KR100957777B1 - 슈도모나스 속 6-19 유래의 ｐｈａ 합성효소 변이체 및이를 이용한 락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법 - Google Patents

슈도모나스 속 6-19 유래의 ｐｈａ 합성효소 변이체 및이를 이용한 락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 및/또는 공중합체를 합성할 수 있는 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19, KCTC 11027BP) 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase, PHA synthase)의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 합성효소 변이체를 이용하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 및/또는 공중합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 슈도모나스 속 6-19 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체는 종래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소가 기질로 사용하는데 어려움이 있었던 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 중합체 및/또는 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다.
폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체

Description

슈도모나스 속 6-19 유래의 ＰＨＡ 합성효소 변이체 및 이를 이용한 락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법{Mutants of PHA synthase from Pseudomonas sp. 6-19 and method for preparing lactate homopolymer or copolymer using the same}
본 발명은 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 및/또는 락테이트 공중합체를 합성할 수 있는 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19) 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 이용하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 및/또는 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
폴리락테이트(PLA)는 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 크다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 연쇄커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합 하는 방법이 있으나, 유기용제(solvent)나 연쇄커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어 있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
화학합성을 통하여 락테이트를 이용하여 PLA를 합성할 경우 PLA 호모폴리머는 쉽게 수득할 수 있다. 그러나 다양한 모노머 유니트(unit)를 지닌 PLA 공중합체의 합성은 어렵고 상업적으로 효용성이 매우 떨어지는 단점이 있다.
한편, 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoaste, PHA)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. 미생물을 이용하여 PLA 및 락테이트 공중합체를 합성할 때도 같은 시스템이 필요하며 원래의 PHA 합성효소의 기질인 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소 이외에 추가로 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 락틸-CoA를 제공하기 위하여 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제를 사용하는 시스템을 이용하여 성공적으로 PLA 및 락테이트 공중합체를 합성할 수 있었다(대한민국 특허출원 공개번호 제10-2006-0121555호). 하지만 2번 위치에 하이드록실레이션(hydroxylation)된 하이드록시알카노에이트에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 매우 떨어졌다. 따라서 in vitro 활성 측정을 통해 PHA 합성효소의 락틸-CoA에 대해 반응성을 분석한 보고는 있었지만, 전술한 문제점과 같이 락틸-CoA에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 매우 미약하다고 알려져 있었다(Zhang et al ., Appl . Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl . Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994; 및 Yuan et al. Arch Biochem Biophys. 394:87, 2001). 따라서 락틸-CoA를 효율적으로 이용하지 못하는 PHA 합성효소를 이용하여 PLA 및 락테이트 공중합체를 합성할 때에는 합성효율이 매우 낮을 수 밖에 없다. 즉, 2번-탄소위치가 하이드록실레이션된 하이드록시알카노에이트인 락테이트는 PHA 합성효소의 기질특이성에 적합하지 않기 때문에 효율적으로 PLA 및 락테이트 공중합체를 합성하기 위해서는 락틸-CoA를 효율적으로 이용할 수 있는 PHA 합성효소가 매우 중요하다 할 수 있다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 락틸-CoA를 기질로 효율적으로 이용할 수 있는 PHA 합성효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락틸-CoA를 기질로 이용할 수 있는 PHA 합성효소 및 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자를 함유하는 식물 또는 세포를 이용하여 PLA 및 락테이트 공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열에서 481번째 아미노산인 글루타민이 변이된 것을 특징으로 하는 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 상기 변이체가 130번째 아미노산인 글루타메이트, 325번째 아미노산인 세린 및 477번째 아미노산인 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 추가로 변이된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 제공한다.
보다 바람직하게, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열에서
a) S325T 및 Q481M;
b) E130D 및 Q481K;
c) S325T 및 Q481K;
d) E130D 및 Q481M;
e) E130D 및 Q481R;
f) E130D, S325T 및 Q481M;
g) E130D, S325T 및 Q481K;
h) E130D, S477R 및 Q481K;
i) E130D, S477R 및 Q481M;
j) E130D, S477R 및 Q481R;
k) E130D, S477H 및 Q481K;
l) E130D, S477H 및 Q481M;
m) E130D, S477H 및 Q481R;
n) E130D, S477F 및 Q481K;
o) E130D, S477F 및 Q481M;
p) E130D, S477F 및 Q481R;
q) E130D, S477Y 및 Q481K;
r) E130D, S477Y 및 Q481M;
s) E130D, S477Y 및 Q481R;
t) E130D, S325T, S477R 및 Q481M;
u) E130D, S325T, S477R 및 Q481K;
v) E130D, S325T, S477F 및 Q481M;
w) E130D, S325T, S477G 및 Q481M; 또는
x) E130D, S325T, S477F 및 Q481K
가 변이된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 제공한다.
본 발명자들은 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체를 사용하는 경우 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 중합체 및/또는 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 공중합체 합성용 재조합 벡터를 제공한다.
보다 바람직하게, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포 또는 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자를 가지지 않는 세포 또는 식물을 상기 재조합 벡터로 형질전환하여 수득되는 것을 특징으로 하나는 세포 또는 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법을 제공한다.
보다 바람직하게, 본 발명은 상기 배양 또는 재배가 3-하이드록시부티레이트(3-HB)를 함유하는 환경에서 수행되고 제조된 공중합체가 3-하이드록시부티레이트 단량체 유니트 및 락테이트 단량체 유니트를 포함하는 공중합체인 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어 상기 공중합체는 단량체의 종류가 2개인 이중합체, 단량체의 종류가 3개인 삼중합체, 단량체의 종류가 4개인 사중합체 등을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어 상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레레이트(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸 산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜텐산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid,)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부티레이트(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부티레이트(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부티레이트(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센 산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부티레이트(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid) 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어 벡터(vector)는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있 다.　적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 본 발명에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다.　그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다.
발현조절서열(expression control sequence)이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다.　그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.　예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의의 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.　진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.　플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다.　고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스(cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다.　유용한 발현조절서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다.　이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)는 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다.　예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.　일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다.　그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다.　이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다.　그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다.　여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다.　발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된(이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다.　바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.　발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명에 있어서, 재조합 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들이 도입될 수 있다.　본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다.　그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.　적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상 의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 적절한 숙주세포로 통상의 방법으로 형질전환할 수 있다. 숙주세포로는 박테리아, 효모 및 곰팡이 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 선호되는 숙주세포는 원핵세포로, 대장균이 바람직하다.　적합한 원핵 숙주세포의 예로는 E.coli균주 DH5a, E.coli균주 JM101, E.coli K12균주 294, E.coli균주 W3110, E.coli균주 X1776, E.coli XL-1Blue(Stratagene), E.coli B 등을 포함한다.　그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다.　전술한 E.coli 이외에도 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주. 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있으며, 본 발명은 상기 기술한 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.　선택적으로 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982)) 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 전환효소의 유전자 및 합성효소의 유전자를 함유하는 식물체를 제 조하기 위한 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여 캘러스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 "외식체(explant)"라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서 이용가능한 형질감염 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명에 따른 슈도모나스 속 6-19 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 합 성효소 변이체를 사용하면 종래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소가 기질로 사용하는데 어려움이 있었던 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 중합체 및/또는 공중합체를 고효율로 제조할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
특히 이하 실시예에서는 PHA 합성효소 변이체를 이용하여 락테이트 공중합체를 합성하는 데에 3-하이드록시부티레이트(3-HB)를 첨가하여 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-락테이트)(P(3HB-co-LA))를 합성하는 것만이 기재되어 있으나, 3-HB 이외의 하이드록시알카노에이트를 첨가하여 상기 하이드록시알카노에이트와 락테이트의 공중합체를 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
<실시예 1> Pseudomonas sp. 6-19 유래의 PHA 합성효소 유전자의 클로닝 및 발현벡터의 제작
본 발명에 사용된 Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP) 유래 PHA 합성효소(phaC1Ps6 -19) 유전자를 분리하기 위해 Pseudomonas sp. 6-19의 전체 DNA를 추출하고, phaC1Ps6 -19 유전자 서열(송애진, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)에 기반한 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하고, PCR을 수행하여 phaC1Ps6 -19 유전자를 수득하였다.
서열번호 1: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3
서열번호 2: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3
PCR 반응물을 아가로오스 젤 전기영동하여 phaC1Ps6 -19 유전자에 해당하는 1.7kbp 크기의 유전자 절편을 확인하였다. phaC1Ps6 -19 합성효소의 발현을 위해서 단량체(monomer) 공급 효소와 합성효소가 같이 발현되는 operon 형태의 항시적 발현 시스템을 도입하였다(도 1).
pSYL105 벡터(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다.
pReCAB 벡터는 PHA 합성효소(phaCRE)와 단량체 공급효소(phaARE 및 phaBRE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현되며 대장균에서도 잘 작동된다고 알려져 있다(Lee et al., Biotech . Bioeng., 1994, 44:1337-1347). pReCAB 벡터를 BstBI/SbfI으로 절단하여 R. eutropha H16 PHA 합성효소(phaCRE)를 제거한 다음, 상기에서 수득한 phaC1Ps6 -19 유전자를 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 제조하였다(도 1).
BstBI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1Ps6 -19 합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환 없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
서열번호 3: 5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3
서열번호 4: 5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3
서열번호 5: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3
서열번호 6: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3
서열번호 7: 5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3
서열번호 8: 5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3
상기 제작한 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터의 phaC1Ps6 -19 유전자 염기 서열은 시퀀싱을 통해 확인하여 서열번호 9로 나타내었으며, 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열번호 10에 나타내었다.
상기 유전자 염기서열의 유사성을 분석한 결과 Pseudomonas sp. strain 61-3 (Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998) 유래 phaC1과 84.3%의 상동성 을 가지며, 아미노산 서열 상동성은 88.9%로 상기 두 합성효소가 상당히 유사한 효소임을 확인하였고, 이를 통해 본 발명에서 얻은 phaC1Ps6 -19 합성효소는 Type II PHA 합성효소임을 확인하였다.
상기 phaC1Ps6 -19 합성효소의 PHB 합성 여부를 확인하기 위해 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 E. coli XL-1Blue(Stratagene)에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5ug/ml)에서 생육 시킨 결과 PHB 생성이 관찰되지 않았다.
<실시예 2> Pseudomonas sp. 6-19 유래 PHA 합성효소의 기질 특이성 변이체의 제작
다양한 종류의 PHA 합성효소 중에서 Type II PHA 합성효소는 비교적 탄소수가 긴 기질을 중합시키는 MCL-PHA (medium-chain-length PHA) 합성효소로 알려져 있다. 이 MCL 합성효소는 락테이트 공중합체 생산에 매우 유용할 것으로 기대되고 있다. 본 발명에서 획득한 phaC1Ps6 -19 합성효소와 매우 상동성이 높은 Pseudomonas sp. 61-3 유래 phaC1 합성효소는 Type II 합성효소이지만, 비교적 넓은 범위의 기질 특이성을 가진다고 보고되어 있고(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998), SCL-PHA (short-chain-length PHA) 생산에 적합한 돌연변이체에 관한 연구 결과가 보고되어 있다(Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004). 이를 바탕으로 본 발명에서는 SCL 활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳을 아미노산 서열 배열 분석을 통해 찾았고, 서열번호 11 내지 서열번호 14의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 다음 표 1과 같은 phaC1Ps6 -19 합성효소 변이체들을 만들었다.
재조합 벡터 핵산 치환 아미노산 치환 프라이머
pPs619C1200-ReAB AGC →ACC S325T 서열번호 11/12
CAG →ATG Q481M 서열번호 13/14
pPs619C1300-ReAB GAA →GAT E130D 서열번호 15/16
AGC →ACC S325T 서열번호 11/12
CAG →ATG Q481M 서열번호 13/14
서열번호 11: 5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3
서열번호 12: 5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3
서열번호 13: 5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3
서열번호 14: 5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3
서열번호 15: 5- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3
서열번호 16: 5- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3
이들 재조합 벡터를 E. coli XL-1Blue에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5ug/ml)에서 생육시킨 결과 pPs619C1200-ReAB로 형질전환된 E. coli XL-1Blue와 pPs619C1300-ReAB로 형질전환된 E. coli XL-1Blue에서 모두 PHB 생성을 확인할 수 있었다. 즉, 단량체 공급효소인 phaARE와 phaBRE에 의해 글루코스로부터 3HB-CoA가 생성되고, 이를 기질로 하여 phaC1Ps6 -19 합성효소 SCL 변이체들(phaC1Ps6 -19200 및 phaC1Ps6 -19300)이 PHB를 합성한 것이다. 정량적인 분석을 위해 형질전환한 재조합 대장균 XL1-Blue를 글루코스(20g/L)가 포함된 LB 배지에서 37℃에서 4일간 배양하였다. 배양한 재조합 대장균에 슈크로오즈 쇼크(sucrose shock)을 준 후 Nile-red 염색을 하였고, 이를 FACS(Florescence Activated Cell Sorting) 분석하였다(도 2).
야생형 합성효소를 포함하는 벡터인 pPs619C1-ReAB 벡터로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 Nile-red에 의해 염색이 되지 않은 반면, pPs619C1200-ReAB로 형질전환된 대장균과 pPs619C1300-ReAB로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 세포 내에 축적된 PHB가 Nile-red에 의해 염색되어 높은 형광도를 나타내었다. 또한, 배양 균체를 원심분리를 통해 회수하여 80℃의 건조기에서 48시간 건조한 후 가스크로마토그래피 분석을 수행하여 세포 내 합성된 PHB 함량을 측정한 결과, pPs619C1200-ReAB로 형질전환시킨 대장균과 pPs619C1300-ReAB로 형질전환시킨 대장균은 PHB 함량이 건조세포중량 대비 각각 29.7%(w/w) 및 43.1%(w/w)였으며, pPs619C1-ReAB의 경우는 검출되지 않았다.
<실시예 3> Pseudomonas sp. 6-19 유래 PHA 합성효소와 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 발현이 가능한 재조합 대장균의 제작 및 이를 이용한 PLA 또는 락테이트 공중합체의 제조
본 실시예에서는 PLA 및 락테이트 공중합체 합성시 필요한 단량체인 락틸-CoA를 제공하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(CP-PCT)를 사용하였고, 도 3과 같이 PHA 합성효소와 CP-PCT가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템을 구축하였다. CP-PCT의 경우 미생물에 독성을 나타낸다고 알려져 있는데, 일반적으로 재조합 단백질 발현에 널리 사용되는 tac 프로모터나 T7 프로모터를 사용한 IPTG에 의한 발현유도 시스템에서는 유도제 첨가와 동시에 재조합 미생물이 모두 사멸한다. 이 때문에 약하게 발현되지만 미생물 성장에 따라 지속적으로 발현되는 항시적 발현 시스템을 사용하는 것이 적합하다고 판단하였다. cp - pct는 Clostridium propionicum의 염색체 DNA를 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR하여 얻어진 단편을 사용하였으며, 이 때, 원래 야생형 CP-PCT에 존재하는 NdeI site를 cloning의 용이성을 위해 SDM방법을 이용하여 제거하였다(도 4).
서열번호 17: 5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA
서열번호 18: 5-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg
또한, SbfI/NdeI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 19과 서열번호 20의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
서열번호 19: 5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3
서열번호 20: 5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3
phaC1Ps6 -19 합성효소 SCL 변이체인 phaC1Ps6 -19300를 함유한 pPs619C1300-ReAB 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 Ralstonia eutrophus H16 유래의 단량체 공급효소(phaARE 및 phaBRE)를 제거한 다음, 상기 PCR 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제조하였다(도 4).
또, 다른 phaC1Ps6 -19 합성효소 SCL 변이체인 phaC1Ps6 -19200를 함유한 과 pPs619C1200-CPPCT 및 야생형 phaC1Ps6 -19 합성효소를 함유한 pPs619C1-CPPCT 재조합 벡터 역시 상기와 같은 방법으로 제작하였다. CP-PCT에 의한 단량체 공급으로 중합체의 합성여부를 확인하기 위하여 pPs619C1200-CPPCT과 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 E. coli XL-1Blue에 형질전환시키고, 이를 PHB 검출배지 (LB agar, glucose 20g/L, 3HB 2g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시킨 결과 PHB 생성을 관찰할 수 있었다.
상기 제작된 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 이용하여 다양한 조건에서 플라스크 배양을 수행하여 PLA 및 락테이트 공중합체의 생산을 시도하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
균주명 배지 배양 기질 PHB 함량(%) PLA 함량(%)
XL1-Blue LB 글루코스 (10g/L) 호기성 락테이트(5g/L) - 0.6
XL1-Blue LB→MR 글루코스 (20g/L) 2 단계 (호기성→혐기성) - - 1
Top10 LB→MR 글루코스 (20g/L) 2 단계 (호기성→혐기성) - - 0.3
XL1-Blue LB→MR 글루코스 (20g/L) 2 단계 (호기성→혐기성) 3HB(2g/L) 3.19 2.75
Top10 LB→MR 글루코스 (20g/L) 2 단계 (호기성→혐기성) 3HB(2g/L) 2.84 3.1
Top10 LB 글루코스 (20g/L) 호기성 3HB(0.05g/L) 락테이트(5g/L) 0.07 1.97
Top10 LB 글루코스 (20g/L) 호기성 3HB(0.2g/L) 락테이트(5g/L) 0.31 3.18
상기 2-단계 배양의 경우 배양액을 MR 배지로 치환한 후, 혐기적 배양을 시도하여 락테이트가 세포 내에서 만들어지도록 시도한 것이다. 다양 조건에서 재조합 대장균을 배양한 결과 PLA 호모폴리머는 대략 건조세포중량 대비 약 1% 정도 합성되었고, 3HB를 기질로 첨가하여 락테이트 공중합체 합성을 시도한 경우는 대략 약 6% 정도의 폴리머를 얻을 수 있었다. 본 실시예에서 사용한 재조합 대장균의 유가식 배양에 사용된 MR 배지의 조성은 표 3에 나타내었다.
성분 Modified R (MR) (/L)
KH2PO4 6.67 g
(NH4)2HPO4 4 g
Citrate 0.8 g
MgSO4·H2O 0.8 g
3HB 0 or 0.2 g
Glucose 50 g
미량성분* 5 mL
*미량성분(/L): FeSO4·H2O, 10g; ZnSO4·H2O, 2.25g; CuSO4·H2O, 1g; MnSO4·H2O, 0.5g; CaCl2·H2O, 2g ; Na2B4O7·H2O, 0.23g; (NH4)6Mo7O24, 0.1g; 35 % HCl, 10mL.
<실시예 4> 재조합 대장균의 유가식 배양을 통한 P(3HB-co-LA) 공중합체의 제조
pPs619C1300-CPPCT 벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 20 g/L의 포도당, 100 mg/L의 앰피실린 등이 포함된 3 mL의 LB 배지에서 37℃, 교반속도 200rpm로 12 시간 동안 배양을 수행하였다. 이 배양액을 동일 배지 100 mL에 모두 접종하여 동일 조건에서 6 시간 배양해 주었고, 이를 유가식 배양의 종균배양액(seed culture)으로 사용하였다. 유가식 배양을 위한 시작배지는 MR 배지를 사용하였다. MR 배지 2.4L가 함유된 발효조에 100 mL의 종균배양액을 접종하여 유가식 배양을 시작하였다. 배양액의 온도는 37℃이었고, pH는 14% 암모니아수를 이용하여 6.8-6.9가 되게 조절해 주었으며, 용존 산소는 공기 공급 및 교반속도 조절을 통하여 포화공기의 20% 이상으로 유지해 주었다. 이 때, 공기 공급 속도는 1vvm 이었다. 초기 시작배지에 함유된 포도당이 고갈되었을 때, 포도당 20g 과 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate; 3HB) 5 g을 공급해 주었고, 동시에 교반속도를 200rpm으로, 그리고 공기 공급 속도를 0.1vvm으로 각각 감소시켜 배양 조건을 호기 조건에서 혐기조건으로 전환시켜 주었다. 배양기간동안 포도당의 공급은 총 5번 해주었고, 이 중 첫 번째와 세 번째 공급 시에는 5 g의 3HB를 함께 공급해 주었다. 배양 종료 후 원심분리를 통하여 세포를 회수하였고, 이를 동결건조 하였다.
합성된 고분자의 분리 정제를 위하여　Soxhlet 장치에서 클로로포름을 이용하여 동결건조된 세포로부터 고분자를 추출하였다. 클로로포름에 녹아있는 고분자 추출액으로부터 rotary evaporator를 이용하여, 클로로포름을 거의 제거하였고, 여기에 메탄올을 첨가하여 고분자를 침전시켰다. 침전된 고분자를 필터여과를 이용하여 거른 후, 진공 건조기에서 12시간 동안 건조하여 최종 회수하였다.
또한, 원심분리에 의해 회수된 균체 일부를 80℃의 건조기에서 48시간 건조한 후, 가스크로마토그래피 분석을 수행하여 세포내 합성된 P(3HB-co-LA) 공중합체 함량을 측정하였다. 3HV 함량이 무게비로 12%인 P(3HB-co-3HV) 공중합체 및 PLA 호모폴리머를 표준물질로 사용하였다.
분석결과, 대장균 내에 합성된 P(3HB-co-LA)의 함량은 건조세포중량 대비 약 10% 이었고, 공중합체 중의 PLA 함량은 88 mol% 이었다.
본 실시예를 통하여 최종 회수된 고분자의 가스크로마토그래피 분석을 수행한 결과 회수된 고분자는 P(3HB-co-LA) 공중합체임을 재확인하였고, 공중합체 중의 PLA 함량 또한 88 mol%임을 재확인하였다.
<실시예 5> 재조합 대장균의 유가식 배양을 통한 PLA 호모폴리머의 제조
실시예 4와 동일한 방법으로 pPs619C1300-CPPCT 벡터로 형질전환된 재조합 대장균의 종균배양을 실시하였으며, MR 배지 2.4 L가 함유된 발효조에 100 mL의 종균배양액을 접종하여 유가식 배양을 시작하였다. 배양액의 온도는 37℃이었고, pH는 14% 암모니아수를 이용하여 6.8-6.9가 되게 조절해 주었으며, 용존산소는 공기 공급 및 교반속도 조절을 통하여 포화공기의 20% 이상 유지해 주었다. 이 때, 공기 공급 속도는 1vvm 이었다. 초기 시작배지에 함유된 포도당이 고갈되었을 때, 포도당 20g 을 공급해 주었고, 동시에 교반속도를 200rpm으로, 공기 공급속도를 0.1vvm으로 각각 감소시켜 배양조건을 호기조건에서 혐기조건으로 전환시켰다. 배양기간 동안 포도당의 공급은 총 5번 해주었다. 배양 종료 후 원심분리를 통하여 세포를 회수하였고, 이를 동결건조하였다. 고분자는 실시예 4와 동일한 방법으로 최종 회수하였다.
또한, 원심분리에 의해 회수된 균체 일부를 80℃의 건조기에서 48시간 건조한 후 가스크로마토그래피 분석을 수행하여 세포내 합성된 PLA 함량을 측정하였으며, 3HV 함량이 무게비로 12%인 P(3HB-co-3HV) 공중합체, methyl-4HB 및 PLA 호모폴리머를 표준물질로 사용하였다.
분석결과 3HB 및 4HB는 전혀 검출되지 않았고, 오직 PLA만 검출되었음을 확인할 수 있었다. 대장균 내에 합성된 PLA의 함량은 건조세포중량 대비 약 10% 이었다. 본 실시예를 통하여 최종 회수된 고분자의 가스크로마토그래피 분석을 수행한 결과 회수된 고분자는 PLA 함량이 99.1 mol% 폴리락테이트 중합체였다.
<실시예 6> 다양한 변이체의 제작
상기 실시예 2와 유사한 방법으로 하기 프라이머들을 이용하여 다양한 PHA 합성효소 변이체들을 제작하였다. 제작된 변이체들을 하기 표 4, 5, 6 및 7에 종합하여 나타내었다.
E130D
서열번호 15: 5'-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3'
서열번호 16: 5' -ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3'
S325T
서열번호 11: 5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'
서열번호 12: 5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3'
S477R
서열번호 21: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3'
서열번호 22: 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477H
서열번호 23: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cat ggg cat atc- 3'
서열번호 24: 5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477F
서열번호 25: 5'- gaa ttc gtg ctg tcg agc ttt ggg cat atc- 3'
서열번호 26: 5'- gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477Y
서열번호 27: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc tat ggg cat atc- 3'
서열번호 28: 5'-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477G
서열번호 29: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc- 3'
서열번호 30: 5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Q481K
서열번호 31: 5'-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c- 3'
서열번호 32: 5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c- 3'
Q481M
서열번호 33: 5'-ggg cat atc atg agc atc ctg aac ccg c- 3'
서열번호 34: 5'-gcg ggt tca gga tgc tca tga tat gcc c- 3'
Q481R
서열번호 35: 5'-ggg cat atc cgc agc atc ctg aac ccg c- 3'
서열번호 36: 5'-gcg ggt tca gga tgc tgc gga tat gcc c- 3'
재조합 synthase 핵산 치환 아미노산 치환 프라이머
pPs619C1200 AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1202 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1203 AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1204 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1205 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
CAG → CGC Q481R 서열번호 35, 36
재조합 synthase 핵산 치환 아미노산 치환 프라이머
pPs619C1300 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1301 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1304 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → CGC S477R 서열번호 21, 22
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1305 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → CGC S477R 서열번호 21, 22
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1306 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → CGC S477R 서열번호 21, 22
CAG → CGC Q481R 서열번호 35, 36
pPs619C1307 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → CAT S477H 서열번호 23, 24
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1308 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → CAT S477H 서열번호 23, 24
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1309 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → CAT S477H 서열번호 23, 24
CAG → CGC Q481R 서열번호 35, 36
pPs619C1310 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → TTT S477F 서열번호 25, 26
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
재조합 synthase 핵산 치환 아미노산 치환 프라이머
pPs619C1311 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → TTT S477F 서열번호 25, 26
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1312 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → TTT S477F 서열번호 25, 26
CAG → CGC Q481R 서열번호 35, 36
pPs619C1313 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → TAT S477Y 서열번호 27, 28
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1314 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → TAT S477Y 서열번호 27, 28
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1315 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → TAT S477Y 서열번호 27, 28
CAG → CGC Q481R 서열번호 35, 36
재조합 synthase 핵산 치환 아미노산 치환 프라이머
pPs619C1400 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
AGC → CGC S477R 서열번호 21, 22
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1401 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
AGC → CGC S477R 서열번호 21, 22
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
pPs619C1334 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
AGC → TTT S477F 서열번호 25, 26
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1336 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
AGC → GGC S477G 서열번호 29, 30
CAG → ATG Q481M 서열번호 33, 34
pPs619C1339 GAA → GAT E130D 서열번호 15, 16
AGC → ACC S325T 서열번호 11, 12
AGC → TTT S477F 서열번호 25, 26
CAG → AAA Q481K 서열번호 31, 32
<실시예 7> 다양한 변이체들을 이용한 P(3HB-co-LA)의 합성
상기 실시예 3에 기재된 방법과 유사하게 Pseudomonas sp. 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체와 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 발현이 가능한 재조합 대장균의 제작하고, 이를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 P(3HB-co-LA)을 제작하였다. 그 결과를 하기 표 8, 9 및 10에 나타내었다.
변이 　 　 　 　 　 Content (wt%) LA mol%
　 WT E130 S325 S477 Q481 　 　
Double C1-202 D 　 　 K 36.6 35.3
C1-204 D 　 　 M 28.2 19.7
C1-204 D 　 　 M 42.9 10.7
C1-205 D 　 　 R 22.9 35.1
변이 　 　 　 　 　 Content (wt%) LA mol%
　 WT E130 S325 S477 Q481 　 　
Triple C1-300 D T 　 M 43.8 31.9
C1-304 D 　 R K 20.2 22.0
C1-305 D 　 R M 51.8 15.2
C1-306 D 　 R R 23.5 26.8
C1-307 D 　 H K 36.9 31.0
C1-308 D 　 H M 47.0 27.6
C1-309 D 　 H R 28.5 39.8
C1-310 D 　 F K 60.4 15.0
C1-311 D 　 F M 49.2 32.3
C1-312 D 　 F R 57.9 13.2
C1-313 D 　 Y K 51.3 18.5
C1-314 D 　 Y M 50.8 29.3
C1-315 D　 　 Y R 46.1 17.1
변이 　 　 　 　 　 Content (wt%) LA mol%
WT E130 S325 S477 Q481 　 　
Quadruple C1-400 D T R M 15.8 15.4
C1-401 D T R K 12.9 12.5
C1-334 D T F M 1.6 20.8
C1-336 D T G M 10.3 17.5
상기 표 8, 9 및 10에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 PHA 합성효소 변이체들은 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 공중합체를 고효율로 제조할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 Peudomonas sp. 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 phaC1Ps6 -19 합성효소와 SCL 변이체들(phaC1Ps6 -19200 및 phaC1Ps6 -19300)을 포함하는 재조합 벡터(pPs619C1-ReAB, pPs619C1200-ReAB 및 pPs619C1300-ReAB)로 형질전환된 대장균을 PHB가 합성되는 조건에서 배양한 후 FACS (Florescence Activated Cell Sorting) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 PHA 합성효소와 CP-PCT가 동시에 발현되는 항시적 발현 벡터를 간단히 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 Peudomonas sp. 6-19 유래 PHA 합성효소 유전자 및 SCL 변이체 유전자와 CP-PCT 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 과정을 도식화한 것이다.
<110> LG CHEM, LTD Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Mutants of PHA synthase from Pseudomonas sp. 6-19 and method for preparing lactate homopolymer or copolymer using the same <130> F2007-0088PC (PCT07-069) <150> KR10-2006-0116234 <151> 2006-11-23 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aacgggaggg aacctgcagg 20 <210> 9 <211> 1677 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) <400> 9 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 10 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) <400> 10 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg 36 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg 32 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c 31 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gaattcgtgc tgtcgagcca tgggcatatc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gatatgccca tggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 gaattcgtgc tgtcgagctt tgggcatatc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gatatgccca aagctcgaca gcacgaattc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gaattcgtgc tgtcgagcta tgggcatatc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 gatatgccca tagctcgaca gcacgaattc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 gaattcgtgc tgtcgagcgg cgggcatatc 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 gatatgcccg ccgctcgaca gcacgaattc 30 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 gggcatatca aaagcatcct gaacccgc 28 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 gcgggttcag gatgcttttg atatgccc 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 gggcatatca tgagcatcct gaacccgc 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 gcgggttcag gatgctcatg atatgccc 28 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 gggcatatcc gcagcatcct gaacccgc 28 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 gcgggttcag gatgctgcgg atatgccc 28

Claims (11)

  1. 서열번호 10의 아미노산 서열에서,
    30번째 아미노산인 글루타메이트, 325번째 아미노산인 세린, 477번째 아미노산인 세린 및 481번째 아미노산인 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 아미노산이 하기와 같이 변이된 아미노산 서열을 갖는 락틸-CoA를 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 합성할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체:
    a) S325T 및 Q481M;
    b) E130D 및 Q481K;
    c) S325T 및 Q481K;
    d) E130D 및 Q481M;
    e) E130D 및 Q481R;
    f) E130D, S325T 및 Q481M;
    g) E130D, S325T 및 Q481K;
    h) E130D, S477R 및 Q481K;
    i) E130D, S477R 및 Q481M;
    j) E130D, S477R 및 Q481R;
    k) E130D, S477H 및 Q481K;
    l) E130D, S477H 및 Q481M;
    m) E130D, S477H 및 Q481R;
    n) E130D, S477F 및 Q481K;
    o) E130D, S477F 및 Q481M;
    p) E130D, S477F 및 Q481R;
    q) E130D, S477Y 및 Q481K;
    r) E130D, S477Y 및 Q481M;
    s) E130D, S477Y 및 Q481R;
    t) E130D, S325T, S477R 및 Q481M;
    u) E130D, S325T, S477R 및 Q481K;
    v) E130D, S325T, S477F 및 Q481M;
    w) E130D, S325T, S477G 및 Q481M; 또는
    x) E130D, S325T, S477F 및 Q481K.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자.
  5. 제4항의 유전자를 함유하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체 합성용 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  7. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포 또는 식물.
  8. 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자를 가지지 않는 세포 또는 식물을 제6항의 재조합 벡터로 형질전환하여 수득되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 식물.
  9. 제7항 또는 제8항의 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양 또는 재배는 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경에서 수행되고, 공중합체는 하이드록시알카노에이트 단량체 유니트 및 락테이트 단량체 유니트를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이 트(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜텐산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3- 하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid,)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부티레이트(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부티레이트(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부티레이트(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부티레이트(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid) 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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