번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로, Q481K 변이는 481번째 아미노산인 글루타민이 리신으로, 그리고 S477G 변이는 477번째 아미노산인 세린이 글리신으로 치환된 변이를 의미한다. 이와 같은 아미노산 서열의 변이로 인해 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체의 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 생산 활성이 새로이 형성되거나 증가된다.
상기 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열은 각각 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudononas Chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440), 슈도모나스 레지노보란스 (Pseudomonas resinovorans) 또는 슈도모나스 에루기노사 PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PA01) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열이다. 본 발명자들은 상기 설명한 4종의 슈도모나스 균주들로부터 유래된 PHA 합성효소의 변이체를 사용하는 경우 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 중합체 및 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 공중합체 합성용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터가 서열번호 77의 클로스트리디움 프로피오니쿰 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pctCp)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 한다. 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제는 락테이트와 3-하이드록시부티레이트를 각각 락틸-CoA와 3-하이드록시부티레이트-CoA로 전환하는 효소이다.
바람직하게, 상기 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자는,
a) 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
b) 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C;
c) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
d) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Ala243Thr 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G;
e) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Gly 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이;
f) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp257Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
g) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1158C 변이;
h) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Thr199Ile 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1159C 변이; 및
i) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Val193Ala 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T699C 및 T1158C 변이; 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 함유하는 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자를 포함할 수 있다.
서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이는 1200번째 염기인 아데닌이 구아닌으로, T78C 변이는 78번째 염기인 티민이 시토신으로, T669C 변이는 669번째 염기인 티민이 시토신으로, A1125G 변이는 1125번째 염기인 아데닌이 구아닌으로, 그리고 T1158C 변이는 1158번째 염기인 티민이 시토신으로 치환된 변이를 의미한다. 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이는 335번째 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로, Ala243Thr 변이는 243번째 아미노산인 알라닌이 트레오닌으로, Asp65Gly 변이는 65번째 아미노산인 아스파르트산이 글리신으로, Asp257Asn 변이는 257번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로, Asp65Asn 변이는 65번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로, Thr199Ile 변이는 199번째 아미노산인 트레오닌이 이소루신으로, 그리고 Val193Ala 변이는 193번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 변이를 의미한다.
바람직하게, 상기 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Val193Ala 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T699C 및 T1158C 변이를 함유하는 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자 (pct 540Cp)일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터들 중 어느 하나로 형질전환된 형질전환체를 제공하며, 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제를 가지지 않는 형질전환 대상체를 전술한 재조합 벡터들 중 어느 하나로 형질전환하여 수득되는 형질전환체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 적절한 숙주세포로 통상의 방법으로 형질전환할 수 있다. 숙주세포로는 박테리아, 효모 및 곰팡이 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 선호되는 숙주세포는 원핵세포로, 대장균이 바람직하다. 적합한 원핵 숙주세포의 예로는 E.coli DH5a, E.coli JM101, E.coli K12 294, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli XL-1Blue(Stratagene), E.coli B 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)도 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli 이외에도 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있으며, 본 발명은 상기 기술한 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용 가능한 형질전환 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명은 또한 상기 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 그 공중합체의 제조방법을 제공한다.
보다 바람직하게, 본 발명은 상기 배양이 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경에서 수행되고, 제조된 공중합체가 하이드록시알카노에이트 단량체 유니트 및 락테이트 단량체 유니트를 포함하는 공중합체인 하이드록시알카노에이트-co-3-락테이트인 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어 상기 공중합체는 단량체의 종류가 2개인 이중합체, 단량체의 종류가 3개인 삼중합체, 단량체의 종류가 4개인 사중합체 등을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어 상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레레이트(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6~14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydrowyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-4-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hyxenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헥산산(3-hydroxy-6-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methylester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methylester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methylester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethylester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethylester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propylester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzylester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3,12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid) alc 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptenoic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 본 발명에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다.
"발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.　진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.　플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다.　예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다.　그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 전술한 바와 같이 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명에서, 재조합 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
또한, 원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.　선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 전환효소의 유전자 및 합성효소의 유전자를 함유하는 식물체를 제조하기 위한 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(preculture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
특히 이하 실시예에서는 type II PHA 합성효소 변이체를 이용하여 락테이트 공중합체를 합성하는 데에 3-하이드록시부티레이트(3-HB)를 첨가하여 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-락테이트)(P(3HB-co-LA))를 합성하는 것만이 기재되어 있으나, 3-HB 이외의 폴리하이드록시알카노에이트를 첨가하여 상기 폴리하이드록시알카노에이트와 락테이트의 공중합체를 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
<실시예 1> 슈도모나스 속 6-19 유래 PHA 합성효소의 아미노산 서열과 상동성이 높은 PHA 합성효소 탐색 및 유전자 클로닝
본 발명에 사용된 슈도모나스 속 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 (PhaC1 Ps6-19 )와 아미노산 서열 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 탐색하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 분석을 이용하였고, 그 결과 중 비교적 높은 아미노산 서열 상동성을 보이는 합성효소들을 표 1에 나타내었다. 상기 효소들은 모두 비교적 탄소수가 긴 기질을 중합시키는 MCL-PHA (medium-chain-length PHA) 합성효소인 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 군에 포함된다.
표 1 PhaC1 Ps6-19 와 높은 아미노산 서열 상동성을 보이는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소
Organism Nucleotide identity Amino acid identity Genbank accession no.
Pseudomonas sp. MBEL 6-19 100 100 FJ626663
Pseudomonas sp. 3Y2 95 97 AY754343
Pseudomonas fluorescens PfO-1 88 93 CP000094
Pseudomonas sp. KBOS 03 87 91 AY790327
Pseudomonas chlororaphis 85 90 AB049413
Pseudomonas corrugata CFBP5454 85 89 AY910767
Pseudomonas sp. 61-3 84 89 AB014758
Pseudomonas fluorescens Pf-5 85 89 CP000076
Comamonas testosteroni 83 87 AY790326
Burkholderia caryophylli 82 86 AF394660
Aeromonas hydrophila 80 82 AY786298
Pseudomonas putida KT2440 80 81 AE015451
Pseudomonas pseudoalcaligenes HBQ06 80 79 AF336848
Pseudomonas resinovorans 80 81 AF129396
Pseudomonas sp. HJ-2 80 78 AY370934
Pseudomonas stutzeri 1317 79 79 AY278219
Pseudomonas aeruginosa PAO1 78 77 AE004091
이들 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들 중 본 발명의 실현을 위하여 하기 4 종의 대표성을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 실험의 대상으로 선택하였다 [Pseudomonas chlororaphis (KCTC 12349), Pseudomonas putida KT2440 (ATCC 47054), Pseudomonas resinovorans (KCTC 12498), 그리고 Pseudomonas aeruginosa PAO1 (KCTC 1637)]. 본 발명에 사용된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 분리하기 위해 각 슈도모나스 균주로부터 전체 DNA를 추출하고, NCBI Genbank에 등록되어 있는 합성효소 유전자 시퀀스에 기반한 표 2와 같은 프라이머를 제작하여 PCR 클로닝 하였다.
표 2 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 클로닝을 위한 프라이머
합성효소 미생물 합성효소 클로닝 프라이머 인식부위 삽입 프라이머
PhaC1 Pch P. chlororaphis 서열번호 11 & 12 서열번호 9&10, 13&26
PhaC1 Ppu P. putida KT2440 서열번호 15 & 16 서열번호 9&14, 17&26
PhaC1 Pre P. resinovorans 서열번호 19 & 20 서열번호 9&18, 21&26
PhaC1 Pae P. aeruginosa PAO1 서열번호 23 & 24 서열번호 9&22, 25&26
서열번호 9: 5 - gca atg ccc gga gcc ggg cta gct ag - 3
서열번호 10: 5 - gtc atc gtt att ctt gtt act cat gat ttg att gtc tct ctg - 3
서열번호 11: 5 - Cag aga gac aat caa atc atg agt aac aag aat aac gat gac - 3
서열번호 12: 5 - gca ctc atg caa gcg tta acg ttc atg gac ata agt acc - 3
서열번호 13: 5 - ggt act tat gtc cat gaa cgt taa cgc ttg cat gag tgc - 3
서열번호 14: 5 - ctc atc gtt gtt ctt gtt act cat gat ttg att gtc tct ctg - 3
서열번호 15: 5 - cag aga gac aat caa atc atg agt aac aag aac aac gat gag - 3
서열번호 16: 5 - gca ctc atg caa gcg tca acg ctc gtg aac gta ggt g - 3
서열번호 17: 5 - cac cta cgt tca cga gcg ttg acg ctt gca tga gtg c - 3
서열번호 18: 5 - gtc ttc att gtt ctt gtt gct cat gat ttg att gtc tct ctg - 3
서열번호 19: 5 - cag aga gac aat caa atc atg agc aac aag aac aat gaa gac - 3
서열번호 20: 5 - gca ctc atg caa gcg tca tcg ctc gtg cac ata ggt g - 3
서열번호 21: 5 - cac cta tgt gca cga gcg atg acg ctt gca tga gtg c - 3
서열번호 22: 5 - ctc gtt att gtt ctt ctg act cat gat ttg att gtc tct ctg - 3
서열번호 23: 5 - cag aga gac aat caa atc atg agt cag aag aac aat aac gag - 3
서열번호 24: 5 - gca ctc atg caa gcg tca tcg ttc atg cac gta ggt tc- 3
서열번호 25: 5 - gaa cct acg tgc atg aac gat gac gct tgc atg agt gc - 3
서열번호 26: 5 - gaa att gtt atc cgc ctg cag g - 3
PCR 반응물을 아가로오스 젤 전기영동 한 결과, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자에 해당하는 1.7kbp 크기의 유전자 절편을 확인하였다. 각 합성효소의 발현은 단량체 공급효소인 클로스트리디움 프로피오니쿰 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 변이체 유전자 (pct540 Cp )가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템을 도입하기로 하였다. 이에 앞서 기존 오페론 형태의 항시적 발현 시스템에서 클로닝 사이트로 사용하였던 BstBI 사이트가 새로이 클로닝한 몇몇 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자에 다수 포함되어 있음을 NCBI Genbank에 등록되어 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 시퀀스를 통해 확인하였고, 이를 해결하기 위해 BstBI 사이트를 unique 클로닝 사이트인 NheI 사이트로 전환 시킨 pPs619C1300N-CpPCT540 벡터를 pPs619C1300-CpPCT540 (WO09/022797)를 기반으로 site directed mutagenesis (SDM) 방법을 이용하여 제작하였다 (도 1).
상기 제작된 pPs619C1300N-CpPCT540 벡터를 NheI/SbfI으로 절단하여 기존 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자인 phaC1300 Ps6-19 를 제거한 다음, 서열번호 11 ~ 32를 이용하여 수득한 4 종의 합성효소 유전자를 NheI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 각 재조합벡터를 완성하였다. NheI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함되면서 개시 코돈 앞에 RBS region이 포함된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 절편을 만들기 위해서는, 상기 제작한 4종의 합성효소 유전자 PCR 반응물을 주형으로 하고, 표 2에 열거된 "인식 부위 삽입 프라이머"를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
제작한 4종의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자가 함유된 재조합 벡터 (pPchC1-CpPCT540, pPpuC1-CpPCT540, pPreC1-CpPCT540, pPaeC1-CpPCT540)의 합성효소 유전자 염기 서열은 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였으며 (서열번호 1, 3, 5, 7), 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8에 각기 대응한다. 본 발명에서 새로이 클로닝한 4종의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 중 슈도모나스 클로로라피스 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(PhaC1 Pch )를 제외한 3종의 합성효소들의 유전자 서열은 기존 NCBI Genbank에 등록되어 있는 유전자 시퀀스와 동일하였고 (표 1), PhaC1 Pch 의 경우 몇 개의 뉴클레오티드 서열에 차이를 보여 새로이 Genbank에 등록하였다 (Accession no. FJ693714).
이들 4종의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들의 아미노산 서열과 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 PhaC1 Ps6-19 의 아미노산 서열 다중 정렬 분석을 수행한 결과, 촉매 잔기 (catalytic residues)로 추정되는 아미노산 잔기들 (Cys296, Asp451, His479)과 락틸-CoA에 대한 기질 특이성 변화에 영향을 미친다고 기 보고한 (WO08/062999) 아미노산 잔기들 (Glu130, Ser325, Ser477, Gln481) 모두 공통적으로 보존되어 있음을 확인하였다 (도 2). 또 본 발명의 실시예에서는 제외 되었으나 PhaC1 Ps6-19 와 높은 상동성을 보인 슈도모나스 속 61-3 (Pseudomonas sp. strain 61-3) 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 PhaC1 Ps61-3 (Matsusaki et al., J. Bacteriol., 1998, 180:6459-6469; 유전자 서열 상동성 84.3%, 아미노산 서열 상동성 88.7%) 역시 상기 언급한 촉매 잔기들 및 락틸-CoA에 대한 기질 특이성 증가 아미노산 잔기들이 보존되어 있음을 확인하였다 (도 2).
<실시예 2> 락테이트 중합체 및 공중합체 생산 활성이 증가된 변이체 제작
Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소는 비교적 탄소수가 긴 기질을 중합시키는 MCL-PHA (medium-chain-length PHA) 합성효소로 알려져 있고, 다양한 돌연변이체 연구를 통해 SCL-PHA (short-chain-length PHA) 합성 활성이 증가된 변이체에 관한 연구 결과가 보고 되어 있다 (WO08/062999; Takase et al., J. Biochem., 2003, 133:139-145; Takase et al., Biomacromolecules, 2004, 5:480-485; Matsumoto et al., 2005, Biomacromolecules, 6:99-104; Matsumoto et al., 2006, Biomacromolecules, 7:2436-2442).
본 발명에서는 이전 발명에서 (WO08/062999) 락테이트 중합체 및 공중합체 합성 활성에 영향을 미친다고 확인한 바 있는 아미노산 서열 변이들을 새로이 획득한 4종의 Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 (PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae )들에 서열번호 27 ~ 74의 프라이머를 사용한 SDM 방법으로 도입하여 다음 표 3과 같은 변이체들을 제작하였다.
표 3 Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체
PHA 합성효소 재조합 플라스미드 아미노산 치환 프라이머 또는 출처
PhaC1 Ps6-19 pPs619C1202-CpPCT540 E130D WO08/062999
Q481K
pPs619C1310-CpPCT540 E130D WO08/062999
S477F
Q481K
pPs619C1301-CpPCT540 E130D WO08/062999
S325T
Q481K
pPs619C1339-CpPCT540 E130D WO08/062999
S325T
S477F
Q481K
pPs619C1337-CpPCT540 E130D 서열번호 27&28
S325T 서열번호 29&30
S477G 서열번호 31&32
Q481K 서열번호 33&34
PhaC1 Pch pPchC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S477F 서열번호 39&40
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S325T 서열번호 41&42
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S325T 서열번호 41&42
S477F 서열번호 39&40
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S325T 서열번호 41&42
S477G 서열번호 43&44
Q481K 서열번호 37&38
PhaC1 Ppu pPpuC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S477F 서열번호 49&50
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S325T 서열번호 51&52
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S325T 서열번호 51&52
S477F 서열번호 49&50
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S325T 서열번호 51&52
S477G 서열번호 53&54
Q481K 서열번호 47&48
PhaC1 Pre pPreC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S477F 서열번호 59&60
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S325T 서열번호 61&62
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S325T 서열번호 61&62
S477F 서열번호 59&60
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S325T 서열번호 61&62
S477G 서열번호 63&64
Q481K 서열번호 57&58
PhaC1 Pae pPaeC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S477F 서열번호 69&70
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S325T 서열번호 71&72
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S325T 서열번호 71&72
S477F 서열번호 69&70
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S325T 서열번호 71&72
S477G 서열번호 73&74
Q481K 서열번호 67&68
서열번호 27: 5’- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc - 3’
서열번호 28: 5’- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat - 3’
서열번호 29: 5’- ctg acc ttg ctg gtg acc gtg ctt gat acc acc - 3’
서열번호 30: 5’- ggt ggt atc aag cac ggt cac cag caa ggt cag - 3’
서열번호 31: 5’- gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc - 3’
서열번호 32: 5’- gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc - 3’
서열번호 33: 5’- ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c - 3’
서열번호 34: 5’- gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c - 3’
서열번호 35: 5’- atc aac ctg atg acc gat gcc atg gcg ccg acc - 3’
서열번호 36: 5’- ggt cgg cgc cat ggc atc ggt cat cag gtt gat - 3’
서열번호 37: 5’- ggg cat atc aaa agc atc ctc aac ccg c - 3’
서열번호 38: 5’- gcg ggt tga gga tgc ttt tga tat gcc c - 3’
서열번호 39: 5’- gaa ttc gtc ctc tcc agc ttt ggg cat atc - 3’
서열번호 40: 5’- gat atg ccc aaa gct gga gag gac gaa ttc - 3’
서열번호 41: 5’- ctg acc ctg ctg gtc acc gtg ctc gat acc acc - 3’
서열번호 42: 5’- ggt ggt atc gag cac ggt gac cag cag ggt cag - 3’
서열번호 43: 5’- gaa ttc gtc ctc tcc agc ggc ggg cat atc - 3’
서열번호 44: 5’- gat atg ccc gcc gct gga gag gac gaa ttc - 3’
서열번호 45: 5’- atc aac ctg atg acc gat gcc atg gcg ccg acc - 3’
서열번호 46: 5’- ggt cgg cgc cat ggc atc ggt cat cag gtt gat - 3’
서열번호 47: 5’- ggg cat atc aaa agc atc ctc aac ccg c - 3’
서열번호 48: 5’- gcg ggt tga gga tgc ttt tga tat gcc c - 3’
서열번호 49: 5’- gaa ttc gta ctg tcc aac ttt ggg cat atc - 3’
서열번호 50: 5’- gat atg ccc aaa gtt gga cag tac gaa ttc - 3’
서열번호 51: 5’- ctg acc ctg ctg gtc acc gtg ctg gac acc acc - 3’
서열번호 52: 5’- ggt ggt gtc cag cac ggt gac cag cag ggt cag - 3’
서열번호 53: 5’- gaa ttc gta ctg tcc aac ggc ggg cat atc - 3’
서열번호 54: 5’- gat atg ccc gcc gtt gga cag tac gaa ttc - 3’
서열번호 55: 5’- atc aac ctg atg acc gat gcg atg gcg ccc acc - 3’
서열번호 56: 5’- ggt ggg cgc cat cgc atc ggt cat cag gtt gat - 3’
서열번호 57: 5’- ggc cac atc aaa agc att ctc aac cca c - 3’
서열번호 58: 5’- gtg ggt tga gaa tgc ttt tga tgt ggc c - 3’
서열번호 59: 5’- gag ttc gtg ctg tcc aac ttt ggc cac atc - 3’
서열번호 60: 5’- gat gtg gcc aaa gtt gga cag cac gaa ctc - 3’
서열번호 61: 5’- ttc acc cag atg gtc acc gtg ctc gac ttc aac - 3’
서열번호 62: 5’- gtt gaa gtc gag cac ggt gac cat ctg ggt gaa - 3’
서열번호 63: 5’- gag ttc gtg ctg tcc aac ggc ggc cac atc - 3’
서열번호 64: 5’- gat gtg gcc gcc gtt gga cag cac gaa ctc - 3’
서열번호 65: 5’- atc aac ctg ctg acc gat gcg atg tcg ccg acc - 3’
서열번호 66: 5’- ggt cgg cga cat cgc atc ggt cag cag gtt gat - 3’
서열번호 67: 5’- ggt cac atc aaa agc atc ctc aac ccac - 3’
서열번호 68: 5’- gtg ggt tga gga tgc ttt tga tgt gac c - 3’
서열번호 69: 5’- gag ttc atc ctc tcc aac ttt ggt cac atc - 3’
서열번호 70: 5’- gat gtg acc aaa gtt gga gag gat gaa ctc - 3’
서열번호 71: 5’- ttc acc caa ctg gtc acc gtg ctc gac ttc gaa - 3’
서열번호 72: 5’- ttc gaa gtc gag cac ggt gac cag ttg ggt gaa - 3’
서열번호 73: 5’- gag ttc atc ctc tcc aac ggc ggt cac atc - 3’
서열번호 74: 5’- gat gtg acc gcc gtt gga gag gat gaa ctc - 3’
슈도모나스 속 6-19 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 PhaC1 Ps6-19 와 본 발명에서 제작한 4 종의 Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들로부터 제작된 합성효소 변이체들은 단량체 공급효소인 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 변이체 유전자 (pct540 Cp ; WO09/022797)와 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템에 도입되었다. 상기 제작된 합성효소 변이체들이 락테이트 공중합체 [P(3HB-co-LA)] 합성 활성을 나타내는지 확인하기 위해 표 3의 재조합 벡터를 E.coli XL-1 Blue에 형질 전환 시키고, 이를 P(3HB-co-LA) 검출 배지 (LB agar, glucose 20 g/L, 3HB 2 g/L, Nile red 0.5 μg/mL)에서 생육시켰다. 그 결과 아미노산 변이가 도입된 합성효소 변이체를 함유한 재조합 벡터로 형질 전환된 E. coli XL-1 Blue 에서는 다소간의 차이는 있지만 모두 락테이트 공중합체 생성을 Nile-red 염색으로 확인할 수 있었고, 아미노산 변이가 도입되지 않은 야생형의 합성효소가 발현된 E. coli XL-1 Blue 에서는 락테이트 공중합체 생성을 관찰할 수 없었다. 즉, 실시예 1에서 언급한 바와 같이 PhaC1 Ps6-19 와 더불어 본 발명에 사용된 PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae 모두 Glu130, Ser325, Ser477, Gln481 위치의 아미노산 변이에 따라 락테이트 공중합체 생산 활성이 새로이 형성되거나 증가됨을 확인하였다.
<실시예 3> 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 공중합체 생산
실시예 2에서 제작한 5종의 야생형 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들(PhaC1 Ps6-19 , PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae )과 이들의 변이체들의 락테이트 공중합체 [P(3HB-co-LA)] 합성 활성을 정량적으로 분석하기 위해 이들 합성효소가 함유된 재조합 발현 벡터(표 3)로 형질 전환된 E. coli XL-1 Blue를 포도당 (20g/L)과 3HB (2g/L)가 포함된 MR 배지 30 oC 에서 4일간 플라스크 배양하였다. 본 실시예에서 사용한 MR 배지의 조성은 표 4와 같다. 배양 균체를 원심분리를 통해 회수하고 증류수로 3회 세척한 후, 100 oC 의 건조기에서 24시간 건조하였다. 건조 세포 내 합성된 고분자 함량과 조성은 가스크로마토그래피를 통해 분석하였고, 그 결과는 표 5와 같다.
표 4 재조합 대장균의 배양에 사용된 MR 배지의 조성
성분 Modified R (MR) (/L)
KH2PO4 6.67 g
(NH4)2HPO4 4 g
Citrate 0.8 g
MgSO4 7H2O 0.8 g
미량성분* 5 mL
*미량성분(/L): FeSO4ㆍH2O, 10 g ; ZnSO4ㆍH2O, 2.25 g ; CuSO4ㆍH2O, 1 g ; MnSO4ㆍH2O, 0.5 g ; CaCl2ㆍH2O, 2 g ; Na2B4O7ㆍH2O, 0.23 g ; (NH4)6Mo7O24, 0.1 g ; 35 % HCl, 10 mL.
표 5 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 공중합체 합성
출처 PHA 합성효소 아미노산 치환 폴리머 함량(wt%) LA절편(mol%)
Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PhaC1 Ps6-19 - 0.6±0.1 0
PhaC1202 Ps6-19 E130D, Q481K 39.8±5.1 38.9±1.7
PhaC1301 Ps6-19 E130D, S477F, Q481K 49.9±8.2 36.2±3.3
PhaC1310 Ps6-19 E130D, S325T, Q481K 50.9±2.7 43.9±1.8
PhaC1339 Ps6-19 E130D, S325T, S477F, Q481K 59.4±1.6 45.4±3.6
PhaC1337 Ps6-19 E130D, S325T, S477G, Q481K 55.4±3.5 51.7±2.6
Pseudomonas chlororaphis PhaC1 Pch - 0.2±0 0
PhaC1202 Pch E130D, Q481K 13.2±3.4 20.1±0.4
PhaC1301 Pch E130D, S477F, Q481K 21.3±3.5 18.8±1.2
PhaC1310 Pch E130D, S325T, Q481K 27.5±4.4 23.2±7.6
PhaC1339 Pch E130D, S325T, S477F, Q481K 46.8±3.1 34.6±2.0
PhaC1337 Pch E130D, S325T, S477G, Q481K 52.8±1.4 43.7±1.8
Pseudomonas putida KT2440 PhaC1 Ppu - 0 0
PhaC1202 Ppu E130D, Q481K 6.8±0.9 0
PhaC1301 Ppu E130D, S477F, Q481K 7.8±0.5 7.1±0.8
PhaC1310 Ppu E130D, S325T, Q481K 39.3±0.6 27.5±0.8
PhaC1339 Ppu E130D, S325T, S477F, Q481K 41.3±3.1 25.1±0.3
PhaC1337 Ppu E130D, S325T, S477G, Q481K 43.0±2.2 32.0±2.6
Pseudomonas resinovorans PhaC1 Pre - 1.4±0 39.8±4.5
PhaC1202 Pre E130D, Q481K 31.6±4.4 62.7±2.1
PhaC1301 Pre E130D, S477F, Q481K 30.8±2.9 55.3±2.3
PhaC1310 Pre E130D, S325T, Q481K 57.5±0.4 49.0±2.4
PhaC1339 Pre E130D, S325T, S477F, Q481K 52.1±0.4 56.5±0.3
PhaC1337 Pre E130D, S325T, S477G, Q481K 53.6±2.9 65.5±1.0
Pseudomonas aeruginosa PAO1 PhaC1 Pae - 0 0
PhaC1202 Pae E130D, Q481K 5.1±1.1 30.7±3.1
PhaC1301 Pae E130D, S477F, Q481K 8.4±0.6 21.5±0.5
PhaC1310 Pae E130D, S325T, Q481K 36.0±1.3 36.2±0.1
PhaC1339 Pae E130D, S325T, S477F, Q481K 39.9±1.1 40.1±0.6
PhaC1337 Pae E130D, S325T, S477G, Q481K 49.2±2.9 52.7±0.5
가스크로마토그래피 분석 결과, 5종의 야생형 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(PhaC1 Ps6-19 , PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae )가 발현된 재조합 E. coli XL-1 Blue 에서는 락테이트 공중합체가 생성되지 않거나 미량(1.4 wt%) 생성된 반면, Glu130, Ser325, Ser477, Gln481 위치의 아미노산 변이가 도입된 변이체들의 경우 락틸-CoA를 기질로 받아들일 수 있는 활성이 새로이 생겨 (혹은 증가하여) 락테이트 공중합체 [P(3HB-co-LA)]가 세포 내에 축적되었다. 합성된 락테이트 공중합체의 세포 내 함량과 조성은 각각의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 종류에 따라 다르지만, E130D, S325T, S477G, Q481K의 변이가 동시에 도입된 변이체들의 경우에서 고분자의 높은 세포 내 축적율과 락테이트 함량이 높은 공중합체 합성능력을 보였다. 또 표 3의 변이체들 중 E130D, Q481K가 동시에 들어간 변이체들과 E130D, S325T, S477G, Q481K가 동시에 들어간 변이체들에 대해서 락테이트 중합체 합성 활성을 분석하였다. 이를 위해 각 변이체가 발현된 E. coli XL-1 Blue를 포도당 (20g/L)이 포함된 MR 배지 30 oC 에서 4일간 플라스크 배양하였다. 분석 결과 E130D, S325T, S477G, Q481K가 동시에 들어간 변이체들을 락테이트 중합체 합성에 이용했을 때 2 ~ 7 wt% 정도 생성되었고, 그 활성은 슈도모나스 레지노보란스 유래의 합성효소 변이체가 가장 높았다 (표 6).
표 6 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 합성
출처 PHA 합성효소 아미노산 치환 PLA (wt%)
Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PhaC1202 Ps6-19 E130D, Q481K 0.5 0.1
PhaC1337 Ps6-19 E130D, S325T, S477G, Q481K 7.2 0.3
Pseudomonas chlororaphis PhaC1202 Pch E130D, Q481K 0.3 0
PhaC1337 Pch E130D, S325T, S477G, Q481K 4.5 0.4
Pseudomonas putida KT2440 PhaC1202 Ppu E130D, Q481K 0
PhaC1337 Ppu E130D, S325T, S477G, Q481K 2.0 0.1
Pseudomonas resinovorans PhaC1202 Pre E130D, Q481K 1.2 0.3
PhaC1337 Pre E130D, S325T, S477G, Q481K 7.3 0
Pseudomonas aeruginosa PAO1 PhaC1202 Pae E130D, Q481K 0.6 0.3
PhaC1337 Pae E130D, S325T, S477G, Q481K 5.9 0.4

Claims (9)

  1. 서열번호가 2, 4, 6 또는 8인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열에서,
    a) E130D 및 Q481K;
    b) E130D, S325T 및 Q481K;
    c) E130D, S477F 및 Q481K;
    d) E130D, S325T, S477F 및 Q481K; 및
    e) E130D, S325T, S477G 및 Q481K; 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지며 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체.
  2. 제 1 항의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자.
  3. 제 2 항의 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체 합성용 재조합 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서,
    서열 번호 77의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 서열 번호 77의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자는,
    a) 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
    b) 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C;
    c) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
    d) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Ala243Thr 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G;
    e) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Gly 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이;
    f) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp257Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
    g) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1158C 변이;
    h) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Thr199Ile 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1159C 변이; 및
    i) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Val193Ala 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T699C 및 T1158C 변이; 로 구성된 군에서 선택되는 변이를 함유하는 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  7. 제 6 항의 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 배양은 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경에서 수행되고, 상기 공중합체는 하이드록시알카노에이트-co-3-락테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레레이트(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6~14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydrowyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-4-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hyxenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헥산산(3-hydroxy-6-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methylester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methylester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methylester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethylester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethylester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propylester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzylester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3,12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptenoic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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