KR101211767B1 - 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락테이트 중합체 (PLA) 및 락테이트 공중합체 (PLA copolymer)를 합성할 수 있는 다양한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)의 변이체들과 그것을 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 슈도모나스 속 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소와 아미노산 서열 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체, 그리고 상기 합성효소 변이체를 이용하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소와 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들은 락테이트 중합체 합성 활성에 영향을 미치는 아미노산 서열 변이에 의해 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성을 가질 수 있게 되며, 이들 합성효소 변이체들을 이용하면 각기 다른 성질을 가지는 락테이트 중합체 및 공중합체를 제조할 수 있다.
락테이트 중합체, 락테이트 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소

Description

폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법 {Mutants of PHA Synthases and Method for Preparing PLA and PLA Copolymer Using the Same}
본 발명은 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체를 합성할 수 있는 다양한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성이 증가된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체들을 이용하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
폴리락테이트(PLA)는 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 연쇄커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 유기용제(solvent)나 연쇄커플링제의 첨가 로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어 있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
화학합성을 통하여 락테이트를 이용하여 PLA를 합성할 경우 PLA 호모폴리머는 쉽게 수득할 수 있지만 다양한 모노머 조성을 지닌 PLA 공중합체의 합성은 어렵고 상업적으로 효용성이 매우 떨어지는 단점이 있다.
한편, 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoaste, PHA)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. 미생물을 이용하여 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 때도 같은 시스템이 필요하며 원래의 PHA 합성효소의 기질인 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소 이외에 추가로 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 2번 탄소 위치에 하이드록실화된 락틸-CoA를 기질로 효율적으로 이용할 수 있는 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19) 유래 PHA 합성효소 변이체를 개발하여 성공적으로 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 수 있었 고(WO08/062999), 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 변이체를 사용하여 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 세포 성장 저해 및 대장균에서의 비효율적인 발현 문제를 해결함으로써 PLA 및 PLA 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인한 바 있다.
상기 발명 예에서 알 수 있듯이 미생물을 이용하여 효율적으로 PLA 및 PLA 공중합체를 생산하기 위해서는 세포 성장을 저해하지 않으면서 활성화 형태로 발현되어 락틸-CoA를 원활히 공급할 수 있는 단량체 공급효소와 효율적으로 락틸-CoA를 기질로 인식할 수 있는 PHA 합성효소의 도입이 매우 중요함을 알 수 있다.
이에, 본 발명자들은 기존 시스템에서 사용되고 있는 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소와 아미노산 서열 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들을 탐색하였다. 상기 상동성이 높은 합성효소들 가운데 대표적인 4 종의 슈도모나스 균주들로부터 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 클로닝하고 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성에 영향을 미치는 아미노산 서열을 변화시킨 변이체들을 제조하여 락테이트 중합체 및 그 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 다양한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용하여 락테이트 중합체 또는 그 공중합체를 생성할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 락테이트 중합체 또는 그 공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락틸-CoA 공급 효소 유전자와 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudononas Chlororaphis) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 1), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 3), 슈도모나스 레지노보란스 (Pseudomonas resinovorans) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 5), 또는 슈도모나스 에루기노사 PAO 1 (Pseudomonas aeruginosa PA01) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 (서열번호 7)를 동시에 함유하여 락테이트 중합체 및 그 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 76의 아미노산 서열과 상동성이 70% 이상인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열에서,
a) E130D 및 Q481K;
b) E130D, S325T 및 Q481K;
c) E130D, S477F 및 Q481K;
d) E130D, S325T, S477F 및 Q481K; 또는
e) E130D, S325T, S477G 및 Q481K 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지며 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 제공한다.
상기 E130D 변이는 130번째 아미노산인 글루타메이트가 아스파르트산으로, S325T 변이는 325번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로, S477F 변이는 477번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로, Q481K 변이는 481번째 아미노산인 글루타민이 리신으로, 그리고 S477G 변이는 477번째 아미노산인 세린이 글리신으로 치환된 변이를 의미한다. 이와 같은 아미노산 서열의 변이로 인해 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체의 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 생산 활성이 새로이 형성되거나 증가된다.
본 발명의 다른 구체예에서 상기 슈도모나스 속 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(PhaC1Ps6 -19)의 아미노산 서열과 상동성이 70% 이상인 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열(각각 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudononas Chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440), 슈도모나스 레지노보란스 (Pseudomonas resinovorans), 및 슈도모나스 에루기노사 PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PA01) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열)인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 상기 설명한 4종의 슈도모나스 균주들로부터 유래된 PHA 합성효소의 변이체를 사용하는 경우 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 중합체 및 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
바람직하게, 본 발명에 따른 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열은 슈도모나스 속 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(PhaC1Ps6 -19)의 아미노산 서열과 상동성이 77% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 공중합체 합성용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터가 서열번호 77의 클로스트리디움 프로피오 니쿰 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pctCp)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 한다. 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제는 락테이트와 3-하이드록시부티레이트를 각각 락틸-CoA와 3-하이드록시부티레이트-CoA로 전환하는 효소이다.
바람직하게, 상기 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자는,
a) 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
b) 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C;
c) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
d) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Ala243Thr 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G;
e) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Gly 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이;
f) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp257Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
g) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1158C 변이;
h) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Thr199Ile 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1159C 변이; 및
i) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Val193Ala 변이 및 서열번호 77의 염기 서열에서 T78C, T699C 및 T1158C 변이; 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 함유하는 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자를 포함할 수 있다.
서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이는 1200번째 염기인 아데닌이 구아닌으로, T78C 변이는 78번째 염기인 티민이 시토신으로, T669C 변이는 669번째 염기인 티민이 시토신으로, A1125G 변이는 1125번째 염기인 아데닌이 구아닌으로, 그리고 T1158C 변이는 1158번째 염기인 티민이 시토신으로 치환된 변이를 의미한다. 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이는 335번째 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로, Ala243Thr 변이는 243번째 아미노산인 알라닌이 트레오닌으로, Asp65Gly 변이는 65번째 아미노산인 아스파르트산이 글리신으로, Asp257Asn 변이는 257번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로, Asp65Asn 변이는 65번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로, Thr199Ile 변이는 199번째 아미노산인 트레오닌이 이소루신으로, 그리고 Val193Ala 변이는 193번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 변이를 의미한다.
바람직하게, 상기 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Val193Ala 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T699C 및 T1158C 변이를 함유하는 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자 (pct 540Cp)일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터들 중 어느 하나로 형질전환된 형질전환체를 제공하며, 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제를 가지지 않는 형질전환 대상체를 전 술한 재조합 벡터들 중 어느 하나로 형질전환하여 수득되는 형질전환체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 적절한 숙주세포로 통상의 방법으로 형질전환할 수 있다. 숙주세포로는 박테리아, 효모 및 곰팡이 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 선호되는 숙주세포는 원핵세포로, 대장균이 바람직하다. 적합한 원핵 숙주세포의 예로는 E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12 294, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)도 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli 이외에도 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있으며, 본 발명은 상기 기술한 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용 가능한 형질전환 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명은 또한 상기 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 그 공중합체의 제조방법을 제공한다.
보다 바람직하게, 본 발명은 상기 배양이 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경에서 수행되고, 제조된 공중합체가 하이드록시알카노에이트 단량체 유니트 및 락테이트 단량체 유니트를 포함하는 공중합체인 하이드록시알카노에이트-co-3-락테이트인 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어 상기 공중합체는 단량체의 종류가 2개인 이중합체, 단량체의 종류가 3개인 삼중합체, 단량체의 종류가 4개인 사중합체 등을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어 상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레레이트(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6~14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydrowyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5- hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-4-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hyxenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헥산산(3-hydroxy-6-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록 시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methylester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methylester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methylester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethylester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethylester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propylester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzylester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록 시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3,12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid) alc 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3- hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptenoic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 본 발명에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다.
"발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.　진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.　플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다.　예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다.　그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 전술한 바와 같이 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명에서, 재조합 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러 한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
또한, 원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.　선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 전환효소의 유전자 및 합성효소의 유전자를 함유하는 식물체를 제조하기 위한 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(preculture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 아미노산 서열과 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들은 모두 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 합성 활성에 영향을 미치는 아미노산 서열 변이에 의해 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성을 가질 수 있게 되며, 이들 합성효소 변이체들을 이용하면 각기 다른 성질을 가지는 락테이트 공중합체를 제조할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
특히 이하 실시예에서는 type II PHA 합성효소 변이체를 이용하여 락테이트 공중합체를 합성하는 데에 3-하이드록시부티레이트(3-HB)를 첨가하여 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-락테이트)(P(3HB-co-LA))를 합성하는 것만이 기재되어 있으 나, 3-HB 이외의 폴리하이드록시알카노에이트를 첨가하여 상기 폴리하이드록시알카노에이트와 락테이트의 공중합체를 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
< 실시예 1> 슈도모나스 속 6-19 유래 PHA 합성효소의 아미노산 서열과 상동성이 높은 PHA 합성효소 탐색 및 유전자 클로닝
본 발명에 사용된 슈도모나스 속 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 (PhaC1 Ps6 -19 )와 아미노산 서열 상동성이 높은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 탐색하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 분석을 이용하였고, 그 결과 중 비교적 높은 아미노산 서열 상동성을 보이는 합성효소들을 표 1에 나타내었다. 상기 효소들은 모두 비교적 탄소수가 긴 기질을 중합시키는 MCL-PHA (medium-chain-length PHA) 합성효소인 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 군에 포함된다.
PhaC1 Ps6 -19 와 높은 아미노산 서열 상동성을 보이는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소
Organism Nucleotide identity Amino acid identity Genbank accession no.
Pseudomonas sp. MBEL 6-19 100 100 FJ626663
Pseudomonas sp. 3Y2 95 97 AY754343
Pseudomonas fluorescens PfO-1 88 93 CP000094
Pseudomonas sp. KBOS 03 87 91 AY790327
Pseudomonas chlororaphis 85 90 AB049413
Pseudomonas corrugata CFBP5454 85 89 AY910767
Pseudomonas sp. 61-3 84 89 AB014758
Pseudomonas fluorescens Pf-5 85 89 CP000076
Comamonas testosteroni 83 87 AY790326
Burkholderia caryophylli 82 86 AF394660
Aeromonas hydrophila 80 82 AY786298
Pseudomonas putida KT2440 80 81 AE015451
Pseudomonas pseudoalcaligenes HBQ06 80 79 AF336848
Pseudomonas resinovorans 80 81 AF129396
Pseudomonas sp. HJ-2 80 78 AY370934
Pseudomonas stutzeri 1317 79 79 AY278219
Pseudomonas aeruginosa PAO1 78 77 AE004091
이들 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들 중 본 발명의 실현을 위하여 하기 4 종의 대표성을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 실험의 대상으로 선택하였다 [Pseudomonas chlororaphis (KCTC 12349), Pseudomonas putida KT2440 (ATCC 47054), Pseudomonas resinovorans (KCTC 12498), 그리고 Pseudomonas aeruginosa PAO1 (KCTC 1637)]. 본 발명에 사용된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 분리하기 위해 각 슈도모나스 균주로부터 전체 DNA를 추출하고, NCBI Genbank에 등록되어 있는 합성효소 유전자 시퀀스에 기반한 표 2와 같은 프라이머를 제작하여 PCR 클로닝 하였다.
폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 클로닝을 위한 프라이머
합성효소 미생물 합성효소 클로닝 프라이머 인식부위 삽입 프라이머
PhaC1 Pch P. chlororaphis 서열번호 11 & 12 서열번호 9&10, 13&26
PhaC1 Ppu P. putida KT2440 서열번호 15 & 16 서열번호 9&14, 17&26
PhaC1 Pre P. resinovorans 서열번호 19 & 20 서열번호 9&18, 21&26
PhaC1 Pae P. aeruginosa PAO1 서열번호 23 & 24 서열번호 9&22, 25&26
서열번호 9: 5' - gca atg ccc gga gcc ggg cta gct ag - 3'
서열번호 10: 5' - gtc atc gtt att ctt gtt act cat gat ttg att gtc tct ctg - 3'
서열번호 11: 5' - Cag aga gac aat caa atc atg agt aac aag aat aac gat gac - 3'
서열번호 12: 5' - gca ctc atg caa gcg tta acg ttc atg gac ata agt acc - 3'
서열번호 13: 5' - ggt act tat gtc cat gaa cgt taa cgc ttg cat gag tgc - 3'
서열번호 14: 5' - ctc atc gtt gtt ctt gtt act cat gat ttg att gtc tct ctg - 3'
서열번호 15: 5' - cag aga gac aat caa atc atg agt aac aag aac aac gat gag -3'
서열번호 16: 5' - gca ctc atg caa gcg tca acg ctc gtg aac gta ggt g - 3'
서열번호 17: 5' - cac cta cgt tca cga gcg ttg acg ctt gca tga gtg c - 3'
서열번호 18: 5' - gtc ttc att gtt ctt gtt gct cat gat ttg att gtc tct ctg - 3'
서열번호 19: 5' - cag aga gac aat caa atc atg agc aac aag aac aat gaa gac - 3'
서열번호 20: 5' - gca ctc atg caa gcg tca tcg ctc gtg cac ata ggt g - 3'
서열번호 21: 5' - cac cta tgt gca cga gcg atg acg ctt gca tga gtg c - 3'
서열번호 22: 5' - ctc gtt att gtt ctt ctg act cat gat ttg att gtc tct ctg - 3'
서열번호 23: 5' - cag aga gac aat caa atc atg agt cag aag aac aat aac gag - 3'
서열번호 24: 5' - gca ctc atg caa gcg tca tcg ttc atg cac gta ggt tc- 3'
서열번호 25: 5' - gaa cct acg tgc atg aac gat gac gct tgc atg agt gc - 3'
서열번호 26: 5' - gaa att gtt atc cgc ctg cag g - 3'
PCR 반응물을 아가로오스 젤 전기영동 한 결과, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자에 해당하는 1.7kbp 크기의 유전자 절편을 확인하였다. 각 합성효소의 발현은 단량체 공급효소인 클로스트리디움 프로피오니쿰 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 변이체 유전자 (pct540 Cp )가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템을 도입하기로 하였다. 이에 앞서 기존 오페론 형태의 항시적 발현 시스템에서 클로닝 사이트로 사용하였던 BstBI 사이트가 새로이 클로닝한 몇몇 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자에 다수 포함되어 있음을 NCBI Genbank에 등록되어 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 시퀀스를 통해 확인하였고, 이를 해결하기 위해 BstBI 사이트를 unique 클로닝 사이트인 NheI 사이트로 전환 시킨 pPs619C1300N-CpPCT540 벡터를 pPs619C1300-CpPCT540 (WO09/022797)를 기반으로 site directed mutagenesis (SDM) 방법을 이용하여 제작하였다 (도 1).
상기 제작된 pPs619C1300N-CpPCT540 벡터를 NheI/SbfI으로 절단하여 기존 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자인 phaC1300 Ps6 - 19 를 제거한 다음, 서열번호 11 ~ 32를 이용하여 수득한 4 종의 합성효소 유전자를 NheI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 각 재조합벡터를 완성하였다. NheI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함되면서 개시 코돈 앞에 RBS region이 포함된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 절편을 만들기 위해서는, 상기 제작한 4종의 합성효소 유전자 PCR 반응물을 주형으로 하고, 표 2에 열거된 "인식 부위 삽입 프라이머"를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
제작한 4종의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자가 함유된 재조합 벡터 (pPchC1-CpPCT540, pPpuC1-CpPCT540, pPreC1-CpPCT540, pPaeC1-CpPCT540)의 합성효소 유전자 염기 서열은 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였으며 (서열번호 1, 3, 5, 7), 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8에 각기 대응한다. 본 발명에서 새로이 클로닝한 4종의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 중 슈도모나스 클로로라피스 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(PhaC1 Pch )를 제외한 3종의 합성효소들의 유전자 서열은 기존 NCBI Genbank에 등록되어 있는 유전자 시퀀스와 동일하였고 (표 1), PhaC1 Pch 의 경우 몇 개의 뉴클레오티드 서열에 차이를 보여 새로이 Genbank에 등록하였다 (Accession no. FJ693714).
이들 4종의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들의 아미노산 서열과 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 PhaC1 Ps6 - 19 의 아미노산 서열 다중 정렬 분석을 수행한 결과, 촉매 잔기 (catalytic residues)로 추정되는 아미노산 잔기들 (Cys296, Asp451, His479)과 락틸-CoA에 대한 기질 특이성 변화에 영향을 미친다고 기 보고한 (WO08/062999) 아미노산 잔기들 (Glu130, Ser325, Ser477, Gln481) 모두 공통적으로 보존되어 있음을 확인하였다 (도 2). 또 본 발명의 실시예에서는 제외 되었으나 PhaC1 Ps6 -19 와 높은 상동성을 보인 슈도모나스 속 61-3 (Pseudomonas sp. strain 61-3) 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 PhaC1 Ps61 -3 (Matsusaki et al., J. Bacteriol., 1998, 180:6459-6469; 유전자 서열 상동성 84.3%, 아미노산 서열 상동성 88.7%) 역시 상기 언급한 촉매 잔기들 및 락틸-CoA에 대한 기질 특이성 증가 아미노산 잔기들이 보존되어 있음을 확인하였다 (도 2).
< 실시예 2> 락테이트 중합체 및 공중합체 생산 활성이 증가된 변이체 제작
Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소는 비교적 탄소수가 긴 기질을 중합시키는 MCL-PHA (medium-chain-length PHA) 합성효소로 알려져 있고, 다양한 돌연변이체 연구를 통해 SCL-PHA (short-chain-length PHA) 합성 활성이 증가된 변이체에 관한 연구 결과가 보고 되어 있다 (WO08/062999; Takase et al., J. Biochem., 2003, 133:139-145; Takase et al., Biomacromolecules, 2004, 5:480-485; Matsumoto et al., 2005, Biomacromolecules, 6:99-104; Matsumoto et al., 2006, Biomacromolecules, 7:2436-2442).
본 발명에서는 이전 발명에서 (WO08/062999) 락테이트 중합체 및 공중합체 합성 활성에 영향을 미친다고 확인한 바 있는 아미노산 서열 변이들을 새로이 획득한 4종의 Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 (PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae )들에 서열번호 27 ~ 74의 프라이머를 사용한 SDM 방법으로 도입하여 다음 표 3과 같은 변이체들을 제작하였다.
Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체
PHA 합성효소 재조합 플라스미드 아미노산 치환 프라이머 또는 출처
PhaC1 Ps6-19 pPs619C1202-CpPCT540 E130D WO08/062999
Q481K
pPs619C1310-CpPCT540 E130D WO08/062999
S477F
Q481K
pPs619C1301-CpPCT540 E130D WO08/062999
S325T
Q481K
pPs619C1339-CpPCT540 E130D WO08/062999
S325T
S477F
Q481K
pPs619C1337-CpPCT540 E130D 서열번호 27&28
S325T 서열번호 29&30
S477G 서열번호 31&32
Q481K 서열번호 33&34
PhaC1 Pch pPchC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S477F 서열번호 39&40
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S325T 서열번호 41&42
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S325T 서열번호 41&42
S477F 서열번호 39&40
Q481K 서열번호 37&38
pPchC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 35&36
S325T 서열번호 41&42
S477G 서열번호 43&44
Q481K 서열번호 37&38
PhaC1 Ppu pPpuC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S477F 서열번호 49&50
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S325T 서열번호 51&52
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S325T 서열번호 51&52
S477F 서열번호 49&50
Q481K 서열번호 47&48
pPpuC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 45&46
S325T 서열번호 51&52
S477G 서열번호 53&54
Q481K 서열번호 47&48
PhaC1 Pre
pPreC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S477F 서열번호 59&60
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S325T 서열번호 61&62
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S325T 서열번호 61&62
S477F 서열번호 59&60
Q481K 서열번호 57&58
pPreC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 55&56
S325T 서열번호 61&62
S477G 서열번호 63&64
Q481K 서열번호 57&58
PhaC1 Pae pPaeC1202-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1310-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S477F 서열번호 69&70
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1301-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S325T 서열번호 71&72
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1339-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S325T 서열번호 71&72
S477F 서열번호 69&70
Q481K 서열번호 67&68
pPaeC1337-CpPCT540 E130D 서열번호 65&66
S325T 서열번호 71&72
S477G 서열번호 73&74
Q481K 서열번호 67&68
서열번호 27: 5’- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc - 3’
서열번호 28: 5’- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat - 3’
서열번호 29: 5’- ctg acc ttg ctg gtg acc gtg ctt gat acc acc - 3’
서열번호 30: 5’- ggt ggt atc aag cac ggt cac cag caa ggt cag - 3’
서열번호 31: 5’- gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc - 3’
서열번호 32: 5’- gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc - 3’
서열번호 33: 5’- ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c - 3’
서열번호 34: 5’- gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c - 3’
서열번호 35: 5’- atc aac ctg atg acc gat gcc atg gcg ccg acc - 3’
서열번호 36: 5’- ggt cgg cgc cat ggc atc ggt cat cag gtt gat - 3’
서열번호 37: 5’- ggg cat atc aaa agc atc ctc aac ccg c - 3’
서열번호 38: 5’- gcg ggt tga gga tgc ttt tga tat gcc c - 3’
서열번호 39: 5’- gaa ttc gtc ctc tcc agc ttt ggg cat atc - 3’
서열번호 40: 5’- gat atg ccc aaa gct gga gag gac gaa ttc - 3’
서열번호 41: 5’- ctg acc ctg ctg gtc acc gtg ctc gat acc acc - 3’
서열번호 42: 5’- ggt ggt atc gag cac ggt gac cag cag ggt cag - 3’
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서열번호 45: 5’- atc aac ctg atg acc gat gcc atg gcg ccg acc - 3’
서열번호 46: 5’- ggt cgg cgc cat ggc atc ggt cat cag gtt gat - 3’
서열번호 47: 5’- ggg cat atc aaa agc atc ctc aac ccg c - 3’
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서열번호 49: 5’- gaa ttc gta ctg tcc aac ttt ggg cat atc - 3’
서열번호 50: 5’- gat atg ccc aaa gtt gga cag tac gaa ttc - 3’
서열번호 51: 5’- ctg acc ctg ctg gtc acc gtg ctg gac acc acc - 3’
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서열번호 55: 5’- atc aac ctg atg acc gat gcg atg gcg ccc acc - 3’
서열번호 56: 5’- ggt ggg cgc cat cgc atc ggt cat cag gtt gat - 3’
서열번호 57: 5’- ggc cac atc aaa agc att ctc aac cca c - 3’
서열번호 58: 5’- gtg ggt tga gaa tgc ttt tga tgt ggc c - 3’
서열번호 59: 5’- gag ttc gtg ctg tcc aac ttt ggc cac atc - 3’
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서열번호 61: 5’- ttc acc cag atg gtc acc gtg ctc gac ttc aac - 3’
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서열번호 65: 5’- atc aac ctg ctg acc gat gcg atg tcg ccg acc - 3’
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서열번호 71: 5’- ttc acc caa ctg gtc acc gtg ctc gac ttc gaa - 3’
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서열번호 73: 5’- gag ttc atc ctc tcc aac ggc ggt cac atc - 3’
서열번호 74: 5’- gat gtg acc gcc gtt gga gag gat gaa ctc - 3’
슈도모나스 속 6-19 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 PhaC1 Ps6 -19 와 본 발명에서 제작한 4 종의 Type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들로부터 제작된 합성효소 변이체들은 단량체 공급효소인 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 변이체 유전자 (pct540 Cp ; WO09/022797)와 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템에 도입되었다. 상기 제작된 합성효소 변이체들이 락테이트 공중합체 [P(3HB-co-LA)] 합성 활성을 나타내는지 확인하기 위해 표 3의 재조합 벡터를 E.coli XL-1 Blue에 형질 전환 시키고, 이를 P(3HB-co-LA) 검출 배지 (LB agar, glucose 20 g/L, 3HB 2 g/L, Nile red 0.5 μg/mL)에서 생육시켰다. 그 결과 아미노산 변이가 도입된 합성효소 변이체를 함유한 재조합 벡터로 형질 전환된 E. coli XL-1 Blue 에서는 다소간의 차이는 있지만 모두 락테이트 공중합체 생성을 Nile-red 염색으로 확인할 수 있었고, 아미노산 변이가 도입되지 않은 야생형의 합성효소가 발현된 E. coli XL-1 Blue 에서는 락테이트 공중합체 생성을 관찰할 수 없었다. 즉, 실시예 1에서 언급한 바와 같이 PhaC1 Ps6 -19 와 더불어 본 발명에 사용된 PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae 모두 Glu130, Ser325, Ser477, Gln481 위치의 아미노산 변이에 따라 락테이트 공중합체 생산 활성이 새로이 형성되거나 증가됨을 확인하였다.
< 실시예 3> 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 공중합체 생산
실시예 2에서 제작한 5종의 야생형 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들(PhaC1 Ps6 -19 , PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae )과 이들의 변이체들의 락테이트 공중합체 [P(3HB-co-LA)] 합성 활성을 정량적으로 분석하기 위해 이들 합성효소가 함유된 재조합 발현 벡터(표 3)로 형질 전환된 E. coli XL-1 Blue를 포도당 (20g/L)과 3HB (2g/L)가 포함된 MR 배지 30 oC 에서 4일간 플라스크 배양하였다. 본 실시예에서 사용한 MR 배지의 조성은 표 4와 같다. 배양 균체를 원심분리를 통해 회수하고 증류수로 3회 세척한 후, 100 oC 의 건조기에서 24시간 건조하였다. 건조 세포 내 합성된 고분자 함량과 조성은 가스크로마토그래피를 통해 분석하였고, 그 결과는 표 5와 같다.
재조합 대장균의 배양에 사용된 MR 배지의 조성
성분 Modified R (MR) (/L)
KH2PO4 6.67 g
(NH4)2HPO4 4 g
Citrate 0.8 g
MgSO4?7H2O 0.8 g
미량성분* 5 mL
*미량성분(/L): FeSO4?7H2O, 10 g ; ZnSO4?7H2O, 2.25 g ; CuSO4?5H2O, 1 g ; MnSO4?5H2O, 0.5 g ; CaCl2?2H2O, 2 g ; Na2B4O7?7H2O, 0.23 g ; (NH4)6Mo7O24, 0.1 g ; 35 % HCl, 10 mL.
합성효소 변이체를 이용한 락테이트 공중합체 합성
출처 PHA 합성효소 아미노산 치환 폴리머 함량(wt%) LA절편
(mol%)
Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PhaC1 Ps6 -19 - 0.6±0.1 0
PhaC1202 Ps6 -19 E130D, Q481K 39.8±5.1 38.9±1.7
PhaC1301 Ps6 -19 E130D, S477F, Q481K 49.9±8.2 36.2±3.3
PhaC1310 Ps6 -19 E130D, S325T, Q481K 50.9±2.7 43.9±1.8
PhaC1339 Ps6 -19 E130D, S325T, S477F, Q481K 59.4±1.6 45.4±3.6
PhaC1337 Ps6 -19 E130D, S325T, S477G, Q481K 55.4±3.5 51.7±2.6
Pseudomonas chlororaphis PhaC1 Pch - 0.2±0 0
PhaC1202 Pch E130D, Q481K 13.2±3.4 20.1±0.4
PhaC1301 Pch E130D, S477F, Q481K 21.3±3.5 18.8±1.2
PhaC1310 Pch E130D, S325T, Q481K 27.5±4.4 23.2±7.6
PhaC1339 Pch E130D, S325T, S477F, Q481K 46.8±3.1 34.6±2.0
PhaC1337 Pch E130D, S325T, S477G, Q481K 52.8±1.4 43.7±1.8
Pseudomonas putida KT2440 PhaC1 Ppu - 0 0
PhaC1202 Ppu E130D, Q481K 6.8±0.9 0
PhaC1301 Ppu E130D, S477F, Q481K 7.8±0.5 7.1±0.8
PhaC1310 Ppu E130D, S325T, Q481K 39.3±0.6 27.5±0.8
PhaC1339 Ppu E130D, S325T, S477F, Q481K 41.3±3.1 25.1±0.3
PhaC1337 Ppu E130D, S325T, S477G, Q481K 43.0±2.2 32.0±2.6
Pseudomonas resinovorans PhaC1 Pre - 1.4±0 39.8±4.5
PhaC1202 Pre E130D, Q481K 31.6±4.4 62.7±2.1
PhaC1301 Pre E130D, S477F, Q481K 30.8±2.9 55.3±2.3
PhaC1310 Pre E130D, S325T, Q481K 57.5±0.4 49.0±2.4
PhaC1339 Pre E130D, S325T, S477F, Q481K 52.1±0.4 56.5±0.3
PhaC1337 Pre E130D, S325T, S477G, Q481K 53.6±2.9 65.5±1.0
Pseudomonas aeruginosa PAO1 PhaC1 Pae - 0 0
PhaC1202 Pae E130D, Q481K 5.1±1.1 30.7±3.1
PhaC1301 Pae E130D, S477F, Q481K 8.4±0.6 21.5±0.5
PhaC1310 Pae E130D, S325T, Q481K 36.0±1.3 36.2±0.1
PhaC1339 Pae E130D, S325T, S477F, Q481K 39.9±1.1 40.1±0.6
PhaC1337 Pae E130D, S325T, S477G, Q481K 49.2±2.9 52.7±0.5
가스크로마토그래피 분석 결과, 5종의 야생형 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(PhaC1 Ps6 -19 , PhaC1 Pch , PhaC1 Ppu , PhaC1 Pre , PhaC1 Pae )가 발현된 재조합 E. coli XL-1 Blue 에서는 락테이트 공중합체가 생성되지 않거나 미량(1.4 wt%) 생성된 반면, Glu130, Ser325, Ser477, Gln481 위치의 아미노산 변이가 도입된 변이체들의 경우 락틸-CoA를 기질로 받아들일 수 있는 활성이 새로이 생겨 (혹은 증가하여) 락테이트 공중합체 [P(3HB-co-LA)]가 세포 내에 축적되었다. 합성된 락테이트 공중합체의 세포 내 함량과 조성은 각각의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 종류에 따라 다르지만, E130D, S325T, S477G, Q481K의 변이가 동시에 도입된 변이체들의 경우에서 고분자의 높은 세포 내 축적율과 락테이트 함량이 높은 공중합체 합성능력을 보였다. 또 표 3의 변이체들 중 E130D, Q481K가 동시에 들어간 변이체들과 E130D, S325T, S477G, Q481K가 동시에 들어간 변이체들에 대해서 락테이트 중합체 합성 활성을 분석하였다. 이를 위해 각 변이체가 발현된 E. coli XL-1 Blue를 포도당 (20g/L)이 포함된 MR 배지 30 oC 에서 4일간 플라스크 배양하였다. 분석 결과 E130D, S325T, S477G, Q481K가 동시에 들어간 변이체들을 락테이트 중합체 합성에 이용했을 때 2 ~ 7 wt% 정도 생성되었고, 그 활성은 슈도모나스 레지노보란스 유래의 합성효소 변이체가 가장 높았다 (표 6).
합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 합성
출처 PHA 합성효소 아미노산 치환 PLA (wt%)
Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PhaC1202 Ps6 -19 E130D, Q481K 0.5±0.1
PhaC1337 Ps6 -19 E130D, S325T, S477G, Q481K 7.2±0.3
Pseudomonas chlororaphis PhaC1202 Pch E130D, Q481K 00.3±
PhaC1337 Pch E130D, S325T, S477G, Q481K 4.5±0.4
Pseudomonas putida KT2440 PhaC1202 Ppu E130D, Q481K 0
PhaC1337 Ppu E130D, S325T, S477G, Q481K 2.0±0.1
Pseudomonas resinovorans PhaC1202 Pre E130D, Q481K 1.2±0.3
PhaC1337 Pre E130D, S325T, S477G, Q481K 7.3±0
Pseudomonas aeruginosa PAO1 PhaC1202 Pae E130D, Q481K 0.6±0.3
PhaC1337 Pae E130D, S325T, S477G, Q481K 5.9±0.4
1. 도 1은 본 발명의 슈도모나스 속 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소와 아미노산 서열 상동성이 높은 type II 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소들과 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 변이체(Pct540 Cp )를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로부터 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성 활성이 증가된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체들을 제작하는 과정을 도식화한 것이다.
2. 도 2는 본 발명에 사용된 슈도모나스 속 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 슈도모나스 레지노보란스 (Pseudomonas resinovorans) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소, 그리고 슈도모나스 에루기노사 PAO 1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 서열 multiple alignment를 나타낸 것으로 촉매 잔기 (catalytic residues)로 추정되는 아미노산 잔기들 (Cys296, Asp451, His479)에는 * 표시를, 락틸-CoA에 대한 기질 특이성 변화에 영향을 미치는 아미노산 잔기들 (Glu130, Ser325, Ser477, Gln481)에는 아미노산 서열 번호를 표시하였다.
<110> LG CHEMICAL LTD. <120> Mutants of PHA Synthases and Method for Preparing PLA and PLA Copolymer Using the Same <130> P090399 <160> 78 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1677 <212> DNA <213> PHA synthase from Pseudomonas chlororaphis KCTC 12349 (phaC1Pch) <400> 1 atgagtaaca agaataacga tgacctgaaa cgccaagcct cggaaaacac tctgggcctg 60 aatcctgtca tcggtttacg tcggaaagat ctgcttacct ctgctcgtat ggtgctgacc 120 caggccatca aacaaccgct gcacagcgcc aaacatgtgg cccatttcgg cgtcgaactg 180 aagaacgtga tgttcggcaa atcgacgctg caaccggaga gcgatgaccg tcgcttcaac 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctgtac aagcgttacc tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggagc ttcacgactg gatcggccac agcaacctct ccgaacagga catcagtcgc 360 gcccacttcg tcatcaacct gatgaccgaa gccatggcgc cgaccaacac cgccgccaac 420 cccgcggcgg tcaaacgctt cttcgagacc ggcggcaaaa gcctgctcga tggcctctcc 480 catctggcca aggacctggt gcacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catggacgcc 540 ttcgagatcg gcaagaacct gggcaccagt gaaggcgcgg tggtatttcg caacgacgtg 600 ctggaactga tccagtaccg cccggtgacc gagcaggtgc acgaacgccc gctgctggtg 660 gtcccgccac agatcaacaa gttctacgtc ttcgacctca gcccggacaa gagcctggcg 720 cgtttctgcc tgcgcaacgg cgtgcagacc tttatcgtca gttggcgcaa cccgaccaag 780 gcgcagcgcg agtggggcct gtcgacctac atcgaagcgc tgaaagaagc ggtcgacgtg 840 gtcaccgcca tcaccggcag caaggacgtg aacatgctcg gcgcctgctc cggtggcatc 900 acctgcaccg cgctgctggg gcactacgcg gccctgggcg agaagaaggt caacgccctg 960 accctgctgg tcagcgtgct cgataccacc ctcgacaccc aggtggcgct gttcgtcgac 1020 gagcagaccc tggaagccgc caagcgtcat tcctatcagg ctggcgtgct ggaaggccgc 1080 gacatggcca aggtcttcgc ctggatgcgg cccaacgacc tgatctggaa ctactgggtg 1140 aacaactacc tgctgggcaa cgagccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacccggt tgcccgcggc cttccacggc gacctgatcg aaatgttcaa aaacaatcca 1260 ctgatccgcc ccaacgcact ggaagtgtgc ggtacgccga tcgacctgaa acaggtcacc 1320 gccgacatct tctctctggc cggcaccaac gatcacatca ccccatggaa gtcctgctac 1380 aagtcggccc aactgttcgg cggcaaggtc gaattcgtcc tctccagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tcaacccgcc gggcaacccc aagtcgcgct acatgaccag cgaagagatg 1500 ccgcccagcg ccgacgactg gcaggaaaac tccaccaagc acactgactc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ggagcgctcg ggcaaactga aaaagacgcc gagcattctc 1620 ggcaacaagg cgtatccagc ggccgaggcg gcgccgggta cttatgtcca tgaacgt 1677 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase from Pseudomonas chlororaphis KCTC 12349 (PhaC1Pch) <400> 2 Met Ser Asn Lys Asn Asn Asp Asp Leu Lys Arg Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Ile Gly Leu Arg Arg Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Thr Ser Ala Arg Met Val Leu Thr Gln Ala Ile Lys Gln Pro Leu His 35 40 45 Ser Ala Lys His Val Ala His Phe Gly Val Glu Leu Lys Asn Val Met 50 55 60 Phe Gly Lys Ser Thr Leu Gln Pro Glu Ser Asp Asp Arg Arg Phe Asn 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Gly His Ser Asn 100 105 110 Leu Ser Glu Gln Asp Ile Ser Arg Ala His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Asp Ala Phe Glu Ile Gly Lys Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Arg Pro 195 200 205 Val Thr Glu Gln Val His Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Gly Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Leu Gly Glu Lys Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Thr Gln Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Met Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Lys Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Glu Glu Met Pro Pro Ser Ala Asp Asp Trp Gln Glu Asn Ser Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Glu 515 520 525 Arg Ser Gly Lys Leu Lys Lys Thr Pro Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 3 <211> 1677 <212> DNA <213> PHA synthase from Pseudomonas putida KT2440 ATCC 47054 (phaC1Ppu) <400> 3 atgagtaaca agaacaacga tgagctacag cggcaggcct cggaaaacac cctggggctg 60 aacccggtca tcggcatccg ccgcaaggac ctgttgagct cggcacgcac cgtgctgcgc 120 caggccgtgc gccaaccgct gcacagcgcc aagcatgtgg ctcactttgg cctggagctg 180 aagaacgtgt tgctgggcaa atccagcctg gccccggaca gcgacgaccg tcgcttcaat 240 gacccggcct ggagcaacaa cccgctgtac cgccgctacc tgcaaaccta cctggcctgg 300 cgcaaggagc tgcaggactg ggtgagcagc agcgacctgt ccccccagga catcagccgc 360 ggccagttcg tcatcaacct gatgaccgag gccatggcgc cgaccaatac cctgtccaac 420 ccggctgcgg tcaaacgctt cttcgaaacc ggcggcaaga gcctgctcga tggcctgtcc 480 aacctggcca aggacatggt caacaacggc ggcatgccca gccaggtgaa catggatgcc 540 ttcgaagtgg gcaagaacct gggcaccagc gaaggcgcgg tggtgtaccg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacag ccccatcacc gagcaggtgc atgcccgtcc gctgctggtg 660 gtgccaccgc agatcaacaa gttctacgtg ttcgacctca gcccggaaaa gagcctggcg 720 cgcttctgcc tgcgctcgca gcagcagacc ttcatcatca gctggcgcaa cccgaccaag 780 gcccagcgtg aatggggcct gtccacctac atcgatgcgc tgaaagaagc cgtcgacgcg 840 gtgctgtcga ttaccggcag caaggacctg aacatgctcg gcgcctgctc cggtggcatc 900 acttgtaccg cactggtggg ccactatgcc gccattggcg agaacaaggt caacgccctg 960 accctgctgg tcagcgtgct ggacaccacc atggacaacc aggttgcttt gtttgtcgac 1020 gagcagacct tggaggccgc caagcgccac tcctatcagg cgggcgtgct ggaaggcagc 1080 gaaatggcca aggtgttcgc ctggatgcgc cccaacgacc tgatctggaa ctactgggta 1140 aacaactacc tgctcggcaa tgagcccccc gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacgcgcc tgccggccgc cttccacggc gacctgatcg aaatgttcaa gagcaacccg 1260 ctgacccgcc ccgacgccct ggaagtgtgc ggcaccgcga tcgacctgaa acaggtcaaa 1320 tgcgacatct acagcctcgc cggcaccaac gaccacatca ccccctggcc gtcatgctac 1380 cgctcggcac atctgttcgg cggcaagatc gaattcgtac tgtccaacag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tcaacccgcc gggcaacccg aaggcacgtt tcatgaccgg tgccgatcgc 1500 ccgggtgacc cggtggcctg gcaggaaaat gccatcaagc atgcagactc ctggtggttg 1560 cactggcaga gttggctggg cgagcgtgcc ggcgcgctga aaaaggcacc 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Gln Val 165 170 175 Asn Met Asp Ala Phe Glu Val Gly Lys Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Tyr Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Ser Pro 195 200 205 Ile Thr Glu Gln Val His Ala Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Glu Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Ser Gln Gln Gln Thr Phe Ile Ile Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Asp 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Ala Val Leu Ser Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Leu Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Val Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Met Asp Asn Gln Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Ser Glu Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Met Phe 405 410 415 Lys Ser Asn Pro Leu Thr Arg Pro Asp Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Ala Ile Asp Leu Lys Gln Val Lys Cys Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Pro Ser Cys Tyr Arg Ser Ala His 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Lys Ile Glu Phe Val Leu Ser Asn Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ala Arg Phe Met Thr 485 490 495 Gly Ala Asp Arg Pro Gly Asp Pro Val Ala Trp Gln Glu Asn Ala Ile 500 505 510 Lys His Ala Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ser Trp Leu Gly Glu 515 520 525 Arg Ala Gly Ala Leu Lys Lys Ala Pro Thr Arg Leu Gly Asn Arg Thr 530 535 540 Tyr Ala Ala Gly Glu Ala Ser Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 5 <211> 1677 <212> DNA <213> PHA synthase from Pseudomonas resinovorans KCTC 12498 (phaC1Pre) <400> 5 atgagcaaca agaacaatga agacctgcag cgccaggcct cggacaacac cctgaacctc 60 aatccggtga taggtatccg cggcaaggat ctgctgtctt cagcacggat ggtgctgttg 120 caagccatca agcaaccttt ccacagtgca aaacacgtcg cccatttcgg cctggaattg 180 aaaaacgtgt tgcttggcca gtccggtctg caaccggaag ccgatgaccg tcgcttcaat 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctgtac aagcgctatc tgcagaccta cctcgcctgg 300 cgcaaggagc tgcacagctg gatcgacgag agcaacctct cgtcacagga tgccagtcgc 360 ggccacttcg tcatcaacct gatgaccgag gcgatggcgc ccaccaacag catggccaac 420 ccggccgcag tcaaacggtt cttcgagacc ggcggcaaga gcctgctgga tggcctctcc 480 cacctggcca aggacatggt gaacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catggatgcc 540 ttcgaggtcg gccagaacct cgccacgacc gaaggtgcgg tggttttccg caatgacgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gcccatcacc gagagcgtgt acgaacgccc gctactcgtg 660 gtgccgcccc agatcaacaa gttctacgtc ttcgacctgt caccggagaa gagcctcgcg 720 cgcttctgcc tgcgcagcaa cctgcagacc ttcatcgtca gctggcgcaa cccgaccaag 780 gcgcagcgcg agtggggcct gtccacgtac atcgaggccc tcaaggaggc cattgacgtc 840 atcctgaaga tcaccggcgc caaggacctc aacatcctcg gcgcgtgctc cggcggcatc 900 accacggtcg ccctgctcgg ccactaccag gccattggtg aaaccaaggt caatgccttc 960 acccagatgg tcagcgtgct cgacttcaac ctcgatagcc aggtcgcgct gttcgccgac 1020 gagcagaccc tcgaagccgc caagcgccgc tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggcaaa 1080 gacatggcca aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgacc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaactacc tgctgggcaa cgaaccgccg gccttcgaca tcctctattg gaacaacgac 1200 accacgcgtc tgcctgcagc gttccatggc gaactggtgg aaatgttcaa gaccaatgcc 1260 ctgacccgtc caaatgccct ggaggtctgt ggcacgccca tcgacctgaa gcaagtcacc 1320 agcgacttct tctgccttgc cggcaccacc gaccacatta ccccctggga agcctgctac 1380 cgctcggcgc tgctgctggg cggcaaatgc gagttcgtgc tgtccaacag cggccacatc 1440 cagagcattc tcaacccacc gggcaacccc aaggcacgct tctccaccgg cagcgagatg 1500 ccgaaagatc cgaaggcctg gctggaaaat gcgaccaagc acgccgactc ctggtggctg 1560 cattggcagc agtggatcgg cgaacgctcc ggcaagacca agaaagccag ctttaccctg 1620 ggcaacaagg ccttcccggc cggtgaagcc tcgcccggca cctatgtgca cgagcga 1677 <210> 6 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase from Pseudomonas resinovorans KCTC 12498 (PhaC1Pre) <400> 6 Met Ser Asn Lys Asn Asn Glu Asp Leu Gln Arg Gln Ala Ser Asp Asn 1 5 10 15 Thr Leu Asn Leu Asn Pro Val Ile Gly Ile Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ser Ser Ala Arg Met Val Leu Leu Gln Ala Ile Lys Gln Pro Phe His 35 40 45 Ser Ala Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Gln Ser Gly Leu Gln Pro Glu Ala Asp Asp Arg Arg Phe Asn 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Ser Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ser Ser Gln Asp Ala Ser Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Ser Met Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Met Val Asn Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Asp Ala Phe Glu Val Gly Gln Asn Leu Ala Thr Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Ile Thr Glu Ser Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Glu Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Ser Asn Leu Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Ile Asp Val Ile Leu Lys Ile Thr Gly Ala Lys 275 280 285 Asp Leu Asn Ile Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Thr Val Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Gln Ala Ile Gly Glu Thr Lys Val Asn Ala Phe 305 310 315 320 Thr Gln Met Val Ser Val Leu Asp Phe Asn Leu Asp Ser Gln Val Ala 325 330 335 Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg Arg Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Lys Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Ala Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Glu Leu Val Glu Met Phe 405 410 415 Lys Thr Asn Ala Leu Thr Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ser Asp Phe Phe Cys Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Thr Asp His Ile Thr Pro Trp Glu Ala Cys Tyr Arg Ser Ala Leu 450 455 460 Leu Leu Gly Gly Lys Cys Glu Phe Val Leu Ser Asn Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ala Arg Phe Ser Thr 485 490 495 Gly Ser Glu Met Pro Lys Asp Pro Lys Ala Trp Leu Glu Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Ala Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Gln Trp Ile Gly Glu 515 520 525 Arg Ser Gly Lys Thr Lys Lys Ala Ser Phe Thr Leu Gly Asn Lys Ala 530 535 540 Phe Pro Ala Gly Glu Ala Ser Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 7 <211> 1677 <212> DNA <213> PHA synthase from Pseudomonas aeruginosa PAO1 KCTC 1637 (phaC1Pae) <400> 7 atgagtcaga agaacaataa cgagcttccc aagcaagccg cggaaaacac gctgaacctg 60 aatccggtga tcggcatccg gggcaaggac ctgctcacct ccgcgcgcat ggtcctgctc 120 caggcggtgc gccagccgct gcacagcgcc aggcacgtgg cgcatttcag cctggagctg 180 aagaacgtcc tgctcggcca gtcggagcta cgcccaggcg atgacgaccg acgcttttcc 240 gatccggcct ggagccagaa tccactgtac aagcgctaca tgcagaccta cctggcctgg 300 cgcaaggagc tgcacagctg gatcagccac agcgacctgt cgccgcagga catcagtcgt 360 ggccagttcg tcatcaacct gctgaccgag gcgatgtcgc cgaccaacag cctgagcaac 420 ccggcggcgg tcaagcgctt cttcgagacc ggcggcaaga gcctgctgga cggcctcggc 480 cacctggcca aggacctggt gaacaacggc gggatgccga gccaggtgga catggacgcc 540 ttcgaggtgg gcaagaacct ggccaccacc gagggcgccg tggtgttccg caacgacgtg 600 ctggaactga tccagtaccg gccgatcacc gagtcggtgc acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtc ttcgacctgt cgccggacaa gagcctggcg 720 cgcttctgcc tgcgcaacgg cgtgcagacc ttcatcgtca gttggcgcaa cccgaccaag 780 tcgcagcgcg aatggggcct gaccacctat atcgaggcgc tcaaggaggc catcgaggta 840 gtcctgtcga tcaccggcag caaggacctc aacctcctcg gcgcctgctc cggcgggatc 900 accaccgcga ccctggtcgg ccactacgtg gccagcggcg agaagaaggt caacgccttc 960 acccaactgg tcagcgtgct cgacttcgaa ctgaataccc aggtcgcgct gttcgccgac 1020 gagaagactc tggaggccgc caagcgtcgt tcctaccagt ccggcgtgct ggagggcaag 1080 gacatggcca aggtgttcgc ctggatgcgc cccaacgacc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaactacc tgctcggcaa ccagccgccg gcgttcgaca tcctctactg gaacaacgac 1200 accacgcgcc tgcccgccgc gctgcacggc gagttcgtcg aactgttcaa gagcaacccg 1260 ctgaaccgcc ccggcgccct ggaggtctcc ggcacgccca tcgacctgaa gcaggtgact 1320 tgcgacttct actgtgtcgc cggtctgaac gaccacatca ccccctggga gtcgtgctac 1380 aagtcggcca ggctgctggg tggcaagtgc gagttcatcc tctccaacag cggtcacatc 1440 cagagcatcc tcaacccacc gggcaacccc aaggcacgct tcatgaccaa tccggaactg 1500 cccgccgagc ccaaggcctg gctggaacag gccggcaagc acgccgactc gtggtggttg 1560 cactggcagc aatggctggc cgaacgctcc ggcaagaccc gcaaggcgcc cgccagcctg 1620 ggcaacaaga cctatccggc cggcgaagcc gcgcccggaa cctacgtgca tgaacga 1677 <210> 8 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase from Pseudomonas aeruginosa PAO1 KCTC 1637 (PhaC1Pae) <400> 8 Met Ser Gln Lys Asn Asn Asn Glu Leu Pro Lys Gln Ala Ala Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Asn Leu Asn Pro Val Ile Gly Ile Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Thr Ser Ala Arg Met Val Leu Leu Gln Ala Val Arg Gln Pro Leu His 35 40 45 Ser Ala Arg His Val Ala His Phe Ser Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Gln Ser Glu Leu Arg Pro Gly Asp Asp Asp Arg Arg Phe Ser 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Met Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Ser Trp Ile Ser His Ser Asp 100 105 110 Leu Ser Pro Gln Asp Ile Ser Arg Gly Gln Phe Val Ile Asn Leu Leu 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ser Pro Thr Asn Ser Leu Ser Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Gly 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val Asn Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asp Met Asp Ala Phe Glu Val Gly Lys Asn Leu Ala Thr Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Arg Pro 195 200 205 Ile Thr Glu Ser Val His Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro 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gagtaacaag aataacgatg ac 42 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 12 gcactcatgc aagcgttaac gttcatggac ataagtacc 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 13 ggtacttatg tccatgaacg ttaacgcttg catgagtgc 39 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 14 ctcatcgttg ttcttgttac tcatgatttg attgtctctc tg 42 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 15 cagagagaca atcaaatcat gagtaacaag aacaacgatg ag 42 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 16 gcactcatgc aagcgtcaac gctcgtgaac gtaggtg 37 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 17 cacctacgtt cacgagcgtt gacgcttgca tgagtgc 37 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 18 gtcttcattg ttcttgttgc tcatgatttg attgtctctc tg 42 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 19 cagagagaca atcaaatcat gagcaacaag aacaatgaag ac 42 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 20 gcactcatgc aagcgtcatc gctcgtgcac ataggtg 37 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 21 cacctatgtg cacgagcgat gacgcttgca tgagtgc 37 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 22 ctcgttattg ttcttctgac tcatgatttg attgtctctc tg 42 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 23 cagagagaca atcaaatcat gagtcagaag aacaataacg ag 42 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PHA synthase cloning <400> 24 gcactcatgc aagcgtcatc gttcatgcac gtaggttc 38 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 25 gaacctacgt gcatgaacga tgacgcttgc atgagtgc 38 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for recognition site insertion <400> 26 gaaattgtta tccgcctgca gg 22 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 27 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 28 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 29 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 30 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 31 gaattcgtgc tgtcgagcgg cgggcatatc 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 32 gatatgcccg ccgctcgaca gcacgaattc 30 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 33 gggcatatca aaagcatcct gaacccgc 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Ps6-19 <400> 34 gcgggttcag gatgcttttg atatgccc 28 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Pch <400> 35 atcaacctga tgaccgatgc catggcgccg acc 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Pch <400> 36 ggtcggcgcc atggcatcgg tcatcaggtt gat 33 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Pch <400> 37 gggcatatca aaagcatcct caacccgc 28 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Pch <400> 38 gcgggttgag gatgcttttg atatgccc 28 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477F mutation in PhaC1Pch <400> 39 gaattcgtcc tctccagctt tgggcatatc 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477F mutation in PhaC1Pch <400> 40 gatatgccca aagctggaga ggacgaattc 30 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Pch <400> 41 ctgaccctgc tggtcaccgt gctcgatacc acc 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Pch <400> 42 ggtggtatcg agcacggtga ccagcagggt cag 33 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Pch <400> 43 gaattcgtcc tctccagcgg cgggcatatc 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Pch <400> 44 gatatgcccg ccgctggaga ggacgaattc 30 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Ppu <400> 45 atcaacctga tgaccgatgc catggcgccg acc 33 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Ppu <400> 46 ggtcggcgcc atggcatcgg tcatcaggtt gat 33 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Ppu <400> 47 gggcatatca aaagcatcct caacccgc 28 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Ppu <400> 48 gcgggttgag gatgcttttg atatgccc 28 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477F mutation in PhaC1Ppu <400> 49 gaattcgtac tgtccaactt tgggcatatc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477F mutation in PhaC1Ppu <400> 50 gatatgccca aagttggaca gtacgaattc 30 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Ppu <400> 51 ctgaccctgc tggtcaccgt gctggacacc acc 33 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Ppu <400> 52 ggtggtgtcc agcacggtga ccagcagggt cag 33 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Ppu <400> 53 gaattcgtac tgtccaacgg cgggcatatc 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Ppu <400> 54 gatatgcccg ccgttggaca gtacgaattc 30 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Pre <400> 55 atcaacctga tgaccgatgc gatggcgccc acc 33 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Pre <400> 56 ggtgggcgcc atcgcatcgg tcatcaggtt gat 33 <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K 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Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Pre <400> 64 gatgtggccg ccgttggaca gcacgaactc 30 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Pae <400> 65 atcaacctgc tgaccgatgc gatgtcgccg acc 33 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for E130D mutation in PhaC1Pae <400> 66 ggtcggcgac atcgcatcgg tcagcaggtt gat 33 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Pae <400> 67 ggtcacatca aaagcatcct caacccac 28 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Q481K mutation in PhaC1Pae <400> 68 gtgggttgag gatgcttttg atgtgacc 28 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477F mutation in PhaC1Pae <400> 69 gagttcatcc tctccaactt tggtcacatc 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477F mutation in PhaC1Pae <400> 70 gatgtgacca aagttggaga ggatgaactc 30 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Pae <400> 71 ttcacccaac tggtcaccgt gctcgacttc gaa 33 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S325T mutation in PhaC1Pae <400> 72 ttcgaagtcg agcacggtga ccagttgggt gaa 33 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Pae <400> 73 gagttcatcc tctccaacgg cggtcacatc 30 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for S477G mutation in PhaC1Pae <400> 74 gatgtgaccg ccgttggaga ggatgaactc 30 <210> 75 <211> 1677 <212> DNA <213> PHA synthase from Pseudomonas sp. MBEL 6-19 KCTC 11027BP (phaC1Ps6-19) <400> 75 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 76 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase from Pseudomonas sp. MBEL 6-19 KCTC 11027BP (PhaC1Ps6-19) <400> 76 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 77 <211> 1572 <212> DNA <213> Propionyl-CoA transferase from Clostridium propionicum (pctCp) <400> 77 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa 1380 agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt 1440 gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca 1500 aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag 1560 gaaatgaagt cc 1572 <210> 78 <211> 524 <212> PRT <213> Propionyl-CoA transferase from Clostridium propionicum (PctCp) <400> 78 Met Arg Lys Val Pro Ile Ile Thr Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Ile 1 5 10 15 Lys Asp Gly Asp Thr Val Thr Thr Ser Gly Phe Val Gly Asn Ala Ile 20 25 30 Pro Glu Ala Leu Asp Arg Ala Val Glu Lys Arg Phe Leu Glu Thr Gly 35 40 45 Glu Pro Lys Asn Ile Thr Tyr Val Tyr Cys Gly Ser Gln Gly Asn Arg 50 55 60 Asp Gly Arg Gly Ala Glu His Phe Ala His Glu Gly Leu Leu Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Ile Ala Gly His Trp Ala Thr Val Pro Ala Leu Gly Lys Met Ala 85 90 95 Met Glu Asn Lys Met Glu Ala Tyr Asn Val Ser Gln Gly Ala Leu Cys 100 105 110 His Leu Phe Arg Asp Ile Ala Ser His Lys Pro Gly Val Phe Thr Lys 115 120 125 Val Gly Ile Gly Thr Phe Ile Asp Pro Arg Asn Gly Gly Gly Lys Val 130 135 140 Asn Asp Ile Thr Lys Glu Asp Ile Val Glu Leu Val Glu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Gln Glu Tyr Leu Phe Tyr Pro Ala Phe Pro Ile His Val Ala Leu Ile 165 170 175 Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Phe Glu Lys Glu 180 185 190 Val Ala Pro Leu Glu Gly Thr Ser Val Cys Gln Ala Val Lys Asn Ser 195 200 205 Gly Gly Ile Val Val Val Gln Val Glu Arg Val Val Lys Ala Gly Thr 210 215 220 Leu Asp Pro Arg His Val Lys Val Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val 225 230 235 240 Val Val Ala Asp Pro Glu Asp His Gln Gln Ser Leu Asp Cys Glu Tyr 245 250 255 Asp Pro Ala Leu Ser Gly Glu His Arg Arg Pro Glu Val Val Gly Glu 260 265 270 Pro Leu Pro Leu Ser Ala Lys Lys Val Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Glu Lys Asp Val Ala Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro Glu 290 295 300 Tyr Val Ala Ser Val Ala Asp Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Arg Phe Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Asp Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr 340 345 350 Gln Phe Asp Tyr Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Cys Tyr Leu Gly 355 360 365 Leu Ala Glu Cys Asp Glu Lys Gly Asn Ile Asn Val Ser Arg Phe Gly 370 375 380 Pro Arg Ile Ala Gly Cys Gly Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr 385 390 395 400 Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val 405 410 415 Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys 420 425 430 Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu Gln Ile Thr Phe Asn Gly Asp Val Ala 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Gln Gln Val Thr Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val Phe 450 455 460 Leu Leu Lys Glu Asp Gly Leu His Leu Ser Glu Ile Ala Pro Gly Ile 465 470 475 480 Asp Leu Gln Thr Gln Ile Leu Asp Val Met Asp Phe Ala Pro Ile Ile 485 490 495 Asp Arg Asp Ala Asn Gly Gln Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe 500 505 510 Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu Lys Glu Met Lys Ser 515 520

Claims (10)

  1. 서열번호 6의 아미노산 서열에서,
    a) E130D 및 Q481K;
    b) E130D, S325T 및 Q481K;
    c) E130D, S477F 및 Q481K;
    d) E130D, S325T, S477F 및 Q481K; 및
    e) E130D, S325T, S477G 및 Q481K; 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지며 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체.
  2. 삭제
  3. 제 1 항의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자.
  4. 제 3 항의 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체 합성용 재조합 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    서열 번호 77의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서, 서열 번호 77의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자는,
    a) 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
    b) 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C;
    c) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
    d) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Ala243Thr 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G;
    e) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Gly 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이;
    f) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp257Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 A1200G 변이;
    g) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Asp65Asn 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1158C 변이;
    h) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Thr199Ile 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T699C, A1125G 및 T1159C 변이; 및
    i) 서열번호 78의 아미노산 서열에서 Val193Ala 변이 및 서열번호 77의 염기서열에서 T78C, T699C 및 T1158C 변이; 로 구성된 군에서 선택되는 변이를 함유하는 프로피오닐 CoA-트랜스퍼라아제의 변이체 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  8. 제 7 항의 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 배양은 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경에서 수행되고, 상기 공중합체는 하이드록시알카노에이트-co-3-락테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레레이트(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6~14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydrowyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4- hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-4-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hyxenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헥산산(3-hydroxy-6-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄 산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methylester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methylester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methylester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methylester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethylester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethylester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propylester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzylester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄 산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3,12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptenoic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020090059488A 2009-06-30 2009-06-30 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용한 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체의 제조방법 KR101211767B1 (ko)

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